TIỂU LUẬN MÔN SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG (di truyền y học)

Định nghĩa,nguyên tắc, phân loại,phân tích ưu nhược điểm, quy trình thực hiện, ứng dụng của kỹ thuật ELISA và PCR trong y học (có hình ảnh minh họa và tài liệu tham khảo).MỤC LỤCI. PCR11. Khái niệm:12. Quy trình13. Phản ứng RTPCR (PCR ngược)23.1 Nguyên lí23.2 Tiến hành phản ứng RT PCR34. Realtime PCR34.1 Khái niệm:34.2 Nguyên tắc:34.3 Ưu, nhược điểm:44.3.1 Ưu điểm:44.3.2 Nhược điểm:45. Lưu ý với RTPCR: giống với PCR và cần chú ý thêm76. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR77. Những ứng dụng của PCR87.1 Vân tay di truyền97.2 Chẩn đoán bệnh di truyền97.3 Tách dòng gen107.4 Gây đột biến điểm107.5 Phân tích mẫu DNA cổ117.6 Xác định kiểu gene của các đột biến117.7 So sánh mức độ biểu hiện của gen11II. ELISA121. Khái niệm:122. Nguyên lý:123. Các yếu tố ảnh hưởng:144. Ưu, nhược điểm:144.1 Một số ưu điểm của kỹ thuật này:144.2 Tuy nhiên kỹ thuật này vẫn còn tồn tại một số hạn chế:145. Phân loại ELISA155.1 Direct ELISA (ELISA trực tiếp)155.2 ELISA gián tiếp155.3 Sandwich ELISA175.3.1 Sandwich ELISA trực tiếp185.3.2 Sandwich ELISA gián tiếp195.4 Phản ứng ức chế cạnh tranh195.5 Direct CElisa: Kiểm tra kháng nguyên205.6 Direct CElisa: Kiểm tra kháng thể216. Ưu điểm phương pháp elisa227. Ứng dụng kỹ thuật ELISA trong y học:237.1 ứng dụng phương pháp ELISA xét nghiệm HIV:237.1.1 Cấu trúc HIV:237.2 Nguyên lí của kỹ thuật ELISA phát hiện kháng thể kháng HIV:237.3 Sinh phẩm HIV UNIFORM II Plus O phát hiện nhiễm HIV:257.4 Phát hiện kháng thể trên bệnh giun lươn bằng phản ứng ELISA26III. Dịch bài báo “Isolation of RNA from Equine Peripheral Blood Cell: Comparison of Methods”.26 DANH MỤC CÁC BẢNG HÌNHHình 1: Thiết bị nhân ADN (máy PCR)1Hình 2: Chu trình PCR2Hình 3: Các thiết bị dùng trong kỹ thuật realtime PCR4Hình 4: Kết quả sau khi dùng kỹ thuật PCR5Hình 5: Sơ đồ Realtime PCR TaqMan6Hình 6: Kết quả thử nghiệm quan hệ cha con9Hình 7: Nhân bản một gen bằng plasmid10Hình 8: Kỹ thuật ELISA13Hình 9: Sự khác biệt giữa ức chế và cạnh tranh20Hình 10: Quy trình xét nghiệm HIV25Hình 11: Trung bình và sai số chuẩn của giá trị trung bình33Sơ đồ 1: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA trực tiếp15Sơ đồ 2: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA gián tiếp16Sơ đồ 3: Tiến trình thực hiện ELISA Sandwich trực tiếp18Sơ đồ 4: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA Sandwich gián tiếp19Sơ đồ 5: Direct CELISA kiểm tra kháng nguyên21Sơ đồ 6: Direct CELISA kiểm tra kháng thể22Bảng 1: Kết quả cho mẫu lâm sàng……….……………………………………………31

TIỂU LUẬN

DI TRUYỀN Y HỌC

MỤC LỤC

I PCR 1

1 Khái niệm: 1

2 Quy trình 1

3 Phản ứng RT-PCR (PCR ngược) 2

3.1 Nguyên lí 2

3.2 Tiến hành phản ứng RT- PCR 3

4 Real-time PCR 3

4.1 Khái niệm: 3

4.2 Nguyên tắc: 3

4.3 Ưu, nhược điểm: 4

4.3.1 Ưu điểm: 4

4.3.2 Nhược điểm: 4

5 Lưu ý với RT-PCR: giống với PCR và cần chú ý thêm 7

6 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 7

7 Những ứng dụng của PCR 8

7.1 Vân tay di truyền 9

7.2 Chẩn đoán bệnh di truyền 9

7.3 Tách dòng gen 10

7.4 Gây đột biến điểm 10

7.5 Phân tích mẫu DNA cổ 11

7.6 Xác định kiểu gene của các đột biến 11

7.7 So sánh mức độ biểu hiện của gen 11

II ELISA 12

1 Khái niệm: 12

2 Nguyên lý: 12

3 Các yếu tố ảnh hưởng: 14

4 Ưu, nhược điểm: 14

4.1 Một số ưu điểm của kỹ thuật này: 14

4.2 Tuy nhiên kỹ thuật này vẫn còn tồn tại một số hạn chế: 14

5 Phân loại ELISA 15

5.1 Direct ELISA (ELISA trực tiếp) 15

5.2 ELISA gián tiếp 15

5.3 Sandwich ELISA 17

5.3.1 Sandwich ELISA trực tiếp 18

5.3.2 Sandwich ELISA gián tiếp 19

5.4 Phản ứng ức chế /cạnh tranh 19

5.5 Direct C-Elisa: Kiểm tra kháng nguyên 20

5.6 Direct C-Elisa: Kiểm tra kháng thể 21

6 Ưu điểm phương pháp elisa 22

7 Ứng dụng kỹ thuật ELISA trong y học: 23

7.1 ứng dụng phương pháp ELISA xét nghiệm HIV: 23

7.1.1 Cấu trúc HIV: 23

7.2 Nguyên lí của kỹ thuật ELISA phát hiện kháng thể kháng HIV: 23

7.3 Sinh phẩm HIV UNIFORM II Plus O phát hiện nhiễm HIV: 25

7.4 Phát hiện kháng thể trên bệnh giun lươn bằng phản ứng ELISA 26

III Dịch bài báo “Isolation of RNA from Equine Peripheral Blood Cell: Comparison of Methods” 26

DANH MỤC CÁC BẢNG HÌNH

Hình 1: Thiết bị nhân ADN (máy PCR) 1

Hình 2: Chu trình PCR 2

Hình 3: Các thiết bị dùng trong kỹ thuật realtime PCR 4

Hình 4: Kết quả sau khi dùng kỹ thuật PCR 5

Hình 5: Sơ đồ Realtime PCR TaqMan 6

Hình 6: Kết quả thử nghiệm quan hệ cha con 9

Hình 7: Nhân bản một gen bằng plasmid 10

Hình 8: Kỹ thuật ELISA 13

Hình 9: Sự khác biệt giữa ức chế và cạnh tranh 20

Hình 10: Quy trình xét nghiệm HIV 25

Hình 11: Trung bình và sai số chuẩn của giá trị trung bình 33

Sơ đồ 1: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA trực tiếp 15

Sơ đồ 2: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA gián tiếp 16

Sơ đồ 3: Tiến trình thực hiện ELISA Sandwich trực tiếp 18

Sơ đồ 4: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA Sandwich gián tiếp 19

Sơ đồ 5: Direct C-ELISA kiểm tra kháng nguyên 21

Sơ đồ 6: Direct C-ELISA kiểm tra kháng thể 22

Bảng 1: Kết quả cho mẫu lâm sàng……….………31

I PCR

1 Khái niệm:

PCR(Polymerase Chain Reaction) là môt kỹ thuật cho phép khuếch đại một

đoạn gen đặc hiệu để thu được nhiều bản sao phục vụ nghiên cứu Bên cạnh đó,PCR cũng cho phép dễ dàng đưa các thay đổi, đột biến vào ADN để nghiên cứu

Hình 1: Thiết bị nhân ADN (máy PCR)

2 Quy trình

Quy trình PCR gồm 20 đến 30 chu kỳ Mỗi chu kỳ gồm 3 bước (Hình 2)

 (1)Nhiệt độ tăng lên 94-96 °C để tách hai sợi DNA ra Bước này gọi làbiến tính, nó phá vỡ cầu nối hydrogen nối 2 sợi DNA Trước chu kỳ 1,DNA thường được biến tính đến thời gian mở chuỗi để đảm bảo mẫuDNA và mồi được phân tách hoàn toàn và chỉ còn dạng sợi đơn Thờigian: 1-2 phút

 (2)Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ thấp xuống để mồi có thểgắn vào sợi DNA đơn Bước này gọi là gắn mồi Nhiệt độ giai đoạn nàyphụ thuộc vào đoạn mồi và thường thấp hơn nhiệt độ biến tính 50 °C (45-

60 °C) Sử dụng sai nhiệt độ trong giai đoạn này dẫn đến việc đoạn mồikhông gắn hoàn toàn vào DNA mẫu, hay gắn một cách tùy tiện Thời gian:1-2 phút

 (3) Cuối cùng, DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống Nó bắt đầu bámvào và hoạt động dọc theo sợi DNA Bước này gọi là kéo dài Nhiệt độ

kéo dài phụ thuộc DNA-polymerase Thời gian của bước này phụ thuộcvào cả DNA-polymerase và chiều dài mảnh DNA cần khuếch đại Nhưmột quy tắc …, 1000bp/ 1 phút.

Hình 2: Chu trình PCR

3 Phản ứng RT-PCR (PCR ngược)

3.1 Nguyên lí

Thực chất của RT-PCR là phản ứng nhân một trình tự từ khuôn ARN,

gồm 2 giai đoạn: (1) Tổng hợp trình tự ADN 2 sợi từ sợi ARN làm khuôn; (2)Trình tự ADN 2 sợi lại làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR Phản ứng biến đổiARN thành ADN phải nhờ enzyme phiên mã ngược (Reverse-trancriptase) đượcgọi là giai đoạn chuyển ngược (RT) thực hiện ở nhiệt độ 50oC – 55oC trong 30

phút Sau khi có sản phẩm ADN 2 sợi thì phản ứng tiếp theo là PCR thôngthường gồm 3 giai đoạn RT-PCR được sử dụng để nhân ARN của retrovirut hoặcmARN tách từ tế bào chất.

Hình 3: Các thiết bị dùng trong kỹ thuật realtime PCR

Real time PCR gồm hai quá trình diễn ra đồng thời: nhân bản DNA bằng phảnứng PCR và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng đoạn DNA tạothành

4.3 Ưu, nhược điểm:

4.3.1 Ưu điểm:

Real-time PCR: Nhanh, cho phép theo dõi tiến trình phản ứng và biết đượclượng DNA đã tạo thành ở từng thời điểm Không cần điện di nên tiến hànhđược nhiều mẫu (gần 200 mẫu/ngày) Hạn chế tạp nhiễm Độ nhạy cao (3pgDNA) Lượng mẫu biến động (10-1010 copies) Độ lặp lại cao (CV < 2,0%)

sự tầm soát sớm nhiễm HIV ở trẻ, BS Nhi Khoa phải chờ đợi đến tháng thứ 15 để

có thể biết tình trạng huyết thanh học thực sự của trẻ sinh ra từ bà mẹ HIV(+)Nếu trẻ không được phát hiện sớm và điều trị thuốc kháng virus, trẻ có nguy cơ

tử vong là 50% trong 02 năm đầu tiên của cuộc sống Kỹ thuật kinh điển trongchẩn đóan nhiễm HIV ở trẻ - RT PCR/b-DNA: Giá thành đắt

- Nested-DNA PCR (gen: Gag, Pol và/hoặc Env): Đắt, kỹ thuật phức tạp - Nuôicấy và phân lập virus: Đắt, kỹ thuật phức tạp, mất nhiều thời gian, cần labo an

tòan mức độ 3 - Kỹ thuật real time PCR Để chẩn đoán sớm, giá thành thấp ở trẻsinh ra từ mẹ nhiễm HIV.

Hình 4: Kết quả sau khi dùng kỹ thuật PCR

Thông thường, real-time PCR được kết hợp với RT-PCR để định lượng mộtlượng nhỏ ARN thông tin Ký hiệu real-time PCR là rt PCR Định lượng trực tiếpkhông những có vai trò trong chẩn đoán mà còn có vai trò trong tiên lượng bệnh,quyết định điều trị, tái điều trị, duy trì điều trị thuốc kháng virus đặc hiệu

RT – PCR sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang

Phương pháp phổ biến nhất là sử dụng thuốc nhuộm ADN, thường là SYBRGreen, thuốc nhuộm gắn không đặc hiệu vào tất cả các chuỗi ADN kép và pháthuỳnh quang, sau mỗi chu kỳ phản ứng, lượng ADN sản phẩm tăng làm tăngcường độ tín hiệu huỳnh quang tương ứng Nhược điểm của chất huỳnh quang là

chính xác trong phân tích định lượng kết quả trình tự đích cần khuếch đại.

Phản ứng được thực hiện trong một máy chu kỳ nhiệt như bình thường, trừ việcthêm thuốc nhuộm chuỗi ADN kép, thuốc nhuộm chỉ phát quang khi gắn vớichuỗi ADN kép, và đầu dò sẽ đo mức huỳnh quang sau mỗi chu kỳ Nếu kèmgam chuẩn ngoài thì phản ứng có thể định lượng được

RT – PCR sử dụng đầu dò đánh dấu huỳnh quang (RT – PCR

TaqMan)

Sử dụng đầu dò mang chất huỳnh quang là một phương pháp chính xác và đángtin cậy nhất, nhưng cũng đắt nhất Nguyên lý của phương pháp này là các đầu dòchuyển năng lượng cộng hưởng huỳnh quang tới sản phẩm khuếch đại cần pháthiện (hiện tượng FRET) Đầu dò ADN hay ARN gắn đặc hiệu vào khu vực giữahai đoạn mồi để định lượng chỉ những ADN chứa trình tự đầu dò, do vậy làmtăng đáng kể độ đặc hiệu, và thậm chí có thể cho phép định lượng khi có mặt cảmột số sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu Khả năng này còn cho phép làm thửnghiệm đa mồi khi sử dụng các đầu dò đặc hiệu đánh dấu các mầu khác nhau

Hình 5: Sơ đồ Realtime PCR TaqMan

Thông thường, đầu dò mang huỳnh quang ở một đầu (Reporter – 5’) và một chấtchặn ở đầu kia (Quencher – 3’), vị trí gần nhau giữa chất mang và chất chặn làmthuốc nhuộm huỳnh quang truyền năng lượng tới chất chặn gần đó chứ khôngphát

quang Khi taq polymerase hoạt động, do enzyme này có hoạt tính 5’ – 3’exonuclease nên đầu dò bị đánh bật khỏi khuôn mẫu, lúc này, trạng thái gần nhau

giữa chất mang và chất chặn bị phá vỡ nên hiện tượng FRET không xảy ra nữa,chất huỳnh quang không còn bị chặn, ở trạng thái tự do nên phát quang và tínhiệu phát quang này sẽ được máy đo lạiỀ Sản phẩm đích tăng lên sau mỗi chu kỳphản ứng thì lượng chất huỳnh quang tự do được giải phóng ra cũng tích tụ lạingày càng nhiều.

PCR được tiến hành bình thường, trừ việc thêm đầu dò có đánh dấu huỳnhquang; Khi phản ứng bắt đầu, ở giai đoạn gắn mồi của PCR, cả mồi và đầu dòđều gắn đặc hiệu vào ADN đích; Quá trình tổng hợp chuỗi được thực hiện từ vịtrí các mồi, và khi taq polymerase chạm vào đầu dò thì hoạt tính 5’ – 3’exonuclease của enzyme này phá hủy đầu dò, tách chất mang huỳnh quang khỏichất chặn và do đó làm tăng lượng chất huỳnh quang ở dạng tự do Chất huỳnhquang được đo bằng máy real-time PCR, lượng tăng trung bình nhân chất huỳnhquang tương ứng với lượng tăng cấp số mũ của sản phẩm và được sử dụng để xácđịnh chu kỳ ngưỡng (Ct) của mỗi phản ứng

5 Lưu ý với RT-PCR: giống với PCR và cần chú ý thêm

 Loại enzyme phiên mã ngược

Enzyme phiên mã ngược là ADN polymerase phụ thuộc ARN, xúc tác quá trìnhtổng họp từ ARN thành sợi đơn ADN bổ trợ đầu tiên và sau đó là tổng hợp chuỗiADN đầu tiên

Trên thị trường thường lưu hành 3 loại enzyme có hoạt tính phiên mã ngược làAMV, M-MuLV, và Tth Các loại enzyme này có hoạt tính tối ưu ở các độ pH,nồng độ muối, và nhiệt độ ủ khác nhau nên cần tối ưu hóa các điều kiện phảnứng cho từng loại AMV và M-MuLV có khả năng tổng hợp ADN bổ trợ dài tớilOkb, còn khả năng tổng hợp của Tth là 1 – 2 kb

6 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR

Các mồi oligonucleotide: Tỷ lệ GC ở các mồi thường chiếm khoảng40-75% Khoảng cách giữa hai mồi thường không dài quá 3 kb Các mồi khôngđược tạo cấu trúc bậc hai do liên kết giữa các nucleotide ngay trong một mồi

Độ dài của mồi (số nucleotide) từ 15 đến không quá 30 Những mồi dài hoặcngắn hơn ảnh hưởng đến khả năng bắt cặp chính xác với ADN khuôn hoặc nhânbản không đặc hiệu ADN được tổng hợp khi đầu 3' của mồi đã liên kết vớikhuôn mặc dù đầu 5' có thể tự do Do đó đầu 5' của mồi có thể được gắn thêm

linker hoặc đoạn nucleotide điều khiển (promoter) Nồng độ mồi khoảng

0,1μM đến 1μM Nồng độ thường được xác định dựa vào giá trị OD đo ở 260

Liên kết giữa mồi và ADN khuôn: Mồi gắn vào sợi khuôn ADN nhờliên kết tạo cặp bổ sung giữa chúng Liên kết này phụ thuộc thời gian, nhiệt độ,nồng độ mồi cũng như nồng độ sợi khuôn Khi nồng độ mồi rất lớn so với nồng

độ khuôn, thời gian ủ mồi với sợi khuôn không cần thiết quá lâu Nhiệt độ ởgiai đoạn này phụ thuộc chiều dài của mồi và hàm lượng GC Khi oligo mồigồm 12 đến 15 base, nhiệt độ ủ khoảng 40-45oC Nhiệt độ 72oC thích hợp chophản ứng tổng hợp ADN bằng Taq polymerase (là AND polymerase có hoạttính ở nhiệt độ cao) Lúc này cần lưu ý các mồi ngắn thường bị biến tính 87-88tách ra khỏi sợi khuôn Ngoài ra, trong trường hợp mồi được tổng hợp xuất phát

từ trình tự acid amin thì liên kết giữa mồi với ADN khuôn không hoàn toàn bổsung do tính chất thoái hoá của mã di truyền Do đó, mồi loại này dễ dàng tách

ra khỏi sợi khuôn ở nhiệt độ tổng hợp ADN 27oC Vì vậy trong trường hợp này,thời gian gắn mồi có thể kéo dài hơn so với mồi có trình tự chính lấy từ đoạncần nhân bản vì Taq polymerase có thể tổng hợp ADN ở nhiệt độ gắn mồi Sau

đó mới tăng nhiệt độ lên 72oC Rõ ràng nhiệt độ và thời gian ở giai đoạn gắnmồi đặc biệt quan trọng; nhiệt độ quá cao gây biến tính, nhiệt độ quá thấp tạo racác liên kết không đặc hiệu (mồi có thể bám vào vị trí bất kỳ có độ tương đồngchứ không đảm bảo chính xác) Ngoài ra khi ADN khuôn chiếm tỷ lệ rất nhỏ (ví

dụ một đoạn ADN trong genome), thời gian cần thiết để mồi tìm đúng vị trí liênkết đặc hiệu và tạo cặp với khuôn thường khoảng 2 phút trong một số chu kỳđầu tiên Điều đáng lưu ý khi chỉ vài nucleotide ở đầu 3' của mồi đã liên kết vớikhuôn thì Taq polymerase sẽ kéo dài sợi mồi thành sợi ADN mới bất chấp mồichưa liên kết hoàn toàn với khuôn ở đầu 5'

Nồng độ một số ion cũng như bốn loại nucleotide dNTPs trong môitrưòng đều ảnh hưởng đến phản ứng PCR Ví dụ, ion Mg+2 kích thích phản ứngtổng hợp ADN trong khi muốn nhân được đoạn ADN dài cần loại bỏ hoàn toànKCl khỏi môi trường ADN khuôn có thể là ADN genome tách ra từ tế bào,ADN từ các ngân hàng genome hoặc ADNc, các AND bất kỳ; ARN tổng sốhoặc ARNm Nồng độ ADN khuôn thường < ng với ADNc, hoặc <μg với ADNgenome

7 Những ứng dụng của PCR

7.1 Vân tay di truyền

Vân tay di truyền là một kỹ thuật pháp y sử dụng để xác định một người bằngcách so sánh DNA của người đó với mẫu đã có, ví dụ như, mẫu máu thu được từ

hiện trường vụ án có thể được so sánh di truyền với mẫu máu của người tìnhnghi Có thể chỉ cần một lượng nhỏ DNA thu từ máu, tinh dịch, nước bọt, tóc

Về lý thuyết thì chỉ cần một mạch DNA đơn là đủ

Mặc dù các kết quả "dấu vân tay" là duy nhất (trừ cặp song sinh giống hệt nhau),mối quan hệ di truyền, ví dụ, cha mẹ và con hoặc anh chị em ruột, có thể đượcxác định từ hai hoặc nhiều dấu vân tay di truyền, có thể được sử dụng để thửnghiệm quan hệ cha con Một biến thể của kỹ thuật này cũng có thể được sửdụng để xác định các mối quan hệ tiến hóa giữa các sinh vật

Hình 6: Kết quả thử nghiệm quan hệ cha con

7.2 Chẩn đoán bệnh di truyền

Phát hiện các bệnh di truyền trong một gen nhất định là một quá trình lâu dài vàkhó khăn, có thể được rút ngắn đáng kể bằng cách sử dụng phương pháp PCR.Mỗi gen trong câu hỏi có thể dễ dàng được khuếch đại qua PCR bằng cách sửdụng các loại sơn lót thích hợp và sau đó trình tự để phát hiện đột biến

Bệnh virus, cũng có thể được phát hiện bằng phương pháp PCR thông quakhuếch đại của DNA của virus Phân tích này là có thể ngay sau khi nhiễm trùng,

có thể từ vài ngày đến vài tháng trước khi các triệu chứng thực tế xảy ra Chẩn

đoán sớm như vậy cho các bác sĩ dẫn quan trọng trong điều trị.

7.3 Tách dòng gen

Nhân bản một gen không nên nhầm lẫn với nhân bản toàn bộ một sinh vật mô tảquá trình cô lập một gen từ một sinh vật và sau đó chèn nó vào sinh vật khác.PCR thường được sử dụng để khuếch đại gen, mà sau đó có thể được chèn vàomột vector (vector là một phương tiện chèn một gen vào cơ thể) như một plasmid(một phân tử DNA vòng) (Hình 7) DNA sau đó có thể được chuyển thành mộtsinh vật khác nhau, nơi gen và sản phẩm của nó có thể được nghiên cứu chặt chẽhơn Thể hiện một gen nhân bản (thể hiện một gen có nghĩa là để sản xuất cácprotein mà nó xác định sản xuất) cũng có thể là một cách để sản xuất hàng loạthữu ích ví dụ protein-cho, thuốc men

Hình 7: Nhân bản một gen bằng plasmid

7.4 Gây đột biến điểm

Đột biến là một cách để làm thay đổi trình tự của các nucleotide trong DNA Cónhững tình huống trong đó một là quan tâm đến biến đổi (thay đổi) bản sao củamột chuỗi ADN nhất định, ví dụ, khi đánh giá các chức năng của một gen hoặctrong ống nghiệm tiến hóa protein Đột biến có thể được đưa vào trình tự DNAsao chép theo hai cách cơ bản khác nhau trong quá trình PCR Đột biến trangweb hướng cho phép người thử nghiệm để giới thiệu một đột biến tại một địađiểm cụ thể trên sợi DNA Thông thường, đột biến mong muốn được kết hợptrong các mồi sử dụng cho các chương trình PCR Đột biến ngẫu nhiên, mặtkhác, dựa trên việc sử dụng các polymerase dễ bị lỗi trong quá trình PCR Trongtrường hợp đột biến ngẫu nhiên, vị trí và tính chất của đột biến không thể kiểmsoát Một ứng dụng của đột biến ngẫu nhiên là để phân tích các mối quan hệ cấutrúc chức năng của protein Bằng cách thay đổi một cách ngẫu nhiên một chuỗi

DNA, người ta có thể so sánh các protein kết quả với ban đầu và xác định chứcnăng của từng phần của protein.

7.5 Phân tích mẫu DNA cổ

Sử dụng PCR, nó sẽ trở thành có thể phân tích ADN đó là hàng ngàn năm tuổi

Kỹ thuật PCR đã được sử dụng thành công trên động vật, chẳng hạn như một voi

ma mút bốn mươi ngàn năm tuổi, và cũng trên DNA của con người, trong cácứng dụng khác nhau, từ việc phân tích các xác ướp Ai Cập đến việc xác định một

Sa hoàng Nga

7.6 Xác định kiểu gene của các đột biến

Thông qua việc sử dụng kỹ thuật PCR, người ta có thể dễ dàng xác định alen củamột đột biến hoặc đa hình một cá nhân Ở đây, một trong hai đoạn mồi là phổbiến và sẽ bám một khoảng cách ngắn từ đột biến, trong khi người anneals khácphải làm biến thể của đầu 3' của mồi cụ thể được sửa đổi, chỉ ủ nếu nó phù hợpvới một trong các alen Nếu đột biến của lãi suất là một T hoặc C đơn đa hình(T / C SNP), người ta sẽ sử dụng hai phản ứng, một trong có chứa một mồi kếtthúc bằng T và kết thúc khác trong C Lớp sơn lót phổ biến là như nhau SauPCR, hai bộ phản ứng sẽ được chạy trên gel agarose và các mô hình ban nhạc sẽcho bạn biết nếu cá nhân là đồng hợp tử T, đồng hợp tử C, hoặc heterzygous T /

C Phương pháp này có nhiều ứng dụng, chẳng hạn như khuếch đại haplotypenhất định (khi alen nhất định ở mức 2 hoặc nhiều SNPs xuất hiện cùng nhau trêncùng nhiễm một sắc thể (Linkage mất cân bằng) hoặc phát hiện các nhiễm sắc thểtái tổ hợp và nghiên cứu về tái tổ hợp phân bào giảm nhiễm

7.7 So sánh mức độ biểu hiện của gen

Các nhà nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật PCR truyền thống như là một cách đểước tính thay đổi trong số lượng biểu hiện của gen Axit ribonucleic (RNA) đượcphiên mã từ DNA trước khi tổng hợp protein và những sợi RNA giữ các hướngdẫn trình tự protein được gọi là RNA thông tin (mRNA) Một khi RNA được côlập nó có thể được đảo ngược chép lại vào DNA (DNA bổ sung để được chínhxác, được gọi là cDNA), lúc đó truyền thống PCR có thể được áp dụng đểkhuếch đại gen, phương pháp này được gọi là RT-PCR Trong hầu hết các trườnghợp nếu có nhiều nguyên liệu ban đầu (mRNA) của một gen sau đó trong PCRnhiều bản sao của gen được tạo ra Khi sản phẩm của phản ứng PCR được chạytrên gel agarose, tương ứng với một gen, sẽ xuất hiện lớn hơn trên gel Bằng cáchchạy mẫu khuếch đại cDNA từ sinh vật xử lý khác nhau có thể có được một ý

tưởng chung trong đó mẫu thể hiện nhiều hơn của gen quan tâm.

độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện Hay nói cách khác ELISA giúpxác định sự có mặt hay không có mặt cũng như lượng kháng nguyên trong mẫunghiên cứu

Trong phương pháp này:

có thể được đo spectrophotometrically

Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là: kháng nguyên,kháng thể (cần có ít nhất một kháng thể đặc hiệu cho kháng nguyên chưa biết) vàchất tạo màu; quy trình được thực hiện qua hai bước:

 Bước 1: phản ứng miễn dịch học- là sự kết hợp giữa kháng nguyên và

kháng thể

 Bước 2: phản ứng hóa học- thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme làmgiải phóng oxy nguyên tử [O] từ H2O2 để oxy hóa cơ chất chỉ thị màu, do

đó làm thay đổi màu của hỗn hợp trong dung dịch thí nghiệm

Enzyme thường được sử dụng là:

Số lượng kháng thể thứ nhất được gắn vào đáy giếng

Ái lực của kháng thể thứ nhất đối với kháng nguyên

Ái lực của kháng thể thứ hai đối với kháng nguyên

3 Các yếu tố ảnh hưởng:

Ngoài ra, kết quả cửa ELISA còn chịu ảnh hưởng của các yếu tố:

 Nếu các đối chứng âm cho kết quả dương tính thì có thể do sự nhiễm từchất tạo màu hoặc từ kháng thể được đánh dấu hoặc chính các đối chứng

bị nhiễm

 Nếu màu không xuất hiện đối với đối chứng dương hoặc đối với mẫu thìphải kiểm tra lại tất cả hoá chất bao gồm: hạn sử dụng, nồng độ, điều kiệnbảo quản

 Nếu màu xuất hiện quá thấp đối với đối chứng dương và cả mẫu kiểm trathì phải kiểm tra lại kháng thể được gắn enzyme và nồng độ của chất tạomàu

 Nếu có tạo màu đối với mẫu nhưng không tạo màu với đối chứng dươngthì có thể kiểm tra lại nguồn gốc đối chứng, hạn sử dụng và điều kiện bảoquản

 Khi chạy lại một thử nghiệm trong điều kiện đang gặp sự cố thì chỉ nênthay đổi một yếu tố thí nghiệm

Kĩ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên hoặckháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml) So với kĩ thuật miễn dịchphóng xạ (RIA- Radio Immuno Assay) thì kĩ thuật này rẻ tiền và an toàn hơn màvẫn đảm bảo độ chính xác như nhau ELISA được dùng để xác định nhiều tácnhân gây bệnh như virus, vi khuẩn, nấm, kí sinh

4 Ưu, nhược điểm:

4.1 Một số ưu điểm của kỹ thuật này:

Dễ thực hiện

Có thể tiến hành đồng thời nhiều mẫu

Có thể phát hiện kháng thể IgM, IgG, IgA và IgE

4.2 Tuy nhiên kỹ thuật này vẫn còn tồn tại một số hạn chế:

Đòi hỏi thời gian ( có kết quả sau 5 giờ)

Thiết bị mắc tiền

5 Phân loại ELISA

5.1 Direct ELISA (ELISA trực tiếp)

Direct ELISA: Đây là dạng đơn giản nhất của phương pháp ELISA Trong đó,kháng nguyên cần phát hiện sẽ được gắn trực tiếp lên bề mặt giá thể và sẽ đượcphát hiện bằng một kháng thể duy nhất (kháng thể này đã được gắn enzyme)

Sơ đồ 1: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA trực tiếp

- Ưu điểm: Đơn giản nhất

- Nhược điểm:

+ Độ đặc hiệu bị giới hạn vì thường thì kháng nguyên có ít nhất là 2 epitope(trình diện kháng nguyên) mà phương pháp này chỉ sử dụng 1 kháng thể gắn vàomột epitope

+ Phải đánh dấu cho từng kháng thể chuyên biệt với từng đối tượng

5.2 ELISA gián tiếp

Indirect ELISA: Phương pháp này khác Direct ELISA ở chỗ kháng thể bắt khángnguyên không được gắn enzyme mà nó là mục tiêu gắn đặc hiệu của một khángthể khác (kháng thể này mới là kháng thể được gắn với enzyme)

Sơ đồ 2: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA gián tiếp

 Chuyển kháng nguyên đã biết lên bề mặt cứng (được gọi chung là cácđĩa).Kháng nguyên sẽ được cố định trên bề mặt Nồng độ của các mẫukháng nguyên này dùng để thiết lập đường chuẩn cho việc tính nồng độcủa kháng nguyên trong các mẫu chưa biết

 Chuyển các mẫu kháng nguyên chưa biết vào các giếng khác Khángnguyên chưa biết được hòa tan trong cùng một loại dung dịch đệm giốngcác mẫu KNchuẩn

 Thêm dung dịch protein không tương tác (non-interacting protein) nhưalbumin huyết thanh bê (bovine serum albumin) hay casein vào tất cả cácmẫu (kể cả mẫu chuẩn) Bước này được gọi là "blockin" do protein huyếtthanh có tác dụng ngăn cản sự hấp phụ của các protein khác lên bề mặtcủa đĩa Rửa bề mặt đĩa sau đó chuyển kháng thể (biết trước) vào tất cảcác giếng của đĩa Kháng thể sẽ kết hợp với các kháng nguyên đã được cốđịnh mà không kết hợp với protein của huyết thanh

 Thêm kháng thể thứ cấp (secondary antibody), kháng thể thứ cấp sẽ kếthợp với bất kỳ một kháng thể còn dư (bước này có thể được bỏ qua nếukháng thể dùng để phát hiện kháng nguyên đã gắn với enzyme)

 Rửa đĩa, các kháng nguyên gắn enzyme còn dư sẽ được loại bỏ

 Thêm cơ chất Enzyme sẽ làm biến đổi cơ chất làm sản sinh tín hiệuhuỳnh quang hay tín hiệu điện hóa học (enzyme có tác dụng như yếu tốkhuyếch đại)