Nhân nhanh giống in vitro cây mai giảo

chúng tôi tiến hành nghiên cứu “ Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân nhanh giống in vitro cây Mai giảo Thủ Đức (Chaenomeles sp.) ở Quy Nhơn, Bình Định” nhằm tìm ra loại mô, môi trường nuôi cấy thích hợp và các chất kích thích dinh dưỡng cần thiết trong nhân giống in vitro.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUY NHƠN

TRẦN NGUYÊN VĂN

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN NHANH GIỐNG

IN VITRO CÂY MAI GIẢO THỦ ĐỨC

(Ochana sp.) Ở QUY NHƠN

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60.42.01.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS LÊ DỤ

BÌNH ĐỊNH - 2013

MỤC LỤC

Trang phụ bìa

Danh mục các từ viết tắt……… ……… …i

Danh mục các bảng……… …ii

Danh mục các hình ảnh……… ….iv

Danh mục các biểu đồ……… v

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

3.1 Đối tượng nghiên cứu 2

3.2 Phạm vi nghiên cứu 3

4 Cấu trúc của luận văn 3

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3

5.1 Ý nghĩa khoa học 3

5.2 Ý nghĩa thực tiễn 4

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Giới thiệu chung về cây Mai Giảo Thủ Đức 5

1.1.1 Nguồn gốc, vị trí phân loại 5

1.1.2 Đặc điểm sinh học 5

1.1.3 Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô cây Mai Giảo Thủ Đức trong và ngoài nước 10 1.1.4 Kỹ thuật trồng và chăm sóc Error! Bookmark not defined

1.1.5 Giá trị sử dụng của cây Đinh lăng Error! Bookmark not defined

1.2 Công nghệ sinh học đối với nhân giống cây trồng, sự phát triển và bảo tồn các

loại dược liệu Error! Bookmark not defined

1.2.1 Công nghệ sinh học đối với nhân giống cây trồng Error! Bookmark not defined

1.2.2 Công nghệ sinh học đối với sự phát triển và bảo tồn các loại dược liệu,Error! Bookmark not defined

1.3 Kỹ thuật vi nhân giống (micropropagation) 13

1.3.1.Tính toàn năng của tế bào thực vật trong nuôi cây mô,,,,,,,,,,,,,,,, 19

1.3.2 Các bước thực hiện trong kỹ thuật vi nhân giống 16

1.3.3 Các nhân tố trong môi trường nuôi cấy in-vitro 18

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU30 2.1 Đối tượng 30

2.2 Nội dung nghiên cứu 31

2.2.1 Giai đoạn khử trùng mẫu 31

2.2.2 Giai đoạn tạo chồi con in-vitro 32

2.2.3 Giai đoạn nhân nhanh 32

2.2.4 Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh 34

2.2.5 Giai đoạn vườn ươm 36

2.3 Phương pháp nghiên cứu 36

2.3.1 Bố trí thí nghiệm 36

2.3.2 Phương pháp tiến hành Error! Bookmark not defined 2.3.3 Các chỉ tiêu theo dõi 39

2.4 Xử lý số liệu 41

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 43

3.1 Xác định phương pháp khử trùng tốt nhất 43

3.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của Javel 30% ở các mức thời gian khác nhau

đến hiệu quả khử trùng mẫu 43

3.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của Javel và các mức thời gian khử trùng khác

nhau đến hiệu quả khử trùng mẫu Error! Bookmark not defined

3.2 Xác định thành phần môi trường PSHT chồi con in-vitro 49

3.3 Giai đoạn nhân nhanh chồi 53

3.3.1 Xác định công thức môi trường tạo cụm chồi tốt nhấtError! Bookmark not defined

3.3.2 Xác định công thức môi trường nhân cụm chồi tốt nhấtError! Bookmark not defined

3.3.3 Xác định công thức tăng trưởng chồi tốt nhất Error! Bookmark not defined

3.4 Xác định môi trường tạo rễ thích hợp nhất Error! Bookmark not defined

3.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA lên sự hình thành rễError! Bookmark not defined

3.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA lên sự hình thành rễError! Bookmark not defined

3.4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp IBA, NAA và than hoạt tính lên

sự hình thành rễ, Error! Bookmark not defined

3.5 Xác định giá thể thích hợp nhất ra ngôi cây Mai Giảo cấy mô 79

i

Danh mục các từ viết tắt

2,4D : 2,4 Dichlorophenory acetic acid

BA : Benzyl adenine

IAA : β - Indol acetic acid

IBA : β - Indol butyric acid

KIN : Kinetin (6 - Furfurylamino Purine) NAA : α-Naphthalene acetic Acid

MS : Môi trường Murashige & Skoog (1962) Đ/C : Đối chứng

ii

Danh mục các bảng

Số hiệu

3.1 Ảnh hưởng Javel 50% ở các mức thời gian khác nhau đến

3.2 Ảnh hưởng của Javel và các mức thời gian khử trùng khác

3.3 Ảnh hưởng của các loại môi trường khác nhau đến khả

năng tạo chồi con in-vitro của mẫu cấy 43

3.4 Ảnh hưởng của KIN lên khả năng tạo cụm chồi sau 8

3.5 Ảnh hưởng của BA lên khả năng tạo cụm chồi 48

3.6 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và NAA lên khả năng tạo

3.7 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và các auxin khác đến khả

3.8 Ảnh hưởng của BA lên khả năng nhân cụm chồi 58

3.9 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và NAA lên khả năng nhân

3.10 Ảnh hưởng của BA đến khả năng tăng trưởng chồi 62

3.11 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và NAA đến khả năng tăng

3.12 Ảnh hưởng của IBA lên sự hình thành rễ 68 3.13 Ảnh hưởng của tổ hợp IBA, NAA và than hoạt tính

iii

3.14 Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống và sinh trưởng,

iv

Danh mục các hình ảnh

Số hiệu

3.1 Mẫu chồi ngọn và chồi bên cây Đinh lăng sau 30

3.2 Mẫu PSHT và tạo chồi sau 8 tuần nuôi cấy trên môi

3.3 Ảnh hưởng của KIN và BA lên khả năng tạo cụm

3.4 Ảnh hưởng của sự kết hợp BA 3,0 mg/l và NAA lên

3.5 Ảnh hưởng của phối hợp giữa các loại auxin và

cytokinin BA lên quá trình tạo cụm chồi 56

3.6 Ảnh hưởng của BA, NAA lên quá trình nhân nhanh

3.7 Ảnh hưởng của BA và NAA lên quá trình tăng

3.8 Ảnh hưởng của NAA và IBA lên sự hình thành rễ 72

v

Danh mục các biểu đồ

Số hiệu

3.1 Ảnh hưởng của các loại môi trường khác nhau đến khả

năng tạo chồi con in-vitro của mẫu cấy 44

3.2 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và NAA lênkhả năng tạo

3.3 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và NAA lênkhả năng

3.4 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và NAA đến khả năng

3.5 Ảnh hưởng của tổ hợp IBA, NAA và than hoạt tính

3.6 Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống và sinh

Ở Việt Nam, cây Mai vàng 5 cánh (Ochna integerrima) là một loại cây

có hoa đặc trưng từ Huế trở vào Nam được sử dụng để trang trí nhiều trong

ngày tết Hoa mai vàng (Ochna integerrima) có 5 cánh tượng trưng cho năm

thần cát tường là Phúc, Lộc, Thọ, Khang, Ninh Màu vàng của hoa mai tượng trưng cho sự vinh hiển cao sang Ngoài ra, mai miền Nam mang sắc vàng, một màu vàng rực lửa và chói chang của ánh nắng phương Nam

Từ ngàn xưa, Cây mai vàng 5 cánh đã có địa vị trong văn thơ Việt Nam

"Xuân đi trăm hoa rụng, Xuân đến trăm hoa cười

Việc đời qua trước mắt, Già đến trên đầu rồi!

Chớ bảo xuân tàn hoa rụng hết, Ngoài sân đêm trước một cành mai.”

(Thiền sư Mãn Giác , trích Cáo tật thị chúng)

Nó là hình tượng cao quý ẩn dụ cho khả năng tiếp nhận chân lý, tinh thần siêu việt tiềm ẩn trong khả năng của con người

Ngày nay, Con người với nhu cầu chơi hoa, cây cảnh; đặc biệt, Mai vàng ngày càng trở nên phổ biến và đòi hỏi sự đa dạng về màu sắc và hình thái ……… Ở những vùng chuyên trồng mai như Chợ Lách (Bến Tre), Thủ Đức (TP Hồ Chí Minh), Khánh Hòa, Bình Định… việc kinh doanh mai Tết đem lại nguồn thu nhập khá cho các nhà vườn Mặc dù, nhân giống mai có thể thực hiện bằng các phương pháp truyền thống như nhân giống hữu tính, gieo hạt hay nhân giống vô tính bằng cách giâm, chiết hoặc ghép cành, nhưng không tạo ra cây con sạch bệnh, năng suất cao, giữ được phẩm chất cây mẹ Đồng thời, nó còn tốn nhiều thời gian và công chăm sóc, phí vận chuyển

2 Xuất phát từ những yêu cầu cung cấp một lượng lớn cây giống đồng đều trong một thời gian ngắn, giảm chi phí vận chuyển và giữ được phẩm chất giống và sạch bệnh bảo vệ loại cây được xem là quí hiếm và có nguy cơ tuyệt chủng này ở Trung Quốc; Cho nên, việc nghiên cứu và xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây Mai vàng là yêu cầu của thực tiễn, đề tài nghiên cứu

sẽ có nhiều phát hiện mới về khoa học Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên

cứu “ Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân nhanh giống in vitro cây Mai

giảo Thủ Đức (Chaenomeles sp.) ở Quy Nhơn, Bình Định” nhằm tìm ra

loại mô, môi trường nuôi cấy thích hợp và các chất kích thích dinh dưỡng cần thiết trong nhân giống in vitro

2 Mụcđích và nhiệm vụ nghiên cứu

2.1 Mục đích nghiên cứu

Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây Mai giảo Thủ Đức ở Quy Nhơn Nghiên cứu chọn loại mô, môi trường nuôi cấy phù hợp và các chất kích thích sinh trưởng phù hợp với quy trình nhân giống Qua các nghiên cứu

đó rút ra quy trình cho hiệu quả cao nhất, góp phần giải quyết yêu cầu sản xuất giống Mai giảo Thủ Đức ở Quy Nhơn

2.2 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Xác định quy trình nhân giống in vitro cây Mai giảo Thủ Đức

- Tạo nguồn giống cây Mai giảo đồng đều, sạch bệnh phục vụ cho công tác sản xuất giống Mai giảo thương phẩm

- Chủ động trong việc sản xuất khi có nhu cầu lớn

- Góp phần sản xuất một loại cây cảnh phù hợp với nhu cầu thị hiếu của con người

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

3.1 Đối tượng nghiên cứu

Giống cây Mai giảo Thủ Đức (Chaenomeles sp.)

- Giá thể thích hợp của cây con khi ươm ngoài vườn

- Đề tài nghiên cứu từ giai đoạn mô đến giai đoạn phát triển thành cây con và

đưa cây con ra vườn ươm

4 Cấu trúc của luận văn

Gồm các phần như sau:

Mở đầu: gồm 4 trang

- Chương 1 Tổng quan tài liệu: gồm 21 trang

- Chương 2 Đối tượng, phạm vi, nội dung và phương pháp nghiên cứu: gồm 10 trang

- Chương 3 Kết quả và bàn luận: gồm 41 trang

Kết luận và đề nghị: gồm 2 trang

Tài liệu tham khảo: Gồm 4 trang Trong đó có 23 tài liệu tiếng Việt và 12

tài liệu tiếng Anh

Phụ lục

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

5.1 Ý nghĩa khoa học

- Xây dựng quy trình nhân nhanh giống tốt với cây Mai giảo Thủ Đức

(Chaenomeles sp.), bổ sung vào kho tri thức của nhân loại về quy trình nhân

giống in vitro thực vật

- Ứng dụng thành công phương pháp nhân giống tiên tiến phục vụ công tác giống cây trồng tại địa phương

5 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về cây Mai Giảo

1.1.1 Nguồn gốc

1.1.1.1 Phân loại

Giới (regnum): Cây trồng (Plantae)

Bộ (ordo): Sơ ri (Mailpighiales)

Họ (familia): Mai vàng (Ochnaceae)

Chi (genus): Mai vàng (Ochna)

Loài (species): Ochnacea sp

1.1.1.2 Nguồn gốc, phân bố

Khi khảo sát nguồn gốc cây Mai vàng, các nhà khoa học của Viện Nghiên cứu Rau quả và Trường Đại học Nông nghiệp l cũng đều nhận thấy giống mai vàng này đã có cách đây khoảng 800 năm, được phân bố rải rác khắp vùng rừng Yên Tử Chúng tập trung ở 3 khu vực chính; đó là: Khe núi dọc từ chùa Hoa Yên xuống, khu rừng thuộc phường Vàng Danh (TX Uông Bí) và khu rừng thuộc dãy núi xã Tràng Lương, Bình Khê (Đông Triều)

Tại đây, người ta có thể bắt gặp những cây mai cao đến 15 mét, đường kính thân 60-70cm và có rất nhiều cành Theo những nghiên cứu gần đây của Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, thì cây mai vàng Yên Tử và cây mai vàng miền Nam đều thuộc cùng một loài (tên khoa học là Ochna integerrima), đây là loại mai có 5 cánh, lộc màu xanh Cánh hoa có màu vàng tươi rất sáng

và có mùi thơm nhẹ đặc trưng rất dễ chịu

Nói như vậy có nghĩa là Mai vàng có nguồn gốc xuất xứ từ Việt Nam

Cây Mai giảo Thủ Đức được xuất hiện trong quá trình lai tạo hoặc chọn lọc tự nhiên, chọn giống cải tạo dần từ cây Mai vàng 5 cánh tại những nhà vương thuộc quận Thủ Đức , thành phố Hồ Chí Minh

1.1.2 Đặc điểm sinh học

6

1.1.2.1 Mô tả

Mai Giảo là loại cây rụng lá hàng năm, có khả năng sinh trưởng khỏe, ổn định, chống chịu với sâu bệnh tốt Thân có chiều cao trung bình 2-5m, đường kính thân 10-25cm Cành có màu xám nâu, phân nhánh mạnh, chiều dài mỗi long 1 – 3 cm Lá có màu xanh, lá đơn, mọc cách, mặt trên thường bóng Phiến lá bầu dục, to và mỏng, không có lông, gân phụ 8 – 10 cặp, bìa lá có răng cưa nhỏ Kích thước lá 7-19 cm x 3-5,5cm Cuống lá dài 4 – 7 mm Hoa màu vàng rực, có hương thơm nhẹ và thường được trổ 15 ngày sau khi rụng

lá Mật độ hoa dày và lâu tàn Đường kính hoa trung bình 4- 6 cm Hoa có từ

10 -12 cánh, thường là 12 cánh, cếp thành 2 tầng xen kẽ nhau Cánh hoa hình

ô van, dài 1,3 - 2cm, chiều rộng 1-1,4cm Hoa có nhiều nhị, số lượng thay đổi,

có chiều cao từ 0,9 - 1,2cm Nhuỵ thường cao hơn nhị, trung bình 1 - 1,4cm Đài hoa màu xanh, số lượng thay đổi từ 4 - 6, kích thước lá đài 10 - 12 x 6 - 7mm Bầu có 3 – 10 múi, mỗi múi là 1 noãn Quả có có nhiều hạch nhỏ, không cuống, xếp quanh đế hoa, Cây Mai vàng thích hợp trồng ở độ cao 300-1400m so với mực nước biển.[11]

Hoa của cây Mai giảo vàng tươi để tươi có thể cất được tinh dầu thơm, dùng để chữa vết bỏng nước và uống có thể chữa khỏi bệnh ngứa trẻ con Hoa phơi khô dùng để chữa ho, suyễn [24]

1.1.2.2 Đặc tính sinh thái

Loại đất: Mai Giảo là loại cây không kén đất trồng Trong tự nhiên, có có thể sinh trưởng và phát triển ở nhiều vùng đất có tính chất khác nhau như: đất cát, đất cát pha, đất phù sa, đất thịt… Tuy nhiên điều kiện để cây Mai giảo sinh trưởng và phát triển tốt nhất là giữ ẩm, thoát nước tốt, thoáng khí và pH thích hợp

Nhiệt độ: Nhiệt độ thích hợp nhất là 25 – 350C Nếu nhiệt độ quá cao, lá sẽ nhanh bị lão hóa Ngược lại, nếu nhiệt đọ thấp dưới 100C thì cây sinh trưởng phát triển chậm

7 Ánh sáng: Mai Giảo là loại cây ưa sáng Thời gian chiếu sáng phù hợp là

từ 6 – 8 giờ/ngày Nếu thiếu ánh sáng, cây sinh trưởng kém, thân cành yếu, ra hoa ít, cánh hoa mỏng …

Nước, pH: Mai là loại cây ưa nước nhưng không phù hợp với điều kiện ngập úng pH phù hợp là 5,5 – 7

1.1.2.3 Đặc điểm một số loại Mai vàng phân bố trên thế giới

1.1.2.3.1 Đặc điểm một số loại mai vàng ở Việt Nam [36]

a Mai vàng năm cánh (Ochna integerrima): Loài này phân bố nhiều nhất tại những khu rừng thuộc dãy Trường Sơn và các tỉnh từ Quảng Nam, Đà Nẵng cho tới Khánh Hòa; các vùng núi ở đồng bằng sông Cửu Long, cao nguyên

có số lượng ít hơn Mai vàng năm cánh là cây đa niên, gốc to rễ lồi lõm, thân

xù xì, cành nhánh nhiều, lá đơn mọc xen, bìa lá có răng cưa Hoa có năm cánh, màu vàng và có mùi thơm dịu

Ngày nay, dựa vào sự sai khác nhỏ của lá, hoa mà người ta chia mai vàng năm cánh thành từng nhóm nhỏ như: mai sẻ, mai liễu, mai chùm gởi, mai ngự, mai cánh dài, mai lá xoắn…[36]

b Mai núi (Ochna integerrima (lour.); Merr): Cũng là một loại mai rừng nhưng có số lượng cánh nhiều hơn từ 12 cho đến 18 cánh, có khi còn hơn thế nữa Mai này mọc trên những núi đá khô khốc và sống chủ yếu bằng hơi sương, nước mưa và nước ngầm trong lòng đất cộng với khí hậu ẩm thấp của miền núi Loài mai này thường xuất hiện nhiều tại các vùng núi thuộc Tây Nguyên và Campuchia

c Mai Tứ quý (Ochna atropurpurea): Loài mai đặc trưng của vùng Nam bộ Mai này cũng trổ hoa vàng nhưng sau khi cánh hoa rụng đi thì đài hoa còn lại năm cánh màu đỏ với nhụy hoa và các hạt xanh (khi chín hạt sẽ chuyển thành màu đen) Năm cánh hoa màu đỏ cũng tròn trịa và giống hình một đóa hoa mai Do tính chất nở hai lần trên cùng một đóa nên người ta còn gọi mai tứ quý là “nhị độ mai” tức “mai nở hai lần” Mai này trổ bông lác đác quanh

8 năm nên mới gọi là mai tứ quý (xuân, hạ, thu, đông đều trổ hoa) Mai tứ quý thân sần sùi và đen

Mai tứ quý có cây phát triển rất to và cao nhưng đa số là những cây lâu năm Càng lâu năm nhìn nó càng cổ kính và vững chắn

d Mai vàng nhiều cánh: là loại mai vàng có nhiều cánh do lai tạo hoặc chọn lọc tự nhiên, chọn giống cải tạo dần Mai nhiều cánh ở Việt Nam gồm có: Mai giảo Thủ Đức (12 cánh thẳng, 2 tầng cánh); mai 12 cánh Bến Tre (loại hoa chùm, cánh hoa lớn hơn mai giảo Thủ Đức); mai 18 cánh Bến Tranh (3 tầng cánh, cánh hoa hơi nhỏ); mai 12-14 cánh Tư Giỏi (3 tầng cánh); mai Cửu Long 24 cánh (3 tầng cánh); mai cúc Thủ Đức (24 cánh, 3 tầng cánh); mai BB hay mai Ba Bi (24-32 cánh, 3 tầng cánh) rất giống mai cúc Thủ Đức nhưng nhiều cánh và hoa to hơn; mai 24 cánh chín Đợi (hoa vàng rất to, nở thẳng); mai 48 cánh Gò Đen (5-6 tầng cánh); mai 120-150 cánh Bến Tre

Nhìn chung, ở Việt Nam người ta chỉ xác định được tên khoa học của vài loài mai là Ochna integerrima (mai vàng năm cánh); Ochna integerrima (lour.); Merr (mai núi) và Ochna atropurpurea (mai tứ quý) Riêng về mai tứ quý, ngoài tên khoa học Ochna atropurpurea, chúng còn những tên khác là Ochna atropurpurea DC, Ochna serrulata hay Ochna integerrima (theo cách gọi của Thái Lan) Tất cả những loài mai khác, kể cả mai giảo và mai ghép nhiều cánh, đều chưa có tên khoa học

1.1.2.3.2 Các loài hoa mai vàng (hoàng mai) trên thế giới được bao gồm:

a Mai vàng Campuchia

Loài mai này có tên khoa học là Ochna integerrima (lour.)Merr Hoa

thường có 5 đến 9 cánh, khi nở tối đa những cánh hoa úp ngược về phía cuống Màu hoa hơi vàng tái Loài này còn được tìm thấy ở Việt Nam Chúng

là loài cây hoang dã mọc trong rừng ở miền Nam và miền Trung, phân bố từ nơi khô cằn cát nóng cho tới chỗ ven sông râm mát Mai vàng Campuchia thuộc dạng thân gỗ, nhánh gầy mảnh và dài, lá đơn màu xanh nhạt bóng Mọc

9 thưa trên cành, mép lá có răng cưa nhỏ Hoa mọc thành chùm ở nách lá Cuống hoa ngắn, đài hoa xanh bóng không che kín nụ Nhìn chung, loài này ở Campuchia hay Việt Nam đều đã được nâng cấp số lượng cánh lên rất nhiều Ngày nay, người ta có thể nhìn thấy loài này có hoa 40 cánh trở lên Và không chỉ có màu vàng, mà còn có thêm màu trắng hoặc màu đỏ

b Mai vàng Nam Phi

Nam Phi có khoảng 12 loài mai vàng thuộc chi Ochna, bao gồm dạng

cây lẻ và cây bụi, trong đó có hai loài phổ biến là: Ochna pretoriensis (magalies plane) và Ochna pulchra (peeling plane) Hai loài này xuất hiện rộng khắp vùng đồi thuộc Koppie Loài Ochna pulchra cao khoảng

7m, vỏ cây thường bị tróc ra, lá dễ rụng Chúng mọc hoang dã trong rừng, vỏ cây màu xám nhạt, xù xì ở phần gốc Phần trên của thân cây vỏ bị tróc lộ ra màu trắng kem nhạt Gỗ cây ít được sử dụng vì giòn và dễ gãy Loài này có hai loại màu hoa: màu vàng và màu hồng

Ở Nam Phi còn có những loài mai vàng khác, có tên khoa học là Ochna serrulata, Ochna multiflora, Ochna tropurpurea Người nước ngoài gọi

chúng là Mickey Mouse Plant, Bird’s Eye Bush, Small-leaved plant và Carnival bush Chúng khá giống với mai tứ quí Việt Nam

c Mai vàng Myanma

Ở đất nước này, có loài mai vàng Ochna serrulata, giống như mai ở

Nam Phi, tuy nhiên, hình thức hoa có khác đôi chút ở chỗ cánh bẹt hoặc có bầu noãn đỏ tồn tại khá lâu trước khi hoa rụng

d Mai vàng Indonesia

Những loài này có tên khoa học là Ochna kirkii Oliv,; Ochna serrulata (Hochst.) Walp Và Ochna serrulata Chúng đều có nguồn gốc ở

Nam Phi, tuy nhiên kích thước lớn hơn Có loài nở hoa vào mùa xuân và mùa

hè hoặc nở quanh năm

e Mai vàng Madagascar

10

Ở Madagascar có loài mai vàng Ochna greveanum với 5 cánh tròn,

dúm giống như mai cánh dúm ở Việt Nam, lá dài và rủ xuống từng chùm

f Mai vàng Châu Phi

Có một loài mai phân bố rải rác khắp những nước nhiệt đới ở châu Phi Chúng có 5 cánh hoa màu vàng như ở Việt Nam, song lại khác tên khoa học,

đó là loài Ochna thomasiana, thuộc dạng cây bụi Lá hình oval, đầu lá bén,

dài khoảng 10cm Hoa nở rộ trên cành vào mùa xuân, song đôi khi cũng bất chợt nở vào mùa hè với số lượng hoa ít hơn Cánh hoa dài khoảng 2cm Đài hoa bung rộng và trở thành màu đỏ tía, bên trong có trái non màu xanh, khi già màu đen Chúng có tên tiếng Anh là Mickey Mouse bush và bird’s eye bush

1.1.2.2 Thành phần hóa học và công dụng của cây Mai

Trong thành phần hóa học, hoa mai chứa nhiều tinh dầu như cineole, borneol, linalool, benzyl alcohol, farnesol, terpineol, indol và một số chất khác như meratin, calycanthine, caroten Nghiên cứu hiện đại cho thấy, hoa mai có tác dụng thúc đẩy bài tiết dịch mật, ức chế một số loại vi khuẩn như coli, trực khuẩn lỵ, trực khuẩn thương hàn,

phẩy khuẩn tả, trực khuẩn lao

Theo dược học cổ truyền, hoa mai vị

ngọt hơi đắng, tính ấm, không độc, có công

dụng giải thử sinh tân, khai vị tán uất, hóa

đàm, thường được dùng để chữa các chứng

bệnh như sốt cao phiền khát, tức ngực, ho,

hầu họng sưng đau, bỏng, lao hạch, chán

ăn, chóng mặt Các y thư cổ như Bản thảo

cương mục, Bản thảo nguyên thủy, Bách thảo kính, Bản thảo tái tân, Cương mục thập di, Thực vật nghi kỵ đều đã ghi lại nhiều phương thuốc có dùng

Hoa mai

11 hoa mai với những kiến giải khá sâu sắc Có thể dẫn ra một số ví dụ cụ thể như sau:

- Trúng thử gây tâm phiền, đau dầu, chóng mặt: (1) Hoa mai 9g sắc uống hoặc phối hợp hoa mai với hoa biển đậu và lá sen tươi lượng vừa đủ, sắc uống (2) Hoa mai 15g, hoa cúc trắng 15g, hoa hồng 15g, hãm uống thay trà

- Tăng huyết áp, cơn đau thắt ngực: Hoa mai 3g, thảo quyết minh 10g hãm với nước sôi trong bình kín, sau 15 phút thì dùng được, uống thay trà trong ngày

- Mai hạch khí, đau dạ dày, viêm gan và xơ gan mức độ nhẹ: Hoa mai 5g đem ninh với 100g gạo tẻ thành cháo, chế thêm đường trắng, chia ăn vài lần trong ngày Mai hạch khí là chứng cảm thấy trong họng có vật gì đó gây

bế tắc, thổ không ra, nuốt không trôi nhưng không gây trở ngại cho việc ăn uống Với chứng bệnh này người ta còn dùng hoa mai 12g, hoa quế 3g, trà 20g, ba thứ trộn đều, chia làm 3 lần hãm uống thay trà

- Chướng bụng, đầy hơi: Hoa mai 10g, mộc hương 10g, hương phụ 15g, sắc uống

- Đau bụng do lạnh: Hoa mai và chu sa liên lượng bằng nhau, sấy khô, tán bột, uống mỗi lần 3 - 6g với rượu nhạt

- Nấc: Hoa mai 5g, tai hồng (thị đế) 5 cái, gừng tươi 3 lát, gạo tẻ 100g Đem gừng tươi và thị đế sắc kỹ lấy nước, bỏ bã rồi cho gạo vào nấu thành cháo, khi chín thì cho hoa mai vào, đun sôi vài dạo là được, chia ăn vài lần trong ngày

- Nôn: Hoa mai 5g, nước cốt gừng tươi 5ml Đem hoa mai hãm với nước sôi trong bình kín, sau chừng 20 phút là dùng được, chắt ra hòa thêm nước gừng tươi rồi uống, mỗi ngày dùng 2 thang

- Viêm họng, viêm amydal cấp tính: (1) Hoa mai 6g, huyền sâm 9g, bản lam căn 9g, sắc uống (2) Hoa mai 15g, kim ngân hoa 15g, thạch cao 15g,

12 huyền sâm 9g, sắc uống (3) Hoa mai 9g hãm với nước sôi trong bình kín, uống thay trà trong ngày

- Viêm họng mạn tính: (1) Hoa mai 6g, hoa dành dành 5g, trà 20g Ba thứ trộn lẫn chia làm 2 lần hãm với nước sôi uống thay trà, mỗi ngày 1 thang (2) Hoa mai và hoa ngọc trâm lượng vừa đủ đem nấu với 60g gạo tẻ thành cháo, chia ăn vài lần trong ngày, mỗi ngày 1 thang

- Ho dai dẳng: (1) Hoa mai 9g hãm uống thay trà trong ngày (2) Hoa mai 10g, khoản đông hoa 10g, gạo tẻ 60g, tất cả đem ninh thành cháo, chế thêm một chút mật ong, chia ăn vài lần trong ngày

- Mất nước nhiều do thử nhiệt gây phiền khát, tức ngực: Hoa mai 10g,

lá sâm 10g, cam thảo 10g, mạch môn 15g, hoắc hương 6g, sắc uống

- Chứng chán ăn do thử nhiệt: Hoa mai 10g, lá sen 50g, hãm với nước sôi uống thay trà trong ngày

- Tức ngực, khó thở: Hoa mai 10g, đan sâm 10g, qua lâu 15g, sắc uống trong ngày

- Đau khớp do phong thấp: Hoa mai 9g, thạch nam đằng 9g, thố nhĩ phong 9g, đam ngâm với 200ml rượu, mỗi lần uống 30 - 50ml

- Viêm kết mạc cấp tính: Hoa mai 6g, cúc hoa 9g sắc kỹ rồi hòa thêm một chút mật ong uống

- Tổn thương do trật đả: Hoa mai 9g, lá liễu 9g, quá sơn long 9g, đem ngâm với 250ml rượu trắng, mỗi ngày uống 2 lần, mỗi lần 50ml

- Vết thương chảy máu: Hoa mai 10g đem sao tồn tính rồi tán thành bột rắc vào vết thương

- Viêm loét môi và niêm mạc miệng: Hoa mai tươi lượng vừa đủ đem giã nát với đường trắng rồi vắt lấy nước bôi vào tổn thương

- Loa lịch (lao hạch): Hoa mai lượng vừa đủ, trứng gà 1 quả Dùng dao nhọn chích một lỗ nhỏ ở quả trứng rồi nhét hoa mai vào trong, đem hấp cách thủy cho chín rồi ăn, mỗi ngày 1 lần, 7 lần là một liệu trình

1.1.3 Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô cây Mai vàng trong và ngoài nước

Trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng chỉ có một vài công trình nghiên cứu cây Mai vàng bằng phương pháp cấy mô bước đầu được thực hiện và cho kết quả Vì vậy, cây Mai vàng là đối tượng mới của việc nghiên cứu nhân nhanh giống bằng phương pháp nuôi cấy mô ở nước

ta.

1.3 Nhân giống cây trồng bằng kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào (micropropagation)

1.3.1 Cơ sở lí luận của nuôi cấy mô, tế bào thực vật

Nuôi cấy mô thực vật (hay còn gọi là nuôi cấy thực vật in- vitro) là quá trình nhân giống vô tính thực vật trong ống nghiệm Nuôi cấy mô thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các kỹ thuật nuôi cấy các bộ phận khác nhau (tế bào, mô, cơ quan) thực vật trong môi trường nhân tạo dưới điều kiện vô trùng

Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào in vitro dựa trên cơ sở lý luận khoa học về tính toàn năng (totipotence)và khả năng phân hóa, phản phân hóa của tế bào Cuối thế kỷ 19 nhà bác học người Đức Haberland

14 G.(1902) là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cây mô tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào Theo ông, mỗi tế bào của bất kỳ cơ thể sinh vật nào đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của cả sinh vật đó, vì vậy khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh [42]ưNăm 1922, Kotte và Robbins đã thành công trong việc nuôi cấy đầu rễ cây ngo trong 12 ngày trên môi trường lõng có chứa đường Glucozơ, muối khoáng và thu được hệ rễ nhỏ [43]

Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ hai trong lịch sử nuôi cấy mô thực

vật, khi White nuôi cấy thành công đầu rễ cà chua (Lycopersicum esculentum) trong một môi trường lỏng chứa muối khoáng, glucose và

nước chiết nấm men Sau đó White chứng minh rằng có thể thay thế nước chiết nấm men bằng hỗn hợp 3 loại vitamin nhóm B: thiamin (Bl), pyridoxin (B6) và nicotinic axit (P-P) Từ đó việc nuôi cấy đầu rễ đã được tiến hành trên nhiều loại cây khác nhau

Năm 1958 - 1959, tính toàn năng của tế bào đà được khẳng định bằng công trình nghiên cứu của Stewart và Reiner (1958) trên mô rễ cây cà rốt Các tác giả này đã nuôi cấy mô rễ cà rốt trên môi trường đặc có nước dừa và đã thu nhận được khối mô sẹo gồm các tế bào nhu mô Khi chuyển mô sẹo này sang môi trường lỏng có cùng thành phần và nuôi lắc thì nhận được huyền phù gồm các tế bào riêng lẽ và các nhóm tế bào Tiếp tục nuôi cấy trên môi trường lỏng, không cấy chuyển thì thấy

hình thành rễ

Năm 1965, Vasil và Hildebrant đã nuôi từng tế bào riêng biệt của cây thuốc lá và tạo thành cây thuốc lá hoàn chỉnh trong ống nghiệm Kết quả này chứng minh toàn diện tính toàn năng của tế bào [42]

Ngày nay bằng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta đã nhân giống và phục tráng hàng loạt các giống cây trồng có giá trị như khoai

15 tây, thuốc lá, dứa, lan, các cây lương thực, cây ăn quả, cây lâm nghiệp Việc nhân giống này đã trở thành công nghệ và đã được áp dụng ở nhiều nước trên thế giới [25], [33], [35]

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô thực vật thực chất là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa Tất cả các tế bào trong các cơ quan khác nhau của cơ thể thực vật trưởng thành đều bắt nguồn từ tế bào phôi sinh Sự chuyển hóa tế bào phôi sinh thành các tế bào chuyên hóa để đảm nhiệm chức năng khác nhau gọi là sự phân hóa

tế bào, Quá trình phản phân hóa là quá trình các tế bào đã phân hóa thành mô chức năng nhưng không hoàn toàn mất đi khả năng phân chia

mà khi ở điều kiện thích hợp chúng sẽ trở về dạng phôi sinh và tái phân chia

Quá trình này có thể tóm tắt như sau:

Tế bào phôi sinh

Phân hóa tế bào

Phản phân hóa tế bào

Tế bào dãn Tế bào chuyên hóa

16 Bản chất của quá trình này là một quá trình hoạt hóa, ức chế gen Trong quá trình phát triển cá thể, ở từng thời điểm nhất định đều có một số gen nhất định được hoạt hóa cho tính trạng mới, một số gen khác lại bị ức chế hoạt động Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc phân tử ADNcủa mỗi tế bào khiên quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hòa Mặt khác, trong khối mô bình thường tế bào luôn bị chi phối bởi các tế bào xung quanh Khi tế bào được tách riêng rẽ, tác dụng ức chế của các tế bào xung quanh không còn nữa thì các gen được hoạt hóa và quá trình phân hóa xảy ra theo một chương trình định sẵn [42],[40]

1.3.2 Quy trình nhân giống in vitro

Theo Debergh (1991) [31] thì quy trình nhân giống được chia làm 5 giai đoạn:

1.3.2.1 Lấy mẫu và xử lý mẫu

Đây là giai đoạn quan trọng quyết định trong nhân giống in vitro Khả năng nhiễm bệnh của mẫu phụ thuộc vào: đặc điểm sinh trưởng phát triển của cây lấy mẫu, thời điểm lấy mẫu, cách lấy mẫu, xử lý mẫu trong điều kiện khử trùng Mỗi cây đều có ngưỡng nhiệt độ và độ ẩm phù hợp khi bảo quản và xử lý mẫu Với cây nhiệt đới và á nhiệt đới thì nhiệt độ 250C, độ ẩm 75% là điều kiện giữ mẫu thích hợp, tỷ lệ nhiễm bệnh thấp (Debergh và Zimmerman, 1991) [31]

1.3.2.2 Tái sinh mẫu nuôi cấy

Mục đích của giai đoạn này là tái sinh các cơ quan từ mẫu nuôi cấy Mẫu thường là chồi đỉnh, chồi nách hay lát cắt đốt thân tùy thuộc đối tượng và mục đích nghiên cứu Quan trọng nhất là cần chú ý đến trạng thái sinh lý của mẫu Khả năng thành công của nuôi cấy mô, tế bào phụ thuộc chủ yếu vào trạng thái tuổi của tế bào, càng gần trạng thái phôi sinh bao nhiêu thì nuôi cấy càng có khả năng thành công bấy nhiêu

17 Như vậy, tế bào phôi thường có triển vọng nhất rồi đến tế bào đỉnh sinh trưởng đang hoạt động (đỉnh ngọn, đầu rễ), sau đó là tế bào ở trạng thái ngủ nghỉ (chồi nách)

1.3.2.3 Nhân nhanh chồi

Đây là giai đoạn cốt lõi quyết định đến sự thành công trong nuôi cấy in-vitro Có 3 cách thường được sử dụng trong vi nhân giống: Thông qua callus, sự hình thành chồi bất định và chồi nách (Bhojwani và cs., 1996) Môi trường trong giai đoạn này có bổ sung thêm chất điều hòa sinh trưởng (ausin, cytokinine); mỗi loại cây thích hợp với liều lượng chất điều hòa sinh trưởng nhất định, tăng thời gian chiếu sáng 16h/ngày

và cường độ chiếu sáng là 1000 lux Ánh sáng tím là thành phần kích thích phân hóa mạnh Nhiệt độ thích hợp là 25 – 300C Ví dụ, trên cây

dâu tây Fragaria xanasa, tốc độ nhân nhanh chồi đạt kết quả tốt nhất khi

bổ sung vào môi trường MS các chất điều tiết sinh trưởng BA (4,0 µM)

và NAA (0,1 µM) sau 60 ngày nuôi cấy Nhưng khi bổ sung vào môi trường nồng độ BA cao hơn 4,0 µM cùng với 0,1 µM NAA sẽ làm cho chồi sinh trưởng không tốt và chất lượng chồi xấu, do đó tốc độ nhân nhanh cũng giảm (Bhojwani và Razdan, 1983)

1.3.2.4 Sự hình thành rễ

Sự hình thành rễ của nhiều loài cây có thể không cần bổ sung thêm chất điều tiết sinh trưởng (Saxena và cs., 1998) Rễ của nhiều loài cây có thể được hình thành dễ dàng khi nồng độ các muối khoáng giảm đi một nữa hoặc giảm hơn, và nồng độ đường giảm từ 2 hoặc 3% đến 0,5% (Webb và Street, 1977) Theo Indra D Bhatt và Uppeandra Dhar khi nghiên cứu ảnh hưởng của auxin

(IBA, NAA) lên sự hình thành rễ của loài Fragaria xanasa, cây ra rễ tốt nhất

khi sử dụng NAA với liều lượng thấp (0,1 mg/l)

Rễ của một số loài cây có thể được hình thành dễ dàng hơn khi bổ sung thêm auxin, than hoạt tính vào môi trường, đôi khi có bổ sung thêm cytokinin

18 Than hoạt tính làm nâng cao sự phát triển của rễ khi rễ đầu tiên vừa được hình thành (Marthur và cs., 1999) Sự phát triển của rễ tốt hơn khi trong môi trường có chất hút các chất ức chế ra rễ hoặc làm giảm mức độ chiếu sáng bằng cách bổ sung than hoạt tính (Druart và Cs., 1993; George và Sherrington, 1984)

Sự phát triển sung mãn của hệ rễ của cây con trong nuôi cấy in-vitro là điều kiện thiết yếu cho sự phát triển tốt của cây con trong điều kiện nhà kính

và trên đồng ruộng

1.3.2.5 Đưa cây in-vitro ra đất

Ở giai đoạn này cây con vừa mới được chuyển từ môi trường bên trong phòng thí nghiệm ra bên ngoài Vì vậy, chúng ta cần phải huấn luyện cho cây con thích nghi với điều kiện của môi trường bên ngoài, đồng thời thay đổi những đặc điểm sinh lý và giải phẩu của cây con

1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô thực vật

1.3.3.1 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy

Có hơn 50 công thức môi trường khác nhau được sử dụng cho nuôi cấy

in-vitro nhiều loại cây khác nhau (Gamborg và cộng sự, 1976; Huang và

Murashige, 1977) Trong đó môi trường MS được sử dụng phổ biến nhất, tuy nhiên có nhiều cải biến khác nhau bằng sự thay đổi thành phần các vi lượng (Chand và cs., 1977; Jha và Sen, 1985; Rout và cs., Saxena và cs., 1988), Môi trường dinh dưỡng bao gồm các loại muối vô cơ, nguồn cacbon, vitamin và chất điều tiết sinh trưởng, Một số thành phần khác có thể được bổ sung thêm như nitơ vô cơ, acid vô cơ và chất chiết cây trồng (Gamborg, 1986)

Các muối khoáng được sử dụng như là thành phần của môi trường nuôi cấy mô tế bào Hầu hết các môi trường chứa ít nhất 30mM nitơ vô cơ và kali

vô cơ Muốiamonium có thể được sử dụng từ 2-20mM Ảnh hưởng của muối amonium có thể thay đổi từ ức chế đến hiệu quả, Nồng độ Ca, SO4, photphat

1.3.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ đường

Các mẫu nuôi cấy mô thực vật nói chung sự quang hợp thường bị hạn chế do thiếu clorophin, nồng độ CO2 và nhiều điều kiện khác… vì cậy, cần

bổ sung nguồn cacbon vào thành phần môi trường nuôi cấy Đường vừa là nguồn cacbon cung cấp cho mẫu nuôi cấy, đồng thời tham gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu của môi trường Đường đóng góp 50 – 70% vào khả năng thẩm của môi trường [12 de tài]

Loại hydratcacbon được sử dụng phổ biến là đường saccarozo với hàm lượng 6% (W/w) nhưng nồng độ này có sự thay đổi ở từng đối tượng khác nhau Những loại đường khác nhau như; fructozo, glucozo, maltozo, lactozo, rafinozo… chỉ dung trong trường hợp cá biệt Theo Mulberry Bud, fructozo cho kết quả tốt hơn các loại đường khác trong nuôi cấy chồi dâu tằm

Hàm lượng đường thấp được sử dụng trong nuôi cấy tế bào trần, ngược lại hàm lượng đường cao hơn dung cho nuôi cấy hạt phân, phôi…[44]

Sự hình thành rễ đòi hỏi một lượng đường được cung cấp từ quang hợp hoặc ngoại sinh vì thực chất sự ra rễ là môt quá trình hô hấp Ở hầu hết các loại thực vật khi ra rễ thích hợp với lượng đường 20 – 30g/ lít [21]

1.3.3.3 Các chất điều tiết sinh trưởng

Các chất diều hòa sinh trưởng là thành phần không thể thiếu trong môi

trường nuôi cấy, có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực

20 vật in vitro Hiệu quả tác động của chất điều hòa sinh trưởng phụ thuộc vào: nồng độ sử dụng, hoạt tính vốn có của chất điều hòa sinh trưởng, mẫu nuôi cấy [43]

Ở nồng độ thấp thì chúng kích thích sinh trưởng nhưng ở nồng độ cao lại ức chế sinh trưởng Ba nhóm chất điều khiển sinh trưởng điển hình: Ausin, Cytokinine, Gibberellin Tuy nhiên, trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật thưởng sử dụng hai nhóm chất chính là Ausin và Cytokinine [18]

Ausin là chất điều hòa sinh trưởng do Went và Thimann (1939) phát hiện, chủ yếu kích thích sinh trưởng của tế bào nhưng cũng làm tăng phân bào[dt 13} Các chất thuộc nhóm Ausin thường được sử dụng là IAA, IBA, α-NAA và 2,4D IAA ít được sử dụng do kém bền với nhiệt và ánh sáng, do vậy những môi trường nghiên cứu thì nồng độ IAA khá cao: 1,0 – 30mg/l (Dodds and Roberts, 1999) Các chất Auxin này can thiệp vào nhiều hiện tượng sinh

lý của mô nuôi cấy, kích thích sinh trưởng của mô, hoạt hóa sự hình thành rễ hoặc thúc đẩy sự phân chia mạnh mẽ của tế bào dẫn đến sự hình thành mô sẹo (callus) Thông thường, sử dụng Auxin trong nuôi cấy lúc đầu ở nồng độ cao, sau đó nồng độ thấp 0,1 – 2,0 mg/l để tránh tình trạng nhiễm độc [43]

Cytokinine được Skoog phát hiện lần đầu tiên (1950) trong khi thí nghiệm chiết suất axit nucleic Chúng là những cấu tử của axit nucleic phân hủy thành Cytokinine có tác dụng kích thích phân bào mạnh Ba chất thường dung trong nuôi cấy mô tế bào là Kinetin, BAP và Zeatin Trong đó, Zeatin được sử dụng nhiều nhất nhưng ít được dung vì quá đắt BAP là sản phẩm tổng hợp nhân tạo Hoạt lực của BAP cao hơn nhiều so với kinetin và bản thân BAP bền vững hơn Zeatin với tác động của nhiệt độ cao Những chất này thích thích sự phát sinh chồi nuôi cấy, nếu xử lý phối hợp cùng Auxin với tỉ lệ nồng độ thích hợp sẽ kích thích quá trình phân chia tế bào Hàm lượng sử dụng Cytokinine thường dao động từ 0,1 – 2,0 mg/l Ở nộng đô cao hơn, cytokinine có

21 tác dụng kích thích sự hình thành chồi bất định đồng thời ức chế sự hình thành rễ của chồi nuôi cấy

Gibberellin có tác dụng kích thích sự tăng trưởng của đỉnh sinh trưởng, cảm ứng sự kéo dài của thân, thúc đẩy sự hoạt động của các phôi sinh dưỡng, phôi ngủ của hạt, chồi; kích thích ra hoa của cây ngày dài trong điều kiện ngày ngắn GA3(Gibberellic axit) là loại gibberellin được sử dụng thường xuyên nhất Tuy nhiên, GA3 rất mẫn cảm với nhiệt độ, nó dễ bị mất hoạt tính sinh lý tới 90% sau khi hấp vô trùng, đồng thời, sự tác động của gibberellins đến các tế bào nuôi cấy in vitro không rõ rệt.[19], [43],[42]

1.3.3.4 Ảnh hưởng của than hoạt tính

Than hoạt tính được bổ sung vào môi trường ở các giai đoạn khác nhau của quá trình nuôi cấy in- vitro Than hoạt tính không phải là chất điều tiết sinh trưởng, mà đóngvai trò như là chất hút ẩm của môi trường Than hoạt tính có khả năng hấp thụ một số chất không có lợi cho sự phát triển của cây như các chất được sản sinh ra trong quá trình khử trùng môi trường nuôi cấy hoặc một số chất do cây trồng tiết ra hút thấm các thành phần không sạch của Agar, hút thấm hoặc giải phóng chất điều hòa sinh trưởng, ảnh hưởng đến pH của môi trường, xúc tác làm bẻ gãy đường saccharose trong khử trùng, làm đen môi trường Điều tra về hoạt tính của than hoạt tính trong quá trình khử trùng và sự thủy phân đường trong môi trường nuôi cấy cho thấy: sau khử trùng , ở môi trường MS + 5 % Saccharose tỷ lệ đường thủy phân là 70%, tỷ lệ tương ứng ở môi trường Gamborg là 56% , còn môi trường không than hoạt tính là 20% Khả năng kích thích sự tăng trưởng của tế bào mô thực vật là do than hoạt tính kết hợp với các chấy phenol độc do mô tiết

ra trong suốt thời gian nuôi cấy Tuy nhiên đôi lúc than hoạt tính cũng đóng vai trò như chất điều tiết sinh trưởng (Ebert và cs., Eymar và cs.,

22 2000; George và Sherrington, 1984) Bổ sung thêm than hoạt tínhvào môi trường có thể có lợi cho việc hình thành rễ của cây do than hoạt tính có tác dụng hạn chế mức độ chiếu sáng hoặc than hoạt tính có khả năng hấp thụ các chất ức chế sự ra rễ có trong môi trường nuôi cấy (Dumas và cs.,1995; George và Skerrington, 1998) [21], [15]

1.3.3.5 Ảnh hưởng của vô trùng mẫu cấy

1.3.3.5.1 Ảnh hưởng của lựa chọn mẫu cấy

Mẫu được dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể là chội ngọn, chồi beenm phiến lá, cuống lá… các cấu trúc của phôi (lá mầm, trụ lá mầm…) các cơ quan dự trữ ( củ, căn hành…) Tùy sự tiếp xúc với môi trường

mà mẫu thực vật có chứa ít hay nhiều mầm bệnh ( vi khuẩn, nấm…) cụ thể: những cấu trúc thực vật được bao kín ( lá mầm, phôi, mô thịt trong quả…) mô non trẻ, bộ phân ở vị trí cao trên cây thường không chứa hoặc chứa ít vi sinh vật hoặc mầm bệnh; Ngược lại, những mô và cơ quan tiếp xúc với đất, nước (rễ, củ, thân ngầm) thường chứa lượng vi sinh vật rất cao và rất khó loại bỏ Ngoài ra, sự sinh trưởng phát triển của mẫu cấy còn phụ thuộc vào mùa trong năm: mùa xuân hay đầu mùa hè thuận lợi cho việc lấy mẫu cấy.[43]

1.3.3.5.2 Ảnh hưởng của phương pháp vô trùng mẫu cấy

Việc khử trùng mẫu trước khi đưa vào môi trường cấy là vấn đề cần thiết vì mẫu cấy ở trong tự nhiên tiếp xúc với môi trường xung quanh nên mang nhiều vi khuẩn, nấm… Tuy nhiên, mức độ nhiễm của mỗi loại mẫu khác nhau và đặc điểm của từng loại mẫu cũng khác nhau nên cần thử nghiệm

về phương pháp và hóa chất khử trùng mẫu cấy nhằm tìm ra phương pháp vô trùng tốt nhất và ít tốn nguyên liệu ban đầu

Hiệu quả khử trùng phụ thuộc vào loại hóa chất khử trùng, nồng độ, thời gian xử lý và mức độ xâm nhập của chất khử trùng vào các kẽ, những phần gồ gề trên bề mặt mô nuôi cấy Để làm tăng hiệu quả người ta thường nhúng những mẫu vào Ethanol 70% trong 30 giấy để làm tăng sức căng bề

23 mặt mẫu rồi mới khử trùng bằng dung dịch khử trùng[dt9] Theo Street, 1974; Narayanaswamy S.,1994; Dods J.H and Robert L.Uw, 1999, các dung dịch thường được sử dụng trong xử lý mẫu cấy[ sltv]:

Thủy ngân clorua HgCl2 0,1 – 1%(W/w) 2 – 10 Trung bình

Đối với các mẫu quá bẫn, việc rữa kỹ bằng nước xà phòng và để dưới vòi nước chảy từ 20 – 30 phút sẽ có tác dụng loại bỏ đáng kể hệ vi khuẩn khỏi mẫu cấy [dt30]

Thời gian khử trùng là một điều kiện quan trọng , nó phụ thuộc vào từng loại dung dịch khử trùng, đặc điểm của từng loại mẫu cấy Ví dụ, cây

Huệ hương (Polianthes tuberose L.) mẫu cấy được khử trùng tốt nhất với

HgCl2 0,1% với thời gian 15 phút hoặc với Ca(ClO)2 15% với thời gian 20 phút [11]

Nếu thời gian khử trùng quá dài, dung dịch khử trùng xâm nhập sâu vào trong mẫu cấy có thể gây chết mẫu, hoại tử; Ngược lại, thời gian quá ngắn sẽ không loại bỏ hết nấm và vi khuẩn nên mẫu sẽ bị nhiễm

Để đạt hiệu quả cao trong khử trùng cho một số mẫu nuôi cấy người ta không chỉ sử dụng một loại hóa chất mà sử dụng phối hợp nhiều loại đã cho kết quả khả quan [17]

Sau khi khử trùng thu được nguồn nguyên liệu vô trùng, các mẫu cấy được chuyển sang các môi trường có bổ sung các chất kích thích sinh trưởng

24

để thực hiện giai đoạn nhân nhanh Năng suất nhân nhanh phụ thuộc vào quá trình tác động của các chất kích thích sinh trưởng

1.3.3.6 Ảnh hưởng của điều kiện ra cây

Đây là giai đoạn quan trọng nhằm đưa cây nuôi cấy ra ngoài điều kiện

tự nhiên, huấn luyện cây thích nghi với điều kiện nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng tự nhiên và chuyển từ chế độ dị dưỡng sang chế độ tự dưỡng Đối với một số cây

có thể chuyển chồi chưa có rễ ra đất nhưng với đa số các loài cây thì chỉ sau khi chồi ra rễ và tạo thành cây hoàn chỉnh mới được chuyển ra vườn ươm cây con Quá trình thích nghi dần với điều kiện ngoauf vườn ươm cây con cần chăm sóc đặc biệt

- Cây được trồng trong điều kiện bảo vệ và cung cấp đủ đọ ẩm bằng cách tưới phun sương

- Giá thể trồng có thể là đất bùn, đất cát hoặc các hỗn hợp nhân tạo không chứa đất

- Các chất dinh dưỡng bổ sung thường ở dạng dung dịch phun qua lá Khi xác định được toàn bộ công thức và các yếu tố cần thiết cho nuôi cấy thì

có thể tạo ra một quy trình sản xuất cây giống với quy mô công nghiệp hợp lý

1.3.3.7 Ảnh hưởng của các yếu tố khác

1.3.3.7.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào và quá trình trao đổi chất trong mô Yêu cầu về nhiệt độ cho sinh trưởng và phát triển ở các loài thực vật không giống nhau Thực tế nuôi cấy trong phòng thí nghiệm thì nhiệt độ được duy trì, ít biến đổi, thường là 25 ±10C Theo Shigenobu và Sakamoto (1981), nhiệt độ cũng như thời gian chiếu sáng ngày đêm phải không biến đổi trong suốt thời gian nuôi cấy Nhiệt độ thấp sẽ ảnh hưởng rõ rệt: nếu xử lý bao phấn lúa ở 40

C thì hiệu suất tạo mô sẹo tăng lên Ngoài ra, nhiệt độ thấp hoặc rất thấp còn được sử dụng làm chậm hay làm

25 ngừng hẳn sinh trưởng của mẫu nuôi cấy nhằm mục đích bảo quản giống ở điều kiện in vitro [42]

Nhiệt độ cũng có tác động qua lại tương hổ với cường đọ ánh sáng, chu kỳ chiếu sáng và những chất thêm vào môi trường nuôi cấy

1.3.3.7.2 Ảnh hưởng của ánh sáng

Ánh sáng là nhân tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phân hóa mô và hình thái của cây Các chỉ tiêu cần chú ý: cường độ ánh sáng, chu kì chiếu sáng và chất lượng ánh sáng (Read, 1990; Dooley, 1991) Cường độ chiếu sáng ảnh hưởng đến quá trình sinh lý, inh trưởng và sự hình thành các cơ quan của mô cấy Theo Murashege (1977), cường độ ánh sáng từ 1000- 2500 lũ được dung phổ biến cho nuôi cấy nhiều loại mô Với cường độ ánh sáng lớn hơn thì sinh trưởng chồi chậm lại nhưng sẽ thúc đẩy quá trình tạo rễ

Chu kì chiếu sáng cũng ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình nuôi cấy Tuy nhiên, nghiên cứu thực tế người ta nhận thấy khó có sự tách biệt ảnh hưởng của chu kỳ chiếu sáng ra khỏi ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng Đối với nhiều loài, thời gian chiếu sáng tốt nhất trong nuôi cấy là 12 – 16 giờ/ngày Chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình sinh trưởng của mô cấy và có liên quan đến sự thay đổi nồng độ hoocmon nội sinh

1.3.3.7.3 Ảnh hưởng của pH

pH của môi trường nuôi cấy được điều chỉnh trong phạm vi 5,5 – 6,0

pH dưới 5,5 làm cho agar khó chuyển sang trạng thái gel, pH lớn hơn 6,0 làm cho agar rất cứng Nếu trong môi trường nuôi cấy có bổ sung GA3 thì pH phải được điều chỉnh trong khoảng 5,7 – 6,0 Vì pH quá kiềm hoặc quá axit sẽ làm cho GA3 mất hoạt tính (Nav Barft and Pierk,1971)

Trong quá trình nuôi cấy, pH của môi trường có thể bị giảm xuống vì một số mẫu thực vật sản sinh ra các axit hữu cơ [43]

1.3.4 Ý nghĩa, ưu điểm và nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro

26

1.3.4.1 Ý nghĩa

Nuôi cấy mô tế bào thực vật, thực chất là một phương pháp nhân giống

vô tính Đối với nhiều loại thực vật quý hiếm, có giá trị kinh tế và ý nghĩa sinh học cao thường gặp khó khăn trong vấn đề nhân giống hữu tính thì nhân giống in vitro là công cụ hữu ích và cho hiệu quả kinh tế cao Trên thực tế có nhiều loài thực vật nhân giống hữu tính bằng hạt cho hệ số nhân cao nhưng lại không hoàn toàn giống bố mẹ về đặc điểm sinh thái, thành phần hóa học và phẩm chất Sự không tương đồng này gây khó khăn trong việc đưa vào sản xuất theo dây chuyền công nghiệp Ví dụ, cây cọ dầu khi nhân giống bằng hạt hàm lượng tinh dầu ở cây con phân ly từ 0,5 – 11,3% Một số cây dược liệu

có khả năng nhân giống hữu tính gặp nhiều khó khăn như cây ô dầu, bạch trược nẩy mầm bằng hạt chậm Một số loài cây gỗ có thời gian sinh trưởng và sinh sản kéo dài như cây đỗ trọng phải mất 10 năm mới ra hoa; cây nhân sâm hạt tươi mới nẩy mầm nên phải trồng lại ngay sau khi thu hoạch, điều này gây khó khăn cho sản xuất [11] Mặt khác, phương pháp nhân giống truyền thống ( giâm, chiết, ghép) mang nhiều nhược điểm: sự lây truyền mầm bệnh,

hệ số nhân thấp

Ngành nông nghiệp gặp những thách thức lớn như phải giảm lượng thuốc bảo vệ thực vật, phân bón nhưng phải đảm bảo năng suất và chất lượng sản phẩm, giảm chi phí sản xuất

Để khắc phục những nhược điểm trên, phương pháp nhân giống in vitro được áp dụng và mang lại hiệu quả kinh tế, ý nghĩa sinh học cao Phương pháp này tạo ra số lượng cây giống lớn, đồng đều về mặt di truyền, cây trồng

có khả ngăng kháng bệnh, khả năng chống chịu điều kiện khắc nghiệt tăng Ví

dụ, ở Mỹ, đậu nành mang gen đề kháng với thuốc diệt cỏ; cây ngô và cây bong mang gen đề kháng với thuốc diệt cỏ và thuốc trừ sâu chiếm diện tích tương ứng gần 85%, 75% và 45% diện tích toàn phần của các loài cây đó trong nông nghiệp

- Có thể nhân nhanh nhiều lại cây không có khả năng kết hạt trong điều kiện sinh thái nhất đinh hoặc khả năng nẩy mầm kém

- Tạo được dòng thuần của các cây tạp giao

- Tạo được các cây có kiểu gen mới bằng cách xử lý đa bội hoặc chuyển gen

- Bảo bản và lưu giữ được tập đoàn giống nhân giống vô tính và các loài nhân giống trong ngân hàng gen

- Khả năng tái sinh có thể bị mất do quá trình cấy truyền callus hay huyền phù

tế bào nhiều lần

- Cây giống có thể bị nhiễm hàng bệnh loạt

- Chi phí sản xuất cao, bởi vì nhân giống đòi hỏi trang thiết bị hiện đại và lao động có tay nghề

- Sản phẩm có sự biến đổi kiểu hình và xuất hiện một số đặc điểm không mong muốn

1.3.5 Các đường hướng nhân giống vô tính in vitro

28 Trong nhân giống in vitro, cây con được tái sinh từ các điểm sinh trưởng

có sẵn trong các bộ phận phôi, đỉnh chồi, đỉnh nách hoặc từ các mô có khả năng hình thành các đỉnh sinh trưởng phụ Có hai phương pháp tái sinh cây con:

- Tái sinh trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng, phôi, ngọn, chồi, chồi nách

- Tái sinh gián tiếp thông qua giai đoạn hình thành mô sẹo

Tái sinh trực tiếp (direct regeneration) từ mẫu nuôi cấy là quá trình phát động những điểm sinh trưởng đã tồn tại trong mô nuôi cấy để phân chia và tái sinh thành cây mới Các điểm sinh trưởng bao gồm các tế bào phôi sinh chứa 2n nhiễm sắc thể đặc trưng cho loài Cây con tạo ra đồng nhất về mặt di truyền và duy trì tính trạng của cây mẹ [hu and wang 1983, In evans et al,177,277]

Tái sinh gián tiếp (indirect regeneration) mẫu nuôi cấu không tái sinh thành cây trực tiếp mà phát triển thành khối mô sẹo (callus) Từ một khối mô sẹo có thể tạo ra số lượng cây giống lớn trong thời gian ngắn bằng kỹ thuật tạo phôi xô ma hoặc tạo hạt giống nhân tạo Trong quá trình phát sinh phát triển của mô sẹo thường xuất hiện những tế bào đột biến nhiễm sắc thể không giống với tế bào ban đầu hoặc chứa những đột biến gen do hiện tượng nội nguyên phân (endomitosic) Do vậy, cây con được tái sinh từ mô sẹo có thể mang nhiều đặc điểm khác với cây mẹ về mặt di truyền

Ngoài ra, mô sẹo là đối tượng lý tưởng để tạo ra các đột biến nhân tạo bằng các tác nhân gây đột biến hoặc công nghệ gen

Tóm lại, trong nhân giống in vitro, con đường tái sinh trực tiếp để nhân nhanh những cá thể đã được chọn lọc; con đường tái sinh gián tiếp để tạo ra nhiều biến dị phục vụ cho công tác chọn lọc và cải tạo giống cây trồng [30]

1.3.6 Các hướng nghiên cứu và ứng dụng của nuôi cấy mô – tế bào thực vật

1.3.6.1 Vi nhân giống in vitro

29

Vi nhân giống in vitro là lĩnh vực dung kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân giống cây tròng trong ống nghiệm, được thực hiện qua:

+ Nuôi cấy mô phân sinh hay đỉnh sinh trưởng

+ Nuôi cấy mô sẹo hay nuôi cấy phôi

Ưu điểm của phương pháp này là hệ số nhân chồi cao, rút ngắn thời gian đưa giống mới vào sản xuất, cây con đồng đều về mặt di truyền, , hoàn toàn sạch bệnh, dễ dàng vận chuyển số lượng giống lớn đi xa, phục tráng giống cây bị nhiễm virut

1.3.6.2 Tạo cây đơn bội

Cây đơn bội được thu nhận từ nuôi cấy bao phấn, hạt phấn trên môi trường rắn hoặc lỏng Kết quả của quá trình này là sự hình thành mô sẹo hoặc phôi và cuối cùng là tái sinh cây

Việc tạo ra cây đơn bội với mục đích tạo ra các dòng thuần phục vụ cho công tác lai giống hoặc tạo cây đa bội băng xử lý coxixin trong thời gian 24 – 48 giờ

1.3.6.3 Nuôi cấy protoplast và lai tế bào xoma

Protoplast được dùng để tạo ra các thể dung hợp nhằm thực hiện những biến đổi di truyền ở thực vật Có hai phương pháp chính:

+ Phương pháp dung hợp của Kao và cs (1974) dùng PEG (polietilenglicon) có khối lượng phân tử cao để gắn các protoplast với nhau

+ Phương pháp diệt nhân: diệt nhân của một protoplast rồi cho dung hợp vào protoplast thứ hai (Zeleer và cs.,1978; Nguyễn Đức Thành, 1977) Phương pháp này cho hiệu quả cao nhất để tạo cây lai xoma và tổ hợp được các tính trạng mong muốn

1.3.6.4 Chọn dòng tế bào cho năng suát thứ cấp cao

Theo Hiraoka, 1986; Nozue và cs., 1987, chọn dòng tế bào là phương pháp chọn lọc dòng tế bào cho năng suất thứ cấp cao là mô sẹo Mục đích của

30 chọn dòng là tạo ra doàn tế bào có khả năng sản xuất ra các chất trao đổi thứ cấp với tốc độ cao và đặc tính ổn định qua nhiều thế hệ tế bào

1.3.6.5 Chuyển gen ở thực vật bậc cao

Chuyển gen thực vật phát triển cùng với sự tiến bộ của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật Thực vật chuyển gen được tạo nên bằng nhiều cách khác nhau: phương pháp vi tiêm, dung sung bắn gen, chuyển gen trực tiếp vào tế bào trần Theo Zambryski, 1988, chuyển gen thưc vật đa số được thực hiện bằng phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu trên cây Mai giảo Thủ Đức (Ochna sp.) Mẫu là những

đỉnh sinh trưởng có kích thước 4 - 6 cm của cây trưởng thành được trồng tại Trạm thực nghiệm khoa học và công nghệ thuộc Trung tâm ứng dụng tiến bộ khoa học và công nghệ Bình Định

31

- Đề tài được thực hiện từ tháng 06 năm 2013 đến tháng 07 năm 2014

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu chất khử trùng và thời gian ảnh hưởng đến hiệu quả khử

trùng mẫu

- Nghiên cứu môi trường nuôi cấy tốt nhất cho các giai đoạn cấy khởi động mẫu, nhân nhanh, tạo rễ và tạo cây hoàn chỉnh trong nuôi cấy in vitro

- Nghiên cứu giá thể tốt nhất cho giai đoạn ra vườn ươm

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1.1 Giai đoạn khử trùng mẫu

Xác định phương pháp khử trùng mẫu hiệu quả nhất là Javen 50%, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm sau: Tất cả mẫu nuôi cấy là phần đỉnh chồi và chồi bên có kích thước 1,5 – 2 cm của cây Mai giảo trưởng thành được nuôi cấy trên môi trường MS cơ bản không có chất điều hòa sinh trưởng

Thí nghiệm 1 Nghiên cứu ảnh hưởng của Javel 30% ở các mức thời gian khác nhau đến hiệu quả khử trùng mẫu

Môi trường nền: MS + 30g saccharose + 7.0g/l agar

Nghiệm thức Thời gian (Phút )