Nghiên cứu sự biến đổi của Super Oxidase Dimutase, Glutathion Peroxidase và tình trạng chống oxy hóa toàn phần (TAS) ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính

Trong cơ thể luôn hình thành một sự cân bằng giữa các dạng oxy hoạtđộng và các chất chống oxy hóa, đây là một trạng thái cân bằng nội môi nhằmduy trì hoạt động bình thường.. Các enzym nh

Trang phụ bìa

Lời cam đoan

Lời cảm ơn

Mục lục

Chữ viết tắt

Danh mục bảng

Danh mục biểu đồ

Danh mục hình

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Một số hiểu biết về gốc tự do trong y sinh học 3

1.1.1 Khái niệm về gốc tự do 3

1.1.2 Đặc điểm của gốc tự do (R∙) 3

1.1.3 Quá trình hình thành các gốc tự do 5

1.1.4 Trạng thái Stress oxy hóa 8

1.2 Hệ thống chống oxy hóa trong cơ thể 9

1.2.1 Các chất chống oxy hóa có bản chất là enzym .9

1.2.2 Hệ thống chống oxy hoá có bản chất không enzym .11

1.2.3 Trạng thái chống oxy hóa toàn phần (TAS) 14

1.3 Bệnh gan mạn tính do vi rút B 14

1.3.1 Tình hình nhiễm HBV mạn tính trên thế giới và Việt Nam 14

1.3.2 Đặc điểm cấu trúc và hệ gen của HBV 16

1.3.3 Quá trình nhân lên của HBV 20

1.3.4 Đáp ứng miễn dịch trong nhiễm HBV mạn tính 21

1.3.5 Diễn biến tự nhiên của nhiễm HBV mạn tính 22

1.3.6 Chẩn đoán viêm gan B mạn tính 24

1.4.1 Stress oxy hóa ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính 27

1.4.2 Vai trò của các chất chống oxy hóa ở bệnh nhân viêm gan B 33

mạn tính 1.5 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về hoạt độ SOD, GPx 35

và TAS ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

38 2.1 Đối tượng nghiên cứu

38 2.1.1 Nhóm bệnh 38

2.1.2 Nhóm chứng 39

2.2 Phương pháp nghiên cứu

39 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 39

2.2.2 Cỡ mẫu 39

2.2.3 Phương tiện nghiên cứu 40

2.3 Nội dung và chỉ tiêu nghiên cứu

40 2.3.1 Nghiên cứu lâm sàng 40

2.3.2 Nghiên cứu cận lâm sàng 41

2.3.3 Xét nghiệm hoạt độ enzym chống oxy hoá và trạng thái 44

và trạng thái chống oxy hóa toàn phần 2.3.4 Sinh thiết gan 51

2.4 Xử lý số liệu

55

2.5.1 Các biện pháp khống chế sai số 55

2.5.2 Hạn chế của đề tài 56

2.6 Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu

56 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

58 3.1 Đặc điểm chung của nhóm nghiên cứu và nhóm chứng

58 3.1.1 Đặc điểm về tuổi và giới 58

3.1.2 Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ở bệnh nhân viêm gan B 59

mạn tính 3.2 Xác định hoạt độ SOD, GPx và tình trạng chống oxy hóa

62 toàn phần (TAS) huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính 3.3 Đánh giá mối liên quan hoạt độ SOD, GPx và TAS trong 64

huyết tương với lâm sàng và cận lâm sàng ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính 3.3.1 Mối liên quan với tuổi 64

3.3.2 Mối liên quan với đặc điểm lâm sàng 66

3.3.3 Mối liên quan với đặc điểm cận lâm sàng 69

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN

81 4.1 Một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ở bệnh nhân 81

viêm gan B mạn tính 4.1.1 Đặc điểm về tuổi và giới tính 81

4.1.2 Một số đặc điểm lâm sàng 84

4.2 Hoạt độ SOD, GPx và tình trạng chống oxy hóa toàn phần 92

(TAS) huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính 4.2.1 Hoạt độ SOD trong huyết tương 93

4.2.2 Hoạt độ GPx 95

4.2.3 Trạng thái chống oxy hóa toàn phần (TAS) 97

4.3 Đánh giá mối liên quan hoạt độ SOD, GPx và TAS trong 99

huyết tương với lâm sàng và cận lâm sàng ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính 4.3.1 Liên quan với tuổi và giới 99

4.3.2 Mối liên quan với một số đặc điểm lâm sàng .100

4.3.3 Liên quan với đặc điểm cận lâm sàng 100

4.3.4 Liên quan với mô học .103

KẾT LUẬN 105

KIẾN NGHỊ

107

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TT Phần viết tắt Phần viết đầy đủ

Bệnh gan do rượu

5 CHB Chronic Hepatitis B: Viêm gan B mạn

7 ER Endoplasmic Reticulum: Lưới nội chất

10 HAI Histology Activity Index: chỉ số hoạt động mô

bệnh học

11 HBcAb Hepatitis B core antibody: kháng thể kháng kháng

nguyênlõi của vi rút viêm gan B

12 HBeAb Hepatitis B e antibody: kháng thể kháng kháng

viêm gan B

14 HBsAb Hepatitis B surface antibody: kháng thể kháng

kháng nguyên bề mặt của vi rút viêm gan B

15 HBsAg Hepatitis B surface antigen: kháng nguyên bề mặt

của vi rút viêm gan B

Vi rút viêm gan B

17 HCC Ung thư biểu mô tế bào gan

Vi rút viêm gan C

21 SL Giá trị p trong kiểm định Mann - Whitney

22 p** Giá trị p trong kiểm định Kruskal - Wallis

Dạng oxy hoạt động

26 TAS Total antioxydant status

Trạng thái chống oxy hóa toàn phần của cơ thể

2.1 Giá trị tham chiếu một số chỉ số huyết học đang áp dụng 42

tại Bệnh viện 103 2.2 Giá trị tham chiếu một số chỉ số hóa sinh đang áp dụng tại .42

Bệnh viện 103 2.3 Tổn thương mô bệnh học theo Knodell năm 1981 .54

3.1 Đặc điểm về tuổi 58

3.2 Đặc điểm về giới tính 58

3.3 Các triệu trứng lâm sàng hay gặp .59

3.4 Xét nghiệm Enzym gan 59

3.5 Kết quả xét nghiệm HBV – DNA 60

3.6 Kết quả xét nghiệm HBeAg 61

3.7 Đặc điểm tổn thương gan trên mô bệnh học 61

3.8 Mức độ viêm gan mạn tính theo phân loại Knodell 62

3.9 Tỷ lệ bệnh nhân định lượng được hoạt độ SOD, GPx 62

và TAS trong huyết tương 3.10 Hoạt độ SOD (U/ml) ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính 63

3.11 Hoạt độ GPx (U/ml) ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính .63

3.12 Hoạt độ TAS (U/ml) ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính 64

3.13 Mối liên quan giữa hoạt độ SOD trong huyết tương với tuổi 64

3.14 Mối liên quan giữa hoạt độ GPx trong huyết tương với tuổi 65

3.15 Mối liên quan giữa hoạt độ TAS trong huyết tương với tuổi 65

3.16 Mối liên quan giữa hoạt độ SOD trong huyết tương .66

với đặc điểm lâm sàng 3.17 Mối liên quan giữa hoạt độ GPx trong huyết tương 67

với bilirubin toản phần

3.22 Mối liên quan giữa tỷ lệ phát hiện được SOD với enzym gan .703.23 Mối liên quan giữa tỷ lệ phát hiện được TAS với enzym gan 713.24 Mối liên quan giữa hoạt độ SOD với Enzym gan 723.25 Mối liên quan giữa hoạt độ GPx trong huyết tương với enzym gan 723.26 Mối liên quan giữa hoạt độ TAS trong huyết tương với Enzym gan 743.27 Mối tương quan giữa SOD, GPx và TAS trong huyết tương với 75 enzym gan

3.28 Mối tương quan giữa SOD, GPx và TAS trong huyết tương75

với công thức máu

3.29 Mối liên quan giữa tỷ lệ phát hiện được SOD với HBV-DNA 763.30 Mối liên quan giữa tỷ lệ phát hiện TAS với HBV-DNA 763.31 Mối liên quan giữa hoạt độ SOD, GPx và TAS trong huyết tương77

với HBV - DNA

3.32 Mối liên quan giữa tỷ lệ phát hiện được SOD với HBeAg 77

tương với HBeAg

3.35 Mối liên quan giữa tỷ lệ phát hiện SOD với mức độ viêm gan 78 mạn tính theo phân loại Knodell

3.1 Xét nghiệm Bilirubin máu .603.2 Mối liên quan giữa hoạt độ GPx và enzym AST 733.3 Mối liên quan giữa hoạt độ GPx với enzym GGT 73

1.1 Các dạng oxy hoạt động trong cơ thể 4

1.2 Phân bố tỷ lệ nhiễm vi rút viêm gan B trên thế giới 15

1.3 Mô hình chu trình thâm nhập và nhân lên của HBV 21

1.4 Stress oxy hóa gây ra bởi HBV 32

2.1 Máy đọc ELISA DAR 800 45

2.2 Hình ảnh bộ kim sinh thiết Hepafix 52

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong các bệnh gan mạn tính, viêm gan vi rút B là một bệnh truyềnnhiễm ở người do vi rút viêm gan B (Hepatitis B virus, HBV) gây nên, mộtbệnh để lại nhiều hậu quả nghiêm trọng , Theo báo cáo của Tổ chức Y tếThế giới năm 2012, ước tính có hơn 2 tỷ người đã nhiễm HBV và khoảng 240triệu người đang mang HBV mạn tính Bệnh nhân viêm gan B mạn tính(Chronic Hepatitis B - CHB) không được điều trị thường tiên lượng xấu, cóthể sẽ dẫn đến xơ gan hoặc ung thư tế bào gan Hàng năm trên thế giới cókhoảng 500 - 700 nghìn người tử vong vì hậu quả của nhiễm HBV

Nhiễm HBV mạn tính là một yếu tố nguy cơ quan trọng trong sinhbệnh học của viêm gan mạn tính, xơ gan và ung thư gan , Đột biến vùng lõi,vùng Pres và gen X là những yếu tố quan trọng trong sinh bệnh học của ungthư biểu mô tế bào gan , , Cả hai yếu tố này đều được gắn liền với quá trìnhstress oxy hóa, quá trình này có thể gây tổn thương lipid, protein và DNA ởmức độ tế bào

Trong cơ thể luôn hình thành một sự cân bằng giữa các dạng oxy hoạtđộng và các chất chống oxy hóa, đây là một trạng thái cân bằng nội môi nhằmduy trì hoạt động bình thường Khi mất cân bằng làm gia tăng các dạng oxyhoạt động, được gọi là trạng thái stress oxy hóa… Như vậy, trạng thái stressoxy hóa chính là rối loạn cân bằng giữa các chất chống oxy hóa và chất oxyhóa theo hướng thiên về tạo ra các chất oxy hóa Tình trạng strees oxy hóađóng có một vai trò nhất định trong bệnh sinh của bệnh gan mạn tính Tế bàogan sẽ bị tổn thương khi có dư thừa các gốc tự do trong cơ thể có nguồn gốc

từ oxy và nitơ Ngoài ra stress oxy hóa cũng liên quan đến mức độ của bệnh,

ở những bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính, quá trình peroxy hóa lipid và tổnthương DNA tăng cao , ,

Các enzym như superoxid dismutase (SOD) và glutathion peroxidase(GPx) là những enzym chống oxy hóa cơ bản nhất của cơ thể, trong đó SOD

có tác dụng thu dọn các gốc tự do khơi mào phản ứng; GPx có tác dụng làmgiảm nồng độ các gốc tự do hoạt động Bên cạnh đó, tình trạng chống oxyhoá toàn phần trong cơ thể (TAS) có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong việc

dự báo khả năng đáp ứng cơ thể với hiệu quả loại bỏ gốc tự do sinh ra Nhiềunghiên cứu cho thấy hoạt độ SOD, GPx và nồng độ TAS giảm đáng kể ởnhóm bệnh nhân viêm gan B mạn tính so với nhóm chứng khỏe mạnh hoặcnhóm người mang vi rút không triệu chứng , ; đồng thời theo một số tác giảqua việc xác định hoạt độ của các chất chống oxy hóa có thể đánh giá tìnhtrạng stress oxy hóa

Những vấn đề này ở Việt Nam chưa được nghiên cứu có hệ thống ởbệnh nhân viêm gan B mạn tính Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài này nhằmmục tiêu:

1 Xác định hoạt độ SOD, GPx và tình trạng chống oxy hóa toàn phần (TAS) huyết tương ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính.

2 Đánh giá mối liên quan hoạt độ SOD, GPx và TAS trong huyết tương với lâm sàng và cận lâm sàng ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Một số hiểu biết về gốc tự do trong y sinh học

1.1.1 Khái niệm về gốc tự do

Gốc tự do là những nguyên tử, nhóm nguyên tử hay phân tử mà lớpngoài cùng của chúng có các điện tử đơn độc ở quỹ đạo ngoài cùng (điện tửkhông cặp đôi) , chúng có thể mang điện tích âm hoặc không mang điện và cókhả năng phản ứng cao Quá trình sinh gốc tự do là một quá trình chuyển hóabình thường của cơ thể

Bình thường gốc tự do tồn tại trong cơ thể với nồng độ thấp và tham giavào một số chức năng sinh lý nhất định Với việc nhận một điện tử đầu tiênoxy đã tạo ra gốc superoxyd (O2-), gốc tự do đã hình thành và có khả năngphản ứng cao như hydro peroxyd (H2O2), oxy đơn bội (1O2), gốc hydroxyl(HO), lipid peroxyd (LO) …, người ta gọi là dạng oxy hoạt động

1.1.2 Đặc điểm của gốc tự do (R ∙ )

Các gốc tự do có tính oxy hóa rất mạnh, có xu hướng lấy điện tử củaphân tử bên cạnh ghép đôi với điện tử của gốc tự do Phân tử bị mất điện tửlại trở thành gốc tự do mới và tác dụng cứ lan truyền, đây chính là nguyênnhân sinh ra chuỗi phản ứng gốc

Vì chứa điện tử không cặp đôi nên gốc tự do bất ổn định về năng lượng

và cả mặt động học Gốc tự do có xu hướng mất điện tử để trở thành gốc khửhoặc nhận điện tử để trở thành gốc oxy hóa Các gốc tự do chủ yếu là dạngoxy hoạt động được hình thành qua chuỗi hô hấp tế bào, trong quá trìnhperoxyd hóa lipid của các acid béo chưa bão hòa có nhiều liên kết đôi

Các gốc tự do và các dạng oxy hoạt động có khả năng phản ứng hóa họcmạnh, chúng có thể tác dụng dễ dàng với các phân tử sinh học gồm lipid,protein, acid nucleic và có thể gây tác hại đến tính chất sinh học của các phân

tử trên Hậu quả của quá trình này là bẻ gãy các liên kết, tạo ra gốc tự do mới

để hình thành liên kết mới, chất mới qua phản ứng giữa các gốc

Trong đời sống tế bào bình thường, oxy là nhiên liệu chủ yếu cần thiếtcho sự sống của tế bào và cũng là nguồn gốc chính sản sinh ra gốc tự do Cácdạng oxy hoạt động (reactive oxygen species - ROS) là những gốc tự do,những ion hoạt động, phân tử có chứa nguyên tử oxy, có khả năng sinh ra gốc

tự do hoặc được hoạt hóa bởi các gốc tự do Các gốc tự do trong cơ thể đượctạo ra thường xuyên: qua chuỗi hô hấp tế bào, tác nhân phóng xạ, hội chứngviêm, trong hiện tượng thiếu máu cục bộ - tưới máu lại, các tác nhânxenobiotic và một số tác nhân khác

Những dạng ROS quan trọng trong cơ thể sinh vật gồm: anionsuperoxyd O2-, hydrogen peroxyde (H2O2), gốc hydroxyl (•OH), oxy đơn bội

1O2, gốc alkoxyl (LO•) hoặc peroxyl (LOO•) …

Hình 1.1 Các dạng oxy hoạt động trong cơ thể

Nguồn: Jes´us Medina and Ricardo Moreno-Otero (2006)

+ Superoxyd được tạo thành từ chuỗi hô hấp tế bào hoặc từ một sốphản ứng tự oxy hóa và trong quá trình bùng nổ hô hấp của hiện tượng thựcbào.

e- + •O-O• O2

-+ Hydrogen peroxyd (H2O2) có thể được hình thành sau phản ứng dị lycủa O2- hoặc do phản ứng khử hai điện tử của oxy H2O2 có hoạt tính hóa họchạn chế, là chất tan trong lipid và có thể xuyên qua các màng sinh học

+ Gốc hydroxyl (•OH) được hình thành từ phản ứng Fenton hoặc phảnứng Haber-Weiss xảy ra chậm

H2O2 + Fe2+ Fe3+ + -OH + -OHKhả năng phản ứng của gốc hydroxyl là rất lớn trong môi trường sinhhọc, có khả năng phản ứng với rất nhiều thành phần của tế bào

+ Gốc alkoxyl (LO•) hoặc peroxyl (LOO•), có thể được tạo ra dưới tácđộng của một gốc tự do có chứa oxygen (O2-, HO• ) trên những chuỗi acidbéo có nhiều nối đôi

+ Oxy đơn bội (1O2) là một dạng oxy có năng lượng cao, hình thành khiO2 được cung cấp năng lượng, nó không phải là gốc tự do nhưng có khả năngoxy hóa cực mạnh Oxy đơn bội được tạo thành ở hệ thống sinh học trong một

số sắc tố như chlorophyll, retinal và flavin khi chúng được chiếu sáng với sự

có mặt của oxy

Tất cả các gốc tự do của oxy và dạng oxy hoạt động được gọi là các chất oxy hóa (oxydant) hoặc tác nhân gây stress oxy hóa.

1.1.3 Quá trình hình thành các gốc tự do

Các gốc tự do trong cơ thể được tạo ra thường xuyên: qua chuỗi hô hấp

tế bào, tác nhân phóng xạ, hội chứng viêm, trong hiện tượng thiếu máu cục bộ

- tưới máu lại, các tác nhân xenobiotic và một số tác nhân khác

1.1.3.1 Chuỗi hô hấp tế bào

Hô hấp tế bào được thực hiện trong ty thể, bao gồm các phản ứng oxyhóa khử oxy để sinh ra nước và năng lượng dưới dạng ATP (phản ứng oxyhóa khử là quá trình cho và nhận điện tử, do vậy sản sinh ra các gốc), O2 màchúng ta hít thở nhận một điện tử ở bước đầu tiên tạo ra O2-

O 2 - sinh ra tỷ lệ thuận với cường độ hô hấp tế bào (tỷ lệ với năng lượngsinh ra), là một gốc anion độc hại ở mức trung bình và chúng bị phân hủy bởi

nhiều cơ chế khác nhau Sự phân huỷ O 2 - được xúc tác bởi enzym SOD,chuyển thành H2O2 theo cơ chế tự oxy hóa khử

2 O 2 - + 2H+ H2O2 + O2

H2O2 thường xuyên sinh ra do sự phân hủy O2 -, nồng độ H2O2 (10-8 mol/

L) và O 2 - (10-12 mol/L) trong tế bào tương đối ổn định Tuy nồng độ thấp nhưvậy, nhưng sự tồn tại đồng thời của chúng trong môi trường sinh học là rấtnguy hại Phản ứng giữa chúng sinh ra những sản phẩm 1O2 cũng rất nguy hại,gốc •OH với hoạt tính cao, có khả năng phá hủy những cấu trúc hữu cơ bềnvững nhất của cơ thể và gây ra các quá trình bệnh lý

Khi không có mặt của ion Fe2+, Cu2+ thì phản ứng này xảy ra chậm, gọi

là phản ứng Harber-Weiss

O 2 - + H2O2 HO• + HO- + 1O2

Khi có mặt của các ion Fe2+, Cu2+ thì tốc độ phản ứng xảy ra rất nhanh

(phản ứng Fenton) Hai tiểu phân O 2 - và H2O2 không độc có thể tạo ra 1O2,

•OH có khả năng phản ứng rất cao, dễ dàng phản ứng với các chất hữu cơ tạo

ra các peroxyd và từ đó tạo ra nhiều sản phẩm độc hại cho tế bào

2 O 2 - + 2 H+ H2O2 + O2

Và khi đó ion kim loại chuyển tiếp (Fe2+, Cu2+) dễ dàng phân tách H2O2thành gốc hydroxyl

Fe2+ + H2O2 HO• + HO- + Fe3+

Gốc •OH có khả năng phản ứng mạnh với hầu hết các phân tử sinh học

ở tốc độ khuếch tán, vì vậy nó thường phản ứng trước khi khuếch tán tớinhững nơi có khoảng cách xa trong tế bào

1.1.3.2 Tác nhân phóng xạ

Các tia phóng xạ hoặc bức xạ có năng lượng cao, có khả năng bẻ gãymột phân tử tạo ra 2 hay nhiều gốc tự do Trong cơ thể chúng ta chiếm phầnlớn là nước, do vậy khi các bức xạ có năng lượng cao tác động trên cơ thể, sẽphân huỷ nước tạo thành các phân tử khác và sản sinh gốc tự do

1.1.3.3 Trong hội chứng viêm

Khi các tác nhân (là các kháng nguyên) xâm nhập vào cơ thể sẽ bị bạchcầu đa nhân trung tính bắt giữ, đồng thời lại kích hoạt bạch cầu đa nhân trungtính tăng tiêu thụ oxy, kích thích enzym của màng tế bào là NADPH-oxydase,

từ đó gây phản ứng xúc tác bởi enzym này, kết quả cuối cùng là tạo ra O 2 -.Nếu số lượng gốc tự do sinh ra quá nhiều sẽ gây nên một tỷ lệ bạch cầu bịchết, giải phóng các gốc ROS ra ngoại bào gây nên hiện tượng viêm

1.1.3.4 Trong quá trình thiếu máu cục bộ và tưới máu lại

Khi thiếu máu cục bộ do lòng mạch máu bị hẹp hoặc có cục máu đông,các chất xanthine được tích lũy do tăng thoái hóa ATP và xanthine oxydaseđược hoạt hóa Khi có sự tưới máu trở lại, với sự có mặt của oxy, xanthineoxydase xúc tác phản ứng chuyển điện tử từ hypoxanthine và xanthine sangO2 và phản ứng oxy hóa xảy ra rất mạnh, một lượng lớn gốc O2 - hình thành lạichuyển thành H2O2, •OH và 1O2

2 H+

Xanthin + O2 Xanthin dạng oxy hoá + O2

2 H+

2 O 2 - H2O2 + 1O2

1.1.3.5 Tác nhân xenobiotic

Các chất xenobiotic (thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ, chì, CCl4, dioxyn )xâm nhập vào cơ thể bằng nhiều con đường khác nhau, khi vào cơ thể sẽ bịchuyển hóa và làm biến đổi sinh học Sau quá trình chuyển hóa đó, cấu trúcxenobiotic bị biến đổi rõ rệt, chúng có thể gắn thêm nhóm -OH, -NH2, -SH, -COOH tạo thành các chất dễ tan trong nước và tiếp tục liên hợp với cácchất, đào thải ra khỏi cơ thể

Trong quá trình chuyển hóa các chất xenobiotic, tạo ra các dạng ROS

như O 2 -, 1O2 có độc tính cao và gây ra tình trạng stress oxy hóa Các chấtchống oxy hóa trong cơ thể như SOD, catalase, protein có nhóm SH,ceruloplasmin trong hồng cầu và gan rất nhạy cảm với các xenobiotic Dovậy, khi có các xenobiotic xâm nhập vào cơ thể, các chất chống oxy hóa này

sẽ thay đổi theo hướng chống lại các tác nhân đó

1.1.3.6 Một số tác nhân khác

Trong một số bệnh lý: bệnh đái đường, vữa xơ động mạch, bệnh lýnhãn khoa, lão hóa, bệnh Parkinson và Alzheimer…cũng tăng tạo các dạngROS

1.1.4 Trạng thái Stress oxy hóa

Khoa học đã minh chứng, oxy vào cơ thể tham gia nhiều phản ứng hóahọc và kết quả của quá trình phản ứng đó là tạo ra năng lượng cho hoạt độngsống và đồng thời cũng là nguồn sinh ra gốc tự do

Bình thường gốc tự do tồn tại trong cơ thể với nồng độ thấp và tham giavào một số chức năng sinh lý nhất định Với việc nhận một điện tử đầu tiên

oxy đã tạo ra gốc superoxyd (O 2 -), gốc tự do đã hình thành và có khả năngphản ứng cao như hydro peroxyd (H2O2), oxy đơn bội (1O2), gốc hydroxyl(HO), lipid peroxyd (LO) …, người ta gọi là dạng oxy hoạt động

Các nghiên cứu cho thấy nhiều chất có khả năng loại bỏ các dạng oxyhoạt động và được gọi là chất chống oxy hóa Các chất chống oxy hóa có bản

chất enzym như: SOD, GPx, glutathion (GSH) Các chất chống oxy hóa cóbản chất không enzym như vitamin C, vitamin E, vitamin A, selen, β-caroten ,.

Trong cơ thể luôn hình thành một sự cân bằng giữa các dạng oxy hoạtđộng và các chất chống oxy hóa Nếu vì một lý do nào đó (cơ thể nhiễm xạ,hóa chất, độc tố, nhiễm vi rút, viêm nhiễm cấp tính ) sẽ làm gia tăng cácdạng oxy hoạt động, khi đó không còn sự cân bằng giữa các chất oxy hóa vàchất chống oxy hóa, người ta gọi đó là trạng thái stress oxy hóa

Nếu stress oxy hóa ở mức độ nhẹ, các phân tử sinh học bị tổn thương cóthể được sửa chữa hoặc thay thế Ở mức độ nặng nề hơn, stress oxy hóa có thểgây tổn thương không hồi phục hoặc chết tế bào

1.2 Hệ thống chống oxy hóa trong cơ thể

Hệ thống chống oxy hóa (antioxydant - system) của cơ thể rất đa dạng vàphức tạp bao gồm các enzym và các chất không có bản chất enzym Trong cơthể luôn tồn tại các dạng oxy hoạt động, đồng thời cũng tồn tại một hệ thốngchống oxy hóa để loại bỏ các tác hại của chúng Hệ thống này hoạt động theo

4 con đường sau: (1) Tạo phức làm mất khả năng xúc tác của các kim loạichuyển tiếp (transferin); (2) Làm gián đoạn các phản ứng lan truyền (α-tocoferol); (3) Làm giảm nồng độ các gốc tự do hoạt động (glutathion); (4)Thu dọn các gốc tự do tham gia khơi mào phản ứng (superoxyd dismutase)

1.2.1 Các chất chống oxy hóa có bản chất là enzym

1.2.1.1 Superoxyd dismutase (SOD)

Superoxyd dismutase là một enzym chống oxy hóa có chứa kim loạithuộc lớp oxydoreductase thực hiện chức năng xúc tác phản ứng chuyển hóasuperoxyd thành O2 và H2O2 :

2 O 2 - + 2H+ 2H2O + O2

Hoạt độ SOD càng cao thì nồng độ O 2 - càng giảm đi SOD là một chất

chống oxy hóa rất cơ bản, làm hạ thấp nồng độ O 2 - là chất khởi đầu cho phảnứng tạo sinh tất cả các dạng ROS (Reactive oxygen species) khác

1.2.1.2 Catalase

Catalase (EC 1.11.1.6) là một enzym chống oxy hóa, xúc tác phản ứngphân hủy hydrogen peroxyd :

Catalase có mặt trong hầu hết các tế bào và các mô động vật nhưng hoạt

độ mạnh nhất là ở gan và thận, ít nhất là ở mô liên kết Trong các mô, catalase

có chủ yếu ở trong ty thể cùng peroxysome Catalase tồn tại dưới dạng dungdịch trong tế bào hồng cầu và được tìm thấy trong các loài thực vật nhưng vớihoạt độ thấp hơn nhiều

Catalase là enzym chống oxy hóa, xúc tác phản ứng phân hủy hydrogenperoxyd Catalase chỉ hoạt động trong môi trường H2O2 có nồng độ cao cònkhi ở nồng độ thấp thì catalase bị ức chế và GPx sẽ hoạt hóa để xúc tác phânhủy H2O2

1.2.1.3 Peroxydase

Peroxydase là một nhóm enzym xúc tác các phản ứng oxy hóa khử,thuộc lớp oxydoreductase Phương trình phản ứng tổng quát của quá trìnhnày:

peroxydase

AH2 + H2O2 A + 2H2O

* Vai trò và tính chất của peroxydase: Cũng như catalase và SOD,

peroxydase là những enzym chống oxy hóa quan trọng trong hệ thống sinhhọc Chúng có vai trò chính là giải độc tế bào bằng cách chuyển hóa H2O2thành H2O Peroxydase còn tham gia vào những phản ứng sinh hóa quantrọng khác trong cơ thể như quá trình chuyển hóa và tổng hợp lignin, sinh

tổng hợp thành tế bào, sinh tổng hợp một số hormon như prostaglandin,thyrosin, ethylen Ngoài ra, peroxydase còn có vai trò chống lại các tác nhângây bệnh xâm nhiễm vào tế bào và mô và đáp ứng bảo vệ những tổn thương.

1.2.1.4 Glutathion peroxydase

Các enzym chống oxy hóa và glutathione đóng một vai trò quan trọngtrong việc bảo vệ chống lại ROS Glutathion peroxydase (GPx) là enzym xúctác phản ứng loại bỏ các peroxyd hữu cơ và vô cơ:

ROOH + 2GSH GS-SG + ROH + H2O2GSH: là glutathion dạng khử, GS-SG: là glutathion dạng oxy hóa,RCOOH là peroxyd, R là gốc hữu cơ hoặc có thể là H trong H2O2

Trong cơ thể enzym này tồn tại chủ yếu ở trong bào tương của tế bào, ởdịch ngoại bào nồng độ rất thấp Có hai loại GPx ở bào tương, loại GPxkhông phụ thuộc selen, chiếm 20%, xúc tác sự khử các hydroperoxyd hữu cơkhi có mặt glutathion nhưng không có tác dụng trên H2O2 Loại GPx phụthuộc selen (Se-GPx), chiếm 80%, xúc tác sự khử H2O2

Glutathion tồn tại ở 2 dạng: dạng khử (thiol GSH) và oxy hóa (disulfideGS-SG) GSH bị oxy hóa trở thành dạng disulfide GS-SG nhờ enzym GPxxúc tác, kèm theo phản ứng oxy hóa khử này, H2O2 và hợp chất peroxyd bịphân giải Sau đó GS-SG bị khử trở lại dạng GSH bởi GR, enzym này sửdụng NADPH làm nguồn cung cấp điện tử Con đường chủ yếu để tái sinhNADPH là glucose-6-phosphat (G6P) chuyển hướng vào chu trình pentosephosphat được thực hiện bởi glucose-6-phosphat dehydrogenase (G6PDH).Hoạt độ của GPx và catalase phụ thuộc vào nồng độ H2O2 Khi nồng độH2O2 cao, GPx bị ức chế và chỉ có catalase hoạt động Ngược lại, khi nồng độH2O2 còn lại rất thấp, catalase không còn tác dụng thì GPx lại được hoạt hóa,xúc tác phản ứng phân hủy H2O2, hệ thống glutathion peroxydase bao gồmGPx, GR và G6PDH đây là hệ thống phòng thủ chống lại những tổn thươnggây nên bởi quá trình oxy hóa

1.2.2 Hệ thống chống oxy hoá có bản chất không enzym

Đây là hệ thống “bẫy” gốc tự do Hệ thống này hỗ trợ hệ thống chấtchống oxy hóa có bản chất enzym Những chất này cần được cung cấp thêm,

hỗ trợ từ bên ngoài thông qua thực phẩm và các chất bổ sung đưa vào cơ thể

1.2.2.1 Nhóm các thiol -SH

Do tính khử mạnh, chúng cùng vitamin C chuyển vitamin E từ dạng oxyhoá sang dạng khử, hồi phục chức năng dập tắt mạch peroxy hoá lipid củavitamin E, có khả năng trung hoà gốc OH∙, tạo gốc thiyl

Tuy vậy nhóm thiol (-SH) cũng rất dễ bị biến đổi dưới tác nhân oxy hoá,tia phóng xạ, các chất độc kim loại nặng khi cơ thể bị nhiễm các chất đó.Những chất có ái tính như chì, các chất phóng xạ và gần đây người ta thấyTNT cũng gây giảm nồng độ -SH, nó có tác dụng cạnh tranh với cơ chất, giảiphóng Enzym bị ức chế bởi xenobiotic (chất lạ sinh học)

1.2.2.2 β-caroten

Trong cơ thể, β-caroten chống lại các gốc tự do, dập tắt phản ứng dâychuyền Nó vô hiệu hóa đặc hiệu đối với oxy đơn bội (1O2) nhờ có hệ dây nốiđôi luân phiên trên mạch cacbon dài, một phân tử β-caroten có thể hấp thunăng lượng của hàng ngàn phân tử 1O2, rồi giải phóng năng lượng ấy dướidạng nhiệt vô hại Có một lượng β-caroten trong cơ thể chuyển thành vitamin

A

1.2.2.3 Vitamin A

Vitamin A có tác dụng chống oxy hóa tương tự như vitamin E, chúng cókhả năng thu dọn các gốc tự do alkoxyl và peroxyl, bảo vệ acid béo chưa bãohòa và các protein của màng tế bào

1.2.2.4 Vitamin E (Tocopherol)

Do đặc điểm cấu tạo phân tử, vitamin E là chất chống các gốc tự do đặcbiệt là loại bỏ gốc lipoperoxyd LOO∙ và H2O2 giúp duy trì độ bền, sự nguyênvẹn của màng tế bào ,

2LOO∙ + Vit.E(OH)2 2LOOH + Vit.E(O2)

Vitamin E bảo vệ cơ thể chống lại các bệnh tim mạch, ung thư, nhiễmkhuẩn, đục thủy tinh thể, parkinson Không đủ vitamin E, hồng cầu dễ bị vỡbởi sự tấn công của hydroperoxyd (H2O2)

1.2.2.5 Selen

Selen được coi là nguyên tố vi lượng rất quan trọng không thể thiếu cho

hệ thống bảo vệ cơ thể chống gốc tự do và có nhiều vai trò sinh học khác.Selen có trong thành phần của nhiều enzym, tạo ra các nhóm chức -S-SeH, -S-Se-S là những tâm hoạt động sinh học mạnh Glutathion peroxydase chứa

Se đặc biệt tập trung nhiều ở gan để hóa giải các chất độc, ở cơ tim để bảo vệcác tế bào có cường độ hoạt động lớn Selen có hiệu quả hơn trong việc ngănngừa các gốc tự do so với vitamin E

1.2.2.6 Vitamin C (Acid ascorbic)

Vitamin C là chất chống oxy hóa, chống gốc tự do điển hình ở ngoại bào

vì tan được trong môi trường nước Vitamin C loại bỏ các gốc tự do

superoxyd (O 2 -), gốc hydroxyl (∙OH), chặn đứng các phản ứng dây chuyềntheo cơ chế gốc tự do Vì vậy, vitamin C giúp cơ thể chống lại có hiệu quảnhiều bệnh nghiêm trọng, trong đó có bệnh ung thư, tim mạch, suy giảm miễndịch và thần kinh

1.2.2.7 Các flavonoid

Là một họ chất rất phổ biến trong thực vật, có bản chất hóa học lànhững polyphenol Các flavonoid có các nhóm hydroxyl phenolic, nhómcarbonyl, vòng thơm benzen nên chúng có khả năng phản ứng rất lớn Chúng

có khả năng triệt tiêu các gốc tự do sinh ra trong quá trình bệnh lý của cơ thể,tạo nên những gốc tự do của chúng bền vững hơn và không tham gia vào dâychuyền phản ứng gốc

1.2.2.8 Nhóm các phối tử sắt và đồng

Ion sắt và đồng xúc tác phản ứng Fenton, tạo nên hai dạng oxy hoạtđộng rất độc hại cho cơ thể là gốc hydroxyl (•OH) và oxy đơn bội Ion sắt nếutạo được phức qua đủ 6 liên kết phối trí thì không có khả năng xúc tác phảnứng trên nữa Một số chất tạo phức chelat với sắt có đủ 6 liên kết phối trí như:

+ Transferrin: là dạng protein vận chuyển sắt của huyết tương, ở

người khỏe mạnh chỉ cần huy động 20 - 30% lượng transferrin là đủ làm mấthoạt tính xúc tác của sắt Trong một số trường hợp quá tải sắt (hồng cầu vỡnhiều trong huyết tán, uống thuốc chứa sắt quá nhiều, tổn thương cơ ), huyếttương không đủ transferrin và phản ứng Fenton xảy ra rất mạnh

+ Lactoferin: có nhiều trong dịch sữa, dịch nước mắt, nước mũi, nước

bọt Lactoferin làm mất hoạt tính xúc tác của sắt trong các dịch trên

+ Ceruloplasmin: là một protein chứa đồng, có khả năng tạo phức với

đồng và làm mất hoạt tính xúc tác phản ứng Fenton của đồng, nó cũng oxyhóa Fe2+ thành Fe3+, ngăn cản sự tạo thành các gốc oxy hoạt động từ phản ứngFenton

1.2.3 Trạng thái chống oxy hóa toàn phần (TAS)

TAS (total antioxydant status) là tình trạng chống oxy hóa toàn phần củahuyết tương dựa trên khả năng ức chế của các chất chống oxy hóa TAS đượcquy cho các chất chống oxy hóa có trong cơ thể chúng gồm nhiều hệ thốngbảo vệ nhằm chống lại những ảnh hưởng có hại của các gốc tự do và hiệntượng peroxyd có hại đối với cơ thể

Theo định nghĩa những chất có khả năng ngăn ngừa, chống lại và loại bỏtác dụng độc hại của các dạng oxy hoạt động đều được gọi là chất chống oxyhoá, trong đó có các chất chống oxy hoá có bản chất enzym như SOD, GPx

và các chất chống oxy hoá có bản chất không enzym Trong nhiều nghiêncứu, TAS được dùng làm chỉ số để đánh giá tổng quát nhất về tình trạng hoạtđộng của hệ thống chống oxy hoá của cơ thể, biểu thị tính sẵn sàng ứng phó

của cơ thể đối với stress oxy hoá.

Tình trạng chống oxy hoá toàn phần trong cơ thể có bảo toàn hay khôngtùy thuộc vào nhiều yếu tố như chất chống oxy hóa có bản chất enzym, chấtchống oxy hóa không có bản chất enzym Như vậy khi khảo sát giá trị TAS có

ý nghĩa vô cùng quan trọng trong việc dự báo khả năng đáp ứng cơ thể vớihiệu quả loại bỏ gốc tự do sinh ra

1.3 Bệnh gan mạn tính do vi rút B

1.3.1 Tình hình nhiễm HBV mạn tính trên thế giới và Việt Nam

1.3.1.1 Trên thế giới

Viêm gan B mạn tính là bệnh truyền nhiễm có ở khắp nơi trên thế giới

và HBV là nguyên nhân thường gặp nhất trong số những vi rút gây bệnh ganmạn ở người Tỷ lệ nhiễm HBV và mô hình lây truyền ở các nước khác nhau

là khác nhau Theo thống kê của WHO (2012), ước tính có khoảng 50 triệungười nhiễm HBV mới hàng năm và trên toàn thế giới có khoảng 500 - 700nghìn người tử vong mỗi năm vì hậu quả của bệnh như suy gan cấp, xơ gan

và HCC

Hình 1.2 Phân bố tỷ lệ nhiễm vi rút viêm gan B trên thế giới

Nguồn: Jules L Dienstag (2008)

Vi rút viêm gan B là nguyên nhân của khoảng 50% HCC trên toàn thếgiới , và là 1 trong 3 nguyên nhân gây tử vong ở châu Phi, châu Á Tỷ lệnhiễm HBV trên thế giới thay đổi từ 0,1% ở vùng lưu hành thấp đến 20% ởvùng lưu hành cao, theo từng khu vực địa lý và quần thể dân cư Những nơitrên thế giới được coi là lưu hành HBV cao khi ít nhất 8% dân số có HBsAgdương tính Lứa tuổi nhiễm HBV có tác động lớn đến tiến triển lâm sàng,nguy cơ tiến triển thành mạn, tuổi càng nhỏ thì nhiễm HBV tiến triển thànhviêm gan mạn càng cao Nhiễm HBV ở trẻ sơ sinh, có 90% chuyển thành mạn

; từ 1 - 5 tuổi có 25 - 50% chuyển thành mạn; ở những đứa trẻ lớn hơn, nhiễmHBV có 5% - 10% chuyển thành mạn

1.3.1.2 Ở Việt Nam

Việt Nam là nước có tỷ lệ nhiễm HBV cao trên thế giới và nhiễm HBVvẫn còn là vấn đề y tế quan trọng Tỷ lệ nhiễm HBV hiện tại (HBsAg dươngtính) dao động từ 8,8% đến 19% , Nghiên cứu của Cuong NH và cộng sự(2011) trong quần thể các đối tượng nguy cơ cao ở Hải Phòng cho thấy, tỷ lệmắc HBV tích lũy (HBsAg + anti-HBs) là 53,2% (10,7% + 42,5%) ở ngườinghiện ma túy, 51,6% (11,0% + 40,6%) ở phụ nữ mại dâm, 54,3% (9,6% +44,7%) trong thuyền viên, 50,5% (12,5% + 38,0%) ở phụ nữ mang thai, và51,0% (18,1% + 32,9%) trong hiến máu Một nghiên cứu về tỷ lệ nhiễm HBVtrong nhóm người có nguy cơ cao bao gồm người cho máu, tiêm chích matúy, người chạy thận nhân tạo, gái bán dâm ở khu vực Hà nội trong 3 năm

2008 – 2010 cho thấy tỷ lệ nhiễm HBV ở các đối tượng này dao động 5,4% 16,5% Theo báo cáo của Ott J.J và cộng sự (2012) tỷ lệ nhiễm HBV của trẻ

-em Việt Nam trong độ tuổi 5 – 9 nằm ở mức thấp < 2%

Một nghiên cứu của Nguyễn Đức Cường và cộng sự tiến hành trongcộng đồng dân cư tại 24 xã/ phường/ thị trấn của 8 huyện/ thị xã/ thành phốcủa tỉnh Quảng Bình với 2019 đối tượng cho thấy tỷ lệ nhiễm HBV 11,89%

Ngô Viết Lộc (2011) nghiên cứu tình hình nhiễm vi rút viêm gan B

trong cộng đồng dân cư tại tỉnh Thừa Thiên Huế năm 2006 – 2009, kết quảcho thấy tỷ lệ HBsAg (+) là 16,36%.

1.3.2 Đặc điểm cấu trúc và hệ gen của HBV

1.3.2.1 Đặc điểm cấu trúc hình thái

Năm 1965, Blumberg và cộng sự đã phát hiện ra kháng nguyên bề mặtHBV trong khi nghiên cứu huyết thanh người người thổ dân Úc mắc bệnhmáu gọi là kháng nguyên Au Năm 1970, dưới kính hiển vi điện tử, Dane đã

mô tả hạt HBV hoàn chỉnh gọi là thể Dane và năm 1973, WHO đổi tên khángnguyên Au thành kháng nguyên bề mặt HBV gọi là HBsAg Ở các bệnh nhânchâu Á, nồng độ HBsAg <100-200 IU / mL vào cuối giai đoạn điều trị có thể

dự đoán giảm nguy cơ tái phát vi rút viêm gan B và có thể xem xét ngưngđiều trị ở những bệnh nhân HBeAg âm tính

HBV thuộc họ Hepadnaviridae , là một loại vi rút hướng gan, có vỏ bao

ngoài, AND 2 sợi xoắn kép, trên bề mặt vỏ có kháng nguyên bề mặt HBsAg;bên trong là lớp nucleocapsid bao quanh AND có các kháng nguyên lõi(HBcAg), kháng nguyên hòa tan (HBeAg) và AND – polymerase phụ thuộcAND HBV tồn tại dưới 3 loại tiểu thể khác nhau quan sát được dưới kínhhiển vi điện tử :

+ Tiểu thể hình cầu nhỏ (small particle) có đường kính 22 nm

+ Tiểu thể hình ống (tubular particle) kích thước 22nm dài 40 - 400nm+ Tiểu thể hình cầu lớn (large particle) có kích thước 42 - 45 nm Đâychính là hạt vi rút hoàn chỉnh (tiểu thể Dane)

Khi nhiễm HBV mạn tính, tiểu thể Dane lưu hành trong hệ tuần hoànthường xuất hiện kèm theo kháng nguyên hòa tan HBeAg Hai tiểu thể còn lạichỉ có lớp protein vỏ (HBsAg) do đó còn gọi là các tiểu thể HBs, đây khôngphải là các virion hoàn chỉnh và các tiểu thể này không có tính lây nhiễm

1.3.2.2 Bộ gene HBV

Bộ gene của HBV là một phân tử DNA mạch kép dạng vòng không

hoàn chỉnh, kích thước 3,2Kb và được cấu tạo bởi 2 chuỗi đơn ngược dấu cóchiều dài không bằng nhau , Chuỗi dài (chuỗi âm) nằm ngoài tạo nên mộtvòng tròn liên tục có chiều dài cố định là 3200 cặp base (basepair; bp) mã hoátoàn bộ thông tin di truyền của HBV, chuỗi ngắn (chuỗi dương) nằm trong cókích thước thay đổi, dung lượng ít hơn chuỗi dài.

Genome của HBV bao gồm bốn đoạn gen cấu trúc có chức năng (ORF:open reading frames) ký hiệu là: S, C, P và X Các ORFs này có đặc điểmchồng gối lên nhau, có thể chồng gối toàn bộ như giữa S và P, hoặc chồng gốimột phần như giữa X và P hay giữa C và P Các gene này mã hóa cho toàn bộcác protein của vi rút Sự bắt cặp bổ sung của các nucleotide trên vùng gốicủa 2 sợi âm và dương được giới hạn bởi hai trình tự lặp trực tiếp DR1 vàDR2 cho phép quá trình khép vòng của hệ gene xảy ra khi protein P liên kếtđồng hóa trị với đầu 5’ của sợi âm

ORF của gene S: có kích thước khá dài, chứa bộ ba mã hóa (codon)

khởi đầu bằng ATG chia ORF này thành ba vùng, vùng S, PreS1 và PreS2 cóchức năng mã hoá tổng hợp phân tử kháng nguyên bề mặt (HBsAg) bao gồmHBsAg nhỏ, HBsAg trung bình và HBsAg lớn Gần đây, nghiên cứu của Kim

H và Kim B.J (2015) tại Hàn Quốc công bố cho thấy có sự liên quan giữađột biến vùng preS/S liên quan đến mức độ trầm trọng của các bệnh nhânviêm gan mạn tính do nhiễm vi rút viêm gan B thể ẩn (HBsAg âm tính, nhưngnồng độ HBV – DNA vẫn tăng cao)

ORF của gene C: Ở đầu 5’ của gene C có 2 codon khởi đầu cho quá

trình đọc mã, trình tự nucleotide nằm giữa 2 codon này được gọi là vùng PC(precore) Nếu quá trình đọc mã được bắt đầu từ codon AUG thứ nhất ở vị trí

1814 và đọc suốt chiều dài của đoạn gene PC và Core (C) sẽ tổng hợp nênHBeAg (Hepatitis B e Antigen) Các nucleotide đầu tiên vùng C sẽ mã hóacho việc tạo nên một đoạn peptide gồm 19 aa gọi là peptide tín hiệu, peptidenày giúp HBeAg được bài tiết qua hệ thống lưới nội bào của tế bào gan, đồng

thời cũng giúp cho kháng nguyên này hòa tan trong huyết thanh và còn đượcgọi kháng nguyên hòa tan Sự xuất hiện của HBeAg có liên quan đến tính lâynhiễm và phản ánh tình trạng HBV đang ở giai đoạn nhân lên Nếu quá trìnhđọc mã bắt đầu từ codon AUG thứ hai ở vị trí 1901 và đi suốt đoạn gene C sẽtổng hợp kháng nguyên lõi (HbcAg - Hepatitis B c Antigen) Đây là khángnguyên cấu trúc của phần nucleocapsid, vì HBcAg không có đoạn peptide tínhiệu cho nên nó không được bài tiết ra ngoài tế bào gan và không xuất hiệntrong huyết thanh.

ORF của gene P: Chiếm 80% chiều dài toàn bộ gene, mã hóa bộ enzym

đa chức năng có kích thước 831aa được gọi là protein P (polymerase P; Pol).Enzym này có trách nhiệm thực hiện các chức năng trong quá trình tái tạo virút gồm: đóng khung RNA tiền hệ gene của vi rút, “mồi” cho quá trình tổnghợp DNA, phiên mã ngược RNA tiền hệ gene thành DNA sợi đôi, có hoạttính RNAse-H để biến tính RNA tiền hệ gene, Pol là mục tiêu lý tưởng chocác thành phần kháng vi rút được sử dụng trong điều trị viêm gan B mạn tính.Cấu trúc của gene polymerase HBV bao gồm 4 vùng bảo toàn đã được xácđịnh thông qua so sánh với trình tự enzym phiên mã ngược của HBV và đượcxác nhận lại bởi các nghiên cứu di truyền và chức năng vi rút

ORF của gene X: Mã hóa cho kháng nguyên X (HBxAg), protein này

có trọng lượng phân tử khoảng 17,5 kD với chiều dài 154 axit amin đây làmột protein nhỏ nhất trong các protein của HBV Protein HBx là một protein

đa chức năng có vai trò trung tâm của quá trình nhiễm vi rút và bệnh sinhUTG HBx có thể truyền đạt thông tin trực tiếp hoặc gián tiếp cho nhiều geneđích của tế bào, làm trung gian hay đối lập cho nhiều chức năng khác nhaucủa tế bào như điều hòa chu trình tế bào, mã hóa tổng hợp các phân tử kếtdính, hoạt hóa các gene sinh ung thư hoặc các gene ức chế ung thư của tếbào

1.3.2.3 Kiểu gen của vi rút viêm gan B

Tiêu chuẩn để phân loại HBV là dựa trên sự khác nhau của chuỗi trongtoàn bộ gen của HBV và đã xác định HBV ở người có 10 kiểu gen được đặttên từ A đến J , trong đó với 2 kiểu gen mới là I và J thì kiểu gen I gặp ở ViệtNam và Lào , và kiểu gen J đã được xác nhận ở quần đảo Ryukyu, Nhật Bản , Một số kiểu gen HBV được tiếp tục phân loại dưới kiểu gen (subtyp) Khitrình tự bộ gen HBV khác nhau trên 8% nucleotit được phân loại kiểu gen và

4 - 8% được phân loại dưới kiểu gen

Phân bố kiểu gen khác nhau giữa các nước và thậm chí giữa các vùngtrong một nước Sự khác biệt bệnh học giữa các kiểu gen đã được hiểu rõ mộtphần Ví dụ, kiểu gen A có xu hướng mạn tính, trong khi đột biến thường gặptrong kiểu gen C, kiểu gen D có xu hướng gặp cả mạn tính và đột biến, trongkhi nguy cơ từ viêm gan mạn tính tiến triển đến ung thư gan lại hay gặp ởkiểu gen C hoặc D Nồng độ HBV – DNA trong huyết thanh của bệnh nhân

có kiểu gen C có xu hướng cao hơn so với kiểu gen B Một nghiên cứu củaBùi Xuân Trường và cộng sự (2007) ở 183 bệnh nhân nhiễm HBV, kết quảcho thấy 67,8% là genotuyp B và 27,9% là genotuyp C Theo nghiên cứu củatác giả Bùi Hữu Hoàng (2003) tiến hành ở 87 bệnh nhân người lớn, trong đó

38 bệnh nhân ung thư gan, 24 bệnh nhân xơ gan và 25 người mang HBsAgmạn tính, kết quả cho thấy genotuyp A là 3,4%; genotuyp B là 45,5% vàgenotuyp C là 34,1%; 1 trường hợp đồng nhiễm genotuyp A và C; 17% khôngxác định được genotuyp

1.3.3 Quá trình nhân lên của HBV

Có thể tóm tắt quá trình nhân lên của HBV như sau: đầu tiên HBVthâm nhập vào tế bào gan qua sự gắn kết của HBV vào các thụ cảm thể trên

bề mặt tế bào gan Sau khi hòa màng, HBV cởi bỏ vỏ protein bao bọc bênngoài và giải phóng lõi ADN vào trong nhân tế bào gan Tại đây, bộ gen củaHBV biến đổi tạo thành cccDNA (covalently closed circular DNA) hoạt động

như một khuôn phiên mã tạo các ARN thông tin của vi rút Các ARN thôngtin này được vận chuyển qua màng nhân ra bào tương của tế bào và dịch mãtạo ra các protein vỏ (HBsAg), protein lõi (HBcAg), kháng nguyên hòa tan(HBeAg), polymerase, HBx protein và một số protein chưa xác định khác.Sau khi các protein trên được dịch mã tại bào tương sẽ thực hiện quá trình

"lắp ghép" các protein mới được mã hóa tạo thành với genom ARN của vi rút

Từ ARN của vi rút này sẽ phiên mã ngược tổng hợp hai chuỗi đơn ADN củaHBV để tạo thành HBV hoàn chỉnh rồi đi qua hệ thống lưới nội sinh chất(ER) bằng hình thức “nẩy chồi” và sau đó thoát ra khỏi tế bào gan vào hệthống tuần hoàn Trong quá trình này một số HBV-DNA mới được hình thành

ở trong bào tương sẽ quay trở lại nhân tế bào, rồi tổng hợp thành cccDNA,một số HBV trong hệ thống tuần hoàn tiếp tục gây nhiễm vào tế bào gan kháctiếp tục chu trình nhân lên mới của vi rút Quá trình đó cứ tái diễn nhiều lầntrong suốt thời gian tồn tại của HBV trong cơ thể vật chủ Người ta ước tính ởmỗi cá thể mang HBV mạn tính mỗi ngày có khoảng 1011 hạt vi rút được tạothành Tất cả HBV hoàn chỉnh cũng như các tiểu thể không hoàn chỉnh đềuđược đổ vào máu và lưu hành trong hệ tuần hoàn

Hình 1.3 Mô hình chu trình thâm nhập và nhân lên của HBV.

*Nguồn: theo Ganem and Prince (2004)

1.3.4 Đáp ứng miễn dịch trong nhiễm HBV mạn tính

Các nghiên cứu trên các bệnh nhân viêm gan B cấp tính và viêm gan B

tự hồi phục cho thấy một sự đáp ứng mạnh mẽ của hệ thống miễn dịch quatrung gian tế bào T đối với các kháng nguyên của HBV Các đáp ứng miễndịch này liên quan với cả hệ thống phức hợp hoà hợp mô chủ yếu lớp II, tếbào lymphô giúp đỡ CD4 và với lớp I, tế bào lymphô gây độc tế bào CD8 Đáp ứng kháng vi rút trực tiếp qua trung gian tế bào T gây độc tế bào đối vớicác quyết định kháng nguyên trong các đoạn nhân, polymerase, và vỏ cũngnhư các đáp ứng tế bào lymphô T giúp đỡ đối với các kháng nguyên đoạn lõi

và polymerase đã được chứng minh rõ ràng trong nhiễm HBV cấp tính

Ngược lại trong các trường hợp mang HBV mạn tính thì đáp ứng của tếbào lymphô T đặc hiệu là rất yếu Các nghiên cứu trên mô hình động vật đãchứng minh rằng mức độ tổn thương gan do đáp ứng viêm không đặc hiệu vớicác kháng nguyên thứ cấp quyết định, như đáp ứng miễn dịch qua tế bào

TCD8, và các cytokine như TNF, các gốc tự do, cũng như protease Các tếbào khác như tế bào giết tự nhiên (NK) cũng đóng vai trò quan trọng Cácnghiên cứu gần đây cho thấy các cytokine viêm như IFN gamma, TNF alfa cótác dụng kháng vi rút mà không liên quan tới việc huỷ hoại tế bào gan Khảnăng diệt vi rút mà không ảnh hưởng tới tế bào gan đích của các cytokine trên

có ý nghĩa rất quan trọng trong quá trình đào thải vi rút tự nhiên

Đáp ứng miễn dịch dịch thể đối với các kháng nguyên vi rút là rất tốt

và duy trì bền vững trên cả viêm gan cấp tính và mạn tính, mặc dù kháng thểkháng HBsAg (anti HBs) là ít khi tìm thấy vì có một lượng quá lớn củaHBsAg luôn được tổng hợp Điều đó gợi ý rõ ràng rằng đáp ứng tế bào T, đặcbiệt là đáp ứng tế bào T gây độc tế bào đóng một vai trò rất quan trọng trong

cơ chế loại trừ vi rút

Bên cạnh tế bào T, các tế bào hình sao cũng đóng vai trò quan trọngtrong bệnh sinh nhiễm HBV mạn tính Tế bào này đóng vai trò chủ yếu trongkhởi phát hoạt động tế bào T Thay đổi chức năng của các tế bào hình sao, cóthể dẫn đến tình trạng đáp ứng yếu của các tế bào T và B ở bệnh nhân CHB

1.3.5 Diễn biến tự nhiên của nhiễm HBV mạn tính

Diến biến tự nhiên của nhiễm HBV mạn tính trải qua 4 giai đoạn kếtiếp nhau

- Giai đoạn dung nạp miễn dịch (Immune tolerance phase) Xảy ra ởgiai đoạn sớm của nhiễm HBV mạn Giai đoạn này gặp ở những trẻ sơ sinh bịlây nhiễm HBV từ mẹ và thường xảy ra trong 20 năm đầu Trong giai đoạnnày ALT và AST thường không tăng nhưng tải lượng HBV - DNA thườngtăng cao, sinh thiết gan thường không phát hiện phản ứng viêm và xơ hóa Các chủng HBV trong giai đoạn dung nạp miễn dịch chủ yếu là các chủngHBV tự nhiên có HBeAg dương tính với rất ít hoặc không có đột biến HBeAg

âm tính

- Giai đoạn thanh thải miễn dịch (Immune clearance phase) Chuyển đổi

từ dung nạp miễn dịch sang thanh thải miễn dịch thường xảy ra ở tuổi từ 20

-40 tuổi, nhưng có thể bắt đầu sớm hơn thậm chí xảy ra ở trẻ em Trong giaiđoạn này HBeAg dương tính, ALT tăng Sinh thiết gan ở những BN này cótổn thương mô học và giảm HBcAg trong nhân tế bào gan với tăng HBcAgtrong nguyên sinh chất Hầu hết BN trong giai đoạn thanh thải miễn dịchthường không có triệu chứng nhưng tăng ALT từ trung bình đến cao Vì vậygọi là viêm gan vi rút B mạn HBeAg dương tính Đáng chú ý trong thực hànhlâm sàng có thể được nhấn mạnh bởi bùng phát viêm gan cấp với ALT tănggấp 5 lần ULN Giai đoạn thanh thải miễn dịch có thời gian thay đổi vàthường kéo dài trong nhiều năm đến khi chuyển đảo huyết thanh HBeAg

- Giai đoạn nhân lên thấp hay không nhân lên (Inactive or residualphase): xảy ra sau khi chuyển đảo huyết thanh từ HBeAg dương tính thànhanti-HBe dương tính Hầu hết những BN đã chuyển đảo huyết thanh duy trìsuốt đời tình trạng HBeAg âm tính và anti-HBe dương tính Tuy nhiên cókhoảng 10% số bệnh nhân có vi rút cao dai rẳng trong máu và ALT tăng cao,mặc dù có sự chuyển đảo từ HBeAg dương tính thành anti-HBe dương tính

- Giai đoạn tái hoạt động (Reactivation phase) Sau một thời gian nhấtđịnh, một số BN xuất hiện giai đoạn tái hoạt động với tăng tải lượng HBV-ADN huyết thanh, xuất hiện các đột biến PC/BCP Đột biến PC tạo ra mã(codon) dừng nằm trong bộ gen của HBV và ngừng tổng hợp HBeAg, trongkhi đó đột biến BCP ảnh hưởng trực tiếp trên hiện tượng sao chép mã để tổnghợp HBeAg Những đột biến này có thể đơn thuần hay phối hợp với nhaunhưng HBV vẫn tiếp tục tăng sinh mặc dù HBeAg âm tính tạo ra nhóm bệnhviêm gan vi rút B mạn HBeAg âm tính Diễn biến của viêm gan vi rút B mạnHBeAg âm tính có đặc điểm ALT tiếp tục tăng và dao động, xuất hiện triệuchứng lâm sàng và tổn thương tế bào gan ngày một nhiều dễ dẫn đến xơ gan

1.3.6 Chẩn đoán viêm gan B mạn tính

Chẩn đoán viêm gan B mạn tính phải dựa vào căn cứ:

1.3.6.1 Căn cứ lâm sàng

Viêm gan B mạn tính là một bệnh thường có tiến triển thầm lặng, biểuhiện lâm sàng nghèo nàn, không đặc hiệu Việc chẩn đoán xác định viêm ganmạn do HBV chủ yếu dựa trên các kết quả huyết thanh học và giải phẫu bệnhhọc

Phần lớn bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính không có triệu chứng lâmsàng Trong số các bệnh nhân viêm gan B mạn hoạt động được phát hiện chỉ

có khoảng 50% có tiền sử mắc viêm gan vi rút cấp trước đó

Triệu chứng lâm sàng thường gặp nhất là hơi mệt mỏi nhưng khôngthường xuyên, ăn ngủ kém, đầy bụng, khó tiêu, đau tức hạ sườn phải Chỉnhững đợt bột phát mới thường kèm theo sốt nhẹ Các triệu chứng gan to, mật

độ chắc, vàng da, lách to, sao mạch, thường gặp ở 25% trường hợp các bệnhnhân và chủ yếu là bệnh nhân lớn tuổi và nhóm bệnh nhân có tổn thương gantiến triển trên mô học

Enzym trasaminase thường tăng trung bình khoảng 2-5 lần giới hạn trênbình thường Bilirubin thường tăng ở mức độ nhẹ và vừa nhưng ở một sốbệnh nhân có thể tăng cao Tỷ lệ prothrombin giảm, albumin giảm, globulintăng có thể gặp ở những trường hợp viêm gan B mạn hoạt động mức độ nặng,giai đoạn chuyển xơ gan

Những triệu chứng ngoài gan gần giống như viêm gan vi rút cấp do sựlắng đọng các phức hợp miễn dịch Ag-Ab như đau khớp, viêm khớp, ban da,viêm cầu thận, viêm mạch

1.3.6.2 Căn cứ miễn dịch

Viêm gan B mạn tính được xác định khi HBsAg tồn tại trên 6 tháng saugiai đoạn khởi phát Nhưng trên thực tế phần lớn các bệnh nhân viêm gan Bmạn tính không rõ tiền sử HBsAg Anti HBc là dấu ấn quan trọng giúp phânbiệt viêm gan B trong giai đoạn cấp tính hay mạn tính Trong giai đoạn mạnthường chỉ có anti HBc type IgG(+)

HBV-DNA có giá trị chẩn đoán sớm nhất khi thấy dương tính kéo dàitrên 8 tuần sau khi có triệu chứng lâm sàng Trong viêm gan B mạn tính,HBV-DNA thường dương tính cùng với HBeAg, DNA polymerase vàHBcAg trong tế bào gan Trong những trường hợp viêm gan mạn HBeAg(-)

do đột biến pre-core và core-promoter, HBV-DNA dương tính là dấu ấn quantrọng để xác định tình trạng nhân lên của vi rút Do vậy việc xác định HBV-DNA là rất cần thiết HBV-DNA còn có giá trị trong theo dõi hiệu quả điều trịbằng các thuốc kháng vi rút

1.3.6.3 Căn cứ giải phẫu bệnh

Chẩn đoán mô bệnh học được coi là tiêu chuẩn vàng không những đánhgiá được mức độ viêm và hoại tử của gan mà còn dự đoán tiên lượng, theo dõimức đáp ứng điều trị

Chẩn đoán mô bệnh học được tiến hành trên một sinh thiết gan Mộtmẩu sinh thiết gan đáp ứng được yêu cầu phục vụ cho chẩn đoán khi nó tốithiểu phải bao gồm 3 khoảng cửa nguyên vẹn Hiện nay có nhiều bảng phânloại mô bệnh học viêm gan mạn khác nhau, trong đó phân loại theo bảng tínhđiểm của Knodell được áp dụng rộng rãi hơn cả

Đặc điểm tổn thương mô học của viêm gan mạn hoạt động: Là sự thâmnhiễm dày đặc của các tế bào đơn nhân ở khoảng cửa và xâm lấn vào tiểuthuỳ gan (ở viêm gan mạn do tự miễn có nhiều plasmocyt xâm nhập) Hoại tửmối gặm và hoại tử cầu nối và hiện tượng tái tạo các đám tế bào tạo nênnhững tiểu thùy giả hoặc đảo lộn tiểu thùy khi tổ chức xơ phát triển mạnh Vềtiêu chuẩn mô học của viêm gan mạn hoạt động ít nhất phải có là hoại tử mốigặm Hoại tử cầu nối có thể thấy ở viêm gan cấp nhưng ở viêm gan mạn hoạtđộng có hoại tử cầu nối là biểu hiện tiến triển đến xơ gan bởi vì những vùnghoại tử cầu nối sẽ phát triển thành cầu xơ chia cắt các tiểu thùy gan hình thànhcác cục tân tạo (nodules) và phát triển tới xơ gan

Đánh giá mức độ hoạt động của viêm gan mạn tính dựa vào chỉ số hoạtđộng mô bệnh học (Histological activity index: HAI) Theo đó, Knodell chiathành 4 mức độ hoạt động của viêm gan mạn như sau :

HAI = 0 điểm: không hoạt động

HAI = 1 – 3 điểm: viêm gan hoạt động mức độ tối thiểu

HAI = 4 – 8 điểm: viêm gan hoạt động mức độ nhẹ

HAI = 9 – 12 điểm: viêm gan hoạt động mức độ vừa

HAI = 12 – 18 điểm: viêm gan hoạt động mức độ nặn

1.4 Stress oxy hóa trong bệnh lý viêm gan B mạn tính

Trong bệnh lý gan mạn tính có rất nhiều yếu tố bệnh sinh độc lập vớicác yếu tố gây bệnh (vi rút, rượu, phản ứng tự miễn dịch…) gây ra quá trìnhtổn thương gan Trong hầu hết các trường hợp từ tổn thương gan ban đầu, dầndần sẽ dẫn tới viêm gan mạn tính, xơ gan và cuối cùng là ung thư gan Tìnhtrạng strees oxy hóa có một ý nghĩa nhất định góp phần làm sáng tỏ cơ chếbệnh sinh trong các bệnh gan như bệnh gan do rượu, viêm gan vi rút mạntính, bệnh gan tự miễn và bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu Tế bào gan sẽ

bị tổn thương khi có dư thừa các gốc tự do trong cơ thể có nguồn gốc từ oxy

và nitơ

Trong những năm gần đây, dưới góc độ sinh học phân tử, đã có nhữngtiến bộ trong nghiên cứu về các tế bào kiểm soát sự cân bằng giữa các chấtchống gốc tự do và gốc tự do Trên cơ sở các bằng chứng này, trong nhữngnăm gần đây, các chất chống oxy hóa được sử dụng như một chiến lược hợp

lý trong điều trị bệnh gan mạn tính Chưa có một nghiên cứu lâm sàng với sốlượng lớn bệnh nhân, tuy nhiên với các nghiên cứu nhỏ, thực hiện ở nhiềutrung tâm khác nhau đã chỉ ra rằng việc sử dụng các chất chống oxy hóa trongđiều trị bệnh gan mạn tính là có giá trị đặc biệt là sự kết hợp chất chống oxyhóa với kháng viêm và/ hoặc thuốc kháng vi rút Việc sử dụng các chất chốngoxy hóa như S-adenosylmethionine (SAMe; ademetionine), tocopherol

(vitamin E), polyenylphosphatidylcholine hoặc silymarin đã cho kết quả hứahẹn trong một số bệnh lý , ,

1.4.1 Stress oxy hóa ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính

Các nhóm oxy hoạt động (ROS) và các loại nitơ phản ứng (RNS) đượchình thành từ các chất nội sinh và ngoại sinh khác nhau gây tổn thương lipid,protein và DNA tế bào ở các mức độ khác nhau Ti thể là nguồn sản xuấtROS ROS có thể hình thành thông qua sự rò rỉ electron từ chuỗi hô hấp tithể ROS có thể gây tổn thương DNA ở các mức độ khác nhau theo nhữngcon đường khác nhau Bản thân HBx có mục tiêu là ty lạp thể và trực tiếptương tác với kênh anion phụ thuộc vào điện áp từ đó làm thay đổi điện thếmàng ty thể và làm tăng ROS nội sinh cấp , HBx gây ra stress oxy hóa thôngqua kênh canxi và kích hoạt tế bào kinase, dẫn đến kích hoạt các yếu tố phiên

mã NF - •B, bộ chuyển đổi tín hiệu và kích hoạt phiên mã 3, và những quátrình khác thông qua phosphoryl hóa Ngoài ra, khi HBV gây ra stress oxyhoá cũng kích thích sự phiên mã của kinase protein Raf -1 đến ty thể Kíchhoạt này liên quan đến cả Src kinase qua trung gian của miền kích hoạt Raf –

1 HBx cũng gây ra peoroxy hóa lipid thông qua sự xuất hiện SEP, kết quảlàm gia tăng TNF – α

Mặc dù ROS và RNS là những dấu hiệu có giá trị tốt nhất trong đánhgiá trạng thái stress oxy hóa, nhưng ROS và RNS là những chất không ổnđịnh và dễ bay hơi Do đó, để đánh giá trạng thái stress oxy hóa do ROS vàRNS gây ra, chúng ta có thể xác định thông qua các "sản phẩm phụ" đượcROS / RNS in dấu trên các protein, lipid và DNA hoặc thông qua hoạt độ một

số enzym chống oxy hóa như superoxyd dismutase (SOD), glutathionperoxydase (GPx) và trạng thái chống oxy hóa toàn phần (TAS) của cơ thể để

có thể đánh giá tình trạng stress oxy hóa

Nhiễm vi rút viêm gan B mạn tính là một yếu tố nguy cơ quan trọngtrong sinh bệnh học của viêm gan mạn tính, xơ gan và ung thư gan Đột biến