20 Phan Tuấn NíihTa, Đ ặng Quang HưngĐiện di trê n gel polyacrylam id có SDS SDS-PAGE được thực h iệ n theo phương pháp của L aem m li [3].. Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, KHTN ả CN... rinh s
Trang 1TAP CHỈ KH O A HOC D H Q G H N , KHTN & CN, T.xx, sỏ' 4, 2004
TINH SẠCH CHẤT ứ c CHE TRYPSIN (TI) TỪ HẠT ĐẬU TƯƠNG
( G L Y C I N E M A X L.)
P h a n T u â n N g h ĩ a , Đ ặ n g Q u a n g H ư n g
K hoa S in h học, Trường Đ ại học K hoa học T ự n h iê n , Đ H Q G H N
1 Đ ặ t v ấ n đ ề
H ạ t đ ậu tương 0G lycine m a x L.) có chứa h a i ức c h ế try p s in điển h ìn h với khôi lượng
p h â n tử 8 kD a và 20 k D a và được gọi tương ứng là c h ấ t ức c h ế B o w m an -B irk và c h ấ t ức chê
K unitz th e o cách gọi c ủ a các tác giả lần đ ầu tiên p h á t hiệ n và tin h sạch ch ú n g [2, 4,] Cho đến nay các tính c h ấ t của cả hai c h ấ t ức c h ế n ày đã được n g h iê n cứu r ấ t kỹ [1, 6] Cả hai
c h ất đều đã được m ột số h ã n g hoá c h ấ t t in h sạch và s ả n x u ấ t làm các p ro tein c h u ẩ n cho việc
xác định khôi lượng p h â n tử b ằ n g sắc ký lọc gel và b ằ n g điện di T uy n hiên , ở Việt N am cho đến nay chưa có công tr ì n h nào báo cáo về việc tin h sạch các c h ấ t ức chê này N ghiên cứu này n h ằ m mục đích t h iế t lập một qui tr ì n h tương đôi đơn giản, dề á p d ụ n g đê tin h sạch c h ất
ức chê K u n itz (KI), với khôi lượng 20 kD a vốn k h á bền với nhiệt, có h à m lượng tương đôi cao tron g n guồ n nguyên liệu bột đ ậu tương dễ kiếm, giá rẻ để có th ế sử d ụ n g n h ư một protein
c h u ấn cho việc đ á n h giá khối lượng của các protein th a y cho việc n h ậ p ngoại giá cao
2 N g u y ê n l iệ u v à p h ư ơ n g p h á p n g h i ê n c ứ u
2.1 N g u y ê n liệ u
H ạ t đ ậu tương (G lycine m a x L.) được m u a từ h à n g h ạ t giống H à Nội và được định tê n
khoa học bới chu yên gia p h â n loại thực vật
T ry p sin của h ă n g Sigm a (Mỹ), các pro tein c h u ẩ n của h ã n g P h a rm a c ia (Thụy điển)
T ryp sin -S e p h aro se được ch ú n g tôi tự tông hợp b ằ n g cách g ắn try p s in tin h k h iế t của h ã n g Sigm a vào S e p h a ro se 4B đã được h o ạ t hoá b ằ n g B rC N của H ã n g P h a rm a c ia Các hoá c h ất còn lại đều đ ạ t độ tin h k h iế t d à n h cho p h â n tích
2.2 P h ư ơ n g p h á p n g h iê n cứ u
H oạt độ ức c h ế try p s in (TIA) được xác định th e o phương p h á p k h u ế ch tá n tr ê n đĩa thạch và phương p h á p được mô tả trorig [7] Một đơn vị c h ấ t ức c h ế try p s in là lượng c h ấ t ức chê có k h ả năng là m g iảm 50% h o ạ t độ của 2 mg tr y p s in tin h k h iế t tro n g các điều kiện
p h â n tích
P ro tein được xác định b ằ n g hai phương pháp: đo độ h ấ p t h ụ á n h s á n g ở vù n g bước sóng 280 n m (A2g0) đối với các p h â n đoạn t h u q ua các cột sắc ký cột và phương p h á p Lowry [5] sử d ụ n g a lb u m in h u y ế t t h a n h bò (BSA) làm c h ấ t c hu ẩn
19
Trang 220 Phan Tuấn NíihTa, Đ ặng Quang Hưng
Điện di trê n gel polyacrylam id có SDS ( SDS-PAGE) được thực h iệ n theo phương pháp của L aem m li [3] T ro ng to à n bộ n g hiên cứu n à y c h ú n g tôi d ù n g nồng độ gel tá c h là 12,5% và nồng độ gel cô là 4%
3 K ế t q u ả v à t h ả o l u ậ n
3.1 C h u ấ n bị d ịc h c h iế t h ạ t đ ậ u tư ơ n g
H ạ t đ ậ u tương được n ghiền mịn 20 g bột nghiền mịn được loại mõ b ằ n g ete etylic (theo tỷ lệ 1 g bột 5 ml ete) P h a nổi ở tr ê n chứa mõ tro n g ete được gạn bỏ, p h ầ n bột đã loại
mõ được cho làm bav hơi ete ở n h iệ t độ phòng
Bột đậu tương loại mõ được chiết b ằ n g đệm Tris-HCl, 20 mM, pH 7,5 có chứ a 50 mM KC1 (đệm A) theo tỷ lệ 1:5 (khôi lượng:thể tích) tro n g 1 giò Dịch đồng th ê được ly tâ m ỏ 14.000 v/ph tro n g 20 p h ú t ở 4°c Dịch tr ê n t ủ a được th u lại K ết t ủ a được c h iế t lại với cùng đệm A n h ư n g theo tỷ lệ 1:3 (w:v) và th u dịch tr ê n tủ a b ằ n g ly tâ m
3.2 S ắ c k ỷ tra o đ ô i io n q u a côt DE-52 cellu lo se
Dịch chiết h ạ t đ ậ u tương của h a i lầ n được trộ n lại và cho lên cột DE-52 cellulose (có kích thước l,6x 8 cm) đã được cân bằng với đệm A ở trê n Tốc độ lên cột là 20 ml/giờ
S au khi cho to à n bộ dịch chiết chảy qua cột, cột được rử a b à n g đệm A cho đên khi
A.,80 của dịch rửa chiết nhỏ hơn 0,005 (khoảng 120 ml) và s a u đó được p h ả n hấp th ụ b ằng
g ra d ie n t NaCl từ 0,05-1,0M ph a trong cùng đệm A Tốc độ rử a chiết là 25 ml/giờ vói mỗi
p h ân đoạn th u là 2ml
Kết quả cho th ấ y pro te in và TIA được p h á t h iện ở cả p h ầ n dịch không h ấ p t h ụ (phân đoạn I) Tuy nhiên, qua th ứ nghiệm c h ú n g tôi th ấ y c h ấ t ức c h ế K unitz (Kl) khồn g thuộc
p h â n đoạn I nên c h ú n g tôi khôn g tiếp tục tin h sạch KI từ p h â n đ oạn này s ắ c ký đồ của
ph ầ n protein h ấ p th ụ trê n cột (hình 1) cho th ấ y có h ai đ ỉn h pro te in chính, tro n g đó chỉ đỉnh
th ứ n h ấ t được đẩy ra ở nồng độ NaCl từ 0,3 đến 0,5M là có TIA (và được ký hiệu là phân đoạn II) Còn đ ỉnh p rotein th ứ hai được đẩy r a ỏ nồng độ NaCl cao hơn thì kh ô n g có TIA Nhờ loại bỏ được p h ầ n p rotein không g ắn với cột và p h ầ n p ro te in có ái lực cao do đó chê phẩm KI th u được đã có độ sạch tă n g lên 10,2 lầ n so với b a n đ ầ u (bảng 1) Kết q u ả SDS- PAGE của p h â n đoạn II còn chứa r ấ t n h iề u b ă n g protein, tro n g đó có b ă n g với khôi lượng
p h â n tử 20 kD a (hình 3)
3.3 S ắ c k ý q u a cộ t lọc g e l S e p h a d e x G-100
Các p h â n đoạn II có TIA của bước sắc ký qua cột DE-52 cellulose được dồn lại, loại muôi b ằ n g th ẩ m tích, cô đặc đến 2 ml và cho sắc ký qua cột q u a cột lọc gel S e p h a d e x G-100 (có kích thưỏc 1x70 cm) đã được cân b ằ n g cùng đệm A Cột được rử a chiết b ằ n g cùng đệm A với tốic độ dòng chảy 20 ml/giờ, th u mỗi ông 2,5 ml
Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, KHTN ả CN T.xx, So 4, 2004
Trang 3rinh sạch cliàl ức chê Irypsin 21
Sac ký đồ p h â n đoạn II s a u khi qua cột lọc gel có 1 đỉnh p ro te in lớn và một v ù n g đinh kéo dài đến ông th ứ 40, tu y vậy chỉ có m ột đỉnh TIA, ứng với các ông từ 10-22 là có TIA
N hư vậy bước sác ký lọc gel đã cho phép loại bỏ n h iề u protein k h ô n g m ong muốn, nhờ đó độ sạch của c h ế p h ẩ m KI đã được tă n g lên 12,6 lầ n so với b a n đ ầ u (bảng 1) Tuy vậy, k ế t quả
chạy SDS-PAGE cho th ấ y c h ế p h ẩ m v ẫn còn m ột số b ă n g p ro te in k h á c n h a u , ch ứn g tỏ cần
phái được tiếp tục tin h sạch
3.4 S ắ c k ý á i lự c q u a cột T r y p sin -S e p h a r o se 4B.
Đinh TIA từ bước sắc ký lọc gel được t h u lại, th ẩ m tích đối đệm A và cho sắc ký qua
cột try p sin -se p h aro se 413 đã được cân b à n g với đệm A có chứa 2 mM CaCl._> Protein không hấp th ụ và gắn k hô ng đặc hiệu được đẩy b ằ n g d u n g dịch NaCl IM p h a tro n g cùng đệm A
P hần protein gán đặc hiệ u trê n cột được đẩy b ằ n g d u n g dịch HC1 0,001 M có chứa 2 mM CaClj Kết q u á p h ả n tích cho p h ầ n dịch đẩy b ằ n g N aCl có p rotein n h ư n g không có TIA Dịch p h á n h ấ p t h ụ có chứa cả pro tein và TIA Độ sạch của c h ế p h ẩ m q u a bước này tă n g lên 37,2 lần
Kết quá p h â n tích SD S-PA G E (hình 3) cho th ấ y , c h ế p h ẩ m KI th u được (cột 6 và 8) có duv n h ấ t một b ă n g p ro te in với kích thước b ằ n g 20 kD a, n ằ m đ ú n g vị tr í của b ă n g c h ấ t ức chế K unitz từ đ ậu tươ ng trê n đường chạy của các pro tein c h u ẩn K ết q u ả này chứng tỏ chế pha 111 Tí th u được là đã tin h sạch Qui tr ì n h tin h sạch TI từ đ ậ u tươ ng được tóm t ắ t ở báng
ỉ bao gồm các bước: loại mỡ b ằ n g etylic và chiết b ằ n g đệm Tris-H Cl, sắc ký q ua cột tra o đối ion DE-52 cellulose, sắc ký lọc gel q u a cột Seph ad ex G-100 và sắc ký ái lực q ua cột Trypsin- Sepharose 4B
4 T h ả o l u ậ n
C h ấ t ức chê K u n itz (KI) với h o ạ t tín h ức c h ế try p s in lần đ ầu tiên đã được K u n itz tách
ra từ h ạ t đậu tương m ột qui tr ì n h n h iề u bước k hác n h a u [2] S au n ày F e d u rk in a và Mosolov
111 dã p h á t triể n m ột phương p h á p tin h sạch KI từ h ạ t đ ậu tương r ấ t đơn g iả n b ằ n g sắc ký lìấp th ụ miễn dịch, tro n g đó các tác giả đã sử d ụ n g KI thươ ng m ại gây k h á n g th e k h á n g KI
ỏ thổ và gắn k h á n g t h ể th u được lên S epharo se 4B để tạo cột ái lực T uy nhiên, bước phức
tạ p cua phương p h á p n ày là phải gây được k h á n g th ê k h á n g KI Qui tr ì n h của ch ú n g tôi với
3 bước sác ký phôi hợp ỏ t r ê n là dễ d à n g áp d ụ n g với các phòng th í nghiệm hoá sinh thông thường hiện nay Qui tr ì n h cho phép th u được k h o ả n g 6 mg Kĩ từ 20 gam nguyên liệu ban đẩu Chê p h ẩ m có độ tin h k h iế t cao, h o à n to à n p h ù hợp với mục đích sử d ụ n g n h ư một protein c h u ẩ n cho việc đ á n h giá khôi lượng p h â n tử b ằ n g sắc ký h a y điện di Hơn t h ế nữa, với h o ạ t độ riên g 1,17 ĨU /m g pro tein (bảng 1) và dự a t r ê n tỷ ]ệ ức c h ế lm o l KI: lm o l tryp sin
c ho thây KI th u được v ẫ n giữ n g u y ê n h oạt độ ức c h ế enzym đích
Ỉ ỤỊÌ c hi Khoa học D IIỌ C Ì/IN K H IN & CN T.xx Sô'4 2004
Trang 40 20 40 60
Sò phán đoạn
Hình 1: sác ký qua cột DE-52 cellulose dịch chiết hạt đậu tương có chửa chất ức chê trypsin Cột có kích thước l,6x8cm được cân bằng với đệm A Tốc độ rứ a chiết 25 ml/giò, th u mỗi p h â n đoạn 2,0 ml
Protein TIA
«•
X
Hình 2: sắc ký qua cột Sephadex GlOO phân đoạn TI của hạt đậu tương
Cột có kích thước 1 X 70cm được cân b ằng với đệm A Tốc độ rử a chiết 20 ml/giò, th u mỗi p h â n đoạn 2,5 ml
Tạp chí Khoa liọc fíflQ (} ỈIN K H Ỉ N ấ' CN 'Ị XX So 4 2004
Trang 5Tinh sạch chái ức chế trypsin 23
B ản g 1: Tóm tát qui trình tinh sạch chất ức chê trypsin 20 kDa từ hạt đậu tương
Kết q uả tin h sạch
Protein (mg)
TIA (đơn vị)
H oạt độ riêng (đơn vị/ mg protein)
Hệ sô tinh sạch (lần)
1 Loại mở b ằ n g ete etylic và
c hiết b ằ n g đệm A
2
Sắc ký q u a cột DE-52
3 Sắc ký q ua cột S ep h a d ex G-
4 s á c ký q ua cột Trypsin-
S e p h a ro s e 4B
kDa
4 97
4 66
i 45
4 30
4 14
H ình 3: Điện di gel polyacrylamid 12,5% có SDS chế phẩm chất TI từ đậu tương
1: Dịch chiết hạt đậu tương, 2: Đinh TIA thu từ cột DE-52, 3 và 4: đỉnh TIA thu từ cột Sephadex G-100, 6 và 8: Chế phẩm TI thu từ cột sắc ký ái lực Trypsin-Sepharose 4B, 7: Các protein chuẩn bao gồm: Phosphorylase B, albumin huyết thanh bò, ovalbumin, cacbonic anhydrase, chất ức chê trypsin (KI) đậu tương và lactalbumin
TÀI L IỆ U THAM KHẢO
1 Fedurkina N V and Mosolov.V.V., Purification of soy bean trypsin inhibitor by
immunoabsorption, Applied Biochem an d M ic r o b io l20(1984), 452-457
2 Kunitz M, Crystalline soy bean trypsin inhibitor II General properties, J Gen Physiol
30(1947), 291-310
I tip chi Khoa hục DHQCiHN K H IN & CN, T.XX, So 4, 2004
Trang 624 Phan Tuấn NiihTa, Đạiìii Qiumu Hưim
3 Laemmli U.K Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4 N ature, 227(1970), 680-685
4 Laskowski M Jr and Kato I Proteinase inhibitors of proteinases, A nna Rev Biochem ,
49(1980), 593-676
Õ Lowry O.H., Rousenbrough N.J., Farr A.L., Randall R.J., Protein m easurem ent with
the Folin phenol reagent, J Biol C h e m 193(1951), 265-275
6 Park D.S., Gramham M.Y., Graham T.L., Identification of soybean elicitation competency
factor, CF-1, as the soybean Kunitz trypsin inhibitor Physiol Mol P lant P a t h o l 59(2001),
265-273
7 Phan T.N and Pham T.C., Trypsin inhibitors in developing seeds oỈ M om ordica charantia L., Proc N a tl Center Sci Res V i e t n a m 2(1990), 129-137.
VNU JO URN AL OF SCIENCE Nat., S c L & Tech., T.xx, N04, 2004
P U R I F I C A T I O N O F T R Y P S I N I N H I B I T O R (TI) F R O M S O Y B E A N S
(G L Y C I N E MAX L.)
P h a n T u an N g h ia and D an g Q u an g H u n g
D epartm en t o f Biology, College o f Science, V N Ư
A protocol for purification of th e soybean try p sin inhibitor (SBTI) or K u n itz in hibito r (KI) h a s been reported The g round powder w as e x tra cte d w ith ethylic e t h e r to rem ove fat, then re su sp e n d ed a n d m agnetically s tirre d in 20mM Tris-H Cl buffer, pH 7.5 c o n ta in in g 50
mM KC], followed by cen trifu g a tio n to collect th e clear s u p e r n a n t a n t fluid T h e e x tra c t th e n
u n d e rw e n t 3 steps of purification: i) anion exchange column c h ro m a to g ra p h y on DE-52 cellulose, ii) gel filiation on S ep hadex GlOO and iii) affinity c h ro m a to g ra p h y on Trypsin-
S epharose 4B The o b ta in e d TI p re p a ra tio n contained only a single p ro tein of a m olecular
w eight of 20 kD a a s shown at th e sam e position of th e s ta n d a r d KI p re s e n t in the molecular weight m a rk e rs on SDS-PACtE The protocol allows to o b ta in 6.4 mg KI from 20
g of soybean ground pow der an d th e purification factor of th e KI a fte r th e 4 s te p s in creased
37 fold
Tạp chi Khou học ĐHQGHN Kin N & CN I XX So 4 2004