XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH IN VITRO VÀ NGHIÊN CỨU CHUYỂN NẠP GEN KHÁNG THUỐC DIỆT CỎ GLUFOSINATE TRÊN CÂY ĐẬU XANH (Vigna radiata (L.) Wilczek) BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens Chuyên ngành: Trồng trọt Mã số: 60.62.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG

XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH IN VITRO VÀ NGHIÊN CỨU CHUYỂN NẠP GEN KHÁNG THUỐC DIỆT CỎ GLUFOSINATE TRÊN CÂY ĐẬU XANH (Vigna radiata (L.) Wilczek) BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens Chuyên ngành: Trồng trọt Mã số: 60.62.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH HÀ TRẦN MINH DŨNG XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH IN VITRO VÀ NGHIÊN CỨU CHUYỂN NẠP GEN KHÁNG THUỐC DIỆT CỎ GLUFOSINATE TRÊN CÂY ĐẬU XANH (Vigna radiata (L.) Wilczek) BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens Chuyên ngành: Trồng trọt Mã số: 60.62.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Hướng dẫn khoa học: TS. BÙI MINH TRÍ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 42010 i SỰ HIỆN DIỆN, PHÂN BỐ NẤM MYCORRHIZAE TRONG RỄVÙNG RỄ MÍA VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA NẤM ĐẾN SINH TRƯỞNG CÂY MÍA (Saccharum officinarum L.) NGUYỄN THỊ THÚY LIỄU Hội đồng chấm luận văn 1. Chủ tịch: PGS. TS. LÊ QUANG HƯNG Đại học Nông Lâm TP. HCM 2. Thư ký: TS. VÕ THÁI DÂN Đại học Nông Lâm TP. HCM 3. Phản biện 1: TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN Đại học Nông Lâm TP. HCM 4. Phản biện 2: PGS. TS. MAI THÀNH PHỤNG Trung tâm Khuyến nông quốc gia 5. Ủy viên: PGS. TS. HUỲNH THANH HÙNG Đại học Nông Lâm TP. HCM ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH HIỆU TRƯỞNG ii LÝ LỊCH CÁ NHÂN Tôi tên là Hà Trần Minh Dũng, sinh ngày 04 tháng 10 năm 1980 tại huyện Hòa Thành, tỉnh Tây Ninh. Con ông Hà Văn Mẫn và Bà Trần Huệ Thư. Tốt nghiệp Tú tài tại trường Trung học phổ thông Lý Thường Kiệt, tỉnh Tây Ninh, năm 1997. Tốt nghiệp Đại học ngành Nông học hệ chính quy tại Đại học Nông Lâm, thành phố Hồ Chí Minh. Theo học tiếng Pháp tại Viện trao đổi văn hóa với Pháp (Idecaf), TP. HCM từ 2003 2007. Tháng 9 năm 2005 theo học Cao học ngành Trồng trọt tại Đại học Nông Lâm, Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh. Tình trạng gia đình: chưa lập gia đình. Địa chỉ liên lạc: ấp Khởi Hà, xã Cầu Khởi, huyện Dương Minh Châu, tỉnh Tây Ninh. Điện thoại: 0903318373 Email: hatranminhdunggmail.com iii LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Trần Minh Dũng iv LỜI CẢM TẠ Chân thành cảm tạ Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm, ban Giám đốc Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường và tất cả các cán bộ của Viện đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập và thực hiện đề tài. Cảm tạ tất cả những Thầy Cô đã truyền đạt cho em kiến thức và phương pháp luận trong khoa học. Em xin chân thành cảm ơn TS. Bùi Minh Trí vì những hỗ trợ vật chất và tinh thần quý báu trong một thời gian dài. Con bày tỏ lòng biết ơn đối với Cha Mẹ về sự chăm sóc, động viên và lòng kiên nhẫn. Tôi muốn gửi lời cảm ơn đến các em Huệ, Hưng, Bình, Thu Trang, Thùy Dương, Vũ, Dung, Nam, Phương Hoa vì sự giúp đỡ rất tận tình. Cuối cùng tôi mong muốn gửi lời cảm ơn đến tất cả các thành viên lớp Cao học Trồng trọt 2005, những người đã cùng tôi chia sẻ những niềm vui và cả những khó khăn trong học tập. Thủ Đức, ngày 18 tháng 4, 2010 v TÓM TẮT Đề tài “Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro và ứng dụng trong nghiên cứu chuyển nạp gen bar kháng thuốc diệt cỏ glufosinate trên cây đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek) bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens” được thực hiện từ tháng 72007 đến tháng 92009 tại Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học và Môi trường, trường Đại học Nông Lâm, TP. HCM. Giống đậu xanh được sử dụng trong thi nghiệm là giống đậu xanh thương phẩm NP305 của Công ty TNHH sản xuất thương mại Tân Nông Phát và chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA101pIBGUS do Jabcobsen cung cấp với plasmid mang gen bar kháng thuốc diệt cỏ, gen Pmannop, gen luc và gen chỉ thị gusA. Chúng tôi đã xây dựng được quy trình tái sinh cây đậu xanh in vitro từ nốt lá mầm, cây đậu xanh có thể phát triển tốt trong môi trường dinh dưỡng B5 không có chất điều hòa sinh trưởng, đã xác định được các ngưỡng gây chết của PPT là 1 mgl để phục vụ cho công tác chọn lọc. Quá trình kiểm tra vi khuẩn cho thấy có sự hiện diện của plasmid và gen mục tiêu trên plasmid chứng tỏ vi khuẩn đạt yêu cầu để thực hiện việc chuyển gen. Quá trình nhuộm GUS cho thấy tỷ lệ dương tính đối với thuốc thử Xgluc khá cao ở tất cả các nghiệm thức biến thiên từ 60 – 73%, tuy nhiên sự khác biệt này không có nghĩa thống kê (P > 0,05). Các loại kháng sinh cefotaxime, meropenem không có khả năng loại bỏ vi khuẩn dẫn đến tình trạng tái nhiễm sau khi đồng nuôi cấy. Tuy nhiên, việc sử dụng cyprofloxacin nồng độ 50 mgl cho thấy có khả năng loại bỏ được vi khuẩn. Hiệu suất chuyển gen còn thấp mà nguyên nhân có thể là do sự im lặng của gen hoặc do giống NP305 ít mẫn cảm với vi khuẩn. Cuối thí nghiệm, chúng tôi thu được 2 dòng đậu xanh in vitro có khả năng sống được trong môi trường chọn lọc với PPT và kết quả PCR từ mẫu lá 2 dòng này đã xác nhận sự có mặt của gen bar trong bộ gen của cây đậu. vi SUMMARY This research was carried out at the Institute of Biotechnology and Environment, Nông Lâm university, Hồ Chí Minh city from 72007 – 72009. In this study, we used the seeds of a commercially grown genotype NP305 obtained from Tân Nông Phát company. The cotyledonary node explants were capable directly of developing shoots and roots on basal B5 medium without growth regulators. We determined the lethal dose for mungbean in vitro planlets was 1 mgl PPT and 200 mgl kanamycin. These doses were used in the selection scheme of putative transformant plants. Agrobacterium tumefaciens strain EHA101pIBGUS, harboring a binary vector pGII0229 Trgus cp148 luc carrying βglucuronidase (gusA) gene, bialaphos resistance (bar) gene, Pmannop gene and luc gene with nos poly–A promoter and CaMV 35S terminator was provided by Jacobsen, Hannover university. The presence of binary plasmid and bar gene was confirmed by electrophoresis and PCR. Cotyledonary node explants two day olds were transformed by cocultivation with Agrobacterium. After 3 days of cocultivation, the transient GUS expression has been shown in all treatments. The 10th treatment (cocultivation during 30 minutes and 100 µM acetosyringone) resulted highest transient GUS activity (73%) and the third treatment (cocultivation during 10 minutes and 50 µM acetosyringone) showed the lowest (60%) but there was no statistical difference in all treaments (P > 0,05). In spite of the high concentration (1000 mgl) of cefotaxime and meropenem, these antibiotics could not eliminate the Agrobacterium. The problem was only solved when we used 50 mgl cyprofloxacin. The genetic transformation frequency was low. At the end of this study, we just obtained 2 lines of mungbean in vitro that can survive in the selection medium with 1 mgl PPT. The results were probably affected by gene silencing phenomenon or genotype NP305 was less suitable to Agrobacterium mediated transformation. The presence of bar gene in the genome of mungbean was evidenced by PCR and electrophoresis. vii MỤC LỤC Trang tựa Trang chuẩn y ……………………………………………………………………... i Lý lịch cá nhân…………………………………………………………………… ii Lời cam đoan…………………………………………………………………….. iii Cảm tạ …………………………………………………………………………… iv Tóm tắt…………………………………………………………………………… v Mục lục………………………………………………………………………….. vii Danh sách các chữ viết tắt……………………………………………………… xi Danh sách các hình, biểu đồ và sơ đồ………………………………………… xiii Danh sách các bảng ……………………………………………………………. xiv Chương 1 MỞ ĐẦU .................................................................................................... 1 1.1 Đặt vấn đề ............................................................................................................. 1 1.2 Mục tiêu đề tài ....................................................................................................... 1 1.3 Giới hạn đề tài ....................................................................................................... 1 Chương 2 TỔNG QUAN ............................................................................................ 3 2.1 Nguồn gốc cây đậu xanh và tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới ................ 3 2.2 Tình hình sản xuất đậu xanh ở Việt Nam ............................................................. 4 2.3 Sự cạnh tranh giữa cỏ dại và cây trồng ................................................................. 5 2.3.1 Cạnh tranh về dinh dưỡng ........................................................................................ 5 2.3.2 Cạnh tranh về nước.................................................................................................... 6 2.3.3 Cạnh tranh về ánh sáng ............................................................................................. 6 2.3.4 Hiện tượng allelopathy.............................................................................................. 6 2.4 Những thiệt hại do cỏ dại gây ra ........................................................................... 6 2.4.1 Tác động làm giảm năng suất cây trồng ................................................................. 6 2.4.2 Ảnh hưởng đến chất lượng nông sản ...................................................................... 7 2.4.3 Ảnh hưởng đến sức khoẻ gia súc............................................................................. 7 2.4.4 Ảnh hưởng đến sức khoẻ con người........................................................................ 7 viii 2.4.5 Gây ô nhiễm, cản trở nguồn nước ........................................................................... 7 2.5 Sự tái sinh in vitro của tế bào thực vật .................................................................. 8 2.5.1 Cơ chế của sự tái sinh ở thực vật ....................................................................... 8 2.5.2 Ý nghĩa của sự tái sinh trong quá trình chuyển nạp gen .................................... 8 2.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tái sinh ...................................................... 9 2.5.3.1 Các hợp chất cung cấp nitơ (N) ...................................................................... 9 2.5.3.2 Đường .................................................................................................................... 10 2.5.3.3 Vitamin .................................................................................................................. 10 2.5.3.4 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật ............................................................. 10 2.5.3.5 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy..................................................................... 12 2.6 Thành phần của gen và các gen chuyển nạp phổ biến ........................................ 12 2.6.1 Promoter.................................................................................................................... 12 2.6.2 Gen thông báo (reporter gene) ............................................................................... 13 2.6.3 Chỉ thị chọn lọc (selectable marker) ..................................................................... 13 2.6.4 Những gen chuyển nạp phổ biến vào cây trồng................................................... 14 2.6.4.1 Gen Bt .................................................................................................................... 14 2.6.4.2 Gen gna.................................................................................................................. 15 2.6.4.3 Nhóm gen PR........................................................................................................ 16 2.6.4.4 Gen Xa–21............................................................................................................. 16 2.6.4.5 Gen CP................................................................................................................... 17 2.7 Các phương pháp chuyển nạp gen phổ biến ....................................................... 17 2.7.1 Chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens............................. 18 2.7.2 Chuyển nạp gen bằng phương pháp PEG (polyethylene glycol)....................... 21 2.7.3 Chuyển nạp gen bằng phương pháp sử dụng xung điện (electroporation)....... 22 2.7.4 Chuyển nạp gen bằng phương pháp bắn gen (biolistic) ..................................... 22 2.8 Các gen kháng thuốc diệt cỏ phổ biến và cơ chế kháng thuốc diệt cỏ của gen bar đối với hoạt chất trừ cỏ glufosinate................................................................................. 23 2.8.1 Gen bxn ..................................................................................................................... 23 2.8.2 Gen bar ..................................................................................................................... 24 ix 2.8.3 Tình hình chuyển gen bar trên cây trồng.............................................................. 27 2.9 Hoạt chất diệt cỏ glufosinate ............................................................................... 28 2.9.1 Cơ chế tác động của glufosinate ............................................................................ 28 2.9.2 Sự chuyển hóa của glufosinate–ammonium trong cây trồng biến đổi di truyền và cây trồng không biến đổi di truyền ............................................................................ 30 2.10 Tình hình trồng cây chuyển gen trên thế giới ................................................... 31 2.11 Tình hình trồng cây chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ trên thế giới ................... 33 2.12 Tình hình nghiên cứu cây trồng chuyển gen tại Việt Nam ............................... 35 Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................. 38 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ....................................................................... 38 3.2 Vật liệu thí nghiệm .............................................................................................. 38 3.2.1 Giống đậu xanh........................................................................................................ 38 3.2.2 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và các gen chuyển nạp .......................... 38 3.2.3 Hoá chất .................................................................................................................... 39 3.2.4 Thiết bị dùng trong thí nghiệm .............................................................................. 40 3.3 Phương pháp thí nghiệm ..................................................................................... 41 3.3.1 Khảo sát các quy trình khử trùng hạt .................................................................... 41 3.3.2 Xây dựng hệ thống tái sinh cây đậu xanh in vitro thông qua nốt lá mầm (Cotyledonary node) ......................................................................................................... 43 3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của hoạt chất diệt cỏ phosphinothricin (PPT) đến sự tái sinh của cây đậu xanh in vitro ......................................................................................... 45 3.3.4 Kiểm tra plasmid trong tế bào vi khuẩn và gen bar trên plasmid ..................... 46 3.3.5 Thiết lập quy trình chuyển gen .............................................................................. 47 3.3.6 Khảo sát hiệu quả của các loại kháng sinh cefotaxim, meropenem và cyprofloxacin đến quá trình loại bỏ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens sau khi đồng nuôi cấy..................................................................................................................... 49 3.3.7 Kiểm tra sự biểu hiện của gen chỉ thị gusA.......................................................... 49 3.3.8 Chọn lọc cây chuyển gen........................................................................................ 50 3.3.9 Phản ứng PCR khuếch đại gen bar........................................................................ 51 x Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................. 53 4.1 Khảo sát các quy trình khử trùng hạt .................................................................. 53 4.2 Kết quả khảo sát môi trường tạo chồi ................................................................. 54 4.3 Kết quả khảo sát ngưỡng nồng độ gây chết của hoạt chất diệt cỏ PPT đối với cây đậu xanh in vitro........................................................................................................ 56 4.4 Kết quả ly trích plasmid và kiểm tra sự hiện diện của gen bar trên plasmid ...... 58 4.4.1 Kết quả kiểm tra plasmid ................................................................................. 58 4.4.2 Kết quả kiểm tra sự hiện diện của gen bar trên plasmid .................................... 59 4.5 Kết quả kiểm tra sự biểu hiện của gen gusA trên nốt lá mầm đậu xanh chuyển gen ............................................................................................................................. 60 4.6 Kết quả khảo sát khả năng diệt khuẩn của các loại kháng sinh cefotaxime, meropenem và cyprofloxacin .................................................................................... 61 4.7 Kết quả chọn lọc cây đậu xanh in vitro giả định chuyển gen trong môi trường có PPT ............................................................................................................................ 64 4.8 Kết quả ly trích DNA tổng số và sự hiện diện của gen bar trong genome đậu xanh ........................................................................................................................... 65 Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ...................................................................... 69 5.1 Kết luận ............................................................................................................... 69 5.2 Đề nghị ................................................................................................................ 70 PHỤ LỤC .................................................................................................................. 76 xi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABA: acid abscisic ALS: acetolactate synthase AS: acetosyringone B1: thiamin B3: acid nicotinic B5Co: Coculture medium B5i: Inoculation medium B5Pre: Preculture medium B6: pyridoxine BA: benzyl adenin Bt: Bacillus thuringiensis bxn: bromoxynil nitrilase bromoxynil: 3,5–dibromo–4–hydroxybenzonitrile C: carbon CP: coat protein DHPS: dihydropteroate synthase EPSPS: 3enoyl pyruvyl shikimate 5phosphate synthase glufosinate: DL–homoalanin–4yl (methyl) phosphinic acid GNA: Galantus nivalis agglutinin gusA: β–glucuronidase GS: glutamine synthetase ha: hectare hph: hygromycin phospho transferase IBA: indolebutyric acid ioxynil: 3,5–di–iodo–4–hydroxybenzonitrile M: mol MES: morpholino ethan sulfonic acid xii MHB: 4–methyl–phosphinico–2–hydroxy–butanoic acid MPA: 2–methylphosphinico–acetic acid MPB: 4–methylphosphinico–butanoic acid MPP: 3–methylphosphinico–propionic acid NAG: N–acetyl–L–glufosinate nptII: neomycin phospho transferase OECD: Organisation for Economic Cooperation and Development OHAS: αhydro acetosyringone PAT: phosphinothricin acetyl transferase PEG: polyethylene glycol ppm: par per million PPO: 4–methyl–phosphinico–2–oxo–butanoic acid PPT: phosphinothricin SDS: sodium dodecyl sulfat Tiplasmid: tumorinducing plasmid vir: virulence Xgluc: 5–bromo–4–chloro–3–indolyl glucuronide xiii DANH SÁCH CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ VÀ SƠ ĐỒ Trang Biểu đồ 2.1: Những nước sản xuất đậu xanh chủ yếu trên thế giới ............................ 4 Hình 2.1: Thành phần của một gen chuyển nạp ........................................................ 14 Hình 2.2: Tiplasmid của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens .............................. 20 Hình 2.3: Hoạt động của các gen vir trong quá trình xâm nhiễm của TDNA vào tế bào thực vật. ....................................................................................................... 21 Hình 2.4: Cấu trúc hóa học của Bialaphos ................................................................ 26 Hình 3.1: Plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc .......................................................... 39 Sơ đồ 3.1: Sơ đồ vùng TDNA của plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc .................. 39 Sơ đồ 3.2: Quy trình kiểm tra plasmid và gen bar trên vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ........................................................................................................ 46 Sơ đồ 3.3: Các bước của quy trình nhuộm GUS mô đậu xanh sau 2 ngày đồng nuôi cấy với vi khuẩn ................................................................................................. 50 Sơ đồ 3.4: Quy trình ly trích DNA cây đậu xanh ...................................................... 51 Hình 4.1: Sự tạo chồi và tạo rễ cây đậu xanh in vitro giống NP305 ....................... 56 Hình 4.2: Khả năng tái sinh chồi từ nốt lá mầm ở các nồng độ PPT 0; 0,5; 1; 2 mgl ........................................................................................................................... 58 Hình 4.3: Plasmid li trích từ vi khuẩn ....................................................................... 59 Hình 4.4: Kết quả kiểm tra gen bar trên plasmid ...................................................... 59 Hình 4.5: Một số hình ảnh kết quả nhuộm GUS tiêu biểu ........................................ 61 Hình 4.6: Hai dòng đậu xanh in vitro M1 và M2 giả định chuyển gen trong môi trường chọn lọc với 1 mgl PPT ........................................................................ 65 Hình 4.7: Kết quả điện di DNA tổng số từ mô lá cây đậu xanh ............................... 65 Hình 4.8: Sản phẩm gen bar trong bộ gen cây đậu xanh .......................................... 66 Sơ đồ 4.1: Tóm tắt quy trình xây dựng hệ thống tái sinh và chuyển gen. ................ 67 Hình 4.9: Mô tả một số bước trong quy trình chuyển gen ........................................ 68 xiv DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1: Hàm lượng dinh dưỡng trong một số loài cỏ và cây trồng........................... 5 Bảng 2.2: Một số auxin được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô in vitro ............. 11 Bảng 2.3: Một số cytokinin được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô in vitro....... 11 Bảng 2.4: Các nước có diện tích cây chuyển gen lớn trên thế giới năm 2000 .......... 32 Bảng 2.5: Các nước có diện tích cây chuyển gen lớn trên thế giới năm 2006 .......... 32 Bảng 2.6: Các loại thuốc diệt cỏ và gen kháng phổ biến ............................................. 34 Bảng 2.7: Cây trồng chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ và công ty sản xuất................ 35 Bảng 3.1: Các quy trình thử nghiệm khử trùng hạt....................................................... 42 Bảng 3.2: Thành phần môi trường tạo chồi ................................................................... 44 Bảng 3.3: Thành phần môi trường tạo rễ........................................................................ 44 Bảng 3.4: Môi trường chọn lọc với PPT ........................................................................ 45 Bảng 3.5: Các nghiệm thức trong thí nghiệm chuyển gen ........................................... 47 Bảng 3.6: Thành phần các môi trường tiền nuôi cấy (Preculture medium), môi trường ủ (Inoculation medium) và môi trường đồng nuôi cấy (Coculture medium) ............................................................................................................................................. 48 Bảng 3.7: Thành phần hoá chất thực hiện phản ứng PCR ........................................... 52 Bảng 3.8: Chương trình nhiệt thực hiện phản ứng PCR............................................... 52 Bảng 4.1: Kết quả khảo sát 3 quy trình khử trùng hạt.................................................. 53 Bảng 4.2: So sánh khả năng tạo chồi và tạo rễ cây đậu xanh in vitro trên môi trường B5 với các nồng độ BA khác nhau.................................................................................. 54 Bảng 4.3: Tỷ lệ tái sinh chồi của nốt lá mầm ở các nồng độ 0; 0,5; 1; 2 mgl PPT.. 57 Bảng 4.4: Kết quả nhuộm GUS ở các nghiệm thức chuyển gen ................................. 60 Bảng 4.5: Kết quả rửa mẫu với các loại kháng sinh cefotaxime, meropenem và cyprofloxacin ở các nồng độ và thời gian khác nhau.................................................... 62 1 Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cỏ dại luôn là một trong những vấn đề quan trọng mà người nông dân phải đối mặt trong sản xuất. Cỏ dại cạnh tranh nước, dinh dưỡng, không gian sống với cây trồng và từ đó làm giảm năng suất và chất lượng nông sản. Theo Winch (2006), năng suất cây trồng bị tổn thất do cỏ dại gây ra là 16% ở châu Phi, 14% ở châu Á, 8% ở vùng Bắc, Nam và Trung Mỹ, 7% ở châu Âu. Trong canh tác đậu xanh theo Kolar và Dhingra (1986) (trích dẫn bởi Sonia và ctv, 2006) cỏ dại có thể làm tổn thất đến 30 – 40% năng suất. Trong quá trình canh tác, nông dân thường kiểm soát cỏ dại bằng cách cày xới, nhổ cỏ bằng tay, phun thuốc diệt cỏ hay kết hợp tất cả những biện pháp này. Tuy nhiên, việc cày xới sẽ làm tăng tốc độ xói mòn đất do gió và nước, gây hậu quả nghiêm trọng cho môi trường. Tương tự, biện pháp nhổ cỏ bằng tay cũng tỏ ra không hiệu quả trên đồng ruộng có diện tích lớn. Vì có nhiều loại cỏ dại trên đồng ruộng nên nông dân phải sử dụng nhiều loại thuốc diệt cỏ khác nhau. Biện pháp diệt cỏ này rất tốn kém và gây ô nhiễm môi trường. Nhằm giải quyết hạn chế này các nhà khoa học đã đề nghị biện pháp kiểm soát cỏ dại một cách đơn giản hơn là chỉ phun thuốc diệt cỏ kết hợp với việc trồng cây mang tính trạng kháng thuốc diệt cỏ. Cây trồng mang gen kháng thuốc diệt cỏ đã trở thành một công cụ hữu hiệu trong việc kiểm soát cỏ dại và phù hợp với xu hướng canh tác làm đất tối thiểu hiện nay. Cây trồng kháng thuốc diệt cỏ tạo sự tiện lợi trong canh tác cho người nông dân do họ chỉ sử dụng thuốc diệt cỏ khi cần thiết mà không cần phải phun phòng như trước đây. Họ chỉ cần sử dụng duy nhất một loại thuốc đặc hiệu nên có thể kiểm soát được lượng thuốc sử dụng và vì vậy ít gây ô nhiễm môi trường. Mặt khác, với xu hướng thiếu lao động thủ công trong ngành nông nghiệp trong tương 2 lai thì biện pháp trồng cây kháng thuốc diệt cỏ có thể giải phóng đáng kể sức lao động cho nông dân. Đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek) là cây trồng quan trọng trong nhóm đậu đỗ cùng với đậu nành và đậu phộng. Trồng cây đậu xanh vừa cung cấp thức ăn cho người và gia súc lại vừa có tác dụng cải tạo đất do nốt sần của cây chứa vi khuẩn Rhizobium có khả năng cố định đạm (Lambrides và Godwin, 2007). Tuy nhiên, năng suất đậu xanh vẫn còn hạn chế do một số đặc tính nông học chưa tốt và cây thường mẫn cảm với các tác nhân sinh học như nấm, vi khuẩn, virus và côn trùng (Mahalakshmi và ctv, 2006). Hiện nay những nỗ lực cải tiến năng suất và chất lượng hạt đậu xanh bằng con đường lai tạo cổ điển tỏ ra kém hiệu quả (Lambrides và Godwin, 2007). Vì vậy việc ứng dụng những tiến bộ của công nghệ sinh học sẽ cung cấp những công cụ hiệu quả hơn trong việc tạo ra những tính trạng mong muốn trên cây trồng. Đã có nhiều báo cáo về chuyển gen được thực hiện trên đậu nành nhưng những nghiên cứu tương tự trên cây đậu xanh còn tương đối hạn chế. Vì vậy, nhằm nghiên cứu một quy trình chuyển nạp gen phù hợp trên đậu xanh, được sự hướng dẫn của TS. Bùi Minh Trí, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro và nghiên cứu chuyển nạp gen kháng thuốc diệt cỏ glufosinate trên cây đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek) bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”. 1.2 Mục tiêu đề tài Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro hoàn chỉnh cho cây đậu xanh. Xây dựng quy trình chuyển gen bar kháng thuốc diệt cỏ nhóm glufosinate cho cây đậu xanh bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. 1.3 Giới hạn đề tài Đề tài được thực hiện từ tháng 72007 – 72009 và sẽ giới hạn ở giai đoạn kiểm tra biểu hiện của gen chỉ thị gusA và sự hiện diện của gen bar trong genome cây đậu xanh giả định chuyển gen bằng phản ứng PCR. 3 Chương 2 TỔNG QUAN 2.1 Nguồn gốc cây đậu xanh và tì nh hình sản xuất đậu xanh trên thế giới Cây đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek) thuộc bộ Fabales, họ Fabaceae, chi Vigna, là một loại cây trồng cổ truyền của nhân loại. Theo Vavilop (1951) (trích dẫn bởi Nguyễn Thế Côn, 1996), trung tâm khởi nguyên của cây đậu xanh có thể là ở vùng đồng bằng Burma của Ấn Độ. Tuy nhiên, người ta cũng tìm thấy dạng Vigna radiata (L.) Wilczek hoang dại mọc ở vùng ven Ấn Độ Dương thuộc Đông Phi. Hiện nay, đậu xanh được trồng ở 23 nước trên thế giới, từ 300 vĩ Bắc đến 300 vĩ Nam, tập trung chủ yếu ở vùng Nam Á, Đông Á và Đông Nam Á. Đậu xanh đứng đầu trong số các cây trồng thuộc chi Vigna về diện tích với khoảng 3,4 – 3,6 triệu ha và sản lượng 1,4 – 1,8 triệu tấn. Hạt đậu xanh là nguồn thực phẩm giàu đạm vì protein trong hạt chứa đủ 8 amino acid thiết yếu. Trong 100 g hạt đậu xanh chứa 64 mg Ca, 377 mg P và các loại vitamin quan trọng như vitamin B1 (0,72 mg), vitamin B2 (0,15 mg), vitamin PP (2,4 mg), vitamin C (4 mg) (Nguyễn Thế Côn, 1996). Ở châu Á có đến hàng trăm loại thực phẩm được chế biến từ đậu xanh trong đó có các loại rất phổ biến trong đời sống hàng ngày như giá đậu, miến, bột dinh dưỡng. Ở Việt Nam người ta thường sử dụng đậu xanh để làm xôi, nấu chè, làm bánh chưng, bánh tét. Các nước sản xuất đậu xanh chính trên thế giới là Ấn Độ (2,8 triệu ha), Trung Quốc (772.000 ha), Myanmar (650.000 ha), Indonesia (324.000 ha), Thái Lan (289.000 ha). Ấn Độ sản xuất hơn 50 % sản lượng đậu xanh của thế giới nhưng chủ yếu là tiêu thụ trong nước (Vijayalakshmi và ctv, 2003) (trích dẫn bởi Lambrides và Godwin, 2007) trong khi đó Thái Lan chỉ với diện tích 289.000 ha nhưng lại là nước xuất khẩu đậu xanh lớn nhất thế giới. Trong 2 thập niên từ 1980 4 2000, diện tích trồng đậu xanh của Myanmar đã tăng lên 22% và đây là nước có diện tích trồng đậu xanh lớn thứ 3 trên thế giới chỉ sau Ấn Độ và Trung Quốc. Biểu đồ 2.1: Những nước sản xuất đậu xanh chủ yếu trên thế giới (Nguồn: Theo Weinburger (2003) (trích dẫn bởi Lambrides và Godwin, 2007) 2.2 Tình hình sản xuất đậu xanh ở Việt Nam Đậu xanh được trồng rải rác trên hầu hết các vùng miền ở nước ta do đây là cây ngắn ngày, kỹ thuật canh tác tương đối đơn giản và không yêu cầu thâm canh cao. Đậu xanh thường được trồng luân canh với các cây lương thực khác như lúa và bắp. Ở đồng bằng sông Cửu Long, việc luân canh cây trồng cạn trên chân đất lúa đã góp phần làm giảm nhu cầu nước tưới, đặc biệt là trong mùa nắng và làm gia tăng độ phì của đất về lâu dài. Các mô hình luân canh cây bắp, đậu xanh và đậu nành trên chân đất lúa đều cho hiệu quả kinh tế cao hơn mô hình độc canh cây lúa (Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long, 2005). Hiện nay, diện tích trồng đậu xanh còn hạn chế so với các cây họ đậu khác như đậu nành, đậu phụng. Theo Nguyễn Văn Chương (2009), diện tích trồng đậu xanh khoảng 60 80 nghìn ha, sản lượng không đủ để đáp ứng nhu cầu tiêu thụ 5 trong nước, hàng năm phải nhập khẩu một lượng lớn từ Trung Quốc và Campuchia. Một số nguyên nhân ảnh hưởng đến sự phát triển năng suất và hiệu quả kinh tế cây đậu xanh là cây đậu nành phải thu hoạch 2 4 lầnvụ, việc thu và tách hạt thực hiện thủ công rất khó khăn cho việc trồng với diện tích lớn (Phạm Văn Thiều, 2002). 2.3 Sự cạnh tranh giữa cỏ dại và cây trồng Sự cạnh tranh là hoạt động của một sinh vật hoặc một quần thể giành lấy một hoặc vài yếu tố sinh tồn mà sinh vật hoặc quần thể khác cũng muốn sử dụng trong cùng một thời gian. Cạnh tranh giữa cỏ dại và cây trồng chủ yếu xảy ra về chất dinh dưỡng, nước và ánh sáng. 2.3.1 Cạnh tranh về dinh dưỡng Đạm (N) là yếu tố cạnh tranh quan trọng giữa cỏ dại và cây trồng. Sự cạnh tranh cũng xảy ra đối với các chất dinh dưỡng khác. Cỏ thường hấp thu chất dinh dưỡng nhanh hơn nhiều loại cây trồng và tích lũy trong mô với hàm lượng cao. Theo Dương Văn Chín (2005), cây rau dền Amaranthus spp. tích lũy trên 3% N trong chất khô, cỏ chỉ tích lũy 3,36% P2O5 trong chất khô, Chenopodium sp. và Portulaca sp. tích lũy trên 1,3% K2O trong chất khô. Nhìn chung, cỏ dại lấy đi lượng dinh dưỡng gấp 2 lần cây trồng do quần thể cỏ dại rất đa dạng và có khả năng tích lũy dinh dưỡng trong thân với hàm lượng lớn. Bảng 2.1: Hàm lượng dinh dưỡng trong một số loài cỏ và cây trồng Loài thực vật Phần trăm (%) lượng chất khô N P2O5 K2O Cỏ dại Rau dền (Amaranthus viridis) 3,16 0,06 4,51 Rau muối trắng (Chenopodium album) 2,59 0,37 4,34 Rau trai (Commelina benghalensis) 2,02 1,46 1,86 Cỏ lồng vực cạn (Echinochloa colona) 2,98 0,4 2,96 Cây trồng Lúa nước (Oryza sativa L.) 1,13 0,34 1,1 Mía (Saccharum officinarum L.) 0,33 0,19 0,67 Lúa mì (Triticum aestivum L.) 1,33 0,59 1,44 (Nguồn: Theo Dương Văn Chín, 2005) 6 2.3.2 Cạnh tranh về nước Cỏ dại cạnh tranh nước rất gay gắt với cây trồng nhất là ở những vùng khô hạn. Để sản xuất ra cùng một lượng chất khô cỏ dại cần lượng nước cao hơn cây trồng. Ở vùng khô hạn, cỏ dại sử dụng quá nhiều nước làm thiếu nước trầm trọng ở giai đoạn ra hoa và tạo hạt của cây trồng dẫn đến giảm năng suất nghiêm trọng. Nhiều loại cỏ có rễ sâu nên có thể lấy cả lượng nước dự trữ ở tầng đất sâu. 2.3.3 Cạnh tranh về ánh sáng Trong việc cạnh tranh về ánh sáng thì yếu tố chiều cao là rất quan trọng. Trong điều kiện nước và chất dinh dưỡng đầy đủ thì ánh sáng trở thành yếu tố cạnh tranh quan trọng nhất. Sự cạnh tranh về ánh sáng có thể xảy ra rất sớm khi cỏ mọc dày và che phủ cây trồng còn nhỏ. 2.3.4 Hiện tượng allelopathy Allelopathy là hiện tượng một loài cây tiết ra chất hữu cơ từ rễ hoặc sự phân hủy thân lá của loài cây này ảnh hưởng đến sự nảy mầm, sinh trưởng và phát triển của loài thực vật khác. Theo Putnam và Tang (1986), có khoảng 90 loài cỏ có khả năng cạnh tranh với cây trồng bằng cơ chế allelopathy (trích dẫn bởi Lambrides và Godwin, 2007). Như vậy sự gây thiệt hại lẫn nhau giữa cỏ dại và cây trồng (weed– crop interference) bao gồm sự cạnh tranh (weed–crop competition) và allelopathy. 2.4 Những thiệt hại do cỏ dại gây ra Nhiều người không nhận biết đầy đủ những thiệt hại do cỏ dại gây ra vì nó diễn biến từ từ, không gây thiệt hại nhanh chóng và rõ ràng như côn trùng và bệnh. 2.4.1 Tác động làm giảm năng suất cây trồng Qua nhiều kết quả nghiên cứu thì cỏ dại gây ra thiệt hại lớn hơn so với côn trùng và bệnh cộng lại (Bendixen, 1972) (trích dẫn bởi Dương Văn Chín, 2005). Cỏ dại còn là ký chủ phụ của côn trùng, bệnh và là nơi trú ẩn của chuột. Cỏ dại trên ruộng còn gây khó khăn cho quá trình canh tác. Hạt cỏ, thân, rễ sẽ làm ảnh hưởng xấu đến quá trình chế biến nông sản. 7 2.4.2 Ảnh hưởng đến chất lượng nông sản Hạt lúa mì có lẫn hạt cải dầu hoang (Brassica spp.) khi xay ra sẽ có mùi lạ làm người tiêu dùng không chấp nhận. Trong quá trình bảo quản, hạt và thân lá cỏ có ẩm độ cao sẽ làm nông sản mau bị hỏng. Cỏ dại lẫn vào cỏ làm thức ăn gia súc gây mùi lạ làm gia súc không thích ăn. 2.4.3 Ảnh hưởng đến sức khoẻ gia súc Một số loài cỏ có hàm lượng alkaloids, tanin, oxalates, glucocides và nitrate rất cao có thể gây ngộ độc cho gia súc. Ví dụ cỏ Oxytropis spp. có thể gây sẩy thai trên cừu và bò. Một số loài cỏ như kinh giới (Chenopodium sp.), rau dền (Amaranthus sp.) trong điều kiện bình thường thì không độc nhưng khi gặp điều kiện môi trường bất lợi sẽ tích lũy nitrate ở nồng độ rất cao (1000 ppm). Khi ăn vào cơ thể, nitrate sẽ biến thành nitrite và gây độc cho gia súc (Dương Văn Chín, 2005). 2.4.4 Ảnh hưởng đến sức khoẻ con người Nhiều loài cỏ gây dị ứng hoặc gây thương tích cho con người khi tiếp xúc. Nhiều người bị cảm cúm mãn tính do hít phải hạt phấn của các loài cỏ như Ambrosia sp. và Frenseria sp., có người bị dị ứng khi tiếp xúc với cỏ Parthenium sp. Cỏ cũng là nơi trú ẩn của các côn trùng gây bệnh cho con người như ruồi TseTse gây bệnh ngủ, muỗi truyền bệnh sốt rét, sốt xuất huyết. Bèo (Pistia lanceolata) là nơi trú ẩn và sinh sản của muỗi, lục bình (Water hyacinth) cung cấp oxy qua rễ tạo điều kiện tốt cho lăng quăng phát triển. 2.4.5 Gây ô nhiễm, cản trở nguồn nước Các loài cỏ thủy sinh làm cản trở giao thông thủy, làm giảm tốc độ chảy của dòng nước. Cỏ thủy sinh làm tăng tốc độ bốc thoát hơi nước ở các ao hồ do hiện tượng bốc thoát hơi nước. Tổng lượng nước bốc thoát hơi trên mặt hồ có lục bình bằng 130 – 250% so với mặt hồ sạch cỏ (Dương Văn Chín, 2005). Cỏ làm ảnh hưởng đến việc sản xuất thủy sản do rễ tiết ra các chất hữu cơ, do thân lá bị phân hủy gây ô nhiễm nguồn nước. Việc thu hoạch thủy sản cũng sẽ khó khăn khi mặt nước có nhiều cỏ. Tại bang West Bengal của Ấn Độ, việc thất thoát cá do cỏ dại hàng năm khoảng 500 tấn (Ramachandran, 1969) (trích dẫn bởi Dương Văn Chín, 8 2005). Ngoài ra cỏ dại còn ảnh hưởng đến các công trình công cộng, gây khó khăn trong công tác phòng cháy, chữa cháy, gây thiệt hại cho rừng và giảm vẻ mỹ quan môi trường. 2.5 Sự tái sinh in vitro của tế bào thực vật 2.5.1 Cơ chế của sự tái sinh ở thực vật Khi tách rời một bộ phận nào đó ra khỏi cây mẹ tức là ta đã làm cho tính nguyên vẹn (totipotency) của cây bị vi phạm. Đặc tính vốn có của cây là khả năng khôi phục lại tính nguyên vẹn đó bằng sự tái sinh. Khác với động vật, thực vật có khả năng tái sinh mạnh mẽ hơn nhiều, từ một bộ phận tách rời khỏi cây mẹ trong điều kiện nhất định nó có thể tái sinh để tạo thành một cây mới hoàn chỉnh. Sự tái sinh ở thực vật có thể chia thành 2 dạng là tái sinh sinh lý và tái sinh bệnh. Tái sinh sinh lý được hiểu như là sự thay thế những bộ phận đã mất đi và điều này cần thiết cho đời sống của chúng. Đây là những biểu hiện về mặt sinh lý cần thiết của cây, chẳng hạn như cây rụng lá vào mùa thu, mùa đông, sang mùa xuân chúng lại tái sinh ra lá mới để đảm nhận chức năng quang hợp tốt hơn. Tái sinh bệnh là quá trình tái sinh do vết thương gây ra. Khi cây bị tổn thương sẽ xuất hiện sự tái sinh để làm lành vết thương hoặc phục hồi các phần đã mất đi hay tái sinh cho ra cơ quan mới để khôi phục tính nguyên vẹn của cây. Khả năng tái sinh của thực vật rất khác nhau phụ thuộc vào đặc tính của loài, giống, các giai đoạn sinh trưởng, phát triển, mùa vụ và điều kiện sinh thái. 2.5.2 Ý nghĩa của sự tái sinh trong quá trình chuyển nạp gen Từ lâu con người đã biết sử dụng đặc tính tái sinh này trong việc nhân giống vô tính các loại cây trồng thông qua biện pháp giâm cành, chiết cành, ghép mắt và nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro. Ngày nay, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro đã trở thành một khâu rất quan trọng trong quy trình chuyển nạp gen vào cây trồng (Vũ Văn Vụ và ctv, 1998). Để tạo cây chuyển gen, trước hết phải tạo ra được cây tái sinh từ một bộ phận, mô hoặc một tế bào duy nhất, phát triển trong môi trường nuôi cấy in vitro. Đây là bước rất quan trọng trong quy trình tạo ra cây trồng chuyển gen. Nhờ con 9 đường tái sinh này khi ta đưa một đoạn TDNA mang gen có ích vào tế bào thực vật, ta có thể thu nhận cây tái sinh mang gen này. Trong quá trình xây dựng hệ thống tái sinh cần xác định các chất điều hòa sinh trưởng phù hợp, nồng độ các chất này, vật liệu tái sinh, thời điểm tái sinh. Khi đã xác định được bộ phận nuôi cấy tốt nhất, môi trường nuôi cấy thích hợp nhất thì hầu hết các thực vật đều có khả năng tái sinh. Theo Gulati và Jaiwal (1994), nốt lá mầm (cotyledonary node) ở một số cây họ Đậu như đậu nành (Glycine max), đậu cô ve (Phaseolus vulgaris), đậu ngựa (Vicia faba) và đậu Hà Lan (Pisum sativum) đã được sử dụng làm vật liệu nuôi cấy mô in vitro khá thành công. Những nghiên cứu về mô học (histology) của các tác giả này trên đậu xanh cho thấy ở vị trí điểm nốt này có sự phân chia tế bào rất mạnh và ở đây hình thành những vùng mô phân sinh (meristematic regions). Tương tự, các nghiên cứu trên đậu cô ve (McClean và Graton, 1989), Phaseolus acutifolius và Phaseolus coccineus (Malik và Saxena, 1992) (trích dẫn bởi Gulati và Jaiwal, 1994) cũng cho thấy có các vùng mô phân sinh có khả năng phân chia mạnh ở điểm nốt lá mầm. 2.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tái sinh Thành công của việc nuôi cấy mô – tế bào thực vật phụ thuộc rất nhiều vào sự lựa chọn môi trường dinh dưỡng, bao gồm cả chủng loại và nồng độ hóa chất sử dụng. Theo Murashige và Skoog (1962), nhu cầu dinh dưỡng cho việc sinh trưởng tối ưu của các loài thực vật là không giống nhau, ngay cả giữa các bộ phận trong cùng một cơ thể cũng có ít nhiều sự khác nhau (trích dẫn bởi Vũ Văn Vụ, 1999). 2.5.3.1 Các hợp chất cung cấp nitơ (N) Các hợp chất vô cơ chứa N được bổ sung vào môi trường in vitro dưới 2 dạng nitrate (NO3) và amon (NH4+). Lượng NO3 trong hầu hết các môi trường là nhiều hơn NH4+. Ngoài ra, người ta còn bổ sung thêm nguồn N hữu cơ là các amino acid như L–glutamin hay L–asparagin (Narayanaswamy, 1994) (trích dẫn bởi Vũ Văn Vụ, 1999). 10 2.5.3.2 Đường Đường được sử dụng làm nguồn carbon (C) cung cấp năng lượng cho các mô nuôi cấy (Hu và ctv, 1979) (trích dẫn bởi Vũ Văn Vụ, 1999). Ngoài ra, đường còn đóng vai trò là chất thẩm thấu chính của môi trường. Trong số nguồn carbon thì saccharose là loại đường được sử dụng rộng rãi nhất trong nuôi cấy mô. Các loại đường khác cũng thường được sử dụng glucose, mannitol và mantose. 2.5.3.3 Vitamin Hầu hết các mô nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các loại vitamin cần thiết cho quá trình sinh trưởng – phát triển nhưng thường không đầy đủ về số lượng (Czosnowski, 1952; Paris, 1958) (trích dẫn bởi Vũ Văn Vụ, 1999). Vitamin có vai trò xúc tác các quá trình trao đổi chất diễn ra trong tế bào. Vì vậy, để các mô cấy đạt được sự sinh trưởng tối ưu, người ta thường bổ sung vào môi trường một số vitamin như thiamin (B1), acid nicotinic (B3), pyridoxine (B6) và myoinositol. Mỗi loài thực vật sẽ cần số lượng và nồng độ các vitamin khác nhau. 2.5.3.4 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật Đây là thành phần quan trọng bậc nhất của môi trường nuôi cấy in vitro. Nhóm auxin bao gồm một số hợp chất có chứa nhân indol. Auxin có nguồn gốc từ tiếng Hi Lạp là auxein có nghĩa là sinh trưởng. Auxin thúc đẩy quá trình phân chia và giãn nở của tế bào, kích thích các quá trình tổng hợp và trao đổi chất, tham gia điều chỉnh sự phân hóa của rễ và chồi (Bhojwani và Razdan, 1983) (trích dẫn bởi Vũ Văn Vụ, 1999). Các auxin đều có hiệu quả sinh lý ở nồng độ thấp với nồng độ sử dụng từ 0,1 – 2 mgl tùy theo mục đích và vật liệu nuôi cấy. Nồng độ auxin thấp sẽ kích thích sự phân hóa rễ và ngược lại nồng độ cao sẽ kích thích quá trình tạo mô sẹo. Thông thường, người ta thường bổ sung các chất IBA, NAA vào trong môi trường để tạo rễ và sử dụng chất 2,4–D để tạo mô sẹo. 11 Bảng 2.2: Một số auxin được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô in vitro Tên viết tắt Tên hoá học 2,4D 2,4dichlorophenoxyacetic acid 2,4,5T 2,4,5trichlorophenoxyacetic acid Dicamba 2methoxy3,6dichlorobenzoic acid IAA Indole3acetic acid IBA Indole3butyric acid MCPA 2methyl4chlorophenoxyacetic acid NAA 1naphthyl acetic acid NOA 2naphthyloxy acetic acid Picloram 4amino2,5,6trichloropicolinic acid (Nguồn: Theo Bayraç, 2004) Cytokinin là nhóm phytohoocmon dẫn xuất của adenin. Cytokinin được hình thành chủ yếu trong hệ thống rễ và một số cơ quan đang sinh trưởng mạnh như chồi, lá non, quả non (Vũ Văn Vụ và ctv, 1998). Hiệu quả sinh lý đặc trưng nhất của cytokinin là kích thích sự phân chia tế bào mạnh mẽ, kích thích sự phân hóa chồi từ mô sẹo. Bảng 2.3: Một số cytokinin được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô in vitro Tên viết tắt Tên hoá học BAP 6benzylaminopurine 2iP (IPA) N6(2isopentyl) adenine Kinetin 6furfurylaminopurine Thidiazuron 1phenyl3(1,2,3thiadiazol5yl) urea Zeatin 4hydroxy3methyltrans2butenyl amino purine BA benzyladenine (Nguồn: Theo Bayraç, 2004) Theo Vũ Văn Vụ (1999), sự biệt hóa cơ quan thực vật in vitro là kết quả tác động qua lại giữa 2 nhóm chất điều hòa sinh trưởng là auxin và cytokinin. Tỷ lệ auxincytokinin cao sẽ kích thích sự tạo rễ và ngược lại sẽ kích thích sự tạo chồi. 12 Đây là nguyên tắc chung, còn nồng độ cụ thể sẽ phải phụ thuộc vào từng loài thực vật. 2.5.3.5 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy a Nhiệt độ Yêu cầu về khoảng nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng phát triển của từng loại cây in vitro cũng khác nhau. Thông thường, người ta nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ phòng từ 25 280C. Theo các tác giả Shigenobu và Sakamoto (1981) thì nhiệt độ cũng như thời gian chiếu sáng ngày đêm phải không đổi trong suốt thời gian nuôi cấy (trích dẫn bởi Vũ Văn Vụ, 1999). b Ánh sáng Ánh sáng (bao gồm cường độ, chu kỳ và thành phần quang phổ) có ảnh hưởng mạnh đến quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy (Read, 1990; Dooley, 1991) (trích dẫn bởi Vũ Văn Vụ, 1999). Cường độ ánh sáng từ 2.500 – 3.500 lux thường được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô. Cường độ ánh sáng lớn hơn thì sự sinh trưởng của chồi chậm lại nhưng sẽ thúc đẩy quá trình tạo rễ (Murashige, 1977) (trích dẫn bởi Vũ Văn Vụ, 1999). Theo Appelgen (1991), thành phần quang phổ cũng có ảnh hưởng đáng kể đến mô nuôi cấy. Ví dụ nuôi cấy cây quỳ thiên trúc Pelar gonium ở ánh sáng đỏ sẽ làm tăng chiều cao chồi trong khi ánh sáng xanh lại có biểu hiện ức chế (trích dẫn bởi Vũ Văn Vụ, 1999). Sự thu nhận ánh sáng của chồi in vitro phụ thuộc vào bước sóng ánh sáng và chất liệu của bình nuôi cấy. 2.6 Thành phần của gen và các gen chuyển nạp phổ biến 2.6.1 Promoter Một gen lạ chuyển nạp vào cây trồng chỉ có thể biểu hiện khi có một chuỗi trình tự thích hợp đi kèm theo nó. Với mỗi promoter cần có các vector tương ứng. Hiện nay, promoter CAMV35S của virus gây bệnh khảm trên cải bông là một promoter mạnh và được sử dụng phổ biến nhất. 13 2.6.2 Gen thông báo (reporter gene) Thuật ngữ sự biểu hiện gen (gene expression) thường được dùng trong công tác lai tạo giống cây trồng (plant breeding), trong sinh học phân tử (molecular biology) hay lĩnh vực sinh hóa protein (protein biochemistry). Trong ngành lai tạo giống, sự biểu hiện gen được định nghĩa như là một đặc điểm về kiểu hình hay một sự thể hiện tốt hơn (về năng suất, chất lượng) của cây trồng ngoài đồng (better field performance). Theo Jacobsen (2007), bất cứ phương pháp chuyển gen nào dù là chuyển nạp gen gián tiếp bằng vi khuẩn Agrobacterium hay chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen vẫn cần một phương pháp tin cậy để xác định các tế bào đã nhận gen ngoại lai. Với mục đích đó khi thiết kế plasmid, người ta đã sử dụng một hay nhiều gen thông báo. Những gen thông báo đều mang chuỗi mã tổng hợp một loại protein đặc biệt nào đó rất dễ phát hiện trong cây. Người ta thường sử dụng gen gusA của vi khuẩn E. coli làm gen thông báo. Gen gusA mã hóa enzyme β– glucuronidase. Enzyme này xúc tác phản ứng phân giải cơ chất glucuronidae không màu để tạo thành sản phẩm có màu xanh chàm đặc trưng. Glucuronidae thường dùng là 5–bromo–4–chloro–3–indolyl glucuronide (Xgluc). Trong tự nhiên, enzyme β–glucuronidase không tồn tại trong thực vật nên gen gusA là gen chỉ thị rất tốt trong công nghệ gen thực vật. Mặt khác, sản phẩm màu xanh chàm nói trên rất bền và phản ứng ít bị ảnh hưởng của pH môi trường nên rất thuận tiện cho việc theo dõi. 2.6.3 Chỉ thị chọn lọc (selectable marker) Sau quá trình chuyển gen, cần phải tiến hành chọn lọc để tách riêng các tế bào đã nhận gen mục tiêu và cho vào môi trường tái sinh. Thông thường, một plasmid được sử dụng trong chuyển nạp gen sẽ mang các thành phần gen thông báo, chỉ thị chọn lọc và gen mục tiêu. Khi các chỉ thị chọn lọc thể hiện, chúng sẽ giúp tế bào tiếp tục sinh trưởng trong môi trường chọn lọc (selective media) thường chứa chất kháng sinh hay thuốc diệt cỏ. Các chỉ thị chọn lọc phổ biến hiện nay là gen nptII mã hóa enzyme neomycin phospho transferase II. Enzyme này sẽ xúc tác quá trình phosphoryl hóa kháng sinh kanamycin và làm bất hoạt kháng sinh này. Một 14 chỉ thị chọn lọc phổ biến khác là gen hph mã hóa enzyme hygromycin phospho transferase có tác dụng làm bất hoạt kháng sinh hygromycin. Gen bar kháng thuốc diệt cỏ có thể được sử dụng như gen mục tiêu nhưng đồng thời cũng là một chỉ thị chọn lọc. Gen bar mã hóa cho enzyme phosphinothricin acetyl transferase (PAT) làm bất hoạt phosphinothricin (PPT), là thành phần chính trong thuốc diệt cỏ Basta. Gần đây, gen pmi mã hóa enzyme phospho mannose isomerase đã được sử dụng làm chỉ thị chọn lọc. Gen này hoạt động trên cơ sở phản ứng huỳnh quang trong môi trường có đường mannose. Điều này đã mở ra một triển vọng lớn về an toàn sinh học do không cần sử dụng chất kháng sinh hay hoạt chất diệt cỏ trong quá trình chọn lọc (Hòa và Bổng, 2002) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004) Hình 2.1: Thành phần của một gen chuyển nạp (Nguồn: Theo Pighin, 2003) 2.6.4 Những gen chuyển nạp phổ biến vào cây trồng 2.6.4.1 Gen Bt Vi khuẩn Bacillus thuringiensis sản xuất ra những protein dạng tinh thể gọi là Bt hay δ–endotoxin. Theo các tác gi Vaeck và ctv (1987); Steward và ctv, (1996), các Bt toxin rất chuyên tính, ví dụ nhóm cryI chỉ gây độc đối với côn trùng bộ cánh vảy Lepidoptera, không gây độc đối với côn trùng khác hoặc động vật khác như chim, động vật có vú nhóm cryII có độc tính đối với bộ cánh cứng Coleoptera (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004). Ngay khi công nghệ sinh học mới hình thành, các nhà nghiên cứu đã nghĩ đến việc chuyển gen Bt vào cây trồng để cây tạo ra protein độc nhằm tự bảo vệ mình. Gen Bt được phân lập từ tế bào vi khuẩn Bacillus thuringiensis, được cải biên lại trước khi sử dụng cho cây trồng. Cây chuyển nạp gen Bt có nhiều ưu điểm 15 hơn các chế phẩm sinh học Bt được dùng để phun lên cây do nó khắc phục được những nhược điểm như hiệu quả của thuốc không ổn định, không xâm nhập sâu vào mô cây, không có khả năng lưu dẫn, mức chuyên tính quá hẹp. Trong khi đó cây chuyển nạp gen Bt có thể tạo ra protein độc dạng tinh thể trong thân cây. Những protein này được sản xuất liên tục, ít bị phân giải và có mặt ở các mô cần thiết. 2.6.4.2 Gen gna Theo Powel và ctv (1993), hợp chất lectin có nguồn gốc từ thực vật có thể gây độc đối với các côn trùng thuộc bộ cánh nửa Homoptera như rầy nâu (Nilaparvata lugens) hay các loại rầy khác trong đó nhóm lectin có tên “snowdrop lectin” (Galantus nivalis agglutinin) có độc tính mạnh nhất (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004). Trên cây lúa, người ta thấy GNA có thể diệt được rầy nâu và rầy xanh đuôi đen. Lợi dụng đặc tính hút nhựa của các côn trùng này, người ta đã tổng hợp gen gna nhân tạo để chuyển nạp vào cây trồng. Do các côn trùng này có khả năng phân giải protein trong ruột rất thấp nên chúng chỉ sử dụng các amino acid tự do trong nhựa luyện làm nguồn cung cấp đạm chính cho cơ thể. Người ta đã nghĩ ra chiến lược tạo ra cây chuyển gen có chất gây ức chế enzyme protease trong cơ thể côn trùng. Năm 1999, Stoger và ctv đã tiến hành chuyển gen gna vào cây lúa mì (Triticum aestivum L. cv. Bobwhite) nhằm mục tiêu kháng rầy mềm Sitobion avenae (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004). Các tác giả đã đồng chuyển nạp gen gna và gen bar vào mô sẹo lúa mì bằng kỹ thuật bắn gen bằng cách sử dụng vector pLECGNA2, promoter RSsi mang đoạn gen mã hóa GNA và sử dụng vector pAHC20 với promoter “ubiquitin 1” và intron 1 mang gen bar. Sau 9 – 10 tuần, cây tái sinh sẽ được chọn lọc bằng hoạt chất phosphinothricin (PPT) và phân tích Southern blot nhằm chứng minh sự hiện diện của gen bar. Để xác định sự hiện diện của GNA trong cây lúa mì, người ta tiến hành phân tích “immunoblot” lá lúa mì. Với promoter “ubiquitin” kèm theo gen gna, phần lớn các cây chuyển nạp 16 đều thể hiện GNA ở mức có ý nghĩa và dòng BW150 có mức thể hiện gen cao nhất, dòng này có 7 copy của gen gna. 2.6.4.3 Nhóm gen PR Theo Linhorse (1991), khi có sự xâm nhiễm của nấm, vi khuẩn, virus, thực vật sẽ sản sinh ra một protein mới giúp chúng tự bảo vệ (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004). Nhóm protein đó được gọi là pathogenesis–related protein (PR). Các nhóm protein đã được ghi nhận ở thuốc lá là PR–1, PR–2 (β–1,3 glucunase), PR–3 (chitinase), PR–4, PR–5 (thaumatine–like protein) và PR–6 (ức chế protease) trong đó nhóm PR–3 (chitinase) được nghiên cứu nhiều nhất. Người ta nhận thấy hoạt động của chitinase tăng đáng kể khi cây bị bệnh (Lin và ctv, 1995) cũng như khi ta kích thích cây bằng ethylen, tia cực tím và acid salicylic (Gaffney và ctv, 1993) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004). Theo Broglie và ctv (1991), cây thuốc lá được chuyển nạp gen mã hóa chitinase có tỷ lệ sống sót cao hơn trên đất có nhiều mầm bệnh (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004). Năm 1995, Lin và ctv đã sử dụng vector pGL2 mang gen mã hóa chitinase và promoter CAMV35S để chuyển vào giống lúa Chisurah Boro II nhằm giúp giống này kháng được bệnh đốm vằn do nấm Rhizoctonia solani gây ra. 2.6.4.4 Gen Xa–21 Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae là một trong những bệnh quan trọng trong sản xuất lúa gạo. Hiện nay, một gen trội có khả năng kháng bệnh bạc lá là Xa–21 được tìm thấy ở loài lúa hoang châu Phi Oryza longistaminata được xem là có triển vọng hơn cả vì gen có phổ kháng rất rộng đối với nhiều nòi vi khuẩn gây bệnh, do vậy nó thể hiện tính kháng ổn định hơn so với những gen đã được phân lập trước đây (Khush và ctv, 1990) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004). Tu và ctv (1998) đã tiến hành chuyển nạp gen Xa–21 vào giống lúa indica IR72 bằng phương pháp bắn gen. Các tác giả đã sử dụng 2 plasmid trong đó plasmid pC822 mang gen Xa–21 và plasmid pROB5 có chứa gen chọn lọc hph mã 17 hóa tính trạng kháng hygromycin. Những mô sẹo thể hiện tính kháng hygromycin được chuyển sang môi trường N6 để tái sinh cây. Cây sau khi được 2 – 3 tuần tuổi được cấy vào môi trường Yoshida hoặc trồng ra chậu đất. Cho 15 cây T1 này tiếp xúc trực tiếp với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae nòi số 6 bằng kéo nhúng vào dịch vi khuẩn và cắt lên lá lúa, kết quả có 13 cây biểu hiện tính kháng và 2 cây nhiễm. 2.6.4.5 Gen CP Tính kháng virus của “coat protein” (CP) đã được đề cập rất sớm và từ đó người ta muốn đưa tính trạng này vào cây trồng để giúp cây kháng lại các bệnh do virus gây ra. Trước đây, gen CP chủ yếu được chuyển nạp trên cây 2 lá mầm. Các nghiên cứu trên cây thuốc lá chuyển gen cho thấy gen CP đã làm giảm và làm chậm lại sự tích tụ của TMV gây bệnh khảm (Powell và ctv, 1986) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004). Trường hợp điển hình trên cây 1 lá mầm là việc Sivamani và ctv (1999) đã chuyển gen CP (CP1, CP2, CP3 và CP4) vào cây lúa để kiểm soát bệnh tungro do virus tungro dạng hình cầu gây ra

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

****************

HÀ TRẦN MINH DŨNG

XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH IN VITRO VÀ

NGHIÊN CỨU CHUYỂN NẠP GEN KHÁNG THUỐC

DIỆT CỎ GLUFOSINATE TRÊN CÂY ĐẬU XANH

(Vigna radiata (L.) Wilczek) BẰNG VI KHUẨN

SỰ HIỆN DIỆN, PHÂN BỐ NẤM MYCORRHIZAE TRONG RỄ-VÙNG RỄ MÍA VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA NẤM ĐẾN

SINH TRƯỞNG CÂY MÍA (Saccharum officinarum L.)

NGUYỄN THỊ THÚY LIỄU

Hội đồng chấm luận văn

Đại học Nông Lâm TP HCM

Đại học Nông Lâm TP HCM

Đại học Nông Lâm TP HCM

Trung tâm Khuyến nông quốc gia

Đại học Nông Lâm TP HCM

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

HIỆU TRƯỞNG

LÝ LỊCH CÁ NHÂN Tôi tên là Hà Trần Minh Dũng, sinh ngày 04 tháng 10 năm 1980 tại huyện Hòa Thành, tỉnh Tây Ninh Con ông Hà Văn Mẫn và Bà Trần Huệ Thư

Tốt nghiệp Tú tài tại trường Trung học phổ thông Lý Thường Kiệt, tỉnh Tây Ninh, năm 1997

Tốt nghiệp Đại học ngành Nông học hệ chính quy tại Đại học Nông Lâm, thành phố Hồ Chí Minh

Theo học tiếng Pháp tại Viện trao đổi văn hóa với Pháp (Idecaf), TP HCM

từ 2003 - 2007

Tháng 9 năm 2005 theo học Cao học ngành Trồng trọt tại Đại học Nông Lâm, Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh

Tình trạng gia đình: chưa lập gia đình

Địa chỉ liên lạc: ấp Khởi Hà, xã Cầu Khởi, huyện Dương Minh Châu, tỉnh Tây Ninh

Điện thoại: 0903318373

Email: hatranminhdung@gmail.com

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Hà Trần Minh Dũng

LỜI CẢM TẠ

Chân thành cảm tạ Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm, ban Giám đốc Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường và tất cả các cán bộ của Viện

đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập và thực hiện đề tài

Cảm tạ tất cả những Thầy Cô đã truyền đạt cho em kiến thức và phương pháp luận trong khoa học

Em xin chân thành cảm ơn TS Bùi Minh Trí vì những hỗ trợ vật chất và tinh thần quý báu trong một thời gian dài

Con bày tỏ lòng biết ơn đối với Cha Mẹ về sự chăm sóc, động viên và lòng kiên nhẫn

Tôi muốn gửi lời cảm ơn đến các em Huệ, Hưng, Bình, Thu Trang, Thùy Dương, Vũ, Dung, Nam, Phương Hoa vì sự giúp đỡ rất tận tình

Cuối cùng tôi mong muốn gửi lời cảm ơn đến tất cả các thành viên lớp Cao học Trồng trọt 2005, những người đã cùng tôi chia sẻ những niềm vui và cả những khó khăn trong học tập

Thủ Đức, ngày 18 tháng 4, 2010

TÓM TẮT

Đề tài “Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro và ứng dụng trong nghiên cứu chuyển nạp gen bar kháng thuốc diệt cỏ glufosinate trên cây đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek) bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens” được thực hiện từ

tháng 7/2007 đến tháng 9/2009 tại Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học và Môi trường, trường Đại học Nông Lâm, TP HCM

Giống đậu xanh được sử dụng trong thi nghiệm là giống đậu xanh thương phẩm NP-305 của Công ty TNHH sản xuất thương mại Tân Nông Phát và chủng vi

khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA101pIB-GUS do Jabcobsen cung cấp với

plasmid mang gen bar kháng thuốc diệt cỏ, gen P-mannop, gen luc và gen chỉ thị gusA

Chúng tôi đã xây dựng được quy trình tái sinh cây đậu xanh in vitro từ nốt

lá mầm, cây đậu xanh có thể phát triển tốt trong môi trường dinh dưỡng B5 không

có chất điều hòa sinh trưởng, đã xác định được các ngưỡng gây chết của PPT là 1 mg/l để phục vụ cho công tác chọn lọc

Quá trình kiểm tra vi khuẩn cho thấy có sự hiện diện của plasmid và gen mục tiêu trên plasmid chứng tỏ vi khuẩn đạt yêu cầu để thực hiện việc chuyển gen

Quá trình nhuộm GUS cho thấy tỷ lệ dương tính đối với thuốc thử X-gluc khá cao ở tất cả các nghiệm thức biến thiên từ 60 – 73%, tuy nhiên sự khác biệt này không có nghĩa thống kê (P > 0,05)

Các loại kháng sinh cefotaxime, meropenem không có khả năng loại bỏ vi khuẩn dẫn đến tình trạng tái nhiễm sau khi đồng nuôi cấy Tuy nhiên, việc sử dụng cyprofloxacin nồng độ 50 mg/l cho thấy có khả năng loại bỏ được vi khuẩn

Hiệu suất chuyển gen còn thấp mà nguyên nhân có thể là do sự im lặng của gen hoặc do giống NP-305 ít mẫn cảm với vi khuẩn Cuối thí nghiệm, chúng tôi thu

được 2 dòng đậu xanh in vitro có khả năng sống được trong môi trường chọn lọc với PPT và kết quả PCR từ mẫu lá 2 dòng này đã xác nhận sự có mặt của gen bar

trong bộ gen của cây đậu

growth regulators We determined the lethal dose for mungbean in vitro planlets

was 1 mg/l PPT and 200 mg/l kanamycin These doses were used in the selection scheme of putative transformant plants

Agrobacterium tumefaciens strain EHA101pIB-GUS, harboring a binary vector pGII0229 Trgus cp148 luc carrying β-glucuronidase (gusA) gene, bialaphos resistance (bar) gene, P-mannop gene and luc gene with nos poly–A promoter and CaMV 35S terminator was provided by Jacobsen, Hannover university The presence of binary plasmid and bar gene was confirmed by electrophoresis and

PCR

Cotyledonary node explants two day olds were transformed by

co-cultivation with Agrobacterium After 3 days of co-co-cultivation, the transient GUS

expression has been shown in all treatments The 10th treatment (cocultivation during 30 minutes and 100 µM acetosyringone) resulted highest transient GUS activity (73%) and the third treatment (cocultivation during 10 minutes and 50 µM acetosyringone) showed the lowest (60%) but there was no statistical difference in all treaments (P > 0,05)

In spite of the high concentration (1000 mg/l) of cefotaxime and

meropenem, these antibiotics could not eliminate the Agrobacterium The problem

was only solved when we used 50 mg/l cyprofloxacin

The genetic transformation frequency was low At the end of this study, we

just obtained 2 lines of mungbean in vitro that can survive in the selection medium

with 1 mg/l PPT The results were probably affected by gene silencing phenomenon

or genotype NP-305 was less suitable to Agrobacterium- mediated transformation The presence of bar gene in the genome of mungbean was evidenced by PCR and

electrophoresis

MỤC LỤC

Trang tựa

Trang chuẩn y ……… i

Lý lịch cá nhân……… ii

Lời cam đoan……… iii

Cảm tạ ……… iv

Tóm tắt……… v

Mục lục……… vii

Danh sách các chữ viết tắt……… xi

Danh sách các hình, biểu đồ và sơ đồ……… xiii

Danh sách các bảng ……… xiv

Chương 1 MỞ ĐẦU 1 

1.1 Đặt vấn đề 1 

1.2 Mục tiêu đề tài 1 

1.3 Giới hạn đề tài 1 

Chương 2 TỔNG QUAN 3 

2.1 Nguồn gốc cây đậu xanh và tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới 3 

2.2 Tình hình sản xuất đậu xanh ở Việt Nam 4 

2.3 Sự cạnh tranh giữa cỏ dại và cây trồng 5 

2.3.1 Cạnh tranh về dinh dưỡng 5 

2.3.2 Cạnh tranh về nước 6 

2.3.3 Cạnh tranh về ánh sáng 6 

2.3.4 Hiện tượng allelopathy 6 

2.4 Những thiệt hại do cỏ dại gây ra 6 

2.4.1 Tác động làm giảm năng suất cây trồng 6 

2.4.2 Ảnh hưởng đến chất lượng nông sản 7 

2.4.3 Ảnh hưởng đến sức khoẻ gia súc 7 

2.4.4 Ảnh hưởng đến sức khoẻ con người 7 

2.4.5 Gây ô nhiễm, cản trở nguồn nước 7 

2.5 Sự tái sinh in vitro của tế bào thực vật 8 

2.5.1 Cơ chế của sự tái sinh ở thực vật 8 

2.5.2 Ý nghĩa của sự tái sinh trong quá trình chuyển nạp gen 8 

2.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tái sinh 9 

2.5.3.1 Các hợp chất cung cấp nitơ (N) 9 

2.5.3.2 Đường 10 

2.5.3.3 Vitamin 10 

2.5.3.4 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 10 

2.5.3.5 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy 12 

2.6 Thành phần của gen và các gen chuyển nạp phổ biến 12 

2.6.1 Promoter 12 

2.6.2 Gen thông báo (reporter gene) 13 

2.6.3 Chỉ thị chọn lọc (selectable marker) 13 

2.6.4 Những gen chuyển nạp phổ biến vào cây trồng 14 

2.6.4.1 Gen Bt 14 

2.6.4.2 Gen gna 15 

2.6.4.3 Nhóm gen PR 16 

2.6.4.4 Gen Xa–21 16 

2.6.4.5 Gen CP 17 

2.7 Các phương pháp chuyển nạp gen phổ biến 17 

2.7.1 Chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 18 

2.7.2 Chuyển nạp gen bằng phương pháp PEG (polyethylene glycol) 21 

2.7.3 Chuyển nạp gen bằng phương pháp sử dụng xung điện (electroporation) 22 

2.7.4 Chuyển nạp gen bằng phương pháp bắn gen (biolistic) 22 

2.8 Các gen kháng thuốc diệt cỏ phổ biến và cơ chế kháng thuốc diệt cỏ của gen bar

đối với hoạt chất trừ cỏ glufosinate 23 

2.8.1 Gen bxn 23 

2.8.2 Gen bar 24 

2.8.3 Tình hình chuyển gen bar trên cây trồng 27 

2.9 Hoạt chất diệt cỏ glufosinate 28 

2.9.1 Cơ chế tác động của glufosinate 28 

2.9.2 Sự chuyển hóa của glufosinate–ammonium trong cây trồng biến đổi di truyền và cây trồng không biến đổi di truyền 30 

2.10 Tình hình trồng cây chuyển gen trên thế giới 31 

2.11 Tình hình trồng cây chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ trên thế giới 33 

2.12 Tình hình nghiên cứu cây trồng chuyển gen tại Việt Nam 35 

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 38 

3.2 Vật liệu thí nghiệm 38 

3.2.1 Giống đậu xanh 38 

3.2.2 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và các gen chuyển nạp 38 

3.2.3 Hoá chất 39 

3.2.4 Thiết bị dùng trong thí nghiệm 40 

3.3 Phương pháp thí nghiệm 41 

3.3.1 Khảo sát các quy trình khử trùng hạt 41 

3.3.2 Xây dựng hệ thống tái sinh cây đậu xanh in vitro thông qua nốt lá mầm (Cotyledonary node) 43 

3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của hoạt chất diệt cỏ phosphinothricin (PPT) đến sự tái sinh của cây đậu xanh in vitro 45 

3.3.4 Kiểm tra plasmid trong tế bào vi khuẩn và gen bar trên plasmid 46 

3.3.5 Thiết lập quy trình chuyển gen 47 

3.3.6 Khảo sát hiệu quả của các loại kháng sinh cefotaxim, meropenem và cyprofloxacin đến quá trình loại bỏ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens sau khi đồng nuôi cấy 49 

3.3.7 Kiểm tra sự biểu hiện của gen chỉ thị gusA 49 

3.3.8 Chọn lọc cây chuyển gen 50 

3.3.9 Phản ứng PCR khuếch đại gen bar 51 

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 53 

4.1 Khảo sát các quy trình khử trùng hạt 53 

4.2 Kết quả khảo sát môi trường tạo chồi 54 

4.3 Kết quả khảo sát ngưỡng nồng độ gây chết của hoạt chất diệt cỏ PPT đối với cây đậu xanh in vitro 56 

4.4 Kết quả ly trích plasmid và kiểm tra sự hiện diện của gen bar trên plasmid 58 

4.4.1 Kết quả kiểm tra plasmid 58 

4.4.2 Kết quả kiểm tra sự hiện diện của gen bar trên plasmid 59 

4.5 Kết quả kiểm tra sự biểu hiện của gen gusA trên nốt lá mầm đậu xanh chuyển gen 60 

4.6 Kết quả khảo sát khả năng diệt khuẩn của các loại kháng sinh cefotaxime, meropenem và cyprofloxacin 61 

4.7 Kết quả chọn lọc cây đậu xanh in vitro giả định chuyển gen trong môi trường có PPT 64 

4.8 Kết quả ly trích DNA tổng số và sự hiện diện của gen bar trong genome đậu xanh 65 

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 69 

5.1 Kết luận 69 

5.2 Đề nghị 70 

PHỤ LỤC 76 

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ABA: acid abscisic

ALS: acetolactate synthase

AS: acetosyringone

B1: thiamin

B3: acid nicotinic

B5-Co: Co-culture medium

B5-i: Inoculation medium

B5-Pre: Pre-culture medium

EPSPS: 3-enoyl pyruvyl shikimate 5-phosphate synthase

glufosinate: DL–homoalanin–4-yl (methyl) phosphinic acid

GNA: Galantus nivalis agglutinin

gusA: β–glucuronidase

GS: glutamine synthetase

ha: hectare

hph: hygromycin phospho transferase

IBA: indolebutyric acid

ioxynil: 3,5–di–iodo–4–hydroxybenzonitrile

M: mol

MES: morpholino ethan sulfonic acid

nptII: neomycin phospho transferase

OECD: Organisation for Economic Co-operation and Development OH-AS: α-hydro acetosyringone

PAT: phosphinothricin acetyl transferase

PEG: polyethylene glycol

ppm: par per million

PPO: 4–methyl–phosphinico–2–oxo–butanoic acid

PPT: phosphinothricin

SDS: sodium dodecyl sulfat

Ti-plasmid: tumor-inducing plasmid

vir: virulence

X-gluc: 5–bromo–4–chloro–3–indolyl glucuronide

DANH SÁCH CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ VÀ SƠ ĐỒ

Trang

Biểu đồ 2.1: Những nước sản xuất đậu xanh chủ yếu trên thế giới 4

Hình 2.1: Thành phần của một gen chuyển nạp 14

Hình 2.2: Ti-plasmid của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 20

Hình 2.3: Hoạt động của các gen vir trong quá trình xâm nhiễm của T-DNA vào tế bào thực vật 21

Hình 2.4: Cấu trúc hóa học của Bialaphos 26

Hình 3.1: Plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc 39

Sơ đồ 3.1: Sơ đồ vùng T-DNA của plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc 39

Sơ đồ 3.2: Quy trình kiểm tra plasmid và gen bar trên vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 46

Sơ đồ 3.3: Các bước của quy trình nhuộm GUS mô đậu xanh sau 2 ngày đồng nuôi cấy với vi khuẩn 50

Sơ đồ 3.4: Quy trình ly trích DNA cây đậu xanh 51

Hình 4.1: Sự tạo chồi và tạo rễ cây đậu xanh in vitro giống NP-305 56

Hình 4.2: Khả năng tái sinh chồi từ nốt lá mầm ở các nồng độ PPT 0; 0,5; 1; 2 mg/l 58

Hình 4.3: Plasmid li trích từ vi khuẩn 59

Hình 4.4: Kết quả kiểm tra gen bar trên plasmid 59

Hình 4.5: Một số hình ảnh kết quả nhuộm GUS tiêu biểu 61

Hình 4.6: Hai dòng đậu xanh in vitro M1 và M2 giả định chuyển gen trong môi trường chọn lọc với 1 mg/l PPT 65

Hình 4.7: Kết quả điện di DNA tổng số từ mô lá cây đậu xanh 65

Hình 4.8: Sản phẩm gen bar trong bộ gen cây đậu xanh 66

Sơ đồ 4.1: Tóm tắt quy trình xây dựng hệ thống tái sinh và chuyển gen 67

Hình 4.9: Mô tả một số bước trong quy trình chuyển gen 68

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Hàm lượng dinh dưỡng trong một số loài cỏ và cây trồng 5

Bảng 2.2: Một số auxin được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô in vitro 11

Bảng 2.3: Một số cytokinin được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô in vitro 11

Bảng 2.4: Các nước có diện tích cây chuyển gen lớn trên thế giới năm 2000 32

Bảng 2.5: Các nước có diện tích cây chuyển gen lớn trên thế giới năm 2006 32

Bảng 2.6: Các loại thuốc diệt cỏ và gen kháng phổ biến 34

Bảng 2.7: Cây trồng chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ và công ty sản xuất 35

Bảng 3.1: Các quy trình thử nghiệm khử trùng hạt 42

Bảng 3.2: Thành phần môi trường tạo chồi 44

Bảng 3.3: Thành phần môi trường tạo rễ 44

Bảng 3.4: Môi trường chọn lọc với PPT 45

Bảng 3.5: Các nghiệm thức trong thí nghiệm chuyển gen 47

Bảng 3.6: Thành phần các môi trường tiền nuôi cấy (Pre-culture medium), môi trường ủ (Inoculation medium) và môi trường đồng nuôi cấy (Co-culture medium) 48

Bảng 3.7: Thành phần hoá chất thực hiện phản ứng PCR 52

Bảng 3.8: Chương trình nhiệt thực hiện phản ứng PCR 52

Bảng 4.1: Kết quả khảo sát 3 quy trình khử trùng hạt 53

Bảng 4.2: So sánh khả năng tạo chồi và tạo rễ cây đậu xanh in vitro trên môi trường B5 với các nồng độ BA khác nhau 54

Bảng 4.3: Tỷ lệ tái sinh chồi của nốt lá mầm ở các nồng độ 0; 0,5; 1; 2 mg/l PPT 57

Bảng 4.4: Kết quả nhuộm GUS ở các nghiệm thức chuyển gen 60

Bảng 4.5: Kết quả rửa mẫu với các loại kháng sinh cefotaxime, meropenem và cyprofloxacin ở các nồng độ và thời gian khác nhau 62

Chương 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Cỏ dại luôn là một trong những vấn đề quan trọng mà người nông dân phải đối mặt trong sản xuất Cỏ dại cạnh tranh nước, dinh dưỡng, không gian sống với cây trồng và từ đó làm giảm năng suất và chất lượng nông sản Theo Winch (2006), năng suất cây trồng bị tổn thất do cỏ dại gây ra là 16% ở châu Phi, 14% ở châu Á, 8% ở vùng Bắc, Nam và Trung Mỹ, 7% ở châu Âu Trong canh tác đậu xanh theo Kolar và Dhingra (1986) (trích dẫn bởi Sonia và ctv, 2006) cỏ dại có thể làm tổn thất đến 30 – 40% năng suất

Trong quá trình canh tác, nông dân thường kiểm soát cỏ dại bằng cách cày xới, nhổ cỏ bằng tay, phun thuốc diệt cỏ hay kết hợp tất cả những biện pháp này Tuy nhiên, việc cày xới sẽ làm tăng tốc độ xói mòn đất do gió và nước, gây hậu quả nghiêm trọng cho môi trường Tương tự, biện pháp nhổ cỏ bằng tay cũng tỏ ra không hiệu quả trên đồng ruộng có diện tích lớn Vì có nhiều loại cỏ dại trên đồng ruộng nên nông dân phải sử dụng nhiều loại thuốc diệt cỏ khác nhau Biện pháp diệt

cỏ này rất tốn kém và gây ô nhiễm môi trường Nhằm giải quyết hạn chế này các nhà khoa học đã đề nghị biện pháp kiểm soát cỏ dại một cách đơn giản hơn là chỉ phun thuốc diệt cỏ kết hợp với việc trồng cây mang tính trạng kháng thuốc diệt cỏ

Cây trồng mang gen kháng thuốc diệt cỏ đã trở thành một công cụ hữu hiệu trong việc kiểm soát cỏ dại và phù hợp với xu hướng canh tác làm đất tối thiểu hiện nay Cây trồng kháng thuốc diệt cỏ tạo sự tiện lợi trong canh tác cho người nông dân do họ chỉ sử dụng thuốc diệt cỏ khi cần thiết mà không cần phải phun phòng như trước đây Họ chỉ cần sử dụng duy nhất một loại thuốc đặc hiệu nên có thể kiểm soát được lượng thuốc sử dụng và vì vậy ít gây ô nhiễm môi trường Mặt khác, với xu hướng thiếu lao động thủ công trong ngành nông nghiệp trong tương

lai thì biện pháp trồng cây kháng thuốc diệt cỏ có thể giải phóng đáng kể sức lao động cho nông dân

Đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek) là cây trồng quan trọng trong nhóm

đậu đỗ cùng với đậu nành và đậu phộng Trồng cây đậu xanh vừa cung cấp thức ăn cho người và gia súc lại vừa có tác dụng cải tạo đất do nốt sần của cây chứa vi

khuẩn Rhizobium có khả năng cố định đạm (Lambrides và Godwin, 2007) Tuy

nhiên, năng suất đậu xanh vẫn còn hạn chế do một số đặc tính nông học chưa tốt và cây thường mẫn cảm với các tác nhân sinh học như nấm, vi khuẩn, virus và côn trùng (Mahalakshmi và ctv, 2006)

Hiện nay những nỗ lực cải tiến năng suất và chất lượng hạt đậu xanh bằng con đường lai tạo cổ điển tỏ ra kém hiệu quả (Lambrides và Godwin, 2007) Vì vậy việc ứng dụng những tiến bộ của công nghệ sinh học sẽ cung cấp những công cụ hiệu quả hơn trong việc tạo ra những tính trạng mong muốn trên cây trồng Đã có nhiều báo cáo về chuyển gen được thực hiện trên đậu nành nhưng những nghiên cứu tương tự trên cây đậu xanh còn tương đối hạn chế Vì vậy, nhằm nghiên cứu một quy trình chuyển nạp gen phù hợp trên đậu xanh, được sự hướng dẫn của TS

Bùi Minh Trí, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro và nghiên cứu chuyển nạp gen kháng thuốc diệt cỏ glufosinate trên cây đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek) bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”

1.2 Mục tiêu đề tài

- Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro hoàn chỉnh cho cây đậu xanh

- Xây dựng quy trình chuyển gen bar kháng thuốc diệt cỏ nhóm glufosinate cho cây đậu xanh bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

1.3 Giới hạn đề tài

Đề tài được thực hiện từ tháng 7/2007 – 7/2009 và sẽ giới hạn ở giai đoạn

kiểm tra biểu hiện của gen chỉ thị gusA và sự hiện diện của gen bar trong genome

cây đậu xanh giả định chuyển gen bằng phản ứng PCR

Chương 2 TỔNG QUAN

2.1 Nguồn gốc cây đậu xanh và tì nh hình sản xuất đậu xanh trên thế giới

Cây đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek) thuộc bộ Fabales, họ Fabaceae, chi Vigna, là một loại cây trồng cổ truyền của nhân loại Theo Vavilop (1951) (trích

dẫn bởi Nguyễn Thế Côn, 1996), trung tâm khởi nguyên của cây đậu xanh có thể là

ở vùng đồng bằng Burma của Ấn Độ Tuy nhiên, người ta cũng tìm thấy dạng Vigna radiata (L.) Wilczek hoang dại mọc ở vùng ven Ấn Độ Dương thuộc Đông Phi

Hiện nay, đậu xanh được trồng ở 23 nước trên thế giới, từ 300 vĩ Bắc đến 300 vĩ Nam, tập trung chủ yếu ở vùng Nam Á, Đông Á và Đông Nam Á Đậu xanh đứng

đầu trong số các cây trồng thuộc chi Vigna về diện tích với khoảng 3,4 – 3,6 triệu ha

và sản lượng 1,4 – 1,8 triệu tấn Hạt đậu xanh là nguồn thực phẩm giàu đạm vì protein trong hạt chứa đủ 8 amino acid thiết yếu Trong 100 g hạt đậu xanh chứa 64

mg Ca, 377 mg P và các loại vitamin quan trọng như vitamin B1 (0,72 mg), vitamin B2 (0,15 mg), vitamin PP (2,4 mg), vitamin C (4 mg) (Nguyễn Thế Côn, 1996) Ở châu Á có đến hàng trăm loại thực phẩm được chế biến từ đậu xanh trong đó có các loại rất phổ biến trong đời sống hàng ngày như giá đậu, miến, bột dinh dưỡng Ở Việt Nam người ta thường sử dụng đậu xanh để làm xôi, nấu chè, làm bánh chưng, bánh tét

Các nước sản xuất đậu xanh chính trên thế giới là Ấn Độ (2,8 triệu ha), Trung Quốc (772.000 ha), Myanmar (650.000 ha), Indonesia (324.000 ha), Thái Lan (289.000 ha) Ấn Độ sản xuất hơn 50 % sản lượng đậu xanh của thế giới nhưng chủ yếu là tiêu thụ trong nước (Vijayalakshmi và ctv, 2003) (trích dẫn bởi Lambrides và Godwin, 2007) trong khi đó Thái Lan chỉ với diện tích 289.000 ha nhưng lại là nước xuất khẩu đậu xanh lớn nhất thế giới Trong 2 thập niên từ 1980 -

2000, diện tích trồng đậu xanh của Myanmar đã tăng lên 22% và đây là nước có diện tích trồng đậu xanh lớn thứ 3 trên thế giới chỉ sau Ấn Độ và Trung Quốc

Biểu đồ 2.1: Những nước sản xuất đậu xanh chủ yếu trên thế giới

(Nguồn: Theo Weinburger (2003) (trích dẫn bởi Lambrides và Godwin, 2007)

2.2 Tình hình sản xuất đậu xanh ở Việt Nam

Đậu xanh được trồng rải rác trên hầu hết các vùng miền ở nước ta do đây là cây ngắn ngày, kỹ thuật canh tác tương đối đơn giản và không yêu cầu thâm canh cao Đậu xanh thường được trồng luân canh với các cây lương thực khác như lúa và bắp Ở đồng bằng sông Cửu Long, việc luân canh cây trồng cạn trên chân đất lúa đã góp phần làm giảm nhu cầu nước tưới, đặc biệt là trong mùa nắng và làm gia tăng

độ phì của đất về lâu dài Các mô hình luân canh cây bắp, đậu xanh và đậu nành trên chân đất lúa đều cho hiệu quả kinh tế cao hơn mô hình độc canh cây lúa (Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long, 2005)

Hiện nay, diện tích trồng đậu xanh còn hạn chế so với các cây họ đậu khác như đậu nành, đậu phụng Theo Nguyễn Văn Chương (2009), diện tích trồng đậu xanh khoảng 60 - 80 nghìn ha, sản lượng không đủ để đáp ứng nhu cầu tiêu thụ

trong nước, hàng năm phải nhập khẩu một lượng lớn từ Trung Quốc và Campuchia

Một số nguyên nhân ảnh hưởng đến sự phát triển năng suất và hiệu quả kinh tế cây

đậu xanh là cây đậu nành phải thu hoạch 2 - 4 lần/vụ, việc thu và tách hạt thực hiện

thủ công rất khó khăn cho việc trồng với diện tích lớn (Phạm Văn Thiều, 2002)

2.3 Sự cạnh tranh giữa cỏ dại và cây trồng

Sự cạnh tranh là hoạt động của một sinh vật hoặc một quần thể giành lấy một

hoặc vài yếu tố sinh tồn mà sinh vật hoặc quần thể khác cũng muốn sử dụng trong

cùng một thời gian Cạnh tranh giữa cỏ dại và cây trồng chủ yếu xảy ra về chất dinh

dưỡng, nước và ánh sáng

2.3.1 Cạnh tranh về dinh dưỡng

Đạm (N) là yếu tố cạnh tranh quan trọng giữa cỏ dại và cây trồng Sự cạnh

tranh cũng xảy ra đối với các chất dinh dưỡng khác Cỏ thường hấp thu chất dinh

dưỡng nhanh hơn nhiều loại cây trồng và tích lũy trong mô với hàm lượng cao

Theo Dương Văn Chín (2005), cây rau dền Amaranthus spp tích lũy trên 3% N

trong chất khô, cỏ chỉ tích lũy 3,36% P2O5 trong chất khô, Chenopodium sp và

Portulaca sp tích lũy trên 1,3% K2O trong chất khô Nhìn chung, cỏ dại lấy đi

lượng dinh dưỡng gấp 2 lần cây trồng do quần thể cỏ dại rất đa dạng và có khả năng

tích lũy dinh dưỡng trong thân với hàm lượng lớn

Bảng 2.1: Hàm lượng dinh dưỡng trong một số loài cỏ và cây trồng

Loài thực vật Phần trăm (%) lượng chất khô

Cỏ dại

Rau trai (Commelina benghalensis) 2,02 1,46 1,86

Cây trồng

(Nguồn: Theo Dương Văn Chín, 2005)

2.3.2 Cạnh tranh về nước

Cỏ dại cạnh tranh nước rất gay gắt với cây trồng nhất là ở những vùng khô hạn Để sản xuất ra cùng một lượng chất khô cỏ dại cần lượng nước cao hơn cây trồng Ở vùng khô hạn, cỏ dại sử dụng quá nhiều nước làm thiếu nước trầm trọng ở giai đoạn ra hoa và tạo hạt của cây trồng dẫn đến giảm năng suất nghiêm trọng Nhiều loại cỏ có rễ sâu nên có thể lấy cả lượng nước dự trữ ở tầng đất sâu

2.3.3 Cạnh tranh về ánh sáng

Trong việc cạnh tranh về ánh sáng thì yếu tố chiều cao là rất quan trọng Trong điều kiện nước và chất dinh dưỡng đầy đủ thì ánh sáng trở thành yếu tố cạnh tranh quan trọng nhất Sự cạnh tranh về ánh sáng có thể xảy ra rất sớm khi cỏ mọc dày và che phủ cây trồng còn nhỏ

2.3.4 Hiện tượng allelopathy

Allelopathy là hiện tượng một loài cây tiết ra chất hữu cơ từ rễ hoặc sự phân hủy thân lá của loài cây này ảnh hưởng đến sự nảy mầm, sinh trưởng và phát triển của loài thực vật khác Theo Putnam và Tang (1986), có khoảng 90 loài cỏ có khả năng cạnh tranh với cây trồng bằng cơ chế allelopathy (trích dẫn bởi Lambrides và Godwin, 2007) Như vậy sự gây thiệt hại lẫn nhau giữa cỏ dại và cây trồng (weed–crop interference) bao gồm sự cạnh tranh (weed–crop competition) và allelopathy

2.4 Những thiệt hại do cỏ dại gây ra

Nhiều người không nhận biết đầy đủ những thiệt hại do cỏ dại gây ra vì nó diễn biến từ từ, không gây thiệt hại nhanh chóng và rõ ràng như côn trùng và bệnh

2.4.1 Tác động làm giảm năng suất cây trồng

Qua nhiều kết quả nghiên cứu thì cỏ dại gây ra thiệt hại lớn hơn so với côn trùng và bệnh cộng lại (Bendixen, 1972) (trích dẫn bởi Dương Văn Chín, 2005) Cỏ dại còn là ký chủ phụ của côn trùng, bệnh và là nơi trú ẩn của chuột Cỏ dại trên ruộng còn gây khó khăn cho quá trình canh tác Hạt cỏ, thân, rễ sẽ làm ảnh hưởng xấu đến quá trình chế biến nông sản

2.4.2 Ảnh hưởng đến chất lượng nông sản

Hạt lúa mì có lẫn hạt cải dầu hoang (Brassica spp.) khi xay ra sẽ có mùi lạ

làm người tiêu dùng không chấp nhận Trong quá trình bảo quản, hạt và thân lá cỏ

có ẩm độ cao sẽ làm nông sản mau bị hỏng Cỏ dại lẫn vào cỏ làm thức ăn gia súc gây mùi lạ làm gia súc không thích ăn

2.4.3 Ảnh hưởng đến sức khoẻ gia súc

Một số loài cỏ có hàm lượng alkaloids, tanin, oxalates, glucocides và nitrate

rất cao có thể gây ngộ độc cho gia súc Ví dụ cỏ Oxytropis spp có thể gây sẩy thai trên cừu và bò Một số loài cỏ như kinh giới (Chenopodium sp.), rau dền (Amaranthus sp.) trong điều kiện bình thường thì không độc nhưng khi gặp điều

kiện môi trường bất lợi sẽ tích lũy nitrate ở nồng độ rất cao (1000 ppm) Khi ăn vào

cơ thể, nitrate sẽ biến thành nitrite và gây độc cho gia súc (Dương Văn Chín, 2005)

2.4.4 Ảnh hưởng đến sức khoẻ con người

Nhiều loài cỏ gây dị ứng hoặc gây thương tích cho con người khi tiếp xúc Nhiều người bị cảm cúm mãn tính do hít phải hạt phấn của các loài cỏ như

Ambrosia sp và Frenseria sp., có người bị dị ứng khi tiếp xúc với cỏ Parthenium

sp Cỏ cũng là nơi trú ẩn của các côn trùng gây bệnh cho con người như ruồi

Tse-Tse gây bệnh ngủ, muỗi truyền bệnh sốt rét, sốt xuất huyết Bèo (Pistia lanceolata)

là nơi trú ẩn và sinh sản của muỗi, lục bình (Water hyacinth) cung cấp oxy qua rễ

tạo điều kiện tốt cho lăng quăng phát triển

2.4.5 Gây ô nhiễm, cản trở nguồn nước

Các loài cỏ thủy sinh làm cản trở giao thông thủy, làm giảm tốc độ chảy của dòng nước Cỏ thủy sinh làm tăng tốc độ bốc thoát hơi nước ở các ao hồ do hiện tượng bốc thoát hơi nước Tổng lượng nước bốc thoát hơi trên mặt hồ có lục bình bằng 130 – 250% so với mặt hồ sạch cỏ (Dương Văn Chín, 2005) Cỏ làm ảnh hưởng đến việc sản xuất thủy sản do rễ tiết ra các chất hữu cơ, do thân lá bị phân hủy gây ô nhiễm nguồn nước Việc thu hoạch thủy sản cũng sẽ khó khăn khi mặt nước có nhiều cỏ Tại bang West Bengal của Ấn Độ, việc thất thoát cá do cỏ dại hàng năm khoảng 500 tấn (Ramachandran, 1969) (trích dẫn bởi Dương Văn Chín,

2005) Ngoài ra cỏ dại còn ảnh hưởng đến các công trình công cộng, gây khó khăn trong công tác phòng cháy, chữa cháy, gây thiệt hại cho rừng và giảm vẻ mỹ quan

môi trường

2.5 Sự tái sinh in vitro của tế bào thực vật

2.5.1 Cơ chế của sự tái sinh ở thực vật

Khi tách rời một bộ phận nào đó ra khỏi cây mẹ tức là ta đã làm cho tính nguyên vẹn (totipotency) của cây bị vi phạm Đặc tính vốn có của cây là khả năng khôi phục lại tính nguyên vẹn đó bằng sự tái sinh Khác với động vật, thực vật có khả năng tái sinh mạnh mẽ hơn nhiều, từ một bộ phận tách rời khỏi cây mẹ trong điều kiện nhất định nó có thể tái sinh để tạo thành một cây mới hoàn chỉnh Sự tái sinh ở thực vật có thể chia thành 2 dạng là tái sinh sinh lý và tái sinh bệnh

Tái sinh sinh lý được hiểu như là sự thay thế những bộ phận đã mất đi và điều này cần thiết cho đời sống của chúng Đây là những biểu hiện về mặt sinh lý cần thiết của cây, chẳng hạn như cây rụng lá vào mùa thu, mùa đông, sang mùa xuân chúng lại tái sinh ra lá mới để đảm nhận chức năng quang hợp tốt hơn

Tái sinh bệnh là quá trình tái sinh do vết thương gây ra Khi cây bị tổn thương sẽ xuất hiện sự tái sinh để làm lành vết thương hoặc phục hồi các phần đã mất đi hay tái sinh cho ra cơ quan mới để khôi phục tính nguyên vẹn của cây Khả năng tái sinh của thực vật rất khác nhau phụ thuộc vào đặc tính của loài, giống, các giai đoạn sinh trưởng, phát triển, mùa vụ và điều kiện sinh thái

2.5.2 Ý nghĩa của sự tái sinh trong quá trình chuyển nạp gen

Từ lâu con người đã biết sử dụng đặc tính tái sinh này trong việc nhân giống

vô tính các loại cây trồng thông qua biện pháp giâm cành, chiết cành, ghép mắt và

nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro Ngày nay, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro đã trở thành một khâu rất quan trọng trong quy trình chuyển nạp gen

vào cây trồng (Vũ Văn Vụ và ctv, 1998)

Để tạo cây chuyển gen, trước hết phải tạo ra được cây tái sinh từ một bộ

phận, mô hoặc một tế bào duy nhất, phát triển trong môi trường nuôi cấy in vitro

đường tái sinh này khi ta đưa một đoạn T-DNA mang gen có ích vào tế bào thực vật, ta có thể thu nhận cây tái sinh mang gen này Trong quá trình xây dựng hệ thống tái sinh cần xác định các chất điều hòa sinh trưởng phù hợp, nồng độ các chất này, vật liệu tái sinh, thời điểm tái sinh Khi đã xác định được bộ phận nuôi cấy tốt nhất, môi trường nuôi cấy thích hợp nhất thì hầu hết các thực vật đều có khả năng tái sinh

Theo Gulati và Jaiwal (1994), nốt lá mầm (cotyledonary node) ở một số cây

họ Đậu như đậu nành (Glycine max), đậu cô ve (Phaseolus vulgaris), đậu ngựa (Vicia faba) và đậu Hà Lan (Pisum sativum) đã được sử dụng làm vật liệu nuôi cấy

mô in vitro khá thành công Những nghiên cứu về mô học (histology) của các tác

giả này trên đậu xanh cho thấy ở vị trí điểm nốt này có sự phân chia tế bào rất mạnh

và ở đây hình thành những vùng mô phân sinh (meristematic regions) Tương tự,

các nghiên cứu trên đậu cô ve (McClean và Graton, 1989), Phaseolus acutifolius và Phaseolus coccineus (Malik và Saxena, 1992) (trích dẫn bởi Gulati và Jaiwal, 1994)

cũng cho thấy có các vùng mô phân sinh có khả năng phân chia mạnh ở điểm nốt lá mầm

2.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tái sinh

Thành công của việc nuôi cấy mô – tế bào thực vật phụ thuộc rất nhiều vào

sự lựa chọn môi trường dinh dưỡng, bao gồm cả chủng loại và nồng độ hóa chất sử dụng Theo Murashige và Skoog (1962), nhu cầu dinh dưỡng cho việc sinh trưởng tối ưu của các loài thực vật là không giống nhau, ngay cả giữa các bộ phận trong

cùng một cơ thể cũng có ít nhiều sự khác nhau (trích dẫn bởi Vũ Văn Vụ, 1999) 2.5.3.1 Các hợp chất cung cấp nitơ (N)

Các hợp chất vô cơ chứa N được bổ sung vào môi trường in vitro dưới 2

dạng nitrate (NO3-) và amon (NH4+) Lượng NO3- trong hầu hết các môi trường là nhiều hơn NH4+ Ngoài ra, người ta còn bổ sung thêm nguồn N hữu cơ là các amino acid như L–glutamin hay L–asparagin (Narayanaswamy, 1994) (trích dẫn bởi Vũ Văn Vụ, 1999)

2.5.3.2 Đường

Đường được sử dụng làm nguồn carbon (C) cung cấp năng lượng cho các mô nuôi cấy (Hu và ctv, 1979) (trích dẫn bởi Vũ Văn Vụ, 1999) Ngoài ra, đường còn đóng vai trò là chất thẩm thấu chính của môi trường Trong số nguồn carbon thì saccharose là loại đường được sử dụng rộng rãi nhất trong nuôi cấy mô Các loại đường khác cũng thường được sử dụng glucose, mannitol và mantose

2.5.3.3 Vitamin

Hầu hết các mô nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các loại vitamin cần thiết cho quá trình sinh trưởng – phát triển nhưng thường không đầy đủ về số lượng (Czosnowski, 1952; Paris, 1958) (trích dẫn bởi Vũ Văn Vụ, 1999) Vitamin

có vai trò xúc tác các quá trình trao đổi chất diễn ra trong tế bào Vì vậy, để các mô cấy đạt được sự sinh trưởng tối ưu, người ta thường bổ sung vào môi trường một số vitamin như thiamin (B1), acid nicotinic (B3), pyridoxine (B6) và myo-inositol Mỗi loài thực vật sẽ cần số lượng và nồng độ các vitamin khác nhau

2.5.3.4 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Đây là thành phần quan trọng bậc nhất của môi trường nuôi cấy in vitro

Nhóm auxin bao gồm một số hợp chất có chứa nhân indol Auxin có nguồn gốc từ tiếng Hi Lạp là auxein có nghĩa là sinh trưởng Auxin thúc đẩy quá trình phân chia

và giãn nở của tế bào, kích thích các quá trình tổng hợp và trao đổi chất, tham gia điều chỉnh sự phân hóa của rễ và chồi (Bhojwani và Razdan, 1983) (trích dẫn bởi

Vũ Văn Vụ, 1999) Các auxin đều có hiệu quả sinh lý ở nồng độ thấp với nồng độ

sử dụng từ 0,1 – 2 mg/l tùy theo mục đích và vật liệu nuôi cấy Nồng độ auxin thấp

sẽ kích thích sự phân hóa rễ và ngược lại nồng độ cao sẽ kích thích quá trình tạo

mô sẹo Thông thường, người ta thường bổ sung các chất IBA, NAA vào trong môi trường để tạo rễ và sử dụng chất 2,4–D để tạo mô sẹo

Bảng 2.2: Một số auxin được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô in vitro

2,4,5-T 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid

Dicamba 2-methoxy-3,6-dichlorobenzoic acid

Picloram 4-amino-2,5,6-trichloropicolinic acid

(Nguồn: Theo Bayraç, 2004) Cytokinin là nhóm phytohoocmon dẫn xuất của adenin Cytokinin được hình thành chủ yếu trong hệ thống rễ và một số cơ quan đang sinh trưởng mạnh như chồi, lá non, quả non (Vũ Văn Vụ và ctv, 1998) Hiệu quả sinh lý đặc trưng nhất của cytokinin là kích thích sự phân chia tế bào mạnh mẽ, kích thích sự phân hóa chồi từ mô sẹo

Bảng 2.3: Một số cytokinin được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô in vitro

BAP 6-benzylaminopurine

2iP (IPA) N6-(2-isopentyl) adenine

Kinetin 6-furfurylaminopurine

Thidiazuron 1-phenyl-3-(1,2,3-thiadiazol-5-yl) urea

Zeatin 4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butenyl amino purine

Đây là nguyên tắc chung, còn nồng độ cụ thể sẽ phải phụ thuộc vào từng loài thực vật

2.5.3.5 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy

a/ Nhiệt độ

Yêu cầu về khoảng nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng phát triển của từng

loại cây in vitro cũng khác nhau Thông thường, người ta nuôi cấy trong điều kiện

nhiệt độ phòng từ 25 - 280C Theo các tác giả Shigenobu và Sakamoto (1981) thì nhiệt độ cũng như thời gian chiếu sáng ngày đêm phải không đổi trong suốt thời gian nuôi cấy (trích dẫn bởi Vũ Văn Vụ, 1999)

b/ Ánh sáng

Ánh sáng (bao gồm cường độ, chu kỳ và thành phần quang phổ) có ảnh hưởng mạnh đến quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy (Read, 1990; Dooley, 1991) (trích dẫn bởi Vũ Văn Vụ, 1999) Cường độ ánh sáng từ 2.500 – 3.500 lux thường được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô Cường độ ánh sáng lớn hơn thì sự sinh trưởng của chồi chậm lại nhưng sẽ thúc đẩy quá trình tạo rễ (Murashige, 1977) (trích dẫn bởi Vũ Văn Vụ, 1999)

Theo Appelgen (1991), thành phần quang phổ cũng có ảnh hưởng đáng kể

đến mô nuôi cấy Ví dụ nuôi cấy cây quỳ thiên trúc Pelar gonium ở ánh sáng đỏ sẽ

làm tăng chiều cao chồi trong khi ánh sáng xanh lại có biểu hiện ức chế (trích dẫn

bởi Vũ Văn Vụ, 1999) Sự thu nhận ánh sáng của chồi in vitro phụ thuộc vào bước

sóng ánh sáng và chất liệu của bình nuôi cấy

2.6 Thành phần của gen và các gen chuyển nạp phổ biến

2.6.1 Promoter

Một gen lạ chuyển nạp vào cây trồng chỉ có thể biểu hiện khi có một chuỗi trình tự thích hợp đi kèm theo nó Với mỗi promoter cần có các vector tương ứng

Hiện nay, promoter CAMV35S của virus gây bệnh khảm trên cải bông là một

promoter mạnh và được sử dụng phổ biến nhất

2.6.2 Gen thông báo (reporter gene)

Thuật ngữ sự biểu hiện gen (gene expression) thường được dùng trong công tác lai tạo giống cây trồng (plant breeding), trong sinh học phân tử (molecular biology) hay lĩnh vực sinh hóa protein (protein biochemistry) Trong ngành lai tạo giống, sự biểu hiện gen được định nghĩa như là một đặc điểm về kiểu hình hay một

sự thể hiện tốt hơn (về năng suất, chất lượng) của cây trồng ngoài đồng (better field performance) Theo Jacobsen (2007), bất cứ phương pháp chuyển gen nào dù là

chuyển nạp gen gián tiếp bằng vi khuẩn Agrobacterium hay chuyển gen trực tiếp

bằng súng bắn gen vẫn cần một phương pháp tin cậy để xác định các tế bào đã nhận gen ngoại lai Với mục đích đó khi thiết kế plasmid, người ta đã sử dụng một hay nhiều gen thông báo Những gen thông báo đều mang chuỗi mã tổng hợp một loại protein đặc biệt nào đó rất dễ phát hiện trong cây Người ta thường sử dụng gen

gusA của vi khuẩn E coli làm gen thông báo Gen gusA mã hóa enzyme β–

glucuronidase Enzyme này xúc tác phản ứng phân giải cơ chất glucuronidae không màu để tạo thành sản phẩm có màu xanh chàm đặc trưng Glucuronidae thường dùng là 5–bromo–4–chloro–3–indolyl glucuronide (X-gluc) Trong tự nhiên,

enzyme β–glucuronidase không tồn tại trong thực vật nên gen gusA là gen chỉ thị rất

tốt trong công nghệ gen thực vật Mặt khác, sản phẩm màu xanh chàm nói trên rất bền và phản ứng ít bị ảnh hưởng của pH môi trường nên rất thuận tiện cho việc theo dõi

2.6.3 Chỉ thị chọn lọc (selectable marker)

Sau quá trình chuyển gen, cần phải tiến hành chọn lọc để tách riêng các tế bào đã nhận gen mục tiêu và cho vào môi trường tái sinh Thông thường, một plasmid được sử dụng trong chuyển nạp gen sẽ mang các thành phần gen thông báo, chỉ thị chọn lọc và gen mục tiêu Khi các chỉ thị chọn lọc thể hiện, chúng sẽ giúp tế bào tiếp tục sinh trưởng trong môi trường chọn lọc (selective media) thường chứa chất kháng sinh hay thuốc diệt cỏ Các chỉ thị chọn lọc phổ biến hiện nay là gen

nptII mã hóa enzyme neomycin phospho transferase II Enzyme này sẽ xúc tác quá

trình phosphoryl hóa kháng sinh kanamycin và làm bất hoạt kháng sinh này Một

chỉ thị chọn lọc phổ biến khác là gen hph mã hóa enzyme hygromycin phospho

transferase có tác dụng làm bất hoạt kháng sinh hygromycin

Gen bar kháng thuốc diệt cỏ có thể được sử dụng như gen mục tiêu nhưng đồng thời cũng là một chỉ thị chọn lọc Gen bar mã hóa cho enzyme

phosphinothricin acetyl transferase (PAT) làm bất hoạt phosphinothricin (PPT), là

thành phần chính trong thuốc diệt cỏ Basta Gần đây, gen pmi mã hóa enzyme

phospho mannose isomerase đã được sử dụng làm chỉ thị chọn lọc Gen này hoạt động trên cơ sở phản ứng huỳnh quang trong môi trường có đường mannose Điều này đã mở ra một triển vọng lớn về an toàn sinh học do không cần sử dụng chất kháng sinh hay hoạt chất diệt cỏ trong quá trình chọn lọc (Hòa và Bổng, 2002) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

Hình 2.1: Thành phần của một gen chuyển nạp

(Nguồn: Theo Pighin, 2003)

2.6.4 Những gen chuyển nạp phổ biến vào cây trồng

2.6.4.1 Gen Bt

Vi khuẩn Bacillus thuringiensis sản xuất ra những protein dạng tinh thể gọi

là Bt hay δ–endotoxin Theo các tác gi Vaeck và ctv (1987); Steward và ctv,

(1996), các Bt toxin rất chuyên tính, ví dụ nhóm cryI chỉ gây độc đối với côn trùng

bộ cánh vảy Lepidoptera, không gây độc đối với côn trùng khác hoặc động vật khác

như chim, động vật có vú nhóm cryII có độc tính đối với bộ cánh cứng Coleoptera

(trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

Ngay khi công nghệ sinh học mới hình thành, các nhà nghiên cứu đã nghĩ

đến việc chuyển gen Bt vào cây trồng để cây tạo ra protein độc nhằm tự bảo vệ mình Gen Bt được phân lập từ tế bào vi khuẩn Bacillus thuringiensis, được cải biên lại trước khi sử dụng cho cây trồng Cây chuyển nạp gen Bt có nhiều ưu điểm

hơn các chế phẩm sinh học Bt được dùng để phun lên cây do nó khắc phục được những nhược điểm như hiệu quả của thuốc không ổn định, không xâm nhập sâu vào mô cây, không có khả năng lưu dẫn, mức chuyên tính quá hẹp Trong khi đó

cây chuyển nạp gen Bt có thể tạo ra protein độc dạng tinh thể trong thân cây

Những protein này được sản xuất liên tục, ít bị phân giải và có mặt ở các mô cần thiết

người ta đã tổng hợp gen gna nhân tạo để chuyển nạp vào cây trồng Do các côn

trùng này có khả năng phân giải protein trong ruột rất thấp nên chúng chỉ sử dụng các amino acid tự do trong nhựa luyện làm nguồn cung cấp đạm chính cho cơ thể Người ta đã nghĩ ra chiến lược tạo ra cây chuyển gen có chất gây ức chế enzyme protease trong cơ thể côn trùng

Năm 1999, Stoger và ctv đã tiến hành chuyển gen gna vào cây lúa mì (Triticum aestivum L cv Bobwhite) nhằm mục tiêu kháng rầy mềm Sitobion avenae (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004) Các tác giả đã đồng chuyển nạp gen gna và gen bar vào mô sẹo lúa mì bằng kỹ thuật bắn gen bằng cách

sử dụng vector pLECGNA2, promoter RSsi mang đoạn gen mã hóa GNA và sử

dụng vector pAHC20 với promoter “ubiquitin 1” và intron 1 mang gen bar Sau 9 –

10 tuần, cây tái sinh sẽ được chọn lọc bằng hoạt chất phosphinothricin (PPT) và

phân tích Southern blot nhằm chứng minh sự hiện diện của gen bar Để xác định sự

hiện diện của GNA trong cây lúa mì, người ta tiến hành phân tích “immunoblot” lá

lúa mì Với promoter “ubiquitin” kèm theo gen gna, phần lớn các cây chuyển nạp

đều thể hiện GNA ở mức có ý nghĩa và dòng BW150 có mức thể hiện gen cao nhất,

dòng này có 7 copy của gen gna

Người ta nhận thấy hoạt động của chitinase tăng đáng kể khi cây bị bệnh (Lin và ctv, 1995) cũng như khi ta kích thích cây bằng ethylen, tia cực tím và acid salicylic (Gaffney và ctv, 1993) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004) Theo Broglie và ctv (1991), cây thuốc lá được chuyển nạp gen mã hóa chitinase có tỷ lệ sống sót cao hơn trên đất có nhiều mầm bệnh (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004) Năm 1995, Lin và ctv đã sử dụng vector

pGL2 mang gen mã hóa chitinase và promoter CAMV35S để chuyển vào giống lúa

Chisurah Boro II nhằm giúp giống này kháng được bệnh đốm vằn do nấm

Rhizoctonia solani gây ra

2.6.4.4 Gen Xa–21

Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae là một trong

những bệnh quan trọng trong sản xuất lúa gạo Hiện nay, một gen trội có khả năng

kháng bệnh bạc lá là Xa–21 được tìm thấy ở loài lúa hoang châu Phi Oryza longistaminata được xem là có triển vọng hơn cả vì gen có phổ kháng rất rộng đối

với nhiều nòi vi khuẩn gây bệnh, do vậy nó thể hiện tính kháng ổn định hơn so với những gen đã được phân lập trước đây (Khush và ctv, 1990) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

Tu và ctv (1998) đã tiến hành chuyển nạp gen Xa–21 vào giống lúa indica

IR72 bằng phương pháp bắn gen Các tác giả đã sử dụng 2 plasmid trong đó

plasmid pC822 mang gen Xa–21 và plasmid pROB5 có chứa gen chọn lọc hph mã

hóa tính trạng kháng hygromycin Những mô sẹo thể hiện tính kháng hygromycin được chuyển sang môi trường N6 để tái sinh cây Cây sau khi được 2 – 3 tuần tuổi được cấy vào môi trường Yoshida hoặc trồng ra chậu đất Cho 15 cây T1 này tiếp

xúc trực tiếp với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae nòi số 6 bằng kéo nhúng

vào dịch vi khuẩn và cắt lên lá lúa, kết quả có 13 cây biểu hiện tính kháng và 2 cây nhiễm

Trường hợp điển hình trên cây 1 lá mầm là việc Sivamani và ctv (1999) đã

chuyển gen CP (CP1, CP2, CP3 và CP4) vào cây lúa để kiểm soát bệnh tungro do

virus tungro dạng hình cầu gây ra (RTSV = rice tungro spherical virus) RTSV do

rầy xanh Nephotettis virescens làm vector truyền bệnh tungro cho cây lúa làm cây

bị vàng lụi và chết Bệnh đã gây nhiều thiệt hại nghiêm trọng cho ngành trồng lúa ở Philippines trong nhiều năm qua Các tác giả đã chuyển nạp riêng lẻ hoặc tất cả các gen một lúc vào cây lúa indica (TN1) hoặc japonica (Taipei 309) bằng phương pháp bắn gen Dùng kỹ thuật PCR để xét nghiệm sơ khởi cây chuyển gen có chuỗi trình

tự gen CP và thế hệ con lai của chúng Các xét nghiệm Southern, Northern và DAS–ELISA được tiến hành sau đó để tìm hiểu sự xuất hiện của gen CP, hoạt động

chuyển mã của nó hoặc sự xuất hiện của protein bề mặt của virus Kết quả cho thấy

có sự hợp nhất của các gen CP vào trong bộ gen của cây lúa

2.7 Các phương pháp chuyển nạp gen phổ biến

Chuyển nạp gen là kỹ thuật chuyển gen ngoại lai vào cơ thể sinh vật đang nghiên cứu Những thành tựu của kỹ thuật nuôi cấy mô và kỹ thuật tái tổ hợp DNA

đã mở ra triển vọng đối với việc chuyển nạp gen trên thực vật bậc cao, tạo ra những

tính trạng di truyền mới (Uchimiya và ctv, 1989) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004) Đã có rất nhiều phương pháp được phát triển nhằm có được cây trồng chuyển gen Phương pháp chuyển gen gián tiếp bằng vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens ngày càng được sử dụng phổ biến nhờ vào sự cải tiến

không ngừng hệ thống Ti–plasmid Bên cạnh đó còn có các phương pháp chuyển gen trực tiếp khác như phương pháp PEG (polyethylene glycol), phương pháp vi tiêm (microinjection), phương pháp sử dụng xung điện (electroporation), phương pháp bắn gen (biolistic) và một vài kỹ thuật mới khác

Theo Fritsch và Kovalchuk (2000), nhìn chung mỗi phương pháp chuyển gen đều có các ưu nhược điểm riêng Ví dụ phương pháp chuyển gen PEG có thể chuyển trực tiếp gen mục tiêu vào tế bào trần (protoplast) hay chuyển gen bằng vi

khuẩn Agrobacterium tumefaciens qua mẫu lá thực vật còn có những hạn chế vì tế

bào phải trải qua quá trình tái sinh thông qua kỹ thuật nuôi cấy mô Trong thực tế,

có nhiều loài thực vật rất khó tái sinh hoặc các tế bào nuôi trong môi trường tái sinh thường phát sinh các biến dị xô ma và biến dị nhiễm sắc thể không mong muốn Phương pháp sử dụng súng bắn gen thường được áp dụng đối với những thực vật

không phải là đối tượng xâm nhiễm của Agrobacterium tumefaciens hay những đối

tượng khó tái sinh Phương pháp này có thể áp dụng trên cây trưởng thành, trên tế bào mầm (germ line cells) ở phát hoa Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này

là đòi hỏi những máy móc đắt tiền và quy trình bắn gen phải được thiết lập rất nghiêm ngặt

2.7.1 Chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens là một loại vi khuẩn gam âm sống trong đất, là

tác nhân gây ra những khối u trên cây 2 lá mầm Khi có một vết thương ở rễ cây, vi khuẩn sẽ xâm nhập và tạo khối u, khối u này sẽ phát triển không giới hạn và có thể đạt đến 1 m đường kính ở một vài loại cây Đặc điểm quan trọng của tế bào khối u

là tăng trưởng không cần hormon kích thích sinh trưởng trong khi đó tế bào bình thường luôn cần phải bổ sung auxin, cytokinin trong môi trường nuôi cấy Các khối

u sẽ có nhiệm vụ tổng hợp một loại dinh dưỡng đặc biệt giúp cho vi khuẩn phát triển

Theo Schell và Van Montagu (1974), nguồn gốc của những gen tạo ra khối

u nằm trong một plasmid có kích thước khoảng 200 kb (trích dẫn bởi Trần Thị Lệ Minh, 2000) Plasmid này được gọi là Ti-plasmid (tumor-inducing plasmid), chứa nhiều gen, đặc biệt là những gen qui định khả năng tự sao chép Theo Grierson và ctv (1988), việc xác định Ti–plasmid như là một TIPC (tumor–inducing principle)

đã đánh dấu một bước ngoặc trong việc nghiên cứu Agrobacterium (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004) Sự gắn kết giữa Agrobacterium vào tế bào cây bị thương được kiểm soát bởi 2 gen chvA và chvB định vị trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn, 2 gen này thể hiện rất ổn định trong tế bào vi khuẩn Gen chvA và chvB chỉ có thể hoạt động khi Agrobacterium ở gần các tế bào bị thương do những

tế bào này tiết ra các phân tử truyền tín hiệu làm cho gen ở vùng vir (virulence) của Ti–plasmid hoạt động Các phân tử truyền tín hiệu đã được ghi nhận là những hợp chất phenolic như acetosyringone (AS) và α-hydro acetosyringone (OH-AS)

Sau khi xâm nhập vào tế bào thực vật, một phần nhỏ của Ti-plasmid là T–

DNA sẽ xâm nhập vào bộ gen của tế bào và biểu hiện Các gen vir trên Ti-plasmid

sẽ đóng vai trò điều khiển quá trình xâm nhiễm Có 6 loại gen vir là A, B, C, D, E

và G Gen virA có nhiệm vụ truyền phân tử tín hiệu AS (acetosyringone) từ mô thực vật bị thương xuyên qua màng vào tế bào vi khuẩn AS sẽ hỗ trợ virG–protein

để kích thích sự thể hiện của các gen vir B, C, D, E Sự thể hiện của các gen này

giúp cắt T–DNA ra khỏi Ti–plasmid và chuyển nó vào tế bào thực vật Dựa vào đặc điểm này, người ta tiến hành cải tiến Ti-plasmid bằng cách loại bỏ các gen gây khối

u (oncogene) và chèn thêm vào đó các gen mang tính trạng mong muốn Tiến trình này được thực hiện bằng cách sử dụng các enzyme cắt giới hạn (restriction enzyme) và enzyme nối (ligase)

Nuôi tế bào thực vật trong môi trường có vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đã cải tiến ta sẽ thu được những tế bào chuyển gen Hiện nay, sử dụng Agrobacterium tumefaciens là phương pháp phổ biến nhất trong chuyển nạp gen ở

thực vật bậc cao, đặc biệt trên cây 2 lá mầm Gen được chuyển nạp bằng phương pháp này tỏ ra rất ổn định và thường di truyền các tính trạng theo định luật Mendel (De Block và ctv, 1984; Muller và ctv, 1987; Hiei và ctv, 1996) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

Theo Fritsch và Kovalchuk (2000), phương pháp chuyển gen bằng

Agrobacterium tumefaciens không làm ảnh hưởng đến các bộ phận được chuyển

gen và các bộ phận này vẫn có thể sống và phát triển bình thường sau quá trình đồng nuôi cấy với vi khuẩn Quá trình chuyển nạp được xem là thành công khi có

sự biểu hiện của các gen thông báo và chỉ thị chọn lọc trong các mô thực vật Tần

số chuyển nạp từ vi khuẩn vào tế bào thường phụ thuộc rất lớn vào loài thực vật, các điều kiện sinh trưởng, giai đoạn sinh trưởng của thực vật Tần số này còn phụ thuộc vào môi trường nuôi vi khuẩn và mật độ vi khuẩn trong môi trường xâm nhiễm (infiltration medium) Cuối cùng tiến hành chọn lọc tế bào mang gen chuyển nạp thông qua biểu hiện của gen thông báo, chỉ thị chọn lọc và gen mục tiêu, sau đó cho vào môi trường tái sinh ta sẽ thu được các cây chuyển gen

Hình 2.2: Ti-plasmid của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Hình 2.3: Hoạt động của các gen vir trong quá trình xâm nhiễm của T-DNA

vào tế bào thực vật

(Nguồn: http://arabidopsis.info/students/paaras/t_dna1.png)

2.7.2 Chuyển nạp gen bằng phương pháp PEG (polyethylene glycol)

Phương pháp PEG được sử dụng để chuyển nạp gen trên cả động vật lẫn thực vật Phương pháp này chuyển nạp gen vào tế bào trần dưới dạng plasmid DNA dựa trên nguyên tắc PEG làm kích hoạt sự dung hợp tế bào trần từ đó tạo khả năng du nhập gen lạ vào tế bào Cao và ctv (1991) đã sử dụng nguồn tế bào trần từ ba giống lúa Pi 4, Taipei 309 và Nipponbare trong thí nghiệm chuyển gen bằng phương pháp PEG, kết quả là đã thu được những tế bào trần mang các gen chuyển nạp (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

2.7.3 Chuyển nạp gen bằng phương pháp sử dụng xung điện (electroporation)

Nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng xung điện với thời gian cực ngắn trong một điện trường cực mạnh để làm tăng khả năng xâm nhập của DNA cần chuyển vào tế bào trần (Nagara, 1989) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004) Phương pháp sử dụng xung điện đã được sử dụng trong chuyển nạp gen trên cả động vật, thực vật và vi sinh vật Tuy còn nhiều khó khăn chưa giải quyết được về mặt kỹ thuật nhưng người ta cũng đã ghi nhận những trường hợp chuyển gen thành công trên cây lúa (Toriyama và ctv, 1988; Zhang và ctv, 1988;

Shimamoto và ctv, 1989), trên cây bắp (Rhodes và ctv, 1988) và trên cây cải dầu

(Guerche và ctv, 1987) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

2.7.4 Chuyển nạp gen bằng phương pháp bắn gen (biolistic)

Phương pháp bắn gen được John Stanford ở Đại học Cornell phát minh (Klein và ctv, 1987) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004) Đây là phương pháp chuyển nạp gen trực tiếp vào cây trồng Ưu điểm của phương pháp này là có thể áp dụng trên tất cả các loài thực vật một lá mầm và hai lá mầm, không cần vector hai nguồn (binary vector) và quy trình vận hành tương đối đơn giản Hiện nay có 3 loại dụng cụ bắn gen khác nhau:

- Loại 1: là một bộ phận cung cấp năng lượng giống như khẩu súng, gây nổ nhờ một kim hỏa (Klein và ctv, 1987) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

- Loại 2: hoạt động theo nguyên tắc phóng điện đưa DNA phủ lên các phân

tử bằng vàng cực mịn (DNA–coated gold particles) (Christou và ctv, 1988) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

- Loại 3: hoạt động bằng áp suất của khí từ một xi lanh chứa khí trơ như helium hoặc nitrogen Vận tốc của vi đạn khi bắn bằng dụng cụ này chậm hơn rất nhiều so với loại 1 nhưng nó tỏ ra rất có hiệu quả trong trường hợp chuyển plasmid DNA vào tế bào cây trồng (Cao và ctv, 1991) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

Theo Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang (2004), trong quy trình bắn gen trước tiên bột vàng hoặc tungsten sẽ được phủ lớp DNA mục tiêu trên bề mặt và được gắn lên viên đạn plastic Khi bắn, viên đạn phóng xuống tấm chắn tạo ra một lực phóng các hạt vàng (hay tungsten) túa ra trên rây lưới kim loại với một vận tốc lớn xuyên vào tế bào Mô được bắn xong sẽ được chuyển vào môi trường tái sinh có

bổ sung các chất chọn lọc thích hợp Mô nhận gen sẽ xuất hiện mô sẹo sau 5 – 7 ngày nuôi cấy còn các mô không nhận gen sẽ chết trong môi trường chọn lọc

2.8 Các gen kháng thuốc diệt cỏ phổ biến và cơ chế kháng thuốc diệt cỏ của gen

bar đối với hoạt chất trừ cỏ glufosinate

Lần đầu tiên vào năm 1973 người ta đã tiến hành dòng hóa gen thành công Đến năm 1983 người ta đã làm cho gen của loài thực vật này biểu hiện trong cơ thể của loài thực vật khác khi chuyển thành công gen kháng thuốc diệt cỏ Roundup (glyphosate) vào cây thuốc lá (Eisenman, 1996) Các nhà khoa học đã phân lập gen

aroA kháng glyphosate từ vi khuẩn, dòng hóa và chuyển vào tế bào mô sẹo cây

(Eberlein và ctv, 2000) Chi Klebsiella phân bố trong đất, nước, trong hạt và trong

bộ máy tiêu hóa Bromoxynil (3,5–dibromo–4–hydroxybenzonitrile) là hoạt chất diệt cỏ lá rộng rất hiệu quả Chất này tác động lên thực vật bằng cách ngăn chặn dòng điện tử trong chu trình quang hợp dẫn đến sự sản sinh ra các hợp chất oxit làm hủy hoại màng tế bào và ức chế sự hình thành diệp lục

Năm 1998, công ty Aventis CropScience đã tiến hành chuyển gen bxn kháng

hoạt chất diệt cỏ ioxynil (3,5–di–iodo–4–hydroxybenzonitrile) và bromoxynil (3,5–

dibromo–4–hydroxybenzonitrile) vào trong cây canola Argentine (Brassica napus var Westar) bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens dòng EHA 101 mang

plasmid pRPA- BL–150a Cây canola Argentine chuyển gen được tái sinh trong

môi trường có bromoxynil Gen bxn ở thế hệ con lai phân ly theo tỷ lệ 3 : 1, kết hợp

với các kết quả phân tích Southern blots và PCR cho thấy gen này đã kết hợp bền vững vào genome của cây chủ và di truyền ổn định cho các thế hệ sau Kết quả phân tích định lượng Western immunoblot cho thấy hàm lượng enzyme nitrilase trong lá

là 1000 ng/mg protein tổng số và hàm lượng enzyme trong hạt là < 10 ng/mg protein tổng số Người ta không tìm thấy enzyme nitrilase trong mẫu dầu đã tinh luyện (refined oil) Sau đó thế hệ cây chuyển gen đầu tiên Westar–Oxy–235 được

sử dụng làm dòng bố mẹ (parental line) để sản xuất cây canola thương mại mang tên Navigator

Eberlein và ctv (2000) đã tiến hành chuyển gen bxn vào giống khoai tây Solanum tuberosum L cv Lemhi Russet bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Kết quả là đã thu được các dòng khoai tây chuyển gen có khả năng

chịu được nồng độ bromoxynil cao gấp 70 lần so với cây khoai tây bình thường Khi trồng thử nghiệm ngoài đồng, dòng chuyển gen có biểu hiện kiểu hình tốt nhất cho năng suất quả tương đương với cây bình thường nhưng cây ở ruộng U.S No 1

có năng suất thấp hơn khoai tây bình thường 15 – 30% Ba trong số 4 dòng chuyển gen có trọng lượng quả lớn, phần trăm chất rắn và màu sắc khi rán bằng hoặc tốt hơn giống đối chứng Kết quả phân tích cho thấy năng suất của ruộng U.S No 1

thấp là do biến dị xô ma và gen bxn không làm ảnh hưởng bất lợi đến phẩm chất

quả

2.8.2 Gen bar

Gen bar có nguồn gốc từ vi khuẩn Streptomyces hygroscopicus (Thompson

và ctv, 1987) Vi khuẩn này có khả năng sản sinh ra một loại hợp chất thứ cấp là tripeptide bialaphos Bialaphos có chứa chất phosphinothricin, là một đồng dạng của glutamate Glutamate là chất gây ức chế enzyme glutamine synthetase Khi enzyme này bị ức chế cây trồng sẽ không thể tổng hợp được glutamine dẫn đến sự tích lũy ammonia trong cây làm cây chết nhanh chóng

Sản phẩm của gen bar được xem như là một enzyme có khả năng biến đổi

(modifying enzyme), nó có khả năng acetyl hóa hoặc khử gốc methyl

phosphinothricin dẫn đến làm mất hoạt tính của chất này Gen bar đã được tạo dòng phụ (subcloning) và giải mã trình tự Việc chuyển gen bar của chi Streptomyces vào

vi khuẩn E coli đã chứng tỏ khả năng sử dụng gen bar làm chỉ thị chọn lọc

(selectable marker) trong một loài vi khuẩn khác

Trong tự nhiên, những loài vi khuẩn thuộc chi Streptomyces tạo kháng sinh luôn có các cơ chế tiến hóa nhằm tránh được tác động của các chất kháng sinh do

chính chúng tạo ra Cơ chế này là do các enzyme có khả năng biến đổi (modifying enzyme) trong vi khuẩn đã làm bất hoạt các chất kháng sinh Các gen mã hóa enzyme này đã được phân lập từ rất nhiều loài sinh vật tạo kháng sinh bằng cách

dòng hóa chúng trong cơ thể vi sinh vật chủ mẫn cảm với kháng sinh là S lividans

(Hopwood và ctv, 1986) (trích dẫn bởi Thompson và ctv, 1987) Các dòng

Streptomyces spp có khả năng tạo ra hàng trăm loại kháng sinh khác nhau (Berdy

và ctv, 1980, 1981) (trích dẫn bởi Thompson và ctv, 1987) và một trong số đó là bialaphos (còn được biết với tên bilanafos hay PPT) Nguồn gen kháng kháng sinh dồi dào của chúng đã được sử dụng làm chỉ thị chọn lọc ở vi khuẩn (Hopwood và ctv, 1986) và tế bào động vật (Vara và ctv, 1986) (trích dẫn bởi Thompson và ctv,

1987) Vào năm 1986, Murakami và ctv đã tạo dòng gen bar và cho thử nghiệm

tính kháng với chất kháng sinh là bialaphos

Bialaphos được sử dụng như một chất diệt cỏ không chọn lọc trong nông nghiệp Nó là một tripeptide với 2 gốc L-alanine và một đồng dạng của acid glutamic là phosphinothricin (PPT) (Ogawa và ctv, 1973; Kondo và ctv, 1973) (trích dẫn bởi Thompson và ctv, 1987) Một tripeptide nguyên vẹn có rất ít hoặc không có khả năng ức chế hoạt tính của enzyme glutamine synthetase (Bayer và ctv, 1972; Tachibana và ctv, 1986a) (trích dẫn bởi Thompson và ctv, 1987) nhưng khi vào trong cơ thể vi khuẩn hoặc cây trồng, enzyme peptidase trong tế bào sẽ loại bỏ

2 gốc alanine và giải phóng hoạt tính của PPT