Trong nghiên cứu này chúng tôi trìn h bày những đặc tín h s in h học của hai chủng Bacillus sp.. Albolabra Bailey Huyền dịch nuôi sục k h í 24 giờ tuổi của hai chủng T20 và M27 được dùng
Trang 1NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG HAI CHỦNG B A C I L L U S
T20 VÀ M27 NHƯ CÁC CHÊ' PHAM sinh học đe tảng năng SUẤT CÂY RAU CẢI LÀN B R A S S I C A O L E R A C E A VAR
ALBOLABRA BAILEY
N gô T ự T h à n h
K hoa S in h học, Trường Đ ại học K hoa học T ự nhiên, Đ H Q G H N
1 M ở đ ầ u
B acillus là m ột trong n h ữ ng chi vi k h u ẩn có n h iều h o ạt tín h sinh học quý H àng loạt
hoạt tính enzym đã được p h á t hiện [7], đặc b iệt là các proteaza kiểm [3,4,8] Các ho ạt tính khác bao gồm: khả n ãng k h á n g vi k h u ẩn gây bệnh héo xanh ỏ cà chua [1], sinh axit indol axetic (IAA) [2], p h ân h u ỷ p h o tp h a t khó ta n [9], p h ân h u ỷ bã th ả i động v ậ t giáp xác [10] C hính nhò th ế, vi k h u ẩ n n ày đã được dùng dể đ ư a vào các ch ế phẩm hoặc phân sinh học [1,2,6]
Trong nghiên cứu này chúng tôi trìn h bày những đặc tín h s in h học của hai chủng
Bacillus sp T20 và M27 và việc ứng dụng chúng nhằm tăn g n ăn g s u ấ t cây ra u cải làn ịBrassica oleracea var albolabra bailey).
2 Đ ôi t ư ợ n g v à p h ư ơ n g p h á p n g h i ê n c ứ u
a) Vi s in h vật: Hai ch ủ n g ưa kiềm B acillus sp T20 và M27 được ph ân lập từ đất b) M ôi tr ư ờ n g nuôi: Môi trường Horikoshi & Akiba cải tiến (môi trường sô' 1) để nuôi
dịch th ể hai chủng, có th à n h p hần như sau (g /ỉ): glucoza 10, gelatin 5, cao nấm m en 0,3,
KH2P 0 4 2, M g S 0 4.7H20 0,2
• Môi trường thạch d in h dưỡng (môi trưòng số 2) để xác định tổng sô' vi s in h v ậ t hiếu
khí của đ ấ t trồng, có th à n h p h ần như sau (g/l): pepton 5, cao th ịt 3, NaCl 5, th ạc h 16.
c) Xác đ ịnh hoạt tín h các enzym và axit indol axetic (IAA)
- Proteaza được xác đ ịn h b ằng phương pháp khuyếch tá n trê n thạch 0,2m l dịch nuôi được nhỏ vào các lỗ có đường k ính 10m m trê n các đĩa th ạc h có cơ ch ấ t (gelatin, sữa gầy) rồi
giữ ờ tủ lạnh trong 36 giờ S au đó vòng phân h uỷ được p h á t hiện bằn g cách trá n g lên các đĩa
1 m l su lp h at am ôn bão hoà Đưòng kính vòng phán h uỷ được đo, tín h b ằng m m
■ A m ila za và Carboxym etyl xenlulaza (CMC-aza) được xác định bằn g cách cấy điểm
trên đĩa thạch có cơ ch ấ t tương ứng (tinh bột, CMC), sau 48 giờ, trá n g lên đó 1 m l lugol và đo vòng phân h uỷ x u ấ t hiện xung qu an h k h u ẩn lạc, tín h bằng m m
- Ureaza được định tín h bằng cách lần lượt cho vào ông nghiệm các dịch s a u (ml): dịch
nuôi vi khuẩn 1; đệm p h o tp h a t 0,1M, p H 7 ,l 2; u rê 3% 1; nưốc c â t 0; toluen 2 giọt; phenolphtalein 1% trong cồn 2 giọt Trong ống dối chứ ng thì u rê được th ay bằng nước cất
Trang 2Nếu dịch nuôi có ho ạt tín h ureaza, th ì ông thí nghiệm sẽ có m àu hồng so với ông đối chứng không màu
• A xit indol axetic (IAA) được định tính bằng cách cho 1 m l dịch nuôi (trê n môi trường
có bố sung tryptophan) tác dụng với 2m t thuốc th ử Salkow ski (Xanpe) K ế t quả là dương
tính nếu xu ất hiện m àu hồng, từ hồng n h ạ t đến đỏ, tu ỳ theo h àm lượng IAA
d) Đếm tô n g s ố vi s in h vậ t h iế u k h í tro n g đấ t
Cấy g ạ t 0,1 m l huyền dịch đ ấ t ở độ pha loãng thích hợp lên đĩa môi trưòng Đếm các
khuẩn lạc x u ất hiện, từ đó tín h ra sô’ CFU/g đ ất như sau:
Sô lương CFU/g = a — 10 =
Trong đó: a: sô’ k h u ẩn lạc trung bình trên 1 đĩa
k: độ p h a loãng của huyền dịch
10: hệ sô để quy về 1 m l huyền dịch.
e) X á c đ ịn h ả n h h ư ở n g c ủ a c h ế p h ẩ m 2 c h ủ n g B a c illu s lên s in h tr ư ở n g và n ă n g suất của cây rau cải làn ( B r a s s i c a o l e r a c e a var Albolabra Bailey)
Huyền dịch nuôi sục k h í 24 giờ tuổi của hai chủng T20 và M27 được dùng để tưối
cho ra u cải làn Một luông ra u cải làn diện tích 30m 2 được chọn làm th í nghiệm Luông được
chia làm nhiều ô ứng vối các công thức 1, 2, 3, (CT|, CT2, CT3) xen kẽ n h au (tổng diện tích các 6 cúa mỗi công thức là 10m2):
CT,: tưới mỏi trườ ng không nuôi vi khuẩn
CT>: tưới huyền dịch chủng T20
CT3: tưới huyền dịch chủng M27
• Lịch tưới là: 8; 15; 23 và 33 ngày tuổi (lúc th u hoạch) Lượng tưói (mllgốc) theo thứ
tự các lần tưới là 10, 50, 70 và 70 Nền phân bón vô cơ trê n to àn diện tích (k g ) là u rê 1,2;
supe lân 1,7; KC1 0,7
• Các đại lượng đ ể đánh giá sinh trường của cây rau cải là n : C hiểu cao cảy (trung
bình của 10 cây ngẫu n h iên trong mỗi công thức, cm), sô’ lá (tru n g bình như trên ), năng s u ấ t trên diện tích 10m2của mỗi công thức (tổng trọng lượng các cây (bỏ gốc và lá già) trong từng công
thức kg).
3 K ế t q u ả v à t h ả o lu ậ n
a) M ột s ố đ ă c tín h s in h học củ a h a i ch ủ n g T20 và M 27
• Hoạt tín h proteaza
Hoạt tính này được đ ánh giá qua k h ả năng phân h uỷ gelatin và sữ a gầy Kết quả nêu trên h inh 1 cho th ấ y cả h a i chủng đểu có h a i h o ạ t tín h n à y , và c h ủ n g T20 m ạnh hơn
Trang 32 5 -
20
-s 15
Ằ _
Khả năng phâr huỷ gelatin
■ Khả năng phâr b u ỷ rta
Chủng
Hình 1 Hoạt tính phân huỷ gelatin và sữa gầy của 2 chủng T20 và M27
Ghi chú: D là dường kính vòng phân huỷ (mrn)
• Hoạt tín h a m ila za và CMC-aza
Bằng kỹ t h u ặ t cấy điểm, các h o ạt tính này được xác đ ịnh là tương đương nh au ở hai chủng: đường k ính vòng p h â n hnỷ tin h bột của T20 và M 27 lần lượt bằng 19,5 và 20mm, đưòng kính vòng p hân huỷ CMC đều bằng 20mm
• H oạt tín h ureaza và hoạt tín h sinh a xit indol axetỉc (IAA)
Các phép đ ịnh tín h cho thấy h o ạt tính ure aza là dương tín h ở chủng M27, âm tín h ở
chủng T20, còn hoạt tính IAA đều dương tính ở cả hai chủng, ở M27 m ạnh hơn so với ở T20
b) Tác d ộ n g c ủ a c h ế p h ẩ m h a i ch ủ n g T20 và M27 đ ế n tổ n g s ố vi s in h v ậ t (VSV)
h iế u k h í tr o n g đ ấ t trồ n g ra u c ả i là n
CFU(xlO ')!g
150
100
-136
a
112
1
H ình 2 Sô' lượng v s v hiếu khí trong 4 loại đất
Xác định tổng sô 'v s v hiếu k h í trong 4 công thức đất: trưốc khi trồng ra u cải làn (TT),
Trang 4thức 2 (CTo): được tưới định kỳ huyền dịch nuôi chủng T20, và công thức 3 (CT3): được tưới định kỳ huyền dịch nuôi chủng M27
Kết quả nêu trê n h ình 2 cho th ấ y sô lượng v s v h iếu k h í tă n g d ần từ trước khi trồng tới sau khi th u hoạch Điểu đáng chú ý là sô' lượng này ở h a i loại đ ấ t được tưới hai huyền dịch của hai chủng đểu cao hơn so với ờ đ ấ t dối chứng (CT,) Ngoài ra , chủng T20 có tác dụng tãn g cưòng sô' lượng v s v hiếu kh í m ạnh hơn so vối M27
c) T ác đ ộ n g của c h ế p h ẩ m h a i ch ủ n g T20 và M27 đến sin h trưởng củ a cây rau cài làn
T hí nghiệm được tiến h à n h theo 3 công thức như trong m ục b K ết q u ả được nêu trong hinh 3, bảng 1, và h ình 4
ŒCT1 (Tưới môi trường không nuôi 2 chủng)
■ CT2 (Tưái huyền dịch chủng T20)
EỈCT3 (Tưới huyên dịch chủng M27)
H ình 3 Chiều cao cây rau cài làn ờ ba công thúc thi nghiệm
B ả n g 1 Sô lá tru n g bình của cây ra u cải làn ở 3 công thứ c th í nghiệm
_Công thức
33 ngày (thu hoạch) 6,7 7,5 8,3
Qua hình 3, b ảng 1 và h ình 4 th ấ y rằ n g chế phẩm của h a i chủng đểu có tá c dụng tích cực đến các đại lượng được theo dõi của cây (chiểu cao, sô'lá, trọ n g lượng cây) Tác dụng này, theo tuổi cây, càng vê sau càng rõ
Ngoài ra còn th ấy rằng tác dụng cùa chế phẩm chủng M27 là lớn hơn của chủng T20 Điều này có th ể liên qu an trự c tiếp hoặc gián tiếp đến h a i đặc tín h vượt trội của M27: hoạt
Trang 5CT1 CT2 CT3 Công thức
Hình 4 Tông trọng lượng các cây rau cài làn ờ từng công thức thí nghiệm (10 m2)
4 K ế t lu ậ n
Hai chủng Bacillus ưa kiểm T20 và M27 có ho ạt tín h ph ân huỷ gelatin và sữa gầy,
phân h uỷ tinh bột, cacboxymetyl xenluloza, tổng hợp axit indol axetic R iêng M27 còn có thêm h o ạt tín h ureaza Huvền dịch nuôi của hai chủng đêu có tác dụng tô t vâi cây ra u cải
làn Brassica oleracea var albolabra bailey (tăng chiểu cao, sô'lá, trọng lượng cây) Tác dụng
này của chúng M27 lớn hơn của chủng T20
T À I L IỆ U T H A M K H Ả O
1 Nguyễn Thị Phương Chi, Phạm Thanh Hà, Nguyễn Quỳnh Mai, Hồ Kim Anh, Nguyễn Ngọc Dũng, Nguyễn Thị Hồng Nhị Phạm Văn Toàn, Lựa chọn th ành phần các chủng vi khuẩn
trong phân vi sinh vặt đa chức n ăng cho cây cà chua, Báo cáo khoa học Hội nghị Cõng nghệ
sinh học toàn quốc lần th ử hai NXB Khoa học và Kỹ th u ật, Hà Nội, 2003, tr.194-198.
2 Phạm Việt Cường, Phạm Văn Toản, Nguyễn Thị Tuyết Mai, Nguyễn Thị Kim Cúc, Sinh
tổng hợp indol-acetic-acid (IAA) của một số chủng vi khuẩn chi Bacillus phân lập từ đất trồng tại Việt Nam, Báo cáo khoa học Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc lẩn th ứ 2,
NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, 2003, tr.213-217
3 Horikoshi K., Production of alkaline enzymes by alkalophilic microorganisms, P art I
Alkaline protease produced by Bacillus No 221, Agr, Biol Chem, 1971, 35, pp 1407-1414.
4 Horikoshi K., and T Akiba, A lkaline microorganisms: A new microbial world, Japan
Scientific Society Press, Tokyo, 1982
5 Madan M Dhillon s , Singh R- Production of alkaline protease by a UV-mutant of
Bacillus polymvxa, Indian J Microbiol, 2000, 40 (1), pp 25-28.
6 Lâm Tú Minh Trần Vãn Tuân, Nguyễn Tuấn, Nguyễn Thuỳ Châu, Nghiên cửu công nghệ
sản xuất phân bón vi sinh vặt đơn chủng và đa chủng ứng dụng cho một số cây trồng, Báo
cáo khoa học Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc lần th ứ 2, NXB Khoa học và Kỳ thuật,
Trang 67 Priest F.G., Extracellular enzyme synthesis in the genus Bacillus, Bacteriological reviews,
1977, Vol.41, No.8, pp 711-753
8 Scriban R., Biotechnologie, 2ème édition, Technique Documentation (Lavoisier), Paris, 1984.
9 Trấn Tú Thuỷ, Vũ Thuý Nga, Phạm Văn Toản, Nguyễn Ngọc Quyên, Lê Văn Nhương, Nguyễn Lan Hương, s ử dụng vi sinh vật cố định nitơ, phân giải lân để sản xuất phân hữu
cơ vi sinh từ phân mùn, rác và đánh giá hiệu quà trên cây trổng, Hội thảo Quốc t ế sinh học,
Hà Nội, 2001, tr.464-469
10 Yang J.K., L.Shihi, Y Tzeng, and s Wang., Production and purification of protease from a
Bacillus subtilis th a t can deproteinize crustacean w astes, Enzym e and microbial technology, 2000, 26 (5), pp 406-413.
VNU JOURNAL OF SCIENCE Nat Sci & Tech T.xx Np2AP 2004
U S E O F T W O S T R A I N S B A C I L L U S S P T 2 0 A N D M 2 7 A S B I O L O G IC A L
PREPARATIONS APPLIED TO THE CABBAGE (B R A S S Ỉ C A O L E R A C E A
V A R A L B O L A B R A )
N go T u T h a n h
D epartm ent o f Biology, College o f Science, V N U
The two alkalophilic bacterial stra in s Bacillus sp T20 an d M27 show ed th e following
activities: degradation of gelatin, milk, starch, carboxym ethyl cellulose They also synthesized indol acetic acid Only th e strain M27 presented u re ase activity Both fluid
cultures of the two s tra in s showed positive effect on th e grow th of th e cabbage (Brassica
oleracea var albolabra): they increased th e height and th e w eight of the cabbage a s well as
th e num ber of leaves