LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP CHẨN ĐOÁN PHÂN BIỆT VIRUS CHỦNG VACCINE NHƯỢC ĐỘC VÀ THỰC ĐỊA GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP TRÊN HEO (PRRS)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP CHẨN ĐOÁN PHÂN BIỆT VIRUS CHỦNG VACCINE NHƯỢC ĐỘC VÀ THỰC ĐỊA GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP TRÊN HEO (PRRS) MỤC LỤC CHƯƠNG TRANG Trang tựa Trang Chuẩn Y ......................................................................................... i LÝ LỊCH CÁ NHÂN .............................................................................. ii LỜI CAM ĐOAN .................................................................................. iii LỜI CẢM ƠN ........................................................................................ iv TÓM TẮT ............................................................................................... v SUMMARY ........................................................................................... vi MỤC LỤC ............................................................................................ vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ................................................... x DANH SÁCH CÁC BẢNG ................................................................... xi DANH SÁCH CÁC HÌNH ................................................................... xii Chương 1. Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề............................................................................................................... 1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................... 2 1.3 Mục đích nghiên cứu .............................................................................................. 2 Chương 2. Tổng quan tài liệu 2.1 Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS) ............................................ 3 2.1.1 Lịch sử phát hiện bệnh .................................................................................. 3 2.1.2 Đặc điểm bệnh ............................................................................................... 4 2.1.3 Virus PRRS ................................................................................................... 5 2.1.3.1 Phân loại ................................................................................................. 5 2.1.3.2 Kích thước và hình thái học ................................................................... 6 2.1.3.3 Cấu trúc gen ........................................................................................... 7 2.1.3.4 Sự khác biệt về trình tự giữa genotype châu Âu và genotype Bắc Mỹ ....... 8 2.1.3.5 Sự biến đổi của dòng virus PRRS Trung Quốc ..................................... 9 2.1.3.6 Virus PRRS vaccine ............................................................................. 11 viii 2.1.4 Vaccine phòng bệnh do virus PRRS .......................................................... 13 2.1.5 Tình hình tiêm phòng vaccine PRRS ở Việt Nam ...................................... 15 2.2 Các phương pháp chẩn đoán bệnh PRRS ............................................................. 16 2.2.1 Phương pháp phát hiện kháng thể trong huyết thanh .................................. 16 2.2.2 Phương pháp RTPCR ................................................................................. 17 2.2.3 Phương pháp RFLP ..................................................................................... 18 2.2.4 Phương pháp phân tích trình tự................................................................... 18 2.3 Lược duyệt các công trình nghiên cứu liên quan đến PRRSV ở nước ngoài ....... 19 2.4 Lược duyệt các công trình nghiên cứu liên quan đến PRRSV ở trong nước ....... 21 Chương 3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành ............................................................................ 23 3.1.1 Thời gian ....................................................................................................... 23 3.1.2 Địa điểm ........................................................................................................ 23 3.2 Nội dung nghiên cứu ............................................................................................. 23 3.3 Vật liệu và hóa chất ............................................................................................... 23 3.3.1 Nguồn mẫu .................................................................................................... 23 3.3.2 Hóa chất ......................................................................................................... 25 3.3.2.1 Hóa chất để tách chiết RNA.................................................................. 25 3.3.2.2 Hóa chất trong phản ứng RT PCR ....................................................... 25 3.3.2.3 Hóa chất điện di .................................................................................... 25 3.3.2.4 Hóa chất để tinh sạch sản phẩm RTPCR ............................................. 25 3.3.2.5 Hóa chất dùng trong RFLP ................................................................... 25 3.3.3 Thiết bị và dụng cụ........................................................................................ 26 3.4 Phương pháp nghiên cứu: ................................................................................... 26 3.4.1 Xác định mẫu dương tính với PRRSV bằng kỹ thuật RTPCR .................... 26 3.4.1.1 Ly trích RNA từ huyết thanh ................................................................ 26 3.4.1.2 Khuếch đại gen ORF7 ........................................................................... 26 3.4.2 Phân biệt virus PRRS thực địa và virus PRRS vaccine bằng kỹ thuật RT PCR RFLP trên đoạn ORF5. .............................................................. 27 3.4.2.1 Khuếch đại gen ORF5 .......................................................................... 28 ix 3.4.2.2 Tinh sạch sản phẩm RTPCR ................................................................ 29 3.4.2.3 Phân tích RFLP ..................................................................................... 29 3.4.3 Thiết lập cây sinh dòng dựa trên trình tự ORF5 của các chủng PRRSV ...... 30 3.4.3.1 Giải trình tự gen ORF5 ........................................................................ 30 3.4.3.2 Phân tích trình tự nucleotide, thiết lập cây sinh dòng .......................... 31 Chương 4. Kết quả và thảo luận 4.1 Xác định mẫu dương tính với PRRSV bằng kỹ thuật RTPCR ......................... 33 4.2 Phân biệt virus thực địa và virus vaccine bằng kỹ thuật RTPCRRFLP trên đoạn ORF5 .......................................................................................................... 34 4.2.1 Khuếch đại vùng ORF5 của genotype châu Âu ............................................ 34 4.2.2 Khuếch đại vùng ORF5 của genotype Bắc Mỹ............................................. 36 4.2.3 Phân tích RFLP ............................................................................................. 36 4.2.3.1 Phân tích RFLP của các chủng PRRSV thuộc genotype châu Âu ...... 37 4.2.3.2 Phân tích RFLP của các chủng PRRSV thuộc genotype Bắc Mỹ ....... 42 4.3 Phân tích đa dạng di truyền dựa trên vùng ORF5 ............................................... 45 4.4 Giả thuyết nguồn gốc của các chủng PRRSV tại Tp.HCM, Bà Rịa – Vũng Tàu và Đồng Nai ......................................................................................................... 51 Chương 5. Kết luận và đề nghị 5.1 Kết luận .............................................................................................................. 53 5.2 Đề nghị.................................................................................................... 53 Tài liệu tham khảo ......................................................................................... 55 Phụ lục ............................................................................................................. 63

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

….W U X…

ĐẶNG NGỌC THÙY DƯƠNG

CHẨN ĐOÁN PHÂN BIỆT VIRUS CHỦNG VACCINE NHƯỢC ĐỘC VÀ THỰC ĐỊA GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH

SẢN VÀ HÔ HẤP TRÊN HEO (PRRS)

Chuyên ngành : Công Nghệ Sinh Học

CHẨN ĐOÁN PHÂN BIỆT VIRUS CHỦNG VACCINE NHƯỢC ĐỘC VÀ THỰC ĐỊA GÂY HỘI CHỨNG

RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP

TRÊN HEO (PRRS) ĐẶNG NGỌC THÙY DƯƠNG

Hội đồng chấm luận văn:

1 Chủ tịch: PGS.TS TRẦN ĐÌNH TỪ

Hội Thú y Việt Nam

2 Thư ký: TS NGUYỄN ĐÌNH QUÁT Trường Đại học Nông Lâm TP HCM

3 Phản biện 1: TS NGUYỄN TẤT TOÀN Trường Đại học Nông Lâm TP HCM

4 Phản biện 2: PGS.TS TRẦN THỊ DÂN

Hội Thú y Việt Nam

5 Ủy viên: PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẢI Trường Đại học Nông Lâm TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

HIỆU TRƯỞNG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các

số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả luận văn,

Đặng Ngọc Thùy Dương

* Các anh chị phòng huyết thanh, chi cục Thú Y Tp.HCM

* Các bạn bè và người thân đã luôn quan tâm động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Chân thành cảm ơn, Đặng Ngọc Thùy Dương

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu “Chẩn đoán phân biệt virus chủng vaccine nhược độc

và thực địa gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (PRRS)” được

tiến hành tại Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM từ tháng 7/2008 – 8/2009 Đề tài được thực hiện với 3 nội dung nghiên cứu nhằm xây dựng phương pháp phân biệt virus PRRS thực địa và virus PRRS vaccine nhược độc để phục vụ cho công tác phòng chống dịch bệnh và nghiên cứu

sự đa dạng di truyền của PRRSV Các kết quả thu được như sau:

Quy trình RT-PCR phát hiện các chủng virus PRRS khác nhau dựa vào vùng ORF7 đã xác định được 12 mẫu dương tính với PRRSV trong tất cả 18 mẫu khảo sát Cặp primer P71/P72 tham khảo Murtaugh và Elam (1996) cho phép xác định dương tính PRRSV với cả 2 genotype Bắc Mỹ và châu Âu trong điều kiện thí nghiệm

Phương pháp RT-PCR-RFLP dựa trên đoạn ORF5 đã được ứng dụng thành công để chẩn đoán phân biệt 11 chủng virus PRRS thực địa và PRRS vaccine Cả 4

loại enzyme MluI, HincII, SacII và HaeIII đều có thể sử dụng riêng lẻ để phân biệt

virus PRRS thực địa và virus PRRS vaccine thuộc genotype Bắc Mỹ Phân tích

RFLP bằng phần mềm Chromas Pro cho thấy sự kết hợp các enzyme PstI, HaeII, HincII hay ClaI, HaeII, HincII sẽ có thể giúp phân biệt virus PRRS vaccine với

virus PRRS thực địa thuộc genotype châu Âu dựa trên ORF5

Phân tích đa dạng di truyền dựa vào cây sinh dòng được xây dựng trên kết quả giải trình tự vùng ORF5 của 12 chủng PRRSV xác định được trong nghiên cứu bằng phần mềm MEGA 4.1 và DNAStar Dựa trên ORF5, 12 mẫu virus PRRS xác định được đều thuộc genotype Bắc Mỹ, không có mẫu thuộc genotype châu Âu Các chủng này nằm cùng nhóm với các chủng độc lực cao của Trung Quốc và chủng 07QN đã được phân lập tại Việt Nam 2007 với độ tương đồng di truyền ở mức 98 – 98,7 % và có khác biệt với chủng virus PRRS vaccine nhược độc Besta hiện đang được sử dụng tại Việt Nam với độ tương đồng di truyền ở mức 85,9 –

SUMMARY

Research project “Differentiation of a porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccine strain from field isolates by restriction fragment length polymorphism analysis of ORF5” was carried out at Institute of

Biotechnology & Environment, Nong Lam University Ho Chi Minh city from 7/2008 to 8/2009 The project was aimed to distinguish a PRRSV MLV-vaccine from PRRSV field isolates by RT-PCR-RFLP analysis of ORF5 and to study genetic variation of ORF5 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates

The results were summarized as follows:

12 field isolates and 2 MLV-vaccine could be detected by RT-PCR when primers from ORF7 were used for amplification These primers could detect both

NA genotype and EU genotype

RT-PCR-RFLP analysis for differentiating a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) vaccine strain from isolated strains was succeeded ORF5 was amplified for each genotype The restriction enzymes such as

MluI, HincII, SacII, HaeIII were used to cut NA genotype and none of the field

isolated had a similar cutting pattern when compared to modified live virus vaccine

Using Chromas Pro for RFLP analysis, combining PstI, HaeII, HincII or ClaI, HaeII, HincII could help to differentiate a PRRSV vaccine strain from EU isolated

strains

Twelve isolates of PRRSV were studied and compared with several PRRSV isolates from other countries Phylogenetic analysis showed that all isolates of PRRSV in this study belong to the NA genotype Sequence analysis revealed that these isolates shared a close relationship with high virulent of Chinese PRRSV in

2006 and 07QN isolated in Quang Nam, VietNam (98 – 98,7 %) However, these twelve isolates shared only 85,9 – 86,7 % nucleotide sequence identities with that of

MỤC LỤC

CHƯƠNG TRANG

Trang tựa

Trang Chuẩn Y i

LÝ LỊCH CÁ NHÂN ii

LỜI CAM ĐOAN iii

LỜI CẢM ƠN iv

TÓM TẮT v

SUMMARY vi

MỤC LỤC vii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT x

DANH SÁCH CÁC BẢNG xi

DANH SÁCH CÁC HÌNH xii

Chương 1 Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Mục đích nghiên cứu 2

Chương 2 Tổng quan tài liệu 2.1 Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS) 3

2.1.1 Lịch sử phát hiện bệnh 3

2.1.2 Đặc điểm bệnh 4

2.1.3 Virus PRRS 5

2.1.3.1 Phân loại 5

2.1.3.2 Kích thước và hình thái học 6

2.1.3.3 Cấu trúc gen 7

2.1.3.4 Sự khác biệt về trình tự giữa genotype châu Âu và genotype Bắc Mỹ 8

2.1.3.5 Sự biến đổi của dòng virus PRRS Trung Quốc 9

2.1.4 Vaccine phòng bệnh do virus PRRS 13

2.1.5 Tình hình tiêm phòng vaccine PRRS ở Việt Nam 15

2.2 Các phương pháp chẩn đoán bệnh PRRS 16

2.2.1 Phương pháp phát hiện kháng thể trong huyết thanh 16

2.2.2 Phương pháp RT-PCR 17

2.2.3 Phương pháp RFLP 18

2.2.4 Phương pháp phân tích trình tự 18

2.3 Lược duyệt các công trình nghiên cứu liên quan đến PRRSV ở nước ngoài 19

2.4 Lược duyệt các công trình nghiên cứu liên quan đến PRRSV ở trong nước 21

Chương 3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành 23

3.1.1 Thời gian 23

3.1.2 Địa điểm 23

3.2 Nội dung nghiên cứu 23

3.3 Vật liệu và hóa chất 23

3.3.1 Nguồn mẫu 23

3.3.2 Hóa chất 25

3.3.2.1 Hóa chất để tách chiết RNA 25

3.3.2.2 Hóa chất trong phản ứng RT- PCR 25

3.3.2.3 Hóa chất điện di 25

3.3.2.4 Hóa chất để tinh sạch sản phẩm RT-PCR 25

3.3.2.5 Hóa chất dùng trong RFLP 25

3.3.3 Thiết bị và dụng cụ 26

3.4 Phương pháp nghiên cứu: 26

3.4.1 Xác định mẫu dương tính với PRRSV bằng kỹ thuật RT-PCR 26

3.4.1.1 Ly trích RNA từ huyết thanh 26

3.4.1.2 Khuếch đại gen ORF7 26

3.4.2 Phân biệt virus PRRS thực địa và virus PRRS vaccine bằng kỹ thuật

3.4.2.2 Tinh sạch sản phẩm RT-PCR 29

3.4.2.3 Phân tích RFLP 29

3.4.3 Thiết lập cây sinh dòng dựa trên trình tự ORF5 của các chủng PRRSV 30

3.4.3.1 Giải trình tự gen ORF5 30

3.4.3.2 Phân tích trình tự nucleotide, thiết lập cây sinh dòng 31

Chương 4 Kết quả và thảo luận 4.1 Xác định mẫu dương tính với PRRSV bằng kỹ thuật RT-PCR 33

4.2 Phân biệt virus thực địa và virus vaccine bằng kỹ thuật RT-PCR-RFLP trên đoạn ORF5 34

4.2.1 Khuếch đại vùng ORF5 của genotype châu Âu 34

4.2.2 Khuếch đại vùng ORF5 của genotype Bắc Mỹ 36

4.2.3 Phân tích RFLP 36

4.2.3.1 Phân tích RFLP của các chủng PRRSV thuộc genotype châu Âu 37

4.2.3.2 Phân tích RFLP của các chủng PRRSV thuộc genotype Bắc Mỹ 42

4.3 Phân tích đa dạng di truyền dựa trên vùng ORF5 45

4.4 Giả thuyết nguồn gốc của các chủng PRRSV tại Tp.HCM, Bà Rịa – Vũng Tàu và Đồng Nai 51

Chương 5 Kết luận và đề nghị 5.1 Kết luận 53

5.2 Đề nghị 53

Tài liệu tham khảo 55

Phụ lục 63

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

aa: amino acid

EAV: Equine Arteritis Virus

ELISA: Enzyme Linked-Immunosorbent Assay

EU: Europe

E: Envelope

GP: Glycoprotein

IFA: Indirect Immunofluorescent Antibody

IMPA: Immunoperoxidase Monolayer Assay

LDV: Lactate Dehydrogenase Virus

PEARS: Porcine Epidemic and Respiratory Syndrome

PRRS: Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome

PRRSV: Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

RE: Restriction Enzyme

RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism

RFS: Ribosomal frame shifting

RT-PCR: Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction

S/P: Sample/Positive

SHFV: Simian Hemorrhagic Fever Virus

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 So sánh trình tự vùng ORF2 – ORF7 của virus PRRS vaccine với

virus PRRS gốc và 16 chủng phân lập 12

Bảng 3.1 Các chủng virus PRRS trong nghiên cứu 24

Bảng 3.2 Primer sử dụng để khuếch đại vùng ORF5 28

Bảng 3.3 Các chủng virus PRRS được giải trình tự 31

Bảng 3.4 Các chủng virus PRRS tham khảo trên thế giới 32

Bảng 4.1 Vị trí nu các enzyme cắt phân tích bằng phần mềm Chromas Pro 38

Bảng 4.2 Vị trí nu các enzyme cắt phân tích bằng phần mềm Chromas Pro 40

Bảng 4.3 Mã hóa code các enzyme 41

Bảng 4.4 Tổng hợp kiểu RFLP của các chủng virus PRRS genotype châu Âu 41

Bảng 4.5 ORF5 RFLP code của các chủng PRRSV xác định được 44

DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH TRANG

Hình 2.1 Cây sinh dòng của các chủng PRRSV từ các quốc gia khác nhau 6

Hình 2.2 Mô hình các protein cấu trúc PRRSV 7

Hình 2.3 Cấu tạo bộ gen của PRRSV 8

Hình 3.1 Sơ đồ các bước thực hiện để phân biệt chủng virus PRRS vaccine và virus PRRS thực địa bằng kỹ thuật RT-PCR-RFLP 30

Hình 4.1 Sản phẩm khuếch đại vùng ORF7 33

Hình 4.2 Sản phẩm khuếch đại vùng ORF5 genotype châu Âu 35

Hình 4.3 Sản phẩm khuếch đại vùng ORF5 genotype Bắc Mỹ 36

Hình 4.4 Kết quả phân tích RFLP vaccine Porcillis 37

Hình 4.5 Kết quả phân tích RFLP vaccine Porcillis 39

Hình 4.6 Kết quả phân tích RFLP genotype Bắc Mỹ 42

Hình 4.7 Sự thay đổi aa vị trí 137 43

Hình 4.8 Cây sinh dòng của virus PRRS dựa trên vùng ORF5 48

Hình 4.9 Cây sinh dòng của virus PRRS dựa trên vùng ORF5 49

tiên ở Mỹ vào năm 1987 (Keffaber, 1989; Hill, 1990) và ở châu Âu, châu Á vào

đầu những năm 90 của thế kỷ 20 , hội chứng này đã nhanh chóng phát triển thành dịch ở nhiều nơi trên khắp thế giới (Meredith, 1995)

Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện vào năm 1997 trên đàn heo nhập từ Mỹ (Phòng dịch tễ, Cục thú y Việt Nam) Từ đó, PRRSV đã nhanh chóng lây lan và nhiều lần bùng phát thành dịch, gây ảnh hưởng rất nghiêm trọng đến ngành chăn nuôi và đời sống của hàng ngàn hộ dân Việt Nam

Để phòng bệnh, vaccine nhược độc đã được sử dụng Đây là loại vaccine sống nên khi vào cơ thể heo, virus được nhân lên và tồn tại trong nhiều tuần, thậm chí trong vài tháng (Mengeling và ctv, 1996) Các kỹ thuật phát hiện virus hiện có ở

VN như ELISA hay RT-PCR vẫn chưa có khả năng phân biệt được virus PRRS trên heo có nguồn gốc từ virus vaccine hay virus thực địa Vì vậy, cần phải có một phương pháp giúp xác định được virus trên heo có nguồn gốc từ loại virus nào để kiểm soát dịch bệnh hữu hiệu hơn, từ đó nâng cao hiệu quả quản lý phòng dịch ở cấp độ vĩ mô

Nghiên cứu “Chẩn đoán phân biệt virus chủng vaccine nhược độc và thực địa gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (PRRS)” được tiến hành nhằm xây dựng phương pháp phân biệt virus PRRS thực địa và virus PRRS vaccine

cứu cũng tìm hiểu sự biến đổi nếu có của các chủng virus PRRS trong mẫu khảo sát qua việc phân tích sự phát sinh loài của các chủng PRRSV thực địa

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định quy trình RT-PCR phát hiện các genotype virus PRRS khác nhau

- Phân biệt virus PRRS vaccine và virus PRRS thực địa bằng kỹ thuật PCR-RFLP

RT Phân tích đa dạng di truyền và biến chủng dựa vào kết quả giải trình tự ORF5 của virus PRRS thu nhận từ các loại mẫu khảo sát

1.3 Mục đích nghiên cứu

- Phân biệt được heo chủng ngừa PRRSV và heo nhiễm PRRSV thực địa góp phần nâng cao hiệu quả quản lý phòng chống dịch bệnh

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở heo (PRRS)

2.1.1 Lịch sử phát hiện bệnh

Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp (Porcine reproductive and respiratory syndrome – PRRS) được ghi nhận lần đầu tiên ở Hoa Kỳ trước khi lan rộng khắp Bắc Mỹ vào năm 1987 (Keffaber, 1989; Hill, 1990) Vào thời điểm này, bệnh được gọi là “bệnh bí ẩn trên heo” vì tác nhân gây bệnh chưa được xác định Cuối năm

1990, trận dịch PRRS đầu tiên ở châu Âu đã nổ ra tại Đức và nhanh chóng lan ra khắp châu Âu sau đó Giữa tháng 1 năm 1991, bệnh được ghi nhận ở Hà Lan trên đàn heo giống, và đến cuối tháng 3 cùng năm, bệnh đã lan rộng khắp các trang trại nuôi heo (Meredith, 1995) Ở châu Á, trận dịch PRRS đầu tiên xuất hiện ở Nhật vào năm 1988 và được ghi nhận ở Đài Loan năm 1991 Như vậy, đến năm 1994, hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp đã chính thức xuất hiện ở 16 nước và rộng khắp ở cả

3 châu lục: châu Mỹ, châu Á, và châu Âu

Tại châu Âu, vào năm 1991, tác nhân gây ra hội chứng PRRS đã lần đầu tiên được phân lập trên đại thực bào bởi Wensvoort và cộng sự, và được gọi là virus Lelystad (LV) Ngay sau đó, năm 1992 tại Mỹ, virus gây bệnh (ATCC VR-2332) cũng đã được phân lập bởi Collins và cộng sự và được định danh là virus gây hội chứng vô sinh và hô hấp trên heo (swine infertility and respiratory syndrome (SIRS) virus) Đến tháng 9 – 2006, bệnh này đã xảy ra đại dịch ở Trung Quốc làm hàng triệu heo bị mắc bệnh và trong trận dịch này đã phát hiện sự biến chủng của virus thành chủng độc lực cao, có khả năng lây lan và gây chết rất nhanh trên heo

Từ khi xuất hiện, bệnh này đã được gọi nhiều tên khác nhau như: bệnh bí ẩn

và hô hấp trên heo (PEARS), bệnh heo tai xanh Tuy nhiên, đến năm 1992, tại hội nghị quốc tế về bệnh này ở St Paul, Minnessota, Tổ chức dịch tễ thế giới (OIE) đã nhất trí sử dụng tên chung của bệnh này là “hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp ở heo” (porcine reproductive and respiratory syndrome – PRRS)

2.1.2 Đặc điểm bệnh

Đầu tiên, PRRS bùng nổ trên thế giới với mức tàn phá dữ dội như gây sẩy thai hàng loạt ở heo nái hay triệu chứng hô hấp trên heo con Heo ở mọi lứa tuổi đều có thể mắc bệnh Bệnh rõ hơn trên heo nái mang thai, nái nuôi con, heo con theo mẹ và tăng trưởng khi bệnh xâm nhập vào đàn lần đầu tiên

Heo có thể cảm nhiễm qua đường miệng, mũi, sinh dục hay thông qua tiêm bắp, tiêm phúc mạc Khả năng gây bệnh của virus này rất cao, thí nghiệm đã chứng minh chỉ cần 10 virion là có thể gây nhiễm cho heo qua đường mũi hoặc tiêm bắp (Straw và ctv, 1999)

Trên heo nhiễm bệnh và chết, tất cả các phủ tạng đều có độc lực Máu chứa virus rất sớm, trong vòng 12 – 24 giờ sau khi nhiễm Hạch amidan và hạch bạch huyết chứa nhiều virus vì đây vốn là nơi nhân lên đầu tiên của virus PRRS Virus có thể tồn tại trong vùng miệng hầu họng đến vài tháng sau khi nhiễm

Sau khi virus vào cơ thể, có sự bài thải virus qua nước bọt, nước tiểu và tinh dịch Sự bài thải virus qua phân cũng được ghi nhận nhưng được xem là không liên tục Bởi vì virus PRRS có thể gây ra tình trạng mang trùng và nhiễm dai dẳng nên cần phải lưu ý sự thải virus sau nhiễm Sự thải virus có thể diễn ra trong 2 – 3 tháng sau đó

Do virus tồn tại ở vùng hầu – họng rất lâu sau khi nhiễm nên các chất tiết vùng mũi, miệng đóng vai trò quan trọng trong việc truyền bệnh Sự truyền ngang

do tiếp xúc “từ mõm sang mõm” là con đường truyền lây phổ biến Bệnh có thể lây lan qua vết cắn, đó là hành vi thường xảy ra trên đàn heo có heo mới nhập đàn

Nhìn chung, do khả năng truyền lây của virus PRRS tương đối mạnh nên khi không có biện pháp quản lý phòng ngừa bệnh tốt thì bệnh sẽ bùng nổ và gây thiệt hại lớn về mặt kinh tế

2.1.3 Virus PRRS

2.1.3.1 Phân loại

Virus gây ra hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp trên heo thuộc giống

Arterivirus, họ Arteriviridae và bộ Nidovirales Những virus thuộc nhóm họ Arteriviridae bao gồm EAV (equine arteritis virus) gây viêm động mạch ngựa, LDV

(lactate dehydrogenase elevating virus) gây tăng enzyme khử hydro của lactate trên chuột và SHFV (simian hemorrhagic fever virus) gây sốt xuất huyết ở khỉ Những virus thuộc họ này có những đặc điểm chung sau:

(1) Gây nhiễm dai dẳng, không có biểu hiện triệu chứng và thường gây chết (Plagemann và Moenning, 1992)

(2) Có khả năng xâm nhiễm và nhân lên trong đại thực bào (Plagemann và Moenning, 1992)

(3) Có khả năng biến đổi gen rất lớn (Chang và ctv, 2002)

Các chủng virus PRRS phân lập được cho thấy PRRSV có quan hệ gần về mặt sinh học, cấu trúc, và về gen với LDV hơn là EAV (Meulenberg và ctv, 1993; Meng và ctv, 1995) Những nghiên cứu về kháng thể đơn dòng và đa dòng đã chứng minh được giữa virus PRRS ở Bắc Mỹ và châu Âu có sự khác nhau về kháng nguyên (Drew và ctv, 1995; Magar và ctv, 1997) và thậm chí giữa những chủng PRRSV Bắc Mỹ phân lập được cũng có sự khác nhau (Magar và ctv, 1995) Hơn nữa, những nghiên cứu về trình tự cũng cho thấy những chủng phân lập ở Bắc Mỹ và

ở châu Âu đã chia làm 2 nhánh riêng biệt Do đó, hiện nay PRRSV được chia làm 2 genotype:

¾ Genotype châu Âu (EU)

¾ Genotype Bắc Mỹ (NA)

Theo Mardassi và ctv (1994) và Meng và ctv (1995), sự tương đồng về trình

tự nucleotide giữa virus thuộc genotype châu Âu và genotype Bắc Mỹ chỉ khoảng

67 %

2.1.3.2 Kích thước và hình thái học

Virus PRRS là một RNA virus, có vỏ bọc với đường kính 50 – 65 nm, bề mặt nhẵn, và lõi nucleocapsid hình khối với đường kính 25 – 35 nm Trong đại thực bào của phổi heo, virus PRRS hình cầu, kích thước 45 – 65 nm, lõi capsid 30 – 35

nm và màng kép lipid trơn láng bao bọc bên ngoài

PRRSV- NA

Đức Lelystad virus Lithuania

Châu Á Bắc Mỹ Chủng Bắc Mỹ (PRRSV-NA)

Chủng Châu Âu (PRRSV- EU)

Hình 2.1: Cây sinh dòng của các chủng PRRSV từ các nước khác nhau (xây

dựng dựa trên vùng ORF5)(www.porcilis-prrs.com/images/virus-structure.jpg)

PRRSV- NA

Đức Lelystad virus Lithuania

Châu Á Bắc Mỹ Chủng Bắc Mỹ (PRRSV-NA)

Chủng Châu Âu (PRRSV- EU)

Hình 2.1: Cây sinh dòng của các chủng PRRSV từ các nước khác nhau (xây

dựng dựa trên vùng ORF5)(www.porcilis-prrs.com/images/virus-structure.jpg)

Genotype châu Âu

Genotype Bắc Mỹ

Hình 2.1: Cây sinh dòng của các chủng PRRSV từ các quốc gia khác nhau

(dựa trên vùng ORF5) (www.porcillis-PRRS.com/images/virus-structure.jpg)

Hình 2.2: Mô hình các protein cấu trúc PRRSV

Hình 2.2: Mô hình các protein cấu trúc PRRSV

(www.porcilis-prr.com/pathogenesis-PRRS.asp)

2.1.3.3 Cấu trúc gen

Bộ gen của virus PRRS cũng tương tự như các Arterivirus khác về mặt tổ

chức (Snijder và Meulenberg, 1998) RNA virus có chiều dài 15,1 kb, dạng thẳng, 1 mạch Bộ gen chứa 9 vùng ORF mã hóa cho những protein đặc hiệu của virus

ORF1a và ORF1b chiếm 75 % bộ gen (12 kb tính từ đầu 5’) và mã hóa cho protein không cấu trúc (nsp) Những protein từ hai vùng này sẽ tham gia vào quá trình chuyển hóa để tạo thành 12 protein nhỏ hơn nhờ protease do virus tạo ra Chức năng chính xác của các protein này vẫn chưa được hiểu hết, chỉ biết rằng chúng liên quan đến việc mã hóa RNA và dịch mã

Bảy vùng ORF nhỏ còn lại (ORF2 – ORF7) nằm ở đầu cuối 3’ của bộ gen và

mã hóa cho những protein cấu trúc (Dee và Joo, 1994; Dea và ctv, 2000) Protein nucleocapsid (N) được mã hóa ở vùng ORF7 và protein màng (M) được mã hóa ở vùng ORF6 là các protein không được glycosyl hóa Ngược lại, GP2a (mã hóa bởi ORF 2a), GP3 (mã hóa bởi ORF 3), GP4 (mã hóa bởi ORF 4), và GP5 (mã hóa bởi ORF5) là những protein được glycosyl hóa Gần đây, phát hiện thêm một protein mới được mã hóa bởi một vùng nằm trong đoạn ORF2 (được gọi là vùng ORF2b)

Hình 2.2: Mô hình các protein cấu trúc PRRSV

(www.porcilis-prr.com/pathogenesis-PRRS.asp)

Vùng ORF2b này mã hóa cho một protein nhỏ không glycosyl hóa, được gọi là protein 2b ở PRRSV và protein E ở EAV (Snijder và ctv, 1999; Wu và ctv, 2001)

Gen mã hóa RNA polymerase Các gen cấu trúc

Trong đó: Nsp 1- 12 : Protein không cấu trúc (ORF1a, ORF1b)

GP 2, GP3, GP4: Protein màng – Glycoprotein (ORF2a, ORF3, ORF4)

E (GP5) : Protein của vỏ ngoài (ORF5)

M : Protein gian màng (ORF6)

N : Protein của capsid (ORF7)

Hình 2.3: Cấu tạo bộ gen của PRRSV

(www.porcilis-prr.com/pathohenesis-PRRS.asp)

Gen mã hóa RNA polymerase Các gen cấu trúc

Trong đó: Nsp 1- 12 : Protein không cấu trúc (ORF1a, ORF1b)

GP 2, GP3, GP4: Protein màng – Glycoprotein (ORF2a, ORF3, ORF4)

E (GP5) : Protein của vỏ ngoài (ORF5)

M : Protein gian màng (ORF6)

N : Protein của capsid (ORF7)

Hình 2.3: Cấu tạo bộ gen của PRRSV

(www.porcilis-prr.com/pathohenesis-PRRS.asp)

2.1.3.4 Sự khác biệt về trình tự giữa genotype châu Âu và genotype Bắc Mỹ

Những nghiên cứu về trình tự virus hai genotype châu Âu và Bắc Mỹ cho thấy chúng ít tương đồng về trình tự nucleotide và amino acid (Suarez và ctv, 1996; Nelsen và ctv, 1999; Allende và ctv, 1999) Protein GP5 (do vùng ORF5 mã hóa) là protein có cấu trúc thay đổi nhiều nhất, chỉ khoảng 51 – 55 % trình tự amino acid

(www.porcilis-prr.com/pathogenesis-PRRS.asp)

3’ ORF 1a

ORF 1b

Hình 2.3: Cấu tạo bộ gen của PRRSV

(www.porcillis-prr.com/pathogenesis-PRRS.asp)

giống nhau giữa hai genotype, trong khi đó protein M (do vùng ORF6 mã hóa) có cấu trúc ổn định nhất, với sự tương đồng giữa khoảng 78 – 81 %

So sánh chi tiết trình tự nucleotide trên vùng ORF1 của virus Lelystad (LV)

ở châu Âu và 2 chủng virus thuộc genotype Bắc Mỹ (Allende và ctv, 1999) đã cho thấy nhiều khác biệt trong vùng gen này, đặc biệt là các khác biệt nằm trên nsp2 (protein không cấu trúc 2) Protein nsp2 của genotype Bắc Mỹ dài hơn nsp2 của LV khoảng 102 amino acid, hơn nữa, trình tự amino acid tương đồng giữa 2 genotype

này chỉ đạt khoảng 32 %

2.1.3.5 Sự biến đổi của dòng virus PRRS Trung Quốc

Trong những năm gần đây, dòng virus PRRS của Trung Quốc đã được nhắc đến nhiều do khả năng gây bệnh và chết cao Tuy nhiên, bệnh PRRS đã xuất hiện ở Trung Quốc từ 1995 và đã nhanh chóng lan rộng khắp các tỉnh thành gây thiệt hại to lớn cho ngành công nghiệp chăn nuôi heo của quốc gia này (Chen và ctv, 2006)

PRRSV được các nhà khoa học Trung Quốc đưa vào nghiên cứu và phân lập

từ năm 1996 Đến năm 2001, trình tự bộ gen PRRSV đã được giải mã trọn vẹn và công bố lần đầu tiên bởi Yang và ctv (2001) Nhiều công trình sau đó được thực hiện nhằm nghiên cứu sự phân dòng và sự đa dạng địa lý của các genotype PRRSV phân bố trên khắp Trung Quốc đại lục (Gao và ctv, 2004; Chen và ctv, 2006; An và ctv, 2007; Tian và ctv, 2007) Kết quả của các nghiên cứu này đã cung cấp những thông tin quan trọng về quan hệ di truyền của PRRSV Trung Quốc với các chủng virus khác trên thế giới và thiết lập những giả thiết ban đầu cho sự tiến hóa của PRRSV tạo ra các chủng virus độc lực cao như hiện nay

Đặc điểm về bộ gen của hai chủng PRRSV Trung Quốc HB-1 và HB-2 bước đầu được miêu tả và so sánh với các chủng thuộc genotype Bắc Mỹ và châu Âu trong nghiên cứu của Gao và ctv vào năm 2004 Hai chủng HB-1 và HB-2 đều có

tỷ lệ tương đồng cao (89,4 – 89,6 %) với chủng virus PRRS đại diện cho genotype Bắc Mỹ (VR-2332) và chủng Trung Quốc BJ-4 được nghiên cứu trước đó, trong khi

đó chỉ tương đồng khoảng 54,3 – 54,7 % với chủng virus PRRS đại diện cho

genotype châu Âu (Lelystad virus) Điều này đã chứng minh là hai chủng virus

HB-1 và HB-2 đều nằm trong nhóm genotype Bắc Mỹ Ngoài ra nghiên cứu còn phát hiện một vùng đột biến mất đoạn 12 aa ở nsp2 thuộc dòng HB-2 khi so sánh với các chủng thuộc genotype Bắc Mỹ khác và khẳng định đây là một chủng virus PRRS mới

Năm 2006, nghiên cứu của Chen và cộng sự trên đoạn GP5 do OFR5 mã hóa của 13 chủng PRRSV Trung Quốc cho thấy chỉ có 1 chủng tương đồng với genotype châu Âu, 12 chủng còn lại đều tương đồng với genotype Bắc Mỹ Trong

12 chủng này, các tác giả ghi nhận đến 6 chủng tương đồng cao với virus PRRS vaccine nhược độc và với chủng VR-2332 Kết quả này đã đặt ra giả thiết cho sự tiến hóa của một số chủng PRRSV từ vaccine virus tạo ra các thể gây độc và làm giảm hiệu quả tiêm chủng của các vaccine nhược độc này ở Trung Quốc

Công trình của An và cộng sự (2007) khẳng định lại sự liên hệ giữa các dòng PRRSV Trung Quốc với PRRSV nguồn gốc Bắc Mỹ và virus vaccine nhược độc Trong 42 trình tự GP5 của các chủng PRRSV nghiên cứu (bao gồm 15 trình tự được phân lập và giải mã từ các tỉnh miền nam Trung Quốc cộng với 27 trình tự đã công

bố trên GenBank), sau quá trình phân tích cây sinh dòng, cho thấy tất cả đều có sự liên hệ di truyền với genotype Bắc Mỹ và có thể được chia thành 2 phân nhóm: Phân nhóm 1 bao gồm 21 chủng PRRSV với các đặc điểm là đều có độ tương đồng cao với chủng gốc VR-2332 và có sự biến đổi cao ở vùng epitope trung hòa đầu tiên; phân nhóm 2 gồm 17 chủng virus có sự tương đồng cao với virus của vaccine MLV RespPRRs/Repro Kết quả phân tích phân bố địa lý cho thấy phân nhóm 1 phân bố giới hạn ở các tỉnh miền Nam, trong khi phân nhóm 2 có mặt tại tất cả các vùng có bệnh PRRS Điều này được các tác giả đánh giá là một yếu tố gây giảm hiệu lực của các chương trình tiêm chủng PRRS với vaccine nhược độc hay vaccine chết

Năm 2006, một đợt dịch PRRS lớn bùng nổ ở Trung Quốc Trái với các biểu hiện thông thường của bệnh trước đó, bệnh thường ảnh hưởng lên heo con với tỷ lệ

nái và heo trưởng thành Nghiên cứu của Tian và ctv (2007) cho thấy virus gây bệnh vẫn là PRRSV nhưng với độc lực cao hơn nhiều Kết quả tìm hiểu sự đột biến liên quan đến tạo nên dòng virus độc lực cao của các tác giả cho thấy chủng gây bệnh tương đồng cao với các chủng thuộc genotype Bắc Mỹ ở vùng ORF5, nhưng đặc biệt có sự xuất hiện hai đột biến trên nsp2 (vùng ORF1) Đột biến thứ nhất là đột biến mất leucine ở aa 482 và đột biến thứ hai là mất đoạn liên tục 29 aa từ aa

534 – aa 562 Những đột biến này chỉ xuất hiện trên những dòng gây tỷ lệ chết cao

và chỉ xuất hiện sau đợt dịch 2006 Từ các kết quả này, Tian và cộng sự (2007) đã xây dựng nên những giả thiết ban đầu về sự tiến hóa của các chủng PRRSV độc lực cao ở Trung Quốc từ các chủng thuộc genotype Bắc Mỹ với vùng tiến hóa tiềm năng nằm trên nsp2 của vùng ORF1 Các tác giả cũng gợi ý một số nguyên nhân tiến hóa là do các chủng virus thuộc genotype Bắc Mỹ lưu hành tại Trung Quốc chịu ảnh hưởng về mặt địa lý hay môi trường như nhiệt độ, ẩm độ cao vào mùa hè hay sự nhiễm các vi khuẩn thứ phát cũng góp phần lên sự hình thành chủng virus độc lực

2.1.3.6 Virus PRRS vaccine

Yang và ctv (1997) đã so sánh trình tự vùng ORF2 – ORF7 của virus vaccine nhược độc với virus gốc VR-2332 và 16 chủng thuộc genotype Bắc Mỹ phân lập nhằm tìm ra điểm khác biệt mã hóa cho virus vaccine nhược độc Kết quả so sánh nucleotide từ đầu 3’ của vaccine nhược độc và virus gốc cho thấy virus vaccine nhược độc có 98 base thay đổi: 94 base được thay thế, 3 base bị mất và 1 base được thêm vào (15, 26, 17, 29, 9, 6 base thay đổi tương ứng với các vùng ORF2, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6 và ORF7) Tuy nhiên, hầu hết những base thay đổi này đều là những thay đổi lặn, nghĩa là những thay đổi này không làm thay đổi amino acid tương ứng, ví dụ như với 15 base thay đổi ở ORF2 chỉ làm thay đổi 5 amino acid hay 29 base ở ORF5 thay đổi 13 amino acid Trong những amino acid thay đổi đó

có rất nhiều amino acid đã hiện diện trong những dòng virus PRRS thực địa hay virus PRRS độc lực được phân lập từ Bắc Mỹ hay châu Âu, chỉ có 7 amino acid là

Bảng 2.1: So sánh trình tự vùng ORF2 – ORF7 của virus vaccine với virus gốc

và 11 base khác biệt trên 11,5 kb đối với virus vaccine nhược độc Venezuelan equine encephalitis (Kinney và ctv, 1989) Tuy virus PRRS thay đổi rất nhiều khi được nuôi cấy qua nhiều lần nhưng nếu chỉ nuôi cấy qua 1 vài lần thì lại không có sự ảnh hưởng đáng kể nào đến độc lực của virus, vì tất cả các virus phân lập trên đại

thực bào và trên tế bào nuôi cấy đều có khả năng gây độc sau khi đã nuôi cấy qua 5 lần (Nelson và ctv, 1994; Yoon và ctv, 1995; Halbur và ctv, 1996)

Không có thông tin trình tự nào về vùng không mã hóa đầu 5’, vùng ORF1a ORF1b, vùng tận cùng ở đầu 3’ của virus PRRS vaccine Những thay đổi ở vùng này

-có thể ảnh hưởng đến khả năng tự nhân lên, sao mã, dịch mã và độ ổn định của quá trình sao mã Tuy nhiên trên thực tế, khả năng tự nhân lên của virus PRRS vaccine lại cao hơn so với virus gốc khi nuôi cấy trên CL2621 và MARC-145 (Polson, 1994) Tiêm phòng vaccine PRRS nhược độc cũng tạo ra kháng thể mặc dù để đạt được lượng kháng thể cao nhất thì chậm hơn 1 tuần so với chủng gốc (Polson, 1994) Tất

cả những nghiên cứu trên cho thấy việc làm giảm độc lực của virus PRRS vaccine

không liên quan với khả năng sinh sản của virus trong in vitro và trên heo Tuy nhiên,

vẫn không loại trừ khả năng những thay đổi trên vùng này có liên quan đến khả năng gây bệnh của virus (Yang và ctv, 1997)

Theo Yang và ctv (1997), chỉ có một số lượng nhỏ những đột biến trong các protein cấu trúc do vùng ORF2 – 7 quy định là có liên quan đến khả năng nhược độc của virus PRRS vaccine Những đột biến này có thể ảnh hưởng đến khả năng gây bệnh một cách riêng lẽ hay kết hợp nhau để tạo nên ảnh hưởng Như vậy, những đột biến đơn trên protein cấu trúc do vùng ORF2, 3, 4, 5 quy định có thể là những ứng

cử viên sáng giá cho vai trò là tác nhân nhược độc của virus PRRS vaccine và vai trò của những thay đổi này sẽ được làm sáng tỏ trong một tương lai gần

2.1.4 Vaccine phòng ngừa bệnh do virus PRRS

Vaccine phòng bệnh là biện pháp quản lý để hỗ trợ trong việc phát triển hệ miễn dịch trong đàn heo Mục đích việc tiêm phòng là tạo ra một sự miễn dịch ổn định bằng cách tiêm vào đàn heo một lượng virus đã giảm độc lực Điều này sẽ tạo được miễn dịch có hiệu quả cho toàn đàn

Các nghiên cứu đã thực hiện cho thấy cả 2 loại vaccine PRRS nhược độc và vaccine bất hoạt đều có thể được sử dụng nhằm kiểm soát và ngăn ngừa nhiễm PRRSV, tuy nhiên vaccine nhược độc được đánh giá là có hiệu quả cao hơn (Hesse

độ thành công về khả năng bảo hộ miễn dịch của những vaccine phòng bệnh PRRS này, ví dụ như báo cáo của Hesse và cộng sự (1996) về đánh giá hiệu quả của Prime Pac vaccine trong việc kiểm soát sẩy thai do PRRSV gây ra Những nghiên cứu này

đã góp phần làm cho việc sử dụng vaccine thương mại ngày càng thông dụng, đặc biệt là ở Mỹ Hiện nay nghe nhắc đến nhiều trong các nghiên cứu là vaccine RespPRRS/Repro® và Prime Pac ® PRRS vì những loại vaccine đã được sử dụng từ lâu và rộng rãi

Tuy vaccine được xem như là một trong những cách ngăn ngừa nhiễm PRRSV nhưng để đạt được hiệu quả cao nhất trong việc kiểm soát và ngăn nhiễm PRRSV, khi thực hiện chương trình sử dụng vaccine cần phải lưu ý đánh giá các yếu

tố liên quan sau:

(1) Virus PRRS vaccine có thể tồn tại trong nhiều tuần, thậm chí trong vài tháng (Mengeling và ctv, 1996) và sức sống của chúng cũng có thể rất cao như virus độc lực (Wills và ctv,1995; Mengeling và ctv, 1996)

(2) Virus PRRS vaccine có thể lây nhiễm từ heo chủng vaccine sang heo chưa mắc bệnh hay heo chưa chủng vaccine (Botner và ctv, 1997; Mengeling và ctv, 1998)

(3) Virus PRRS vaccine có thể tồn tại trong heo đực giống và lây nhiễm qua tinh dịch (Christopher và ctv, 1997)

(4) Khả năng bảo hộ miễn dịch của vaccine PRRS có thể chậm (Mengeling và ctv, 1996)

(5) Hiệu quả bảo hộ miễn dịch của vaccine PRRS tùy thuộc vào dòng virus nhiễm Nghĩa là, nếu như virus vaccine và virus nhiễm càng có nhiều sự tương đồng về kháng nguyên thì khả năng bảo hộ sẽ tốt hơn là với những dòng không tương đồng nhiều

Mặc dù các loại vaccine PRRS đã thể hiện được vai trò quan trọng trong việc

vẫn còn một số điều cần nghiên cứu nhiều hơn ví dụ như hiệu quả bảo hộ, sự an toàn khi sử dụng, thời gian để có được sự bảo hộ và thời gian bảo hộ Hơn nữa, vì PRRSV có nhiều dòng khác nhau nên việc nghiên cứu tạo ra những vaccine đa chủng cũng là điều cần thiết để có được hiệu quả bảo hộ cao nhất

2.1.5 Tình hình tiêm phòng vaccine PRRS ở Việt Nam

Hiện nay trên thị trường VN có 3 loại vaccine được phép lưu hành:

- Porcilis PRRS của hãng Intervet – Hà Lan Porcillis PRRS là vaccine PRRS nhược độc đông khô có nguồn gốc từ chủng DV thuộc genotype châu Âu

- BCL PS 100 của hãng Besta – Singapore Đây là vaccine PRRS nhược độc đông khô thế hệ mới có nguồn gốc từ chủng JKL-100 thuộc genotype Bắc Mỹ

- Amervac PRRS của hãng Hipra – Tây Ban Nha Amervac PRRS là vaccine PRRS nhược độc đông khô có nguồn gốc từ chủng VP046 BIS thuộc genotype châu Âu

Các vaccine này có hiệu quả tốt khi tiêm phòng vaccine cho heo con tạo nên miễn dịch phòng hộ cho heo cai sữa và heo đang phát triển, sử dụng cho heo nái trước khi phối giống từ 3 – 4 tuần trước đó Nhưng vẫn còn nhiều vấn đề tồn tại khi dùng vaccine nhược độc nên khi muốn dùng vaccine thì cần phải tìm hiểu và nắm rõ kiểu lây lan, nguồn lây lan

Ở Việt Nam, virus PRRS có thể đã xảy ra biến chủng như ở Trung Quốc và

đã tạo ra nhiều biến thể với độc lực cao hơn nhiều so với thể cổ điển, cho nên việc tiêm phòng vaccine PRRS trong giai đoạn hiện nay chưa hẳn đã có tác dụng Tuy nhiên do tình hình dịch bệnh bùng phát quá lớn nên dù được khuyến cáo không nên

sử dụng vaccine vì chưa đạt được đủ các điều kiện để việc tiêm phòng vaccine nhược độc đạt được hiệu quả cao nhất, nhưng các nhà chăn nuôi vẫn sử dụng với mong muốn ngăn chặn được dịch bệnh

2.2 Các phương pháp chẩn đoán bệnh PRRS

Những phương pháp đầu tiên được sử dụng để chẩn đoán hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp chỉ giới hạn ở những phương pháp phân lập virus trên môi trường tế bào đại thực bào phế nang hay dòng tế bào thận khỉ và phương pháp chẩn đoán phát hiện kháng thể như trung hòa huyết thanh SVN (serum virus neutralization) hoặc phản ứng IFA (indirect immunofluorescent antibody) Sau đó, những kỹ thuật mới như ELISA, RT-PCR, RFLP và phân tích trình tự đã được sử dụng giúp việc chẩn đoán nguyên nhân gây bệnh đạt được kết quả chính xác hơn

2.2.1 Phương pháp phát hiện kháng thể trong huyết thanh (serology)

Các phản ứng IFA (indirect immunoflourescent antibody), SNV (serum virus neutralization), IMPA (immunoperoxidase monolayer assay) và ELISA (enzyme – linked immunosorbent assay) đều có thể được sử dụng cho việc phát hiện kháng thể đặc hiệu với virus PRRS Phản ứng IFA, SNV và ELISA được sử dụng thường xuyên trong hầu hết các phòng thí nghiệm ở miền nam nước Mỹ trong khi đó, IMPA được sử dụng nhiều hơn ở châu Âu

Trong phương pháp IFA, mẫu huyết thanh cần kiểm tra được cho vào môi trường tế bào có nuôi cấy PRRSV Kháng thể PRRSV, nếu tồn tại trong mẫu huyết thanh sẽ kết hợp kháng nguyên trong môi trường Sau đó, kháng kháng thể IgG gắn flourescein được cho thêm vào sẽ liên kết với phức hợp kháng nguyên – kháng thể PRRSV Kết quả được đọc dưới kính hiển vi IFA cho kết quả đáng tin cậy đối với việc phát hiện kháng thể đặc hiệu đến ba tháng sau nhiễm và có độ đặc hiệu cao đến 99,5 %

IMPA thường được sử dụng nhằm phát hiện việc nhiễm virus PRRS sau 7 đến 15 ngày Tuy nhiên, IMPA cũng cho kết quả đáng tin cậy đối với việc phát hiện kháng thể đặc hiệu sau hai đến ba tháng nhiễm virus

Có nhiều dạng ELISA đã được thiết kế để phát hiện PRRSV: ELISA trực tiếp sử dụng tỉ số S/P; ELISA trực tiếp sử dụng giá trị OD trực tiếp, ELISA ngăn trở Trong một bộ ELISA kit thương mại (HerdChek® PRRS ELISA, IDEXX

ELISA cho kết quả có độ đặc hiệu và độ nhạy cao đối với việc phát hiện kháng thể virus PRRS trong huyết thanh Điều bất lợi của thử nghiệm này thường cho kết quả dương tính giả Có thể đó chính là do sự hiện diện của kháng thể mẹ truyền cho heo con Kháng thể đặc hiệu từ mẹ đối với virus PRRS tồn tại trong cơ thể heo con từ 4 đến 10 tuần tuổi và đôi khi tồn tại đến 16 tuần tuổi đối với heo bú sữa mẹ đã được miễn dịch

SNV cũng là một phản ứng đặc hiệu cho việc phát hiện kháng thể virus PRRS trong máu, nhưng SNV có độ nhạy thấp hơn so với IFA và ELISA Độ nhạy thấp của phản ứng này trước tiên là do kháng thể trung hòa (một dạng kháng thể được phát hiện bởi phản ứng SNV) kháng virus PRRS phát triển chậm trong 1 đến 2 tháng sau khi nhiễm

2.2.2 Phương pháp RT-PCR (Hennings và ctv, 2002)

Phương pháp RT-PCR được sử dụng để phát hiện RNA của virus PRRS trong các mẫu bệnh phẩm như tinh dịch, huyết thanh, hạch amydale, dịch phổi RNA virus sẽ được phát hiện thông qua quá trình ly trích RNA từ mẫu bệnh phẩm, sau đó RNA này sẽ được phiên mã ngược thành cDNA, và cuối cùng sợi cDNA được dùng làm khuôn cho phản ứng khuếch đại DNA thông thường Vì không cần phải phân lập virus trong môi trường nuôi cấy tế bào nên RT-PCR sẽ chỉ tốn từ 1 –

3 ngày để có kết quả phát hiện

RT-PCR là phương pháp có thời gian chẩn đoán nhanh, độ nhạy và độ đặc hiệu cao Tuy nhiên, phương pháp này lại có thể không phát hiện được virus nếu như có sự khác biệt giữa PRRSV và primer được sử dụng, ví dụ như khi sử dụng cặp primer chỉ có khả năng phát hiện virus PRRS genotype Bắc Mỹ thì sẽ không phát hiện được virus genotype châu Âu hay những chủng giống châu Âu Ngoài ra, kết quả của phương pháp này còn phụ thuộc nhiều vào những yếu tố khác như các điều kiện về mẫu; qui trình thu nhận và trữ mẫu; qui trình chiết tách, tinh sạch; trang thiết bị phòng thí nghiệm; kỹ năng và kinh nghiệm của người thực hiện việc phân tích

Để so sánh virus PRRS thực địa và virus vaccine, phương pháp RT-PCR vùng ORF5 được sử dụng để có sản phẩm cho những phương pháp tiếp theo như giải trình tự và RFLP

2.2.3 Phương pháp RFLP

Phương pháp RFLP là phương pháp dùng để so sánh DNA của các cá thể

khác nhau khi cắt một đoạn DNA bằng enzyme cắt giới hạn (RE) như EcoRI, HincI, SacII,

Phân tích PRRSV bằng kỹ thuật RFLP lần đầu tiên được Wesley và cộng sự

sử dụng vào năm 1998 để phân biệt sự khác biệt giữa nhóm virus vaccine (Ingelvac PRRS) và nhóm virus thực địa ở vùng St Joseph và Missouri Nhóm nghiên cứu này thực hiện phản ứng RFLP trên sản phẩm RT-PCR của đoạn ORF5 với 3 enzyme cắt khác nhau Kết quả của phản ứng được mã hóa thành dạng code 3 ký tự (ví dụ như 1-4-2 hay 2-5-5) tương ứng với số vị trí cắt giới hạn của từng loại enzyme tương ứng trên mỗi mẫu Mặc dù kỹ thuật này không thể phân biệt virus vaccine và chủng gốc của chúng, nhưng kết quả so sánh đã giúp phân biệt được virus của vaccine Ingelvac PRRS (mã RFLP 2-5-2) và virus của những chủng phân lập được

Tuy nhiên, Wesley và cộng sự (1998) cũng ghi nhận về sự biến đổi của các vaccin nhược độc theo thời gian, cũng như là việc xuất hiện của các loại vaccine thương mại mới (Ingelvac PRRSV ATP, Boehringer Ingelheim) với mã RFLP (1-4-2) không phân biệt với các chủng virus thực địa Với các trường hợp này, để thu được sự chính xác trong việc phân biệt vaccine và PRRSV, bên cạnh kết quả RFLP còn cần thêm các thông tin bổ trợ lấy từ gia phả đàn giống hay lấy từ kết quả giải trình tự gen

2.2.4 Phương pháp phân tích trình tự

Giải trình tự giúp cung cấp cho các nhà nghiên cứu thông tin chính xác về chuỗi trình tự nucleotide của virus PRRS Các thông tin này có thể chỉ ra được các đột biến trên gen ở cấp độ nucleotide (thêm nucleotide, mất nucleotide) mà các

tránh được các sai số do đột biến in vitro thường thấy khi sử dụng Hiệu quả của phương pháp giải trình tự trong việc phân biệt các chủng PRRSV lần đầu tiên được chứng minh qua công trình của Kapur và cộng sự (1996) Khi phân tích trình tự các vùng từ ORF2 đến ORF7, nghiên cứu trên đã cho thấy ORF5 là vùng biến đổi nhiều nhất trong khi ORF6 là vùng bảo tồn nhất Kết quả này đặt nền tảng cho việc lựa chọn các gen ở 2 vùng trên (ORF5 và 6) trong đa số các nghiên cứu phân tích trình

tự PRRSV về sau

Mặc dù giải trình tự có thể thực hiện trên bất kỳ đoạn gen nào của bộ gen PRRSV, việc lựa chọn gen mục tiêu nằm trong vùng ORF5 được nhiều tác giả (Yoon và ctv, 2001) khuyến cáo bởi vì ngoài tính đa hình cao, ORF5 còn là vùng có lượng thông tin nghiên cứu lớn nhất, mang lại nhiều thuận lợi cho việc phân tích, so sánh Các nghiên cứu (Yoon và ctv, 2001; Yuan và ctv, 2001) đã xác định được tỷ

lệ đột biến tương đối ổn định ở cấp độ gen của vùng ORF5 là 1 % trong khoảng thời gian ngắn (từ 100 ngày đến 2 năm) Điều này nghĩa là kết quả so sánh trình tự gen trong vùng ORF5 khác biệt nhiều hơn 1 % cho thấy 2 chủng phân tích không có quan hệ gần, ngược lại, kết quả khác biệt ít hơn 1 % chỉ là đột biến tự nhiên của cùng 1 chủng virus trong một đàn

2.3 Lược duyệt các công trình nghiên cứu liên quan đến PRRSV ở nước ngoài

Năm 1998, Wesley và ctv đã nghiên cứu khả năng ứng dụng của phương pháp cắt bằng enzyme để phân biệt được virus của vaccine với virus của các chủng virus PRRS thuộc genotype Bắc Mỹ khác Bước đầu tiên của nghiên cứu này đã thành công trong việc chọn primer có khả năng khuếch đại được đoạn ORF5 (716 bp) của chủng virus vaccine RespPRRS và tất cả 22 chủng PRRSV được lựa chọn kiểm tra Sau đó, dựa trên những trình tự đã được công bố trên genome lựa chọn những enzyme cắt (RE) có tiềm năng phân biệt được chủng virus PRRS vaccine và virus PRRS thực địa bằng chương trình Genework, và những enzyme được lựa chọn

trong nghiên cứu này là MluI, ScfI, HincII và SacII Kết luận cuối cùng của nghiên

cứu này là đã thành công trong việc sử dụng phương pháp RT-PCR-RFLP để phân biệt được chủng virus PRRS vaccine và virus PRRS thực địa.

Năm 2000, Cheon và Chae đã nghiên cứu sự biến đổi di truyền giữa 50 chủng PRRSV phân lập ở Hàn Quốc bằng kỹ thuật RT-PCR-RFLP Tất cả những chủng virus phân lập đều được lấy mẫu sau khi vaccine nhược độc genotype Bắc

Mỹ được đưa vào sử dụng thương mại Sau khi phân tích RFLP với những RE MluI, HincII, SacII và HaeIII thu được 19 kiểu RFLP khác nhau Những sự biến đổi di

truyền trên dường như đã tạo ra những đặc trưng cho những chủng PRRSV phân lập

ở Hàn Quốc Tuy nhiên, 17 trong 50 mẫu phân lập (34 %) có kiểu RFLP giống với kiểu RFLP của vaccine PRRS nhược độc, do đó nghiên cứu này không thể kết luận được là có thể phân biệt virus PRRS vaccine và virus PRRS thực địa với các enzyme đã sử dụng Điều này có thể được lý giải theo 2 cách: một là do những chủng virus lưu hành ở Hàn Quốc trước khi sử dụng vaccine đã có cấu trúc di truyền tương đồng với cấu trúc của vaccine nhược độc nên chúng có kiểu RFLP giống nhau, hai là do vaccine PRRS nhược độc đã được sử dụng khá lâu (từ năm 1996) nên có đột biến làm cho virus có khả năng gây độc trở lại Vì vậy, nếu muốn phân biệt được chủng PRRS vaccine và chủng PRRS phân lập, nhóm tác giả đã đề nghị có thể thay đổi phân tích RFLP với những RE khác

Năm 2001, Bouvet và ctv đã ứng dụng những enzyme đã được sử dụng trong nghiên cứu của Wesley (1996) để nghiên cứu sự biến đổi di truyền của 11 chủng virus PRRSV thuộc genotype châu Âu với các chủng LV và chủng VR2332 của genotype Bắc Mỹ Tuy nhiên, kết quả đạt được không khả quan khi chỉ có một

trong bốn enzyme là HincII có khả năng ứng dụng để nghiên cứu sự thay đổi di

truyền

Năm 2002, Cai và ctv cũng đã ứng dụng phương pháp RFLP để nghiên cứu

sự biến đổi gen PRRSV của đàn heo ở Ontario từ năm 1998 – 2000 Trong nghiên cứu này, tác giả đã sử dụng đến 2 cặp primer khác nhau để cùng khuếch đại gen ORF5 Một cặp primer giống với cặp primer của Wesley và ctv (1998) đã sử dụng

Với cặp primer 716 bp, RFLP có thể phân biệt được 236 mẫu trong 254 mẫu ban đầu với 34 kiểu RFLP khác nhau Trong khi đó, 18 mẫu còn lại chỉ có thể phân biệt khi sử dụng cặp primer 933 bp với 9 kiểu RFLP khác nhau Số lượng kiểu RFLP nhiều chứng tỏ có sự biến đổi di truyền lớn trong đàn heo này Do đó, tác giả đã kết luận rằng virus PRRS vẫn thường xuyên xảy ra đột biến dưới điều kiện môi trường

Năm 2004, nhóm tác giả Punprapa ở Thái Lan đã nghiên cứu những sự biến đổi di truyền của 10 chủng virus thực địa bằng phân tích RT-PCR-RFLP trên đoạn

gen ORF5 Nhóm tác giả này đã sử dụng các RE sau: MluI, HincII, SacII và HaeIII cho chủng thuộc genotype Bắc Mỹ và PstI, HaeII và ClaI cho các chủng thuộc

genotype châu Âu Kết quả thu được là có 4 kiểu code RFLP cho 5 chủng genotype Bắc Mỹ và 4 kiểu RFLP cho 5 chủng genotype châu Âu, trong đó không có chủng nào có cùng kiểu với vaccine PRRS nhược độc Như vậy, ngay trong cùng một genotype Bắc Mỹ hay châu Âu thì cũng có sự biến đổi di truyền để tạo ra tính đa dạng cho PRRSV

Năm 2008, Feng và ctv đã tiến hành xác định đặc tính các chủng virus PRRS phân lập được từ các ổ dịch hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp tại Việt Nam và Trung Quốc năm 2007 Các chủng virus này có bộ gen tương đồng gần 99 % Phân tích di truyền đã chỉ ra rằng các chủng virus đều bị mất một đoạn amino acid ở nsp2

và điều đó chứng tỏ rằng các biến chủng virus xuất hiện tại Việt Nam và Trung Quốc là đồng nhất

2.4 Lược duyệt các công trình nghiên cứu liên quan đến PRRSV trong nước

Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện vào năm 1997 trên đàn heo nhập từ Mỹ (Phòng dịch tễ, Cục thú y Việt Nam) Từ đó, virus PRRS đã nhanh chóng lây lan và nhiều lần bùng phát thành dịch, gây ảnh hưởng rất nghiêm trọng đến ngành chăn nuôi

và đời sống của nhiều hộ dân Việt Nam Năm 2001, Nguyễn Lương Hiền và ctv đã khảo sát tỷ lệ bệnh PRRS trên heo giống tại Tp.HCM và các tỉnh lân cận bằng phương pháp ELISA gián tiếp Kết quả cho thấy 25 % mẫu huyết thanh có kháng

thể kháng PRRSV (596/2308) và tỷ lệ nhiễm ở 2 trại thuộc Tp.HCM là 29,71 % và 1,3 %; 9 trại ở Đồng Nai có 3 trại nhiễm với tỷ lệ 54,5 %, 50 % và 68,29 %; 4 trại ở Bình Dương có 1 trại nhiễm với tỷ lệ 18,96 % Năm 2003, Trần Thị Dân và Trần Thị Bích Liên đã báo cáo tỷ lệ nhiễm PRRSV tại một trại chăn nuôi heo là 5,97 %

và nái dương tính có tỷ lệ sẩy thai cao Năm 2004, tỷ lệ nhiễm là 27,25 % (Trần Thị Dân và Nguyễn Phước Ninh, 2004) và vẫn đang tăng dần, tỉ lệ này trên heo nuôi tập trung ở Cần Thơ là 66,86 % (La Tấn Cường, 2005)

Ở tỉnh Tiền Giang, heo bệnh giảm khả năng sinh sản (Thái Quốc Hiếu và ctv, 2007) Trần Thị Bích Liên và ctv (2007) đã khảo sát sự biến động của kháng thể mẹ truyền trên heo con khi heo mẹ nhiễm PRRS và nhận thấy hiệu giá kháng thể giảm nhiều từ ngày tuổi thứ 19 và tất cả heo con đều âm tính ở 60 ngày tuổi Heo con của những nái dương tính với PRRS có hiệu giá kháng thể cao hơn heo con từ nái âm tính trong vòng 35 ngày sau khi sanh Ngoài ra, nghiên cứu tại tỉnh Tiền Giang cho thấy heo bệnh PRRS bị giảm hiệu giá kháng thể khi chủng ngừa dịch tả heo (Thái Quốc Hiếu và ctv, 2007)

Bên cạnh các nghiên cứu về sự lưu hành của virus PRRS còn có nghiên cứu để phát hiện virus PRRS nhờ vào kỹ thuật RT-PCR trên vùng ORF7 (Huỳnh Trọng Tiến, 2007) Tuy nhiên ở Việt Nam hiện nay chưa có nghiên cứu nào xây dựng được phương pháp phân biệt virus PRRS thuộc chủng vaccine nhược độc hay chủng thực địa Dựa vào các nghiên cứu với mục tiêu tương tự đã được thực hiện ở nước ngoài, đề tài đã chọn kỹ thuật RT-PCR-RFLP để thực hiện mục tiêu trên Hơn nữa, kỹ thuật RT-PCR-RFLP và giải trình tự cũng giúp chúng tôi phân tích sự đa dạng di truyền cũng như xem xét có sự biến chủng hay không giữa các chủng virus thực địa ở Tp.HCM và chủng vaccine PRRS nhược độc

Chương 3

NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành

3.1.1 Thời gian: đề tài được thực hiện từ 7/2008 đến 8/2009

3.1.2 Địa điểm: Ly trích RNA, phản ứng RT-PCR-RFLP được tiến hành tại

Viện nghiên cứu công nghệ sinh học và môi trường, ĐHNL Tp.HCM Sản phẩm RT-PCR của các chủng thực địa và vaccine được gửi giải trình tự DNA tại công ty Macrogen (Seoul, Hàn Quốc)

3.2 Nội dung nghiên cứu

1 Xác định mẫu dương tính với PRRSV bằng kỹ thuật RT-PCR

2 Phân biệt virus thực địa và virus vaccine bằng kỹ thuật RT-PCR-RFLP trên đoạn ORF5

3 Thiết lập cây sinh dòng dựa trên trình tự ORF5 của các chủng PRRSV

3.3 Vật liệu và hóa chất

3.3.1 Nguồn mẫu

Tất cả 21 mẫu trong đó 18 mẫu huyết thanh của heo nghi ngờ nhiễm bệnh (heo sốt cao), 1 mẫu RNA được phân lập từ dịch nuôi cấy tế bào và 2 loại vaccine PRRS nhược độc đang được cấp phép lưu hành tại Việt Nam là Porcilis PRRS MLVs của Intervet – Hà Lan (genotype châu Âu) và BCL.PS 100 MLVs của Besta – Singapore (genotype Bắc Mỹ) (bảng 3.1)

Bảng 3.1: Các chủng virus PRRS trong nghiên cứu

STT Kí hiệu mẫu Nơi lấy mẫu Năm lấy mẫu Loại mẫu

11 1BRVT-VN Bà Rịa, Vũng Tàu 2009 Huyết thanh

12 3BRVT-VN Bà Rịa, Vũng Tàu 2009 Huyết thanh

13 4BRVT-VN Bà Rịa, Vũng Tàu 2009 Huyết thanh

14 5BRVT-VN Bà Rịa, Vũng Tàu 2009 Huyết thanh

15 6BRVT-VN Bà Rịa, Vũng Tàu 2009 Huyết thanh

16 7BRVT-VN Bà Rịa, Vũng Tàu 2009 Huyết thanh