ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ DÒNG ĐIỀU NĂNG SUẤT CAO TRỒNG TẠI VƯỜN ĐIỀU GIỐNG QUỐC GIA CÁT HIỆP, PHÙ CÁT, BÌNH ĐỊNH BẰNG KỸ THUẬT AFLP LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

\[

HUỲNH THỊ THANH TRÀ

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ DÒNG ĐIỀU NĂNG SUẤT CAO TRỒNG TẠI VƯỜN ĐIỀU GIỐNG QUỐC GIA CÁT HIỆP, PHÙ CÁT, BÌNH ĐỊNH

BẰNG KỸ THUẬT AFLP

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 12/2010

A CÁT H BẰNG K

Chuyên M VĂN THẠC

ĐÀO TẠO HỒ

P

NG NGHIỆP

H

ÒNG ĐIỀ GIỐNG ĐỊNH

P

ỀU

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nào khác

Ký tên

Huỳnh Thị Thanh Trà

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

TS Bùi Minh Trí đã luôn động viên, hướng dẫn và chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt quá trình học tập, làm các thí nghiệm và hoàn thành luận văn tốt nghiệp Đồng thời, tôi xin chân thành cảm ơn đến:

TS Nguyễn Thanh Phương, trưởng Phòng Khoa học và Hợp tác Quốc tế, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Duyên Hải Nam Trung Bộ và TS Nguyễn Thị Tố Trân, Phó Phòng Trồng Trọt, Sở Nông Nghiệp và PTNT tỉnh Bình Định đã đóng góp những ý kiến cho tôi trong quá trình làm luận văn tốt nghiệp

Tập thể cán bộ, giáo viên Khoa Nông học và cán bộ Phòng Đào tạo Sau Đại học trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình học tập

Th.S Võ Thị Thúy Huệ, K.S Văn Ngọc Dung và các cán bộ tại Trung tâm phân tích Hóa Sinh, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Môi trường, trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện hoàn thành các thí nghiệm liên quan trong đề tài tốt nghệp

Tập thể cán bộ Trung tâm nghiên cứu Điều Cát Hiệp, Phù Cát, Bình Định đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn

Ba mẹ tôi, người thân và các bạn Phạm Văn Bình, Đặng Ngọc Thùy Dương, Huỳnh Thị Mỹ Phi, Đoàn Thị Tuyết Lê luôn quan tâm, động viên và giúp đỡ trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Tác giả luận văn, Huỳnh Thị Thanh Trà

TÓM TẮT

Đề tài “Đánh giá đa dạng di truyền một số dòng điều năng suất cao trồng tại Vườn điều giống quốc gia Cát Hiệp, Phù Cát, Bình Định bằng kỹ thuật AFLP” được tiến hành nhằm tìm ra các chỉ thị DNA liên quan đến một số chỉ thị hình thái đặc trưng trên cây điều và đánh giá sự đa dạng di truyền một số dòng điều năng suất cao

Hai mươi ba mẫu điều nghiên cứu là các dòng điều năng suất cao trồng tại vườn điều giống quốc gia Cát Hiệp, Phù Cát, Bình Định được thu thập trên cơ sở điều tra và phân loại trong tổng số 248 dòng điều cao sản được trồng tại vườn Các phần mềm NTSYSpc 2.1 và Winboot được sử dụng để tạo sơ đồ phân nhóm di truyền của 23 mẫu điều nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu cho thấy:

- Quy trình ly trích DNA dựa trên phương pháp CTAB của Doyle và Doyle (1987) cho kết quả tốt và ổn định với nồng độ DNA trung bình mỗi mẫu đạt 185 ng/µL ;

- Có sự khác biệt giữa các dòng điều nghiên cứu, tuy nhiên yếu tố nguồn gốc địa lý không ảnh hưởng về mặt di truyền giữa cá cá thể trong cùng một loài;

- Bảy tổ hợp primer sử dụng trong nghiên cứu cho tính đa hình cao với các dòng điều khảo sát Có tổng cộng 664 sản phẩm khuếch đại đa hình trong tổng số

668 sản phẩm khuếch đại có kích thước 70-698 bp trong đó tổ hợp primer CTG/E-ACT cho số sản phẩm khuếch đại đa hình cao nhất;

M Mức tương đồng gen các các thể nghiên cứu từ 0,53 đến 0,8;

- 8 sản phẩm khuếch đại đa hình thu được trên các tổ hợp primer khác nhau

có khả năng là chỉ thị cho các tính trạng nông học quan trọng như thời gian ra hoa, hình dạng tán lá và màu sắc trái khi chín

SUMMARY

The thesis: “Genetic diversity assessment of some high-yielding cashew clones from National Cashew Germplasm Garden in Cat Hiep, Phu Cat, Binh Dinh using AFLP technique” was conducted in order to find out DNA markers corresponding to specific morphological characters of cashew and to evaluate the genetic diversity among high-yielding cashew clones

Twenty three clones of cashew are high-yielding cashew trees were selected among 248 high-yielding clones planted in National Cashew Germplasm Garden in Cat Hiep, Phu Cat, Binh Dinh NTSYSpc 2.1 and Winboot softwares were used to create genetic clustering dendrogram within 23 cashew clones genenerated by AFLP analysis DNA extraction protocol based on CTAB protocol by Doyle and Doyle (1987) allowed to obtain purified DNA templates those met requirements of AFLP technique

The results indicated that

- There was genetic difference among these clones However, no obvious relationships between geographical origin and grouping based on genetic similarities could be found;

- High level of genetic polymorphism was found by using seven AFLP primer combinations A total of 668 AFLP markers were recorded, 664 of which were polymorphic with sizes ranged between 70 to 698 basepairs M-CTG/E-ACT primers combination gave the highest polymorphic amplicons;

- The genetic similarity coefficient ranged from 0.53 to 0.8;

- Eight polymorphic amplicons were supposed to be markers for important agromical traits such as flowering time, canopy shape and fruit color

MỤC LỤC

Trang tựa

Trang chuẩn y

Lý lịch cá nhân i

Lời cam đoan ii

Lời cảm ơn iii

Tóm tắt iv

Mục lục vi

Danh sách các chữ viết tắt x

Danh sách các bảng xi

Danh sách các hình, sơ đồ xii

1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Mục đích nghiên cứu 2

1.4 Yêu cầu 2

2 TỔNG QUAN 3

2.1 Tổng quan về cây điều 3

2.1.1 Nguồn gốc 3

2.1.2 Đặc điểm thực vật học của cây điều 3

2.1.2.1 Thân và cành 3

2.1.2.2 Hệ rễ 4

2.1.2.3 Lá 5

2.1.2.4 Hoa 5

2.1.2.5 Quả và hạt điều 5

2.1.3 Yêu cầu sinh thái của cây điều 6

2.1.3.1 Lượng mưa 6

2.1.3.2 Nhiệt độ 7

2.1.3.3 Gió 7

2.1.3.4 Đất 7

2.1.4 Đa dạng đặc điểm thực vật học các giống điều 7

2.1.4.1 Dựa vào màu sắc lá 8

2.1.4.2 Dựa vào hoa 8

2.1.4.3 Dựa vào quả giả 8

2.1.4.4 Dựa vào chiều cao và đặc điểm tán 8

2.2 Tình hình sản xuất điều trên thế giới và ở Việt Nam 10

2.2.1 Tình hình sản xuất điều trên thế giới 10

2.2.2 Tình hình sản xuất điều ở Việt Nam 11

2.2.2.1 Tình hình sản xuất điều ở Việt Nam 11

2.2.2.2 Hiện trạng sản xuất điều năng suất cao và chất lượng tốt ở Viêt Nam 12

2.3 Đa dạng di truyền và các phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền 13

2.3.1 Khái niệm về đa dạng sinh học 13

2.3.2 Đa dạng di truyền 13

2.3.3 Các phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền 14

2.3.3.1 Phương pháp sử dụng các chỉ thị hình thái 14

2.3.3.2 Phương pháp sử dụng các chỉ thị isozyme 15

2.3.3.3 Phương pháp sử dụng các chỉ thị DNA 15

2.4 Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) 16

2.5 Tổng quan về vườn điều giống quốc gia Cát Hiệp, Phù Cát, Bình Định 18

2.5.1 Khái quát về vườn điều giống quốc gia Cát Hiệp, Phù Cát, Bình Định 19

2.5.1.1 Vị trí địa lý 19

2.5.1.2 Cấu trúc và chức năng 19

2.5.2 Phương pháp bình tuyển và chọn lọc điều năng suất cao

áp dụng tại vườn điều giống 20

2.5.3 Các tiêu chí quy định, chỉ tiêu đánh giá và theo dõi 20

2.5.3.1 Tiêu chí đánh giá cây điều trội 20

2.5.3.2 Các chỉ tiêu sinh trưởng, phát triển và năng suất khi kểm tra hậu thế 21

2.6 Tình hình nghiên cứu cây điều trong và ngoài nước 23

2.6.1 Nghiên cứu ngoài nước 23

2.6.2 Nghiên cứu trong nước 24

3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

3.1 Thời gian, địa điểm và nội dung nghiên cứu 26

3.1.1 Thời gian 26

3.1.2 Địa điểm 26

3.1.3 Nội dung nghiên cứu 26

3.2 Vật liệu, thiết bị và hóa chất thí nghiệm 26

3.2.1 Vật liệu nghiên cứu 26

3.2.2 Hóa chất và thiết bị thí nghiệm 27

3.2.2.1 Hóa chất thí nghiệm 27

3.2.2.2 Thiết bị thí nghiệm 28

3.3 Phương pháp nghiên cứu 29

3.3.1 Phương pháp thu thập và đánh giá các dòng điều năng suất cao

làm vật liệu nghiên cứu 29

3.3.2 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu 29

3.3.3 Phương pháp tách chiết DNA 30

3.3.4 Phương pháp kiểm tra DNA 31

3.3.4.1 Phương pháp định tính DNA bằng điện di 31

3.3.4.2 Phương pháp định lượng DNA bằng quang phổ kế 31

3.3.5 Kỹ thuật AFLP 31

3.3.5.1 Phản ứng cắt DNA bằng 2 enzyme cắt giới hạn EcoRI và MseI 32

3.3.5.2 Phản ứng cắt và gắn 32

3.3.5.3 Phản ứng nhân bản tiền chọn lọc 33

3.3.5.4 Phản ứng nhân bản chọn lọc 34

3.3.5.5 Điện di sản phẩm nhân bản chọn lọc trên máy giải trình tự 34

3.3.6 Phương pháp ghi nhận band sau khi điện di 35

3.3.7 Phương pháp phân tích kết quả bằng phần mềm NTSYS 2.1 35

3.3.8 Phương pháp phân tích kết quả bằng phần mềm Winboot 36

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

4.1 Đặc điểm hình thái học và nguồn gốc các dòng điều nghiên cứu 38

4.2 Kết quả ly trích DNA 41

4.3 Kết quả thực hiện kỹ thuật AFLP trên 7 tổ hợp primer 45

4.4 Kết quả nhận diện các sản phẩm khuếch đại là chỉ thị phân tử cho các tính trạng nghiên cứu trên các dòng điều 47

4.4.1 Kết quả nhận diện các sản phẩm khuếch đại đặc biệt là chỉ thị phân tử cho các tính trạng nghiên cứu trên các dòng điều 47

4.4.2 Kết quả nhận diện các sản phẩm khuếch có thể là chỉ thị cho một số dòng điều 49

4.5 Phân tích đa dạng di truyền 23 dòng điều năng suất cao bằng phần mềm

NTSYSpc 2.1 và Winboot 52

4.6 Thảo luận chung 58

5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 60

5.1 Kết luận 60

5.2 Đề nghị 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO 62

PHỤ LỤC

CTAB: Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

DNA: Deoxyribonucleic acid

dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate

EB: extraction buffer

EDTA: Ethylene Diamine Tetra acetic Acid

IPGRI: International Plant Genetic Resources Institue

OD: Optical density

PCR: Polymerase Chain Reaction

RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA

RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism

RNA: Ribonucleic acid

Rnase: Ribonuclease

Ta : Annealing tenperature (nhiệt độ bắt cặp)

TAE: Tris – Acetate – EDTA

TE: Tris – EDTA

Tm: Melting temperature (nhiệt độ nóng chảy)

U: Đơn vị hoạt tính

UPGMA: Unweighted Pair Group Method with Arithmetic

VINACAS:Hiệp hội cây điều Việt Nam (Viet Nam Cashew Association) VN: Việt Nam

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Diện tích, sản lượng và lượng điều xuất khẩu của Việt Nam 11

Bảng 2.2: Các mức độ đa dạng sinh học 13

Bảng 3.1 Trình tự các primer nhân bản chọn lọc 32

Bảng 3.2: Chương trình nhiệt cho phản ứng nhân bản tiền chọn lọc 33

Bảng 3.3: Chương trình nhiệt cho phản ứng nhân bản chọn lọc 34

Bảng 4.1: Nguồn gốc và các đặc điểm sinh trưởng, phát triển của các dòng điều được chọn làm vật liệu nghiên cứu 39

Bảng 4.2: Giá trị OD các mẫu DNA li trích từ 23 dòng điều nghiên cứu 43

Bảng 4.3 Các tổ hợp primer kết hợp và cặp primer còn lại trong điện di 45

Bảng 4.4: Tổng số sản phẩm khuếch đại và band đa hình trên 7 cặp primer 46

Bảng 4.5: Các band khuếch đại có thể là chỉ thị cho các tính trạng hình thái 48

Bảng 4.6: Các chỉ thị phân tử đặc biệt trên một số dòng điều 51

Bảng 4.7: Hệ số đồng dạng di truyền của các dòng điều khảo sát bằng các tổ hợp primer AFLP 53

DANH SÁCH CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ

Hình 2.1: Cây điều (Anacardium ocidentale L.) 4

Hình 2.2: Các giống điều phân loại theo chiều cao và đặc điểm tán cây 9

Hình 2.3: Các kiểu phân cành trên cây điều 10

Hình 2.4: Kỹ thuật AFLP 18

Hình 3.1: Mô hình đơn giản hóa kích thước các band AFLP 35

Hình 4.1: DNA tổng số li trích tử 12 mẫu lá điều 42

Hình 4.2: DNA tổng số li trích tử 11 mẫu lá điều 42

Hình 4.3: Cây phân nhóm di truyền giữa 23 dòng điều 54

Hình 4.4: Sơ đồ 2D PCA các dòng điều nghiên cứu 55

Sơ đồ 2.1: Mặt bằng vườn điều Cát Hiệp 22

Chương 1

MỞ ĐẦU1.1 Đặt vấn đề

Cây điều được xem là một trong những cây công nghiệp chiến lược của nước

ta Hiện nay, cây điều được trồng chủ yếu ở các tỉnh phía Nam từ Đà Nẵng trở vào, đặc biệt ở các tỉnh Đông Nam Bộ (Vũ Triệu Mân và Ngô Việt Hà, 2005)

Mặc dù diện tích điều của Việt Nam tăng rất nhanh trong những năm gần đây nhưng năng suất hạt điều còn thấp Để giải quyết các vấn đề này cần phải áp dụng đồng bộ các biện pháp kĩ thuật thâm canh vườn điều bao gồm các kĩ thuật canh tác, phòng trừ sâu bệnh hại, sử dụng chế phẩm điều hòa sinh trưởng và cải thiện giống Trong đó cải thiện giống là khâu then chốt và là cơ sở để tạo ra những vườn điều năng suất cao và chất lượng tốt trong tương lai

Tuy nhiên, sự phong phú về nguồn gen hay tính đa dạng là vấn đề quan trọng trong công tác cải thiện giống cây trồng Vì điều là cây giao phấn nên luôn có sự phân ly từ thế hệ này sang thế hệ khác, do đó có thể cung cấp cho các nhà chọn giống một nguồn biến thiên di truyền phong phú (Phạm văn Biên, 1999) Hầu hết các giống điều được phân loại hiện nay đều dựa trên đặc tính hình thái học (Swamy

và ctv, 1998) Tuy các đặc tính hình thái này rất hữu ích nhưng chúng lại biểu hiện rất ít tùy thuộc vào giai đoạn phát triển của cá thể và có chỉ số di truyền thấp nên gây khó khăn cho việc chọn, tạo giống Phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử hiện nay cho phép người nghiên cứu xác định được kiểu gen của các dòng giống, đánh giá mối tương quan giữa các giống, bỏ qua các biến động không di truyền đồng thời theo dõi được các biến động di truyền không thể hiện ra kiểu hình do đó góp phần phục vụ tốt hơn công tác quản lí và bảo tồn đa dạng sinh học, rút ngắn thời gian quá trình chọn, tạo giống

Trong số rất nhiều các chỉ thị phân tử đang được sử dụng, AFLP (Vos và ctv, 1995) là chỉ thị được sử dụng rộng rãi do có tính đa hình, độ tin cậy cao và không cần phải biết trước trình tự bộ gen của đối tượng

Việc nghiên cứu và chọn giống điều đã được Viện nghiên cứu nông nghiệp Duyên hải Nam Trung bộ triển khai từ nhiều năm nhưng biện pháp chủ yếu là bình tuyển các dòng điều từ các vùng nguyên liệu dựa trên các đặc tính về hình thái nhưng chưa ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử Do đó, việc đánh giá mức độ

đa dạng di truyền các dòng điều năng suất cao và có các đặc điểm hình thái mong muốn là có ý nghĩa thiết thực Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành đề tài:

“Đánh giá đa dạng di truyền một số dòng điều năng suất cao trồng tại vườn điều giống quốc gia Cát Hiệp, Phù Cát, Bình Định bằng kỹ thuật AFLP”

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là một số dòng điều năng suất cao nằm trong tập đoàn giống của Viện nghiên cứu nông nghiệp Duyên hải Nam trung bộ trồng tại vườn điều giống quốc gia Cát Hiệp thuộc huyện Phù Cát, tỉnh Bình Định

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Phân tích và đánh giá đa dạng di truyền một số dòng điều năng suất cao trồng tại vườn điều giống quốc gia Cát Hiệp, Phù Cát, Bình Định bằng kỹ thuật AFLP Phát hiện các chỉ thị phân tử liên quan đến các tính trạng cấu thành năng suất trên cây điều

Ly trích DNA từ mẫu lá điều với độ sạch cao

Thực hiện thành công kỹ thuật AFLP trên cây điều

Phân tích sự đa dạng di truyền của các dòng điều khảo sát bằng phần mềm NTSYSpc version 2.1 và Winboot

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về cây điều

2.1.1 Nguồn gốc

Cây điều có tên khoa học là Anacardium occidentale L (2n = 42) có nguồn

gốc ở vùng ven biển Đông Bắc Braxin và Peru (Nakasone, 1998)

Vào thế kỉ XVI, khi Bồ Đào Nha và Tây Ban Nha xâm chiếm Nam Mỹ, các thủy thủ của họ đã mang hạt điều ra khỏi quê hương lãnh thổ của nó, đem đến trồng thử tại một số nước thuộc địa ở Trung Mỹ, Đông Phi và Ấn Độ Vì vậy, có thể thời điểm này là mốc thời gian cây điều được chuyển từhoang dã sang trồng trọt (Hoàng Chương, 1999)

Hiện nay, điều được trồng trên hầu hết các nước thuộc khu vực nhiệt đới (Frota, 1995) và chủ yếu được trồng có hiệu quả ở khu vực giữa 150 Nam và Bắc bán cầu (Ohler, 1979) Các nước sản xuất chính là: Ấn Độ, Braxin, Việt Nam, Indonesia, Tazania, Mozambic, Kenya, Madagasca

Theo Tạ Minh Sơn (2004), điều có thể được đưa vào trồng tại Việt Nam từ thế kỉ XVII dọc theo bờ biển Nam Trung bộ và Đông Nam bộ Đến năm 1980 cây điều mới thực sự biết đến như một cây lâm nghiệp được phát triển làm cây phủ xanh đất trống đồi núi trọc Tuy nhiên, trong quá trình phát triển, do không quan tâm chọn lọc giống nên các rừng trồng trên chỉ đáp ứng yêu cầu che phủ chưa phát huy được hiệu quả kinh tế Mãi đến năm 1996, cây điều tại Việt Nam mới được quan tâm đúng mức và được trồng với mục tiêu chế biến xuất khẩu hạt điều

2.1.2 Đặc điểm thực vật học của cây điều

2.1.2.1 Thân và cành

Điều là cây gỗ lớn có thể cao đến 40m, tán rộng đến 300m2, cành sà sát đất và

có thể sống đến 200 năm (Tạ Minh Sơn, 2004) Cây điều phân cành sớm, tán hình ô rậm và rộng Theo Kumaran và cộng sự (1976), cây 4 tuổi có số cành sơ cấp thay đổi từ 9 - 30 và số cành thứ cấp từ 246 - 412 Gỗ điều tương đối mềm, nhẹ, tỷ trọng

là 0,5 Vỏ cây, thân cũng như cành khi bị tổn thương thường tiết ra nhiều mủ trắng trong

Hình 2.1: Cây điều (Anacardium ocidentale L.)

Chiều cao thân cây có liên hệ mật thiết với mật độ trồng Nếu trồng với mật độ dày, thân cây tăng trưởng mạnh, phát triển chiều cao nhưng cành nhánh nhỏ và ngắn, lá thưa thớt và không thể cho nhiều hoa, trái Thông thường khoảng cách trồng phổ biến khoảng 8 – 10 m

2.1.2.2 Hệ rễ

Cây điều có rễ cọc, vừa có hệ rễ ngang Rễ cọc có thể đâm sâu xuống đất ngay cả khi mùa khô kéo dài 5 – 6 tháng Hệ rễ ngang phát triển rất rộng, có thể lan rộng tới 2-3m ở tầng 50-60 cm lớp trên của đất trồng

2.1.2.3 Lá

Lá điều thuộc loại lá đơn, nguyên, phiến lá dày, gân nổi rõ dưới mặt lá, cuống ngắn 1 – 2 cm Lá có trứng ngược, đuôi lá thường hay tròn, hơi lõm, mặt trên nhẵn bóng Khi non lá có màu xanh nhạt hoặc đỏ, khi già có màu xanh đậm Lá điều dài

từ 6 – 24 cm, rộng 4 – 15 cm Theo Rao và Hassan (1957), thời gian trung bình từ khi ra lá non đến lá trưởng thành khoảng 20 ngày

2.1.2.4 Hoa

Hoa điều trổ từ tháng 1 đến tháng 4, có khi cả năm Hoa nhỏ màu trắng vàng, nở từ từ trung bình khoảng 32 ngày Mỗi cụm hoa có từ 65-240 hoa gồm 2 loại: hoa đực và hoa lưỡng tính Những chùm hoa của đầu và cuối vụ thường nhiều hoa đực, những chùm hoa chính vụ có tỉ lệ hoa lưỡng tính cao Tỉ lệ hoa lưỡng tính còn tùy thuộc vào từng cây khác nhau trong vườn Bình quân tỉ lệ hoa lưỡng tính trong chùm khoảng 12 – 15 % (Đường Hồng Dật, 1999)

Theo Ohler (1979), cây điều ra hoa từ đông sang tây theo chiều kim đồng hồ, hoa thụ phấn chéo Sự thụ phấn chủ yếu nhờ côn trùng, một phần nhờ gió Hạt phấn

có sức sống kéo dài 48 giờ Nhờ có cấu tạo nốt sần ở mặt ngoài, hạt phấn bám chắc vào các lỗ hổng trong bao phấn khiến gió không thể thổi bật được nó ra Tuy nhiên, theo Rao (1974) việc thụ phấn tự nhiên là chưa đủ, qua thụ phấn bằng tay, đã thu được kết quả lên đến 55% đậu trái Theo Kumaran và cộng sự (1976), thụ phấn

chéo thu được 61,3% đậu trái Cây điều chỉ thụ phấn tốt trong điều kiện thời tiết khô

ráo, trời không u ám Nếu gặp mưa khi ra hoa, độ ẩm không khí cao, cây điều dễ bị mất mùa

2.1.2.5 Quả và hạt điều

Sau khi thụ phấn, hạt điều phát triển rất nhanh, cuống phình lên thành trái (trái giả) Sau 60 ngày, trái chín có màu đỏ hay vàng tùy loại, thường tập trung thành chùm ở đầu cành

Hạt điều (trái thực) có hình thận, còn tươi có màu xanh, khi khô chuyển sang nâu, mọc lộ ra ngoài đầu trái giả trông giống như trái có hột chui ra ngoài Vì vậy, cây điều còn có tên gọi là cây đào lộn hột

Hạt điều gồm 3 phần:

- Phần vỏ ngoài dày 0,4 cm có 3 lớp: lớp vỏ ngoài dai láng, lớp vỏ giữa xốp như bọt biển, lớp vỏ trong cứng

- Phần vỏ lụa bao quanh nhân, chiếm 5% trọng lượng hạt

- Phần nhân điều, là phần chứa nhiều dầu nhất

Sau khi trồng khoảng 2 - 3 năm, cây điều bắt đầu ra hoa kết trái Năng suất giữa các cây trong cùng một vườn, giữa các năm, giữa các vườn điều với nhau thường khác nhau, phụ thuộc chủ yếu vào giống, kỹ thuật trồng và thời tiết Năng suất hạt điều trung bình của nước ta khoảng 1,1 tấn/ha

2.1.3 Yêu cầu sinh thái của cây điều

Cây điều phát triển tốt ở nhiệt độ cao, độ cao từ 0 đến 600 m so với mặt biển Nhìn chung, độ cao nơi trồng điều so với mặt biển càng lớn thì sinh trưởng càng chậm và năng suất càng giảm (Nguyễn Phi Hùng, 2003) Các yếu tố sinh thái ảnh hường đến sinh trưởng và phát triển trên cây điều bao gồm:

2.1.3.1 Lượng mưa

Điều là cây ưa sáng, thường sản xuất trong mùa khô, khoảng 2000 giờ nắng/năm Ẩm độ tương đối, cây thích hợp với ẩm độ 66 - 80 %, trong mùa ra hoa của cây, ẩm độ thấp sẽ thuận lợi cho cây Cây điều cần khí hậu có mùa khô kéo dài

ít nhất 4-5 tháng và mùa mưa với thời gian tương tự

Lượng mưa đạt 800 - 1500 mm/năm, trải đều trong 6-7 tháng và một mùa khô kéo dài từ 5 - 6 tháng trùng với mùa cây điều ra hoa kết quả Mưa nhiều hay ít cũng đều ảnh hưởng đến cây điều Mưa nhiều làm cây chậm sinh trưởng và sản phẩm kém chất lượng, bị kí sinh trùng tấn công nhiều Mưa ít làm cho cây ra trái bất thường

Lượng mưa vào các tháng 10, 11, 12 ảnh hưởng rất lớn đến việc thu hoạch sớm, trung bình hay thu hoạch muộn Nếu lượng mưa trung bình mỗi tháng 220 mm

sẽ cho năng suất cao, ngược lại nếu lượng mưa trung bình tháng 11 nhiều hơn sẽ cho kết quả ngược lại ở những cây ra hoa sớm vào tháng 11

2.1.3.2 Nhiệt độ

Cây điều phát triển tốt trong điều kiện nhiệt độ 24 - 280C, nhiệt độ tối đa trung bình cây còn có khả năng chống chịu là 390C Trong giai đoạn sản xuất của cây, nhiệt độ thấp ảnh hưởng đến sự ra hoa Thời kì quả phát triển, nhiệt độ lớn hơn

400C sẽ gây rụng hoa, quả Cây điều non thường rất mẫn cảm với nhiệt độ thấp, cây trưởng thành có thể chịu được nhiệt độ 00C

2.1.3.3 Gió

Ở các nước trồng điều nhiều, khu vực trồng điều chủ yếu nằm gần biển, phơi

ra gió Cây điều phần lớn thụ phấn chéo và được phát tán nhờ gió, tốc độ gió thích hợp là 2 - 25 km/h Gió mạnh sẽ làm rụng hoa, tăng bốc thoát hơi nước làm mất cân bằng sinh lý Gió mặn (có chứa muối) dẫn đến các mầm và lá non bị cháy nắng 2.1.3.4 Đất

Cây điều có thể phát triển được trên các loại đất cát rời, đất bồi, đất feralit Cây chỉ sinh trưởng tốt trên đất xốp, sâu, thoát nước tốt, pH từ 4,5 - 6,5 Cây điều thường bị ảnh hưởng bởi các tác nhân về lý tính hơn là hóa tính Điều có thể mọc ở đất ven biển vì có thể chịu được cát mặn, nồng độ muối cao nhất mà cây điều có thể chịu được mà không chết là từ 3,0 đến 3,5ppm (Ohler, 1979) Ở Việt Nam rất nhiều vùng đất có thể thích hợp cho việc phát triển của cây điều như:

- Đất cát đỏ ở ven biển Bình Thuận

- Đất cát trắng bờ biển duyên hải Nam Trung bộ

- Đất xám phù sa cổ (Đông Nam bộ chiếm diện tích lớn nhất)

- Đất bazan thoái hóa (Các tỉnh ở Tây Nguyên)

Tất cả những loại đất này phần lớn là đất trống, đồi núi trọc cần phải được phủ xanh nên rất thuận lợi cho các kế hoạch mở rộng diện tích trồng điều

2.1.4 Đa dạng đặc điểm thực vật học các giống điều

Theo Tạ Minh Sơn (2005a), điều là cây thụ phấn chéo nên mỗi hạt điều được coi là một hạt lai Quần thể điều thực sinh ngay thời kỳ cây con, các cá thể hoàn toàn khác nhau: có cây lá non xanh, lá non đỏ, cây cao, lùn, bán lùn, cây phân cành sớm, phân cành muộn, cây phát triển nhanh, phát triển chậm Các cá thể phân ly ở

giai đoạn phát dục: có cá thể ngay sau mọc 4 - 6 tháng đã cho hoa, cá thể vài ba năm sau mới cho quả bói, cá thể quả màu vàng, cá thể cho quả màu đỏ, cá thể quả giả to, có cá thể cho quả giả nhỏ Các cá thể khác nhau, kích thước hạt cũng khác nhau Chính sự khác nhau này dẫn đến trong quần thể điều xuất hiện cá thể tốt, cá thể xấu Có thể phân chia các giống điều khác nhau dựa vào đa dạng về hình thái, đặc điểm thực vật học như sau:

2.1.4.1 Dựa vào lá

Theo IPGRI (1986), hình dạng và màu sắc lá trên các giống điều rất đa dạng

Về màu sắc lá, có giống lá non màu nõn chuối, lá già màu xanh nhạt, có giống lá non từ màu hồng đến đỏ tía và lá già có màu xanh Về hình dạng lá, lá có thể là hình trứng, trứng ngược, thuôn hoặc tròn

2.1.4.2 Dựa vào hoa

Theo Hoàng Chương và Cao Vĩnh Hải (1999), có giống hoa nở muộn, nở sớm chênh nhau 10 – 15 ngày, số lượng hoa trong mỗi chùm cũng khác nhau, tỉ lệ hoa đực/hoa lưỡng tính bình quân trong một chùm cũng thay đổi tùy giống (có giống có tỉ lệ hoa lưỡng tính thấp chỉ khoảng 5 %, có giống cao đến khoảng 30 %)

Tỉ lệ hoa lưỡng tính sau khi nở và đậu thành trái cũng khác nhau, có khi nhiều khoảng 6 – 10 trái (gọi là điều chùm), ít chỉ 1 – 3 trái

2.1.4.3 Dựa vào quả giả

Khác biệt ở màu sắc, hình dạng, kích cỡ, mùi vị quả giữa các giống Có giống quả màu đỏ, màu hồng, màu vàng, đỏ sọc xanh Có giống quả tròn, quả dài, quả to hay nhỏ Có giống quả ngọt khi chín, có giống quả nhạt, khi ăn có vị rất chát

do có nhiều tanin trong nước quả

2.1.4.4 Dựa vào chiều cao và đặc điểm tán cây

a Đặc điểm giống điều lùn

Điều lùn là giống điều thấp cây, dáng hình dù, phân cành sớm, đốt lá dày, không vươn dài Phân cành liên tục, cành chính với cành phụ không khác nhau quá lớn Có nhiều hoa đầu cành hơn điều cao Ngoài yếu tố điều lùn dễ chăm sóc, tạo

điều kiện trồng dày, chống đổ tốt thì điều lùn thường có tiềm năng năng suất cao hơn hẳn điều cao vì có nhiều hoa đầu cành

b Đặc điểm giống điều cao

Giống điều cao cây là giống điều có thân cao thẳng đứng, thân chính phát triển mạnh, phân cành muộn Đốt lá dài, cành vươn trải, mọc thưa thớt trên thân Dễ phân biệt giữa thân chính và cành các cấp Tán cây chiếm diện tích che phủ lớn nhưng số hoa đầu cành thấp nên tiềm năng năng suất thường thấp hơn điều lùn Tán cây điều cao cồng kềnh không gọn cây, khó chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh, dễ đổ ngã khi có gió to, mưa lớn

c Đặc điểm giống điều bán lùn

Giống điều bán lùn phân cành sớm hơn giống điều cao, thường có nhiều thân (hơn 2 - 3 thân), cây cao trung bình, phân biệt được thân chính và các cành thứ cấp Thân chính thấp, đốt lá dài vừa phải không thể hiện vươn cành mạnh Giống điều bán lùn vẫn giữ được tán hình dù Với cấu trúc này tán của cây vẫn sà sát đất, và loại hình này vẫn dễ tạo tán, tỉa cành, tạo ra cây có hình dù theo ý muốn, tạo điều kiện thuận lợi cho chăm sóc, phòng trừ sâu bệnh, thu hái và chống đổ ngã tốt

Hình 2.2: Các giống điều phân loại theo chiều cao và đặc điểm tán cây

1.Giống điều cao ; 2.Giống điều bán lùn 3 Giống điều lùn

(b)

(a)

Hình 2.3: Các kiểu phân cành trên cây điều

(a): Phân cành liên tục, không vươn dài (extensive)

(b): Phân cành muộn, vươn dài (intensive)

(Nguồn: IPGRI, 1986)

2.2 Tình hình sản xuất điều trên thế giới và ở Việt Nam

2.2.1 Tình hình sản xuất điều trên thế giới

Từ một loài cây mọc hoang dại ở vùng Nam Mỹ, đến nay cây điều được trồng phổ biến trên hơn 50 nước Sản lượng hạt điều thế giới các năm từ năm 2000 đến năm 2004 liên tục tăng, phản ánh xu hướng sản lượng của châu Phi và Việt Nam, mà nguyên nhân chính là tăng diện tích trồng điều Theo số liệu của FAO (2004), diện tích điều cho thu hoạch năm 2004 của 20 nước có diện tích điều lớn nhất vào khoảng 3,1 triệu ha so với 2,1 triệu ha trong năm 1993 Trong đó, năm nước có diện tích điều đang thu hoạch lớn nhất là Ấn Độ (730 ngàn ha; 23,8%); Brazil (691 ngàn ha; 22,5%); Nigeria (324 ngàn ha; 10,6%); Việt Nam (282 ngàn ha; 9,2%) và Indonesia (260 ngàn ha; 8,5%)

Trong vòng 10 năm qua, sản lượng điều thế giới tăng gấp hơn 2 lần, đạt gần

2 triệu tấn Trong đó, hai nước có sản lượng lớn nhất là Ấn Độ và Việt Nam

Theo số liệu của FAO (2004) (trích dẫn bởi Viện Chính sách và chiến lược phát triển NNNT, 2005), năng suất điều trên thế giới khá thấp Hầu hết các nước trồng điều đạt dưới 1 tấn/ha Điều này cũng phản ảnh thực tế là cây điều vốn chưa

được coi là cây trồng có tiềm năng kinh tế cao và được thâm canh đúng mức Nhiều nước vẫn trồng điều phân tán với mục đích phủ xanh đất trống đồi trọc, có nghĩa là đóng vai trò như cây lâm nghiệp là chính

2.2.2 Tình hình sản xuất điều ở Việt Nam

2.2.2.1 Tình hình sản xuất điều ở Việt Nam

Theo số liệu của Tổng cục Thống kê (2009), diện tích trồng điều ở Việt Nam tăng từ 70 ngàn ha vào năm 1990 lên đến 421,5 ngàn ha năm 2008, tức là tăng 6,02 lần trong vòng 18 năm (bảng 2.1) Nhưng theo báo cáo rà soát quy hoạch ngành điều của Viện Quy hoạch Thiết kế nông nghiệp, diện tích điều thực sự vào năm

2005 đã lên đến 520 ngàn ha Tuy nhiên, hiện nay chưa thống kê được diện tích đang cho thu hoạch

Bảng 2.1: Diện tích, sản lượng và xuất khẩu điều Việt Nam

Xuất khẩu (tấn)

loại sản phẩm

Trị giá (triệu USD)

Ghi chú

1975 500 - - - -

1990 70.000 28.000 27.000 hạt 14,00 Xuất khẩu nhân điều: 286 tấn

1991 75.000 31.000 30.000 hạt 23,00 Xuất khẩu nhân điều: 360 tấn

1992 78.973 32.004 51.700 hạt 46,53 Xuất khẩu nhân điều: 1.400 tấn

1993 122.530 69.089 47.700 hạt 49,00 Xuất khẩu nhân điều: 6.000 tấn

1994 172.740 87.957 49.500 hạt 75,00 Xuất khẩu nhân điều: 9.526 tấn

2.2.2.2 Hiện trạng sản xuất điều năng suất cao và chất lượng tốt ở Việt Nam

Theo số liệu năm 2006 của Cục trồng trọt thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, diện tích điều năm 2006 ở Việt Nam là 385.000 ha trồng mới bằng giống điều ghép cao sản Năng suất điều bình quân toàn quốc đạt khoảng 1,1 tấn/ha

Sự gia tăng nhanh chóng về sản lượng và năng suất điều có việc đóng góp quan trọng của việc áp dụng các quy trình thâm canh cho cây điều, đặc biệt là việc phổ biến các thành quả của việc tuyển chọn giống điều và sản xuất đại trà Những giống điều mới không những làm tăng năng suất mà còn góp phần cải thiện chất lượng hạt điều ở Việt Nam

Mặc dù hiện nay Việt Nam đã trở thành nước xuất khẩu nhân điều đứng thứ hai trên thế giới nhưng chất lượng hạt điều vãn còn kém do năng suất thu hoạch các giống tốt chưa cao Trong tập đoàn các dòng điều có triển vọng đã được chọn lọc trong thời gian qua, một số dòng đã đưa vào sản xuất thử nghiệm và được chọn lọc

để tạo giống đóng góp không nhỏ vào nâng cao năng suất và chất lượng điều ở Việt Nam (Nguyễn Tăng Tôn, 2007)

2.3 Đa dạng di truyền và các phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền

2.3.1 Khái niệm về đa dạng sinh học

Theo định nghĩa của Quỹ Quốc tế về bảo tồn thiên nhiên WWF thì đa dạng sinh học là “sự phồn thịnh của sự sống trên Trái đất, là hàng triệu loài thực vật, động vật và vi sinh vật, là những gen chứa đựng trong các loài và là những hệ sinh thái vô cùng phức tạp cùng tồn tại trong môi trường”

Như thế, đa dạng sinh học cần phải được xem xét ở 3 mức độ Đa dạng sinh học bao gồm sự khác biệt trong các quần xã sinh học nơi các loài đang sống, các hệ sinh thái trong đó các quần xã tồn tại và sự khác biệt giữa các mối tương tác giữa chúng với nhau Đa dạng sinh học ở mức độ loài bao gồm tất cả sinh vật trên trái đất từ vi khuẩn đến các loài động vật, thực vật và nấm Ở mức nhỏ hơn, đa dạng sinh học bao gồm sự khác biệt về gen giữa các loài, khác biệt về gen giữa các quần thể cách ly nhau về địa lý cũng như khác biệt giữa các cá thể chung sống trong một quần thể Sự khác biệt giữa đa dạng sinh học ở 3 mức độ được trình bày qua bảng 2.2

Bảng 2.2: Các mức độ đa dạng sinh học

Đa dạng vùng sinh thái Đa dạng loài Đa dạng di truyền

Sinh đới (Biomes) Giới (Kingdom) Quần thể (PopuLations)

Vùng sinh học (Bioregions) Ngành ( Phyla) Cá thể (Individuals)

Cảnh quan (Landscapes) Lớp (Class) Nhiễm sắc thể (Chromosomes)

Hệ sinh thái (Ecosystems) Bộ (Order) Gene

Nơi ở (Habitats) Họ (Families) Nucleotide

Tổ sinh thái (Niches) Giống (Genera)

Loài ( Species) (Gaston Kevin, 2004)

2.3.2 Đa dạng di truyền

Thể hiện sự sai khác di truyền giữa các cá thể trong một quần thể hoặc giữa các quần thể với nhau Đa dạng di truyền trong nội bộ loài thường là kết quả của tập tính sinh sản của các cá thể trong quần thể Một quần thể là một nhóm các cá thể giao phối với nhau và sản sinh ra con cái hữu thụ Một loài có thể có một hay vài

quần thể khác nhau Một quần thể có thể chỉ gồm một số ít cá thể hay có thể có hàng triệu cá thể

Các cá thể trong một quần thể thường rất khác nhau về mặt di truyền Sự đa dạng về bộ gen có được do các cá thể có gen khác nhau Các dạng khác nhau của gen được gọi là allen và những sự khác biệt nảy sinh qua đột biến, là những sự thay đổi xảy ra trong DNA, đơn vị cấu thành nhiễm sắc thể của cá thể Sự khác biệt của các allen trong gen có thể ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh lý của các cá thể một cách khác nhau

Tổng số các sắp xếp của gen và allen trong quần thể được coi là quỹ gen, trong khi một tổ hợp nào đấy của gen và alen trong bất kì cá thể nào được gọi là kiểu di truyền Kiểu hình của một cá thể nói lên các đặc điểm về hình thái, sinh lý, sinh hóa, là kết quả của biểu hiện kiểu gen trong một môi trường nhất định (Trần Anh Tuấn, 2007) Trong một loài, các giống khác nhau có trình tự bộ gen khác nhau Trình tự bộ gen của các cá thể trong cùng một giống cũng có thể khác nhau

do sự xuất hiện một loại đột biến nào đó Đôi khi sự khác biệt này lại có ý nghĩa về mặt di truyền, do đột biến xuất hiện tại vị trí của một gen nào đó trong bộ gen của một cá thể, làm cho gen đó không biểu hiện hoặc biểu hiện khác đi thành một tính trạng khác với những cá thể cùng giống

Sai khác di truyền cho phép các cá thể thích ứng với những thay đổi của môi trường Nhìn chung, các loài quý hiếm ít có sự đa dạng di truyền hơn các loài có phân bố rộng và kết quả là chúng dễ bị tuyệt chủng hơn khi điều kiện môi trường thay đổi

2.3.3 Các phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền

Sự khác nhau về di truyền của các cá thể trong cùng một giống (hay giữa các giống trong cùng một loài) có thể biểu hiện hay không biểu hiện thành những tính trạng bên ngoài Người ta thường tìm kiếm những dấu hiệu để nhận ra được sự khác nhau về di truyền giữa các cá thể (hoặc giữa các giống), gọi là những chỉ thị (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

2.3.3.1 Các chỉ thị hình thái

Sự đa dạng di truyền có thể phát hiện dựa vào các biểu hiện hình thái Gen thể hiện bản chất di truyền sẽ được liên kết với một tính trạng hình thái nào đó mà người ta có thể đo đếm được – gen đó có thể xem như chỉ thị Tuy nhiên, số chỉ thị hình thái hiện diện trong tự nhiên cũng rất ít, không thỏa mãn yêu cầu của nhiều chương trình chọn giống và chỉ có quy mô hình thái (cơ quan) hoặc ở giai đoạn phát triển đặc biệt của cá thể thể

Sự thể hiện các chỉ thị hình thái bị ảnh hưởng bởi điều kiện môi trường, điều này làm cho chỉ thị hình thái kém thu hút trong cải tiến giống cây trồng (Huỳnh Chấn Khôn, 2006)

2.3.3.2 Các chỉ thị isozyme

Isozyme là các dạng protein có cùng đặc tính xúc tác nhưng lại có sự khác nhau khi chạy điện di Kỹ thuật điện di được dùng để đo sự di động của phân tử protein trong một khoảng thời gian nhất định, trên điện trường đồng nhất Các protein đột biến khác nhau về điện tích sẽ có sự di chuyển khác nhau nên có thể phát hiện sự khác nhau giữa chúng bằng kỹ thuật điện di Nhờ kỹ thuật điện di này, cùng lúc có thể phân tích nhiều cá thể của một quần thể nào đó để đánh giá chính xác số phần trăm dị hợp tử của một gen nhất định, đánh giá sự đa dạng giữa các nhóm sinh vật theo các protein được quan sát Với sự phát triển của kỹ thuật điện di, người ta có thể chẩn đoán được một phần nào sự biến dị ở mức độ DNA

Tuy việc áp dụng chỉ thị isozyme đã làm thay đổi việc nghiên cứu đa dạng di truyền theo chiều hướng thuận lợi hơn do đây là chỉ thị rẻ tiền, nhanh và vật liệu có thể sử dụng trong một thời gian dài nhưng số chỉ thị quá ít, không thỏa mãn cho nhu cầu nghiên cứu

2.3.3.3 Các chỉ thị DNA

Có thể nói rằng kể từ khi con người biết đến sự hiện diện của gene và khi Watson và Crick phát minh ra cấu trúc của chuỗi DNA năm 1955, các kỹ thuật sinh học phân tử được phát minh ngày càng nhiều và càng ngày càng tỏ ra là công cụ đắc lực cho công tác nghiên cứu khoa học do số lượng chỉ thị nhiều hơn hẳn so với 2 loại chỉ thị trên, độ tin cậy cao hơn và thuận tiện hơn nhiều (Tanksley và ctv, 1980)

Những lợi ích của chỉ thị phân tử DNA so với chỉ thị hình thái và chỉ thị isozyme:

− Đo lường trực tiếp các vật liệu di truyền

− Có nhiều chỉ thị trong quần thể

− Đo lường không chi phối ảnh hưởng môi trường và ảnh hưởng có tính chất phát triển

2.4 Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism – đa hình chiều dài những đoạn DNA được nhân bản) là kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại do Zebeau và Vos (1993) phát minh ra, sau đó được Vos và cộng sự (1995), Vos và Kuiper (1997) tiếp tục phát triển Kỹ thuật này dựa trên nền tảng kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những cặp primer đặc biệt được thiết kế sẵn, điều kiện phản ứng PCR được thiết lập nghiêm ngặt giúp nhân bản một cách có chọn lọc những đoạn DNA được cắt giới hạn từ bộ gene của đối tượng nghiên cứu Kỹ thuật AFLP giúp đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể và phát hiện chỉ thị DNA với độ tin cậy cao

Trên nguyên tắc, AFLP gồm hai nội dung cơ bản:

- Cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn sau đó bổ sung các adapter đặc hiệu tạo nên các đoạn có đầu mút giống nhau, đặc trưng cho các primer đã chọn trước Adaptor là một đoạn oligonucleotide đôi, được tổng hợp nhân tạo và có trình tự tương ứng với trình tự ở đầu đoạn DNA được phân cắt bởi một loại enzyme nhất định

- Nhân đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR qua hai giai đoạn với hai loại primer khác nhau

* Enzyme được sử dụng để cắt DNA của bộ gene là:

MseI: Là enzyme cắt ở vị trí xác định là 4 base

EcoRI: Là enzyme cắt ở vị trí xác định là 6 base

* Adaptor là trình tự sợi đôi chuyên biệt cho cả vị trí của EcoRI và vị trí của

MseI Sự gắn kết của adapter đối với DNA đã được cắt thay đổi vị trí cắt để ngăn

chặn sự phân cắt thứ hai xảy ra sau khi đã gắn kết Chỉ những trình tự DNA nào gắn với adapter mới được khuếch đại

* Primer : Có hai loại primer được sử dụng

+ Primer dùng trong khuếch đại tiền chọn lọc:

EcoRI: 5’GACTGCGTACCAATTC-3’

MseI: 5’GATGAGTCCTGAGTAA-3’

Primer này được thiết kế tương ứng với adapter đã sử dụng, đồng thời có gắn thêm một nucleotide ở đầu 3’ để chọn lọc những đoạn DNA cần khuếch đại, cụ thể

là EcoRI gắn thêm nucleotide A và MseI gắn thêm nucleotide C ở đầu 3’

Sự khuếch đại tiền chọn lọc giúp chọn lọc bước đầu các trình tự DNA cần được khuếch đại

+ Primer dùng trong khuếch đại chọn lọc:

Là các primer khuếch đại tiền chọn lọc được thêm vào từ 1 đến 2 nucleotide

ở đầu 3’ Ví dụ: EcoRI A gắn thêm CT và MseI C gắn thêm AG vào đầu 3’

EcoRI: 5’FAM-GACTGCGTACCAATTCACT-3’

MseI : 5’-GATGAGTCCTGAGTAACAG-3’

Kết quả là so với primer được thiết kế tương ứng với adapter thì primer khuếch đại chọn lọc có thêm ba nucleotide ở đầu 3’ Điều này giúp cho việc lựa chọn các đoạn DNA chặt chẽ hơn, giảm sự phức tạp khi đọc kết quả các đoạn DNA trên gel

Chạy điện di các đoạn được khuếch đại trên gel polyacrylamide hoặc được phân tích trên máy giải trình tự DNA

* Có thể tóm tắt quy trình thực hiện AFLP gồm bốn bước cơ bản:

- Tách chiết và tinh sạch DNA

- Cắt các mẫu DNA nghiên cứu bằng các cặp enzyme giới hạn chọn lọc

có bổ sung adapter tương ứng

- Thực hiện phản ứng PCR trên các mẫu đã được cắt giới hạn và có gắn adaptor tương ứng với primer tiền chọn lọc

- Thực hiện phản ứng PCR trên các sản phẩm khuếch đại tiền chọn lọc với các primer chọn lọc

Kỹ thuật AFLP được trình bày tóm tắt theo sơ đồ dưới đây:

Hình 2.4: Kỹ thuật AFLP

(Agarwal M và ctv,2008)

Ưu điểm của kĩ thuật AFLP: nhanh, cho kết quả ổn định và độ tin cậy cao, không phức tạp như RFLP nhưng vẫn khảo sát được toàn bộ gene Kỹ thuật này đòi hỏi ít lượng DNA ban đầu và không cần biết trước trình tự nucleotide của bộ gene

Tuy nhiên, AFLP là một chỉ thị trội, điều này làm hạn chế phân biệt cá thể dị hợp tử

Ứng dụng của kỹ thuật này:

- Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của quần thể

- Đánh giá sự tương quan di truyền giữa các cá thể

- Lập bản đồ di truyền, chọn giống

2.5 Tổng quan về vườn điều giống quốc gia Cát Hiệp, Phù Cát, Bình Định 2.5.1.Khái quát về vườn điều giống quốc gia Cát Hiệp, Phù Cát, Bình Định

2.5.1.1 Vị trí địa lý

Thuộc thôn Tùng Chánh, xã Cát Hiệp, huyện Phù Cát, tỉnh Bình Định

Phía Bắc giáp với đường liên thôn Phía Nam giáp với các hộ dân

Phía Đông giáp với đường liên xã Cát Hiệp và Cát Lâm

Phía Tây giáp với rừng keo và bạch đàn của xã

2.5.1.2 Cấu trúc và chức năng

Được thành lập năm 1998 trong dự án quy hoạch ngành điều của chính phủ đến 2020 (Tạ Minh Sơn, 2004)

Diện tích vườn: 80 ha; được chia thành 2 khu vực chính:

- Khu vườn điều giống: diện tích khoảng 10ha, có chức năng bảo tồn các dòng, giống điều trong toàn quốc Đây là nguồn quỹ gen những cá thể (cây điều) tốt, cây điều ưu tú, cây điều đầu dòng; được tuyển chọn từ các vùng trọng điểm ở 9 tỉnh duyên hải Nam trung bộ và Đông Nam bộ (từ Bình Phước đến Bình Định) Mật

độ trồng 3m x 3m tương đương với khoảng 1000 cây/ha Hiện nay, vườn lưu giữ quỹ gen của 248 dòng điều ưu tú với tiềm năng năng suất trên 4 tấn/ha trên tổng số

800 dòng điều tốt đã được Viện Nghiên cứu Nông nghiệp Duyên hải Nam trung bộ bình tuyển

- Khu thí nghiệm: Các dòng điều đã tuyển chọn trồng thí nghiệm ở các mật

độ khác nhau và sau đó được trồng triển khai bằng những mô hình cụ thể nhằm tìm

ra những giống điều thích hợp cho mỗi loại đất và thích nghi với khí hậu duyên hải Nam Trung bộ

Ngoài ra, vườn còn cung cấp những dòng điều có năng suất, chất lượng cao cho sản xuất; tập trung nghiên cứu các biện pháp thâm canh như mật độ trồng thích hợp, bón phân, tưới nước, tỉa cành, tạo tán, phòng trừ sâu bênh hại, nghiên cứu biện pháp nông lâm kết hợp được thực hiện ở các lô đất xung quanh vườn điều

2.5.2 Phương pháp bình tuyển và chọn lọc điều năng suất cao áp dụng tại vườn điều giống

Phương pháp tuyển sớm thường được áp dụng trong tuyển chọn giống cây lâu năm đã được ứng dụng trên cây điều Phương pháp này dùng kết quả năng suất

và chất lượng của các năm đầu, tiến hành chọn lọc ngay từ các vụ thu hoạch đầu tiên Một chu kỳ chọn giống có thể hoàn thành trong vòng 8 năm kể từ khi sưu tập

và đánh giá tập đoàn (Phạm Văn Biên, Nguyễn Thanh Bình và ctv, 2000)

Quần thể điều được đánh giá hiện diện trong các vùng trọng điểm được bình tuyển thường được so sánh với các dòng điều đã được phép khu vực hóa để làm đối chứng (Tạ Minh Sơn, 2004)

Quy trình đánh giá, bình tuyển và chọn lọc các giống điều tốt có thể tóm tắt như sau:

- Thu thập thông tin về dữ liệu cây điều đã có ở các cấp để xác định vùng sản xuất điều trọng điểm nhằm phục vụ cho công tác điều tra sơ và bình tuyển

- Dã ngoại thực địa để phỏng vấn hộ nông dân, quan sát trực tiếp về kiểu hình các cây điều năng suất cao được nông dân giới thiệu để thu thập các tiêu chí điều tra

- Phân tích, đánh giá để xác định các dòng điều trội cần tuyển chọn theo các tiêu chí quy định

- Thu thập các dòng điều trội và tiến hành kiểm tra hậu thế ở các khu vực sinh thái cần phát triển, qua đó xác định được các dòng điều đảm bảo mục tiêu đề ra

và đề nghị khu vực hóa nhằm đưa vào sản xuất

- Tổng kết ngoài thực tế sản xuất ở quy mô quy định để đề nghị công nhận giống quốc gia

2.5.3 Các tiêu chí quy đinh, chỉ tiêu đánh giá và theo dõi

2.5.3.1 Tiêu chí đánh giá cây điều trội

- Tuổi cây đã đi vào giai đoạn cho trái ổn định: từ 7 năm tuổi trở lên

- Năng suất cá thể vượt trội so với năng suất trung bình của các cây trong cùng điều kiện canh tác

- Số hạt / kg nhỏ hơn 170 hạt khi đã phơi khô hai nắng, tỷ lệ nhân / hạt lớn hơn 25%

- Tỷ lệ cành hữu hiệu từ 90% trở lên Số quả thu hoạch trên 4 quả

- Năng suất quy đổi trên đơn vị hecta trên 3000kg

2.5.3.2 Các chỉ tiêu sinh trưởng, phát triển và năng suất khi kểm tra hậu thế

- Các chỉ tiêu sinh trưởng: chiều cao cây, đường kính tán, số chồi cây

- Các chỉ tiêu về yếu tố cấu thành năng suất và năng suất: tỉ lệ chồi ra hoa / cây (%), tỉ lệ chồi hữu hiệu / cây (%), số quả thu hoạch / phát hoa, năng suất thực thu (kg /ha)

- Các chỉ tiêu về chất lượng: số hạt / kg, tỷ lệ nhân / hạt (%)

C (30 ha)

Lô 22 Lô21 Lô 20 Lô19 Lô 18 Lô 17 Lô 16 Lô 15 Lô 14 Lô 13 Lô 12 Lô 11

Sơ đồ 2.1: Mặt bằng vườn điều Cát Hiệp

VƯỜN ĐIỀU GIỐNG (10 ha) KHU THÍ NGHIỆM (20 ha) Lô 8 Lô 9 Lô 10

Cổng vào ĐƯỜNG PHÂN LÔ

B KHU THÍ NGHIỆM (10ha)

VƯỜN ĐIỀU GIỐNG (10 ha) A KHU THÍ NGHIỆM (20ha) Lô 8 Lô 9 Lô 10

KHU THÍ NGHIỆM

2.6 Tình hình nghiên cứu cây điều trong và ngoài nước

2.6.1 Nghiên cứu ngoài nước

Điều là một trong những cây công nghiệp mang lại hiệu quả kinh tế cao, dễ trồng, chi phí đầu tư ban đầu thấp nên điều được phát triển rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới Cũng chính vì vậy mà cây điều đã dược nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu kĩ lưỡng cả về đặc tính sinh học, yêu cầu sinh thái cũng như kỹ thuật chọn, tạo giống

Năm 1986, Viện Tài nguyên di truyền thực vật quốc tế (IPGRI) đã công bố tài liệu mô tả khá chi tiết các đặc điểm thực vật học cũng như sinh thái học của cây điều Tài liệu này được phát triển dựa trên công trình nghiên cứu của Dasaradhi và Nambiar

Về nghiên cứu đặc tính sinh học, yêu cầu sinh thái và các giống năng suất cao có các nghiên cứu:

Tại các nước trồng điều, khi áp dụng các giải pháp công nghệ về chọn giống tốt và biện pháp kĩ thuật hợp lý đã nâng cao năng suất hạt điều lên từ 55 -65 % so với năng suất quần thể, các thí nghiệm của Lefebre ở Madagasca cho thấy trước khi cây bắt đầu cho trái thì yếu tố lân và đạm là những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình phát triển, ra hoa sớm và năng suất hạt điều (Ohler, 1979)

Theo Rao (1998), tại Ấn độ, điều là cây công nghiệp quan trọng, đến nay tổng diện tích khoảng 635.000 ha với năng suất bình quân khoảng 656,8 kg/ha, ở diện 14.000 ha, năng suất đạt bình quân khoảng 1200 kg/ha và cá biệt đạt trên 3000

kg /ha

Theo Suwit (1996), năng suất điều Thái Lan đạt bình quân khoảng 1.050 kg /ha ở diện tích 55.000 trong năm 1994 Tại Thái Lan, chủ yếu tập trung phát triển hai giống Si Sa ket 60-1 và Si Sa ket 60 – 2 và đánh giá sau 11 năm cho thấy năng suất lần lượt là 33,4 kg/cây và 25 kg/cây

Theo Usman (1998), tại Indonesia, năng suất bình quân đạt rất thấp khoảng trên dưới 200 kg/ha Nhưng cá biệt có vườn đạt năng suất cao từ 900 – 2.200 kg/ha

Theo Alyzu và Awopetu (2007) nghiên cứu đa dạng di truyền trên 59 dòng điều chất lượng cao thu thập ở Ấn độ (23 mẫu), Braxin (25 mẫu) và tại địa phương

là Nigieria (11 mẫu) bằng chỉ thị isozyme cho thấy có 97 band protein –isozyme khác nhau ở các dòng điều

Về nghiên cứu cây điều bằng các kỹ thuật sinh học phân tử đã có các công trình sau:

Samal và ctv (2003) đã phân tích mối quan hệ di truyền giữa những quần thể của điều bằng kỹ thuật RAPD với 40 primer Kết quả đã chọn ra 11 primer cho tính

đa hình cao và phân biệt được mối tương quan di truyền giữa 20 giống điều nghiên cứu

Sunil Archak và ctv (2003) đã nghiên cứu DNA đặc trưng của các giống điều

Ấn Độ bằng kỹ thuật RAPD và ISSR Với 5 primer dùng trong kỹ thuật RAPD và 4 primer dùng trong ISSR đã đánh giá được mối tương quan di truyền của 35 giống điều khảo sát

Cùng năm 2003, Sunil Archak và ctv đã công bố nghiên cứu phân tích đa dạng

di truyền trên cây điều Ấn độ bằng các phương pháp khác nhau trong sinh học phân

tử Cụ thể: với 50 primer RAPD, 12 primer ISSR và 6 primer AFLP nghiên cứu so sánh trên cùng 19 giống điều Ấn độ đã chỉ rõ AFLP là kỹ thuật thích hợp trong nghiên cứu, đánh giá tính đa dạng di truyển của quần thể điều

Nghiên cứu của Cavalcanti và Wilkisnon (2007) bằng chỉ thị AFLP và SSR đã xây dựng được bản đồ di truyền đầu tiên của cây điều

2.6.2 Nghiên cứu trong nước

Về nghiên cứu các giải pháp khoa học công nghệ để nâng cao năng suất và chất lượng hạt điều, theo kêt quả điều tra của Viện NC Nông Nghiệp DHNTB: trong sản xuất có những vườn điều thâm canh đạt năng suất từ 2 – 2,5 tấn hạt/ha như một số hộ ở Đức Linh, Bình Thuận.Tuy nhiên phần lớn diện tích sản xuất điều

ở VN còn mang tính quảng canh, không đầu tư chăm sóc và chưa thực hiện công tác chọn giống do đó không phát huy hết tiềm năng năng suất cũng như hiệu quả kinh

tế của cây điều để phục vụ cho xuất khẩu và tiêu dùng nội địa (Tạ Minh Sơn, 2000)

Theo Phạm Văn Biên (2000), bằng phương pháp đánh giá chọn tạo khác nhau, các đơn vị nghiên cứu thuộc Viện Khoa học kỹ thuật nông nghiệp Việt Nam

đã chọn tạo được một số dòng điều năng suất cao như: ĐDH 67 -15, ĐDH 66 – 14 của Viện Nghiên cứu NN Duyên hải Nam trung bộ, BO1, PN1, CH1 của Viện KHKTNN miền Nam, KP11, BĐ01 của Viện KHKTNLN Tây Nguyên có tiềm năng năng suất đạt trên 3 tấn/ha Bên cạnh đó các đơn vị vẫn còn đang trong giai đoạn tiếp tục nghiên cứu để xác định được nhiều dòng, giống điều tốt hơn nhằm phục vụ cho sản xuất

Về nghiên cứu sử dụng chỉ thị DNA để đánh giá đa dạng di truyền cây điều tại Việt nam có các công trình sau:

Phạm Văn Bình (2005) sử dụng kỹ thuật RAPD với 4 primer nghiên cứu tính

đa dạng di truyền của quần thể điều trồng tại tỉnh Ninh Thuận trong đó có 1 primer

có tính đa hình cao đối với quần thể Ngoài ra, nghiên cứu cũng tiến hành theo

phương pháp AFLP và kết luận 2 tổ hợp primer MseI-CAA với EcoRI-ACT và

MseI-CAA với EcoRI-AGG cho tính đa hình cao, có thể được dùng để đánh giá tính

đa dạng của quần thể điều

Nguyễn Quỳnh Anh (2005) khi đánh giá đa dạng di truyền quần thể điều tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu bằng kỹ thuật RAPD đã nhận định quần thể điều tại tỉnh này có mức độ tương đồng về di truyền khá cao, mức độ tập trung giống khá cao vì vậy rất thuận lợi cho công tác phân loại giống Với kỹ thuật AFLP, theo đánh giá sơ

bộ có 4 primer tổ hợp nhân bản cho nhiều band với mức độ xuất hiện đa hình cao

Hồ Bích Liên (2006) đã sử dụng kỹ thuật AFLP với 7 tổ hợp primer để đánh giá tính đa dạng di truyền một số giống điều trồng tại khu vực Đông Nam bộ đồng thời phát hiện được 17 chỉ thị phân tử có khả năng nhận diện được 17 mẫu diều trong số 26 mẫu điều phân tích

Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian, địa điểm và nội dung nghiên cứu

3.1.3 Nội dung nghiên cứu

- Thu thập dữ liệu về đặc tính sinh trưởng và phát triển của các dòng điều năng suất cao được lập làm nguồn quỹ gen tại Vườn điều giống quốc gia Cát Hiệp, Phù Cát, Bình Định và lựa chọn các dòng làm vật liệu nghiên cứu

- Tối ưu phương pháp ly trích DNA tổng số từ mẫu lá tươi cho độ tinh sạch

3.2 Vật liệu, thiết bị và hóa chất thí nghiệm

3.2.1 Vật liệu nghiên cứu

Hai mươi ba dòng điều được đánh giá có năng suất cao, chất lượng tốt với những cặp tính trạng khác nhau thu thập tại Vườn Điều giống Quốc gia Cát Hiệp, Phù Cát, Bình Định