Nghiên cứu của chúng tôi n hằm từng bước th iết lập qui trìn h xác định giói tín h của gia cầm từ giai đoạn phôi đ ến trư ở ng th ành bằng kỹ th u ậ t PCR cỏ độ n hạy và độ tin cậy cao,
Trang 1X Á C Đ Ị N H G I Ớ I T Í N H G À B A N G K Ỹ T H U Ậ T P C R
P h a n T u â n N g h ĩa , N g u y ễ n M ộng H ù n g , N g u y ế n T h ị V â n A n h ,
N g u y ế n Q u ố c T r u n g , N g u y ễ n T h ị T h ả o , N g u y ễ n T u ấ n A n h , V ũ P h ư ơ n g Ly
K hoa S in h học, Trường Đ ại học Khoa học T ự n hiên, Đ H Q G H N
1 M ở đ ầ u
Gà nói riêng hay gia cầm nói chung là nhóm vật nuôi đóng vai trò q u a n trọng bậc
n h ất trong việc cung cấp th ịt cho con người Xác định sớm giới tín h ở gia cầm có ý nghĩa quan trọng trong cả nghiên cứu về phôi học cũng như ứng d ụ n g trong sản x u ấ t dê chủ động diều khiên tỷ lộ đực /cái theo các hướng mong muốn Đê xác đ ịnh sớm giới tín h ở gia cầm đã
có m ột sô phương ph áp khác n hau được áp dụng như phân tích h ình th á i lỗ h u y ệ t hay phán biệt kiểu n hân Tuy vậy, các phương p háp vừa nêu có hạn c h ế ở chỗ hoặc là m ất nhiều thòi gian hoặc chi’ áp dụng dược cho một sô’ ít đôi tượng C hính vì vậy, trong n h ũ n g n ăm gần đây các phương p háp sinh học ph ân tử dựa trê n sự sai khác ở m ức ADN giữa các cá th ể đực và cái đã dược áp dụng [2.3,4,6,7,8,9,11] Mặc dầu vậy, khi chúng tôi áp d ụ n g m ột sô’ qui trìn h
kỹ th u ậ t đã công bô' [3,9] để xác định giới tính ở gà đã không th u được k ế t q u ả thực sự tin
cậy Hơn thê nữa, cho đến nay ở Việt N am việc áp dụng các kỹ th u ậ t sinh học p hân tử để xác dịnh giới tính gia cầm vẫn chưa dược quan tâm Nghiên cứu của chúng tôi n hằm từng bước th iết lập qui trìn h xác định giói tín h của gia cầm từ giai đoạn phôi đ ến trư ở ng th ành bằng kỹ th u ậ t PCR cỏ độ n hạy và độ tin cậy cao, góp phần hỗ trợ cho công tác nghiên cửu phôi sinh học củng như p h á t triển chản nuôi ỏ trong nước
2 N g u y ê n liệ u v à p h ư ơ n g p h á p n g h i ê n cứ u
2.1 N guyên liệu
Nguyên liệu sử dụng để tách ADN là m áu lấy từ gồ (G alus dom esticus), chim cút {Turnix tanki), bồ câu (Colum ba livià), vịt (Anas platyrhincha) và phôi gà M ẫu phôi do Phòng Công nghệ t ế bào động v ật, thuộc T ru n g tâm S inh học p hán tử và Công nghệ tế bào cung cấp
Các cập mồi dược m ua từ hãng In tegrated DNA Technology (IDT, Mỹ), th a n g chuẩn
ADN klH in d ĩĩỉ và 1 kb của h ãng F erm entas (Lithoania) Các hoá ch ấ t còn lại đểu đ ạ t mức
tinh khiết cho nghiên cứu s in h học p hân tử
2.2 P h ư ơ ng p h á p
ADN của m áu gà hay gia cầm khác và của phôi gà được tách bằn g kit GFX của hãng Pharm acia (Thuỵ Điển) Ngoài ra ADN còn được tách theo phương ph áp củ a Albarino và Romanowski [1] có cải tiến ADN được định lượng bằng cách đo dộ hấp th ụ ở bước sóng 260
nm (AMn) và kiểm tra b ăng điện di gel agarose
P hản ứng chuỗi polym erase (PCR) được thực hiện trong m ột th ể tích 25^1 có chứa 10-
70 ng ADN khuôn, mồi xuôi và mồi ngược ở nồng độ 0,5 nM, 2,5 đơn vị T aq ADN
Trang 2polym erase v à dN TP 0.4 mM C hẽ độ nh iệt bao gồm các bước khởi dộng nóng ỏ 94°c trong 5
p hút, biến tín h ADN khuón ở 94"C trong 30 giây, gắn mồi ớ 65"C trong 15 giây, kéo dài chuỗi ớ 72"C trong 25 giây, với 35 chu kv lặp lại và giũ phán ứng ớ 72"C trong 1 phút, s à n
phấm dược ph àn tích bằng điện di gel agarose và nhuộm băng bang ethidium bromide
3 K ết q u á n g h i ê n cử u
3.1 T á ch A D N từ m á u và p h ô i gà
Để tác h ADN từ m áu gà chúng tôi đã sử dụng kit tinh sạch ADN từ m áu ký hiệu CrFX của h ã n g P h arm ac ia, lượng m áu sử dụng là 2j.ll R iêng với phôi phải có thêm bước nghiền tế bào trước khi lấy m ẫu tách ADN, Lượng ADN th u được từ khoảng 2-6 ng K ết quả kiểm tra độ sạch bằn g điện di trên gel agarosel% dược trìn h bày ỏ hìn h 1 Có thế dễ dàng nhận th ấy rà n g ch ế phẩm ADN của các m ẫu máu gà (A), chim cút (B; hai cột đầu) hay bồ cảu (B: hai cột tiếp theo) thuộc hai giới đực và cái dều cho một băng nguyên vẹn có kích thước lớn khõng lần ARN chứ ng tỏ chế phấin thu được có độ sạch cao
Bẽn cạ n h việc tách ADN bằng kit GFX, chúng tôi cũng đã liến h àn h tách ADN từ
m áu gà theo phương pháp của A lbarino và Romanowski []] Đây là phương pháp áp dụng cho tách ADN lừ m áu người và không dùng chất chống dông Tuv vậy, khi chúng tôi áp dụng phưrlng p háp này đè' tách ADN từ m áu gà thì thấy rằ n g m áu gà dông r ấ t n h an h vì vậy chúng tỏi đã bô su n g thêm vào m áu một the tích tương điíơng dung dịch muôi sinh lý (NaCl 0.9%) và sứ d ụ n g hỗn hợp phenol: chloroform: isoamyl alcohol (ti lệ 25:24:1 vê th ế tích) thay cho việc sử dụng chiết hai bước bằng phenol và bằng chloroform: isoam yl alcohol như trong qui trìn h gốc Kết qu ả phân tích cho th ấy lượng ADN th u được tương tự như khi sử dụng kit, tuy n h iên để tách ADN theo phương pháp này, lượng m ẫu cần lấy ban đổu là từ 20 ị.il trỏ lên Kết quả diện di chế phẩm ADN th u đươe ở hình 1D cho thấy ADN thu từ máu gi1! trông và gà m ái đều cho m ột bâng, eó kích thưốc lớn, không lẫn ARN Dể tách ADN từ phôi, chúng Lôi đã nghiền m ẫu và ủ ở 37°c trong 1 phút Sau đó ly tâm để th u tế bào và tiếp tục tách chiết với qui trìn h tương tự n hu với m ẫu máu Ngoài ra , qui trìn h tách ADN từ phôi cẩn có thâm bưỏc xứ lỹ bảng ARNase dê loại ARN C hế phẩm thu dược có ch ấ t lượng không sai khác với ch ế phàm lách b ằn g kit
Hình 1: Điện di agarose chè phãm ADN
m á u g ia c ắ m và ph ô i gà
A: ADN cùa mâu gà B: ADN cùa
m á u c h im c ú t (2 cột đẩu tiê n ) v à bố
câu (2 cột cuối cùng) C: ADN củạ
phõi, D: ADN của máu sà tách băng
phương pháp không dùng kit M:
thang chuân 1 kb (A, B và C) hay
HindiII (D), P: Phôi.
3.2 X á c đ ịn h g iớ i t in h b ằ n g k ĩ th u ậ t PCR
Đe xác tlịnh giới lín h gà bằng PCR chúng tôi đã sử dụng 2 cặp mồi có ký hiệu NP/M P2 và N P8/M P3 (b ả n g l) được th iết kế dụa cặp mồi NP/M P trong nghiên cứu Ito và
tập thê [7] đ ẽ xác dịnh giới lín h một sô' loài thuộc họ chim cát (Falconìformes) bằng PCR
<r í M đ 1 * t < ì M M PI P2 n M f 9 Eiil
Trang 3CDH1W và CD H 1Z nằm tương ứng trên nhiễm sắc th ể w và z đặc trư ng cho giới tín h cái và
đực của gà Trong 2 cặp mồi NP/M P2 và NP8/MP3 (bảng 1) th ì N P có trin h tự giông nh au
giữa các gen CHD1 của các loài chim cắt và gà còn MP2 và M P3 là được chúng tôi th iết kê dựa trên trìn h tự đặc trư n g của CDH1W MP2 được lựa chọn để k ế t thúc b ằng adenin ờ đầu 3’-OH nên không th ể gắn bô su n g vào trìn h tự gen C D H 1Z (giới tín h đực) vốn chứ a cytosine Ngoài ra , tro n g trìn h tự của M P2 còn có m ột nucleotit sai kh ác (A) giữa CDH1Z
so với CDH1W (T).
Qua nghiên cửu chúng tôi th ấ y rà n g khi sử dụng cặp mồi NP/M P2 cho PCR với lượng ADN khuôn từ 50-70 ng và chế độ nhiêt: biến tín h ban đ ầu â 94°C-5\ tiếp theo là 35 chu ký gồm 94°C-30”, 64°C-15”, 72°C-25” và 72°C-1' đã cho phép th u được bảng n h ân bản với kích thước 286 bp r ấ t rõ n é t với m ẫu ADN khuôn của con cái và chỉ là m ột b ăng mò n h ạ t có kích
thước 269 bp với các m ẫu ADN của con đực (đoạn gen này của C D H 1Z ngắn hơn của CDH1W 17 nucleotit) Theo chúng tôi, sử dụng kỹ th u ậ t PCR với cặp mồi NP/M P2 đú cho
phép xác đ inh giới tín h ỏ gà Qui trìn h này khi được th ử nghiệm trê n các m ẫu ADN tách từ phôi đều hoặc cho bảng n h ân b ản 286 bp, chứng tỏ đó là phôi cái hoặc cho có kích thước gần tương đương nhưng mờ n h ạt, chứ ng tò đỏ là phôi đực Toàn bộ thời gian đê thực hiện việc xác định giới tính của m ẫu khoảng 3,5 giờ, bao gồm việc tách ADN (khoảng 40 phút), chạy PCR ( khoảng 130 p hút) và chạy điện di, phân tích kết quả (khoảng 40 phút)
Cặp mồi NP8/M P3 được chúng tôi sử dụng nhằm làm tă n g tín h đặc hiệu cũng n hư độ
tin cậy của phương pháp Trong đó MP3 vẫn là trìn h tự gen C DH1W n h ư ng lùi về sau 37
nucleotit so với MP2 để có tới 5 nucleotit sai khác so với trìn h tự tươ ng ứng trong gen
CDH1Z của con đực [7] còn N P 8 chửa m ột p hần trìn h tự của N8 và toàn bộ trìn h tự của NP
Việc kéo dài N P th à n h N P 8 là để cả h ai mồi N P 8 và M P3 có n h iệ t độ tách chuỗi (Tm) gẩn như nhau, cho phép chúng tôi sử dụng nh iệt độ gắn mồi cao n hư đôi với M P3 (65°C)
B ả n g 1 Trình tự các cặp mồi dùng để xác đinh giới tín h gà, vịt, chim cút và bồ câu
B ăng nh ân bản đặc hiệu giới tín h s
MP2
5’-GAG AAA CTG TGC AAA ACG A
5’-CGT TTT CTT TCT GAT ATG GAA
286 bp
MP3
5’-GAG AAT GAG AAA CTG TGC AAA ACAG
5’-ACG GGG AAT AGT TCG TGG TCG
328 bp
Kết quả chạy PCR sử dụng cặp mồi NP8/MP3 với chế độ nhiệt: biến tính ban dầu ò
94°C-5\ tiếp theo là 35 chu kỳ gồm 94°C-30”, 65°C-15”, 72°C-25” và 72°C-1’ (hình 3A) cho thấy t ấ t cả m ẫu ADN khuôn của gà trống đểu không cho băng n h ân b ản nào, còn các mẫu
ADN khuôn của gà m ái đểu cho m ột băng n hân b ản r ất rõ n ét có kích thước 328 bp Khi thử
nghiệm qui trìn h để xác định giới tín h của các m ẫu vịt, chim c ú t và bồ cáu đểu cho k ế t quả tương tự (hình 3A) M ặc dầu băng n h ân bản ỏ m ẫu ADN khuôn của vịt ít rõ nét hơn so với các đôi tượng khác nhưng vẫn đủ tín h đặc trư ng cho việc p h ân b iệt đực - cái C húng tôi đã
Trang 4(hình 3B) cho thấy, trong 5 m ẫu phòi này thì P l và P3 không có bảng 328 bp, tương tự như khi s ứ dụng m ầu ADN của gã trống trướng thành, chứng tó chúng là phôi đực còn các m ẫu P2 P-l và P5 đều có b ăng 328 hp tương tự như m ẫu gà m ái trướng th à n h và chứng tó các
m ẫu này là phôi cái
C húng tôi cũng dã tiến hàn h thí nghiệm xác định giới tin h gà với các nồng độ ADN khuôn khác n hau và dã phát hiện được ràng nồng độ ADN khuôn tối th iểu dế có th ể thu được b ằng n hãn b án rõ n é t là 10 ng Theo tín h toán thi lượng ADN 10 n g có th ế tách được từ khoang 5 nanolit m áu hay từ khoáng vài t ế bào phôi ban đẩu
M í .t 1
H in h 2: Điện di g d agarose sán phẩm PCR xác ilịnh giới lính gà sứ dụng cặp mới NP và MP2
M: Thang chuẩn ADN (5(}-20(X)hp) * tương ứng vrti các màu ADN khuôn của máu gà tríína và mái irướng thành
IIin h ỉ : ĐiỌii Ui gcl agarose s;in phẩm PCR xác định giỏi lính gii sir dụng cặp mói NPH/MP.V
A : Sán phàm PCR VỚI until ADN khuôn lừ máu gia cám truitng Ihìrnh B: Síin phẩin l’CR v«ïi inAu ADN
khuôn cùa phói (P) M: Ihang chuẩn ADN Ikb
4 T h ả o lu ậ n
Xác dịnh giới tín h của nhiều loài thuộc tớp chim thường gập khó khồn do con đực và con cái rấ t giông nh au vể hình thái, đặc biệt là ỏ giai đoạn con non [5,8.12] Nhiều kỹ th u ật dựa trẽn sự khác n h au về ADN giữa hai giới đã được p h á t triển để giải q u yết vấn đề này
T rong sô' các kỹ đã được sử dụng thì PCR được xem là phương pháp d áng tin cậy n h ất Điếm chung trong sử d ụ n g PCR của các n h á nghiên cứu là dựa vào sự sai khác vé gen mà hoá như ATPase [9], DMRT1 [10] hay C D H l [3,7] nằm trê n nhiễm sắc th ê giới tín h w của con cái
và z của con dực C húng tôi khi áp dụng kỷ th u ật PCH với các cặp mồi như W 02/W 03 theo qui trìn h của P e titte vã Kegelm eyer [9] hay cặp SS1/SS2 theo qui trin h của D’C osta vã
P e tittc [3] đế x á c đ ịnh giới tin h cùa gà đã không cho kết q u á tin cậy Cụ thế chúng tôi hoặc
là th u được b ãng n h ân b án n hư n hau với m ẫu ADN của cà hai giới, hoặc không th u được băng n hân bán dặc hiệu Nguyên nh ản chính cúa những sai khác này có th ế do cặp mồi
W 02/W 03 chi có th ê áp dụng cho PCR với sự biến đôi các ch ế độ nhiệt trong thời gian rấ t ngắn mà các m áy PCR thông thường không thực hiện được Còn độ lặp lại th ấp khi áp dụng các qui trìn h khác có th ể lã do qui trìn h này chi áp dụng dược cho đôì tượng loài mà các tác giá đó quan tâm Ito và tậ p thê [7] cho thấy việc sử dụng các cập mồi có nucleotit kết thúc ỏ đầu 3’ vào chính điểm k h ác nh au đặc trư n g của gen C D H 1W và C D H IZ đã cho phép phán
Trang 5CDH1Z ỏ gà có n h ũ n g sai khác so vỏi trìn h tự C D H lW và CDH1Z của các loài chim cắt nên không th ế dùng các cặp mồi này đế xác định giới tín h gà bằng PCR Vối nguyên tắc th iế t k ế mồi tương tự ch ú n g tôi đã th iế t kê cặp mồi NP/M P2 dặc trư n g cho gen C D H l ỏ gà và nhờ vậv đã cho phép dễ d àng n h ận dạn g giới tín h của gà bằng PCR Nhằm m ột bước p h át triển tín h đặc hiệu của phương pháp, chúng tôi đã th iế t k ế cặp mồi N P 8 và M P3, trong đó NP8 chửa p h ần trìn h tự có m ặ t ở cả C D H lW v à CDH1Z còn M P3 dựa trên ph ần trìn h trìn h tự có
sự sa i khác tỏi 5 nucleotit giữa gen CDH1W và CDH1Z, nhờ vậy đã làm cho phép ph ân biệt chính xác giới tín h đực-cái của m ẫu vối lượng ADN khuôn rả't th ấ p (10 ng) và loại trừ hoàn toàn sự x u ấ t hiện của (các) bản g không đặc hiệu
Qui trìn h th iế t lập với cặp mồi NP8/M P3 còn cho phép dễ dàng p h á t hiện giới tính của vịt, chim cú t và bồ câu, chứ ng tỏ các loài nàv có vùng gen CDH1 chọn n ghiên cứu rấ t giống vói trìn h tự gen C D H l ở gà Q ui trìn h cho phép p h á t hiện ch ính xác giới tín h của gà ở ngay giai đoạn phôi Với thời gian thực hiện gắn, s ố lượng m ẫu mồi lần phân tích từ vài chục trở lên, qui trìn h chắc chắn sẽ rất có ý nghĩa cho việc nghiên CÛU phôi cũng như cho việc phát triển ch ả n nuôi gia cầm
T À I L IỆ U T H A M K H Ả O
1 Albarifto C.G and Romanowski, V, Phenol extraction revisited: A rapid method for the
isolation and preservation of hum an genomic DNA from whole blood Mol (6 Cell Probes
8 1994 pp 423- 427
2 Clinton, M, A rapid protocol for sexing chick embryos (Gallus g domesticus), Anim Genet
25, 1994 pp 361- 162
3 D’Costa, S and P etitte, J N, Sex identification of turkey embryos using a multiplex
Polymerase chain reaction, Poultry Sci, 77, 1998, pp 718- 721.
4 E'llegren, H., Hens, cocks and avian sex determ ination, A quest for genes on z or w?
EM BO Rep, 2, 2001, pp 192-196.
5 Ellegren, H, Evolution of the avian chromosomes and th eir role in sex determination
Trends Ecol Evol, 25, 2000, pp 188- 192.
6 Griffiths, R., Daan, s , Dijkstra, c Sex identification in birds using two CDH genes Proc
R Soc Lond, 263, 1996, pp 1249-1254.
7 Ito H., Sudo-Yamaji, A Abe, M., M urase, T., Tsubota, T Sex identification by alternative
polymerase chian reaction methods in Falconiformes, Zool Sci, 20, 2003, pp 339-344.
8 O'Neill, M., Binder M., Smith, c , Andrews, J., Reed, K., Sm ith M Millar, C-, Lambert, D Sinclair A ASW: a gene with conserved avian W-linkage and female specific expression
in chick embryonic gonad Dev Genes Evol, 210, 2000, pp 243- 249.
9 P etitte, J N and Kegelmeyer, A Rapid sex determ ination of chick embryos using the
Polymerase chain reaction, Anim Biotechnol, 6 ,1995, pp 119- 130.
10 Shan, z., N anda, I., Wang, Y., Schmid, M., Vortkamp, A Haaf, T Sex-specific expression
of an evolutionarily conserved male regulatory gene, DM RT1, in birds, Cytogen Cell Genet,
89 2000, pp 252-257
11 Sohr», S.H., Lee, c Y., Ryu, E K., Han, J Y., M ultani, A s and P athak, s Rapid sex identification of chicken Fluorescence in situ hybridization using a w chromosome-specific
Trang 612 Stevens, L., Sex chromosomes and sex determ ining m echanism in birds, Sci Program 80,
1997, pp 197-216
Đi' lài dược thực hiện với sự líó n ợ kinh phi của đề tài cấp nhà nước KC.04.24
VNU JOURNAL OF SCIENCE, Nai, Sci & Tech., T.xx Nọ2AP 2004
D E T E R M I N A T I O N O F C H I C K E N S E X B Y P C R T E C H N I Q U E
P h a n T u a n N g h ia , N g u y e n M o n g H u n g , N g u y e n T h i V a n A n h ,
N g u y e n Q u o c T r u n g , N g u y e n T h i T h a o , N g u y e n T u a n A n h , V u P h u o n g Ly
D epartm ent o f Biology, College o f Science, V N U
A protocol for d eterm ination of the sex of chicken a n d th e ir em bryos by PCR technique has been reported usin g a p a ir of p rim ers N P 8 : 5’-AGA AAT GAG AAA CTG TGC AAA ACA G (forward) và MP3: 5’ -A CG GGG AAT AGT TCG TGG TC G (reverse) The
prim ers w ere designed on th e difference in nucleotide sequences of C DH1 gene located on
chromosome z an d w of th e m ale an d fem ale chicks, respectively U sing th e m ethod, no amplified band h a s been observed from the DNA sam p les of th e m ale w hile a 328 bp band
h as been am plified from the fem ale DNA sam ples T he m ethod c a n be applied for early and accurate identification of th e sex not only for chicken an d th e ir em bryos b u t also for pigeons, ducks an d q uails usin g a sm all DNA am o u n t (10 ng), w hich is isolated from about
5 nanolitre of blood o r a few em bryonic cells In addition, a m odified protocol for isolation of DNA from chicken blood an d em bryos has been developed, w hich c a n be used directly for application of the poultry sex detem ination technique