Sử dụng nguồn tetraethyl orthosilicate (TEOS) phủ lên các hạt nano từ tính nhằm tăng diện tích bề mặt của hạt nano từ tính (fe3o4) sử dụng làm vật liệu truyền dẫn thuốc curcumin

Sử dụng nguồn tetraethyl orthosilicate (TEOS) phủ lên các hạt nano từ tính nhằm tăng diện tích bề mặt của hạt nano từ tính (Fe3O4) sử dụng làm vật liệu truyền dẫn thuốc curcumin. Tổng hợp, đặc trưng vật liệu curcumin thương mại gắn trên vật liệu nano CSSiO2Fe3O4, CSSiO2Fe3O4, SiO2Fe3O4, và nano Fe3O4 tổng hợp theo phương pháp vi nhũ tương nghịch. 2 Khảo sát lượng curcumin hấp phụ và nhả trên vật liệu nano CSSiO2 Fe3O4 theo mô hình Invitro. Khảo sát khả hoạt tính gây độc tế bào ung thư trên dòng tế bào ung thư phổi A549 của vật liệu curcumin thương mại và CURCSSiO2Fe3O4.

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu

và kết quả được đưa ra trong luận án là trung thực, được các đồng giả cho phép sử dụng và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả

Lương Văn Sơn

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

MỤC LỤC ii

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích của đề tài 2

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3

4 Nội dung nghiên cứu 3

5 Phương pháp nghiên cứu 3

6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4

LỜI CẢM ƠN 5

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 6

1.1 Vật liệu nano curcumin 6

1.1.1 Nguồn gốc 6

1.1.2 Ứng dụng trong đời sống 6

1.1.3 Ứng dụng của curcumin trong y học 7

1.2 Vật liệu nano từ tính sử dụng làm chất mang truyền dẫn thuốc 8

1.2.1 Vật liệu nano oxit sắt từ 8

1.2.1.1 Cấu trúc tinh thể 8

1.2.1.2 Tính chất từ 9

a Momen từ 10

b Tính chất từ của vật liệu phụ thuộc vào nhiệt độ 11

c.Tính chất từ liên quan đến hiệu ứng kích thước 11

d Tính chất liên quan đến hiệu ứng bề mặt 13

1.2.1.3 Tương tác giữa các hạt sắt từ 14

1.2.1.4 Phương pháp chế tạo hạt nano sắt từ 15

1.2.1.4 Ứng dụng của vật liệu 17

a Phân tách và chọn lọc tế bào 17

b Dẫn truyền thuốc 18

c Nhiệt từ trị ung thư 19

1.2.1.5 Ưu và nhược điểm của vật liệu oxit sắt từ trong ứng dụng làm vật liệu truyền dẫn thuốc 19

1.2.2 Vật liệu nano silica-oxit sắt từ cấu trúc nhân vỏ 20

1.3 Mô hình In-vitro và phương pháp xác định tính độc tế bào ung thư 20

1.3.1 Mô hình In-vitro 20

CHƯƠNG 2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM22 2.1 Hóa chất 22

2.2 Thực nghiệm 22

2.2.1 Tổng hợp nano oxit sắt từ 22

2.2.2 Tổng hợp vật liệu silica phủ lên nano Fe3O4 26

2.2.3 Phủ chitosan lên vật liệu nano SiO2-Fe3O4 27

2.2.4 Hấp phụ curcumin lên vật liệu CS/SiO2-Fe3O4 28

2.2.5 Nhả curcumin theo mô hình In-vitro 29

2.2.6 Thử sinh học xác định tính độc trên tế bào ung thư phổi A549 30

2.2.6.1 Nuôi cấy tế bào ung thư A549 30

2.2.6.2 Xác định tính độc tế bào ung thư 30

2.3 Các phương pháp nghiên cứu 32

2.3.1 Phương pháp phổ nhiễu xạ tia X (XRD) 32

2.3.2 Phổ hồng ngoại chuyển dịch Fourier (FTIR) 33

2.3.3 Phương pháp hiển vi điện tử quét (SEM) 34

2.3.4 Phương pháp phổ hấp phụ electon (UV-VIS) 35

2.3.5 Phương pháp phép đo từ (VSM) 36

3.2.6 Phương pháp đẳng nhiệt hấp phụ-khử hấp phụ N2 (BET) 37

2.3.7 Phương pháp phân tích nhiệt (TGA) 39

2.3.8 Phép đo tính độc tế bào ung thư 40

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41

3.1 Cơ chế phản ứng 41

3.1.1 Quá trình tạo hạt nano Fe3O4 41

3.1.2 Quá trình phủ chitosan lên hạt nano SiO2-Fe3O4 42

3.1.3 Quá trình gắn curcumin lên các hạt CS/SiO2-Fe3O4 43

3.2 Kết quả phổ nhiễu xạ tia X (XRD) 43

3.3 Kết quả phổ hồng ngoại chuyển dịch Fourier (FT-IR) 46

3.4 Kết quả đẳng nhiệt hấp phụ nitơ (BET) 47

3.5 Kết quả phương pháp hiển vi điện tử quét (SEM) 48

3.6 Kết quả phép đo từ (VSM) 49

3.7 Kết quả phân tích nhiệt (TGA) 51

3.8 Kết quả phương pháp phổ hấp phụ electon (UV-Vis) 53

3.8.1 Kết quả quá trình hấp phụ curcumin 53

3.8.2 Kết quả quá trình nhả hấp phụcurcumin 543.9 Kết quả thử sinh học xác định tính độc trên tế bào ung thư phổi A549 55KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 59TÀI LIỆU THAM KHẢO 60PHỤ LỤC 1

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT BET: Brunauer-Emmett-Teller (Hấp phụ và khử hấp phụ Nitơ)

SEM: Scanning Electron microscope (Kính hiển vi điện tử quét)

FT-IR: Fourier transform infrared spectroscopy (Phổ hồng ngoại chuyển dịch

Fourier)

UV-Vis:Ultraviolet–visible spectroscopy (Phổ tử ngoại-khả kiến)

XRD: X-Ray diffraction (Nhiễu xạ tia X)

TGA:Thermal gravimetric analysis(Phương pháp phân tích nhiệt)

VSM:Vibrating sample magnetometer analysis(Phương phápđo từ trường) SiO 2 @Fe 3 O 4 : Các hạt nano oxit sắt từ được phủ silica lên mặt tạo cấu trúc

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Kích thước các hạt nano từ tính 45Bảng 3.2 Phần trăm ức chế sự phát triển của tế bào ung thư A549 55

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của curcuminoids curcumin, demethoxy

curcumin và bis-demethoxy curcumin 7

Hình 1.2 Cấu trúc tinh thể của vật liệu nano Fe3O4 [30] 9

Hình 1.3 Mô hình momen từ 11

Hình 1.4 Đồ thị mô tả sự phụ thuộc của lực kháng từ vào kích thước hạt [28] 13

Hình 1.5 Mô hình với cấu trúc vỏ-lõi của một hạt nano oxit sắt từ [29] 13

Hình 2.1 Sơ đồ khối quá trình tổng hợp nano Fe3O4 24

Hình 2.2 Hệ thiết bị phản ứng tổng hợp nano Fe3O4 trong phòng thí nghiệm 25

Hình 2.3 Các hạt nano Fe3O4 sau khi được sấy khô 25

Hình 2.4 Sơ đồ khối quá trình phủ silica lên vật liệu nano Fe3O4 27

Hình 2.5 Sơ đồ khối quá trình phủ chitosan lên vật liệu SiO2-Fe3O4 28

Hình 2.6 Sơ đồ khối quá trình tổng hợp CUR/CS/SiO2-Fe3O4 29

Hình 2.7 Máy sử dụng đo UV-Vis lỏng tại Viện hóa Học 30

Hình 2.8 Đường đi của tia Rơnghen 32

Hình 2.9 Các bước chuyển năng lượng 35

Hình 2.10 Hệ thiết bị đo từ tính 37

Hình 3.1 Sơ đồ quá trình tổng hợp nano SiO2-Fe3O4 42

Hình 3.2 Các hạt nano SiO2-Fe3O4 phân tán trong môi trường chất hoạt động bề mặt CTAB 42

Hình 3.3 Quá trình chức năng hóa bề mặt hạt nano sắt từ với chitosan 43

Hình 3.4 Kết quả chụp nhiễu xạ tia X mẫu (a) nano Fe3O4, (b) SiO2-Fe3O4 và (c) CUR/CS/SiO2-Fe3O4 44

Hình 3.5 Kết quả phổ FT-IR của mẫu (a) nano Fe3O4, (b) nano SiO2-Fe3O4, (c) CS/SiO2-Fe3O4 và (d) CUR/CS/SiO2-Fe3O4 46

Hình 3.6 Kết quả BET của mẫu (a) nano Fe3O4 và (b) SiO2-Fe3O4 48Hình 3.7 Ảnh SEM của các mẫu (a) nano Fe3O4, (b) SiO2-Fe3O4, (c) CS/SiO2-Fe3O4 và (d) CUR/CS/SiO2-Fe3O4 49Hình 3.8 Đường cong từ hóa của mẫu (a) nano Fe3O4, (b) SiO2-Fe3O4, (c) CS/SiO2-Fe3O4 và (d) CUR/CS/SiO2-Fe3O4 50Hình 3.9 Hình ảnh mẫu sản phẩm (a) nano Fe3O4 và (d) CUR/CS/SiO2-Fe3O4 51Hình 3.10 Kết quả phân tích TGA của các mẫu (b) nano SiO2-Fe3O4, (c) CS/SiO2-Fe3O4 và (d) CUR/CS/SiO2-Fe3O4 52Hình 3.11 Phổ UV-vis hấp phụ curcumin theo thời gian 54Hình 3.12 Phổ UV-vis nhả hấp phụ curcumin theo thời gian 54

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Thực tế hiện nay, tỉ lệ số bệnh nhân mắc bệnh ung thư đang diễn biến theo chiều hướng tăng đáng kể không chỉ ở Việt Nam mà trên toàn thế giới Cũng như các nước trên thế giới, số người mắc bệnh ung thư ở Việt Nam đang có xu hướng ngày một gia tăng Bệnh gặp ở mọi tầng lớp xã hội, mọi lứa tuổi, mọi ngành nghề khác nhau

Bệnh ung thư và sức khoẻ cộng đồng là những vấn đề ngày càng được quan tâm ở hầu hết các quốc gia trên thế giới Theo ước tính và thống kê của

Tổ chức y tế thế giới (WHO) thì hàng năm trên toàn cầu có khoảng 9-10 triệu người mới mắc bệnh ung thư và một nửa trong số đó chết vì căn bệnh này [2] Thực sự, ung thư đang là gánh nặng cho xã hội, cho ngành y tế và cho ngành ung thư Số lượng mắc ung thư hàng năm tại Việt Nam là 150 nghìn người, tử vong là 75 nghìn người Chỉ tính riêng 5 loại ung thư ở nam giới là phổi, gan, đại trực tràng, dạ dày, vòm hầu chiếm 57,1% Riêng 5 loại ung thư

ở nữ giới là vú, cổ tử cung, đại trực tràng, phổi, tuyến giáp chiếm 61,6% [2] Trong những năm gần đây đã có nhiều nghiên cứu không chỉ trong y dược và cả trong lĩnh vực vật liệu với mong muốn và hi vọng tìm ra giải pháp cho điều trị bệnh ung thư, một trong những nghiên cứu đó là nghiên cứu về nano curcumin đang tạo nên một cuộc cách mạng mới trong phòng và hỗ trợ điều trị bệnh với các tác dụng: Chống ung thư mạnh do ngăn chặn cả 3 quá trình hình thành, phát triển và di căn của ung thư mà không hề làm hại gì cho các tế bào khỏe mạnh, không có các tác dụng phụ, đồng thời còn làm giảm độc tính của hóa trị, xạ trị [3]

Curcumin được sử dụng như một loại thuốc phòng chống ung thư, vì nó làm giảm cholesterol trong máu, ngăn ngừa quá trình oxy hóa LDL (Low-density lipoprotein), ức chế sự kết tụ các tiểu cầu, ngăn chặn huyết khối và

ngăn ngừa ung thư [4] Đã có nhiều nghiên cứu cho thấy curcumin có khả năng ngăn ngừa ung thư và tác dụng trị liệu hóa học [3, 7]

Bên cạnh đó, đã có nhiều sự quan tâm và nghiên cứu về hạt nano sắt từ không chỉ trong lĩnh vực ghi âm bằng từ tính mà còn trong các lĩnh vực chăm sóc y tế và cảm biến từ Đặc biệt, các hạt siêu nano sắt từ (Fe3O4 và γ-Fe2O3)

đã biến tính bề mặt hóa học đã được sử dụng rộng rãi cho nhiều ứng dụng y sinh học trong cơ thể như hệ thống phân phối thuốc (DDS - drug delivery systems), chụp cộng hưởng từ (MRI - magnetic resonance imaging), điều trị ung thư, sửa chữa mô, xét nghiệm miễn dịch, giải độc của dịch sinh học, tăng thân nhiệt, phân phối thuốc và tách tế bào [6, 5]

Việc nghiên cứu và ứng dụng hệ thống dẫn thuốc được mang trên các hạt nano từ tính, được định hướng bởi một môi trường từ từ bên ngoài là một hướng nghiên nghiên cứu mới và có nhiều triển vọng trong việc tránh các vấn

đề liên quan tới việc phải hóa trị liệu thông thường [5]

Nhóm nghiên cứu khoa học trước đó đã thực hiện tổng hợp và đặc trưng của chitosan phủ trực tiếp lên các hạt nano từ tính cho quá trình truyền dẫn thuốc curcumin Đề tài này tiếp tục nghiên cứu và tiến hành sử dụng nguồn tetraethyl orthosilicate (TEOS) phủ lên các hạt nano từ tính nhằm tăng diện tích bề mặt của hạt nano từ tính (Fe 3 O 4 ) sử dụng làm vật liệu truyền dẫn thuốc curcumin Với mong muốn đề tài nghiên cứu này sẽ

góp một phần nhỏ, bổ sung thêm kiến thức về vật liệu nano từ tính, nano silica phủ lên Fe3O4 dạng cấu trúc nhân vỏ và curcumin hấp phụ lên vật liệu

- Khảo sát lượng curcumin hấp phụ và nhả trên vật liệu nano Fe3O4 theo mô hình In-vitro

CS/SiO2 Khảo sát khả hoạt tính gây độc tế bào ung thư trên dòng tế bào ung thư phổi A549 của vật liệu curcumin thương mại và CUR/CS/SiO2-Fe3O4

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Các vật liệu dùng cho cho việc truyền dẫn thuốc, đi từ nguồn nguyên liệu đơn giản, dễ kiếm và có nguồn gốc tự nhiên

- Phạm vi nghiên cứu: Tổng hợp vật liệu, xác định hoạt tính gây độc tế bào ung thư trên dòng tế bào ung thư phổi A549

4 Nội dung nghiên cứu

- Nội dung 1: Thu thập và tổng quan tài liệu về Curcumin, chitosan,

SiO2-Fe3O4 dạng nhân vỏ và nano Fe3O4

- Nội dung 2: Tổng hợp, đặc trưng các mẫu vật liệuCUR/CS/SiO2Fe3O4, CS/SiO2-Fe3O4, SiO2-Fe3O4, và nano Fe3O4

Nội dung 3: Khảo sát lượng curcumin gắn và nhả trên vật liệu nano

Fe3O4

- Nội dung 4: Khảo sát khả hoạt tính gây độc tế bào ung thư trên dòng

tế bào ung thư phổi A549 của vật liệu curcumin thương mại và CUR/CS/SiO2-Fe3O4

5 Phương pháp nghiên cứu

Sử dụng các phương pháp hóa - lí truyền thống và hiện đại như:

- Phương pháp nhiễu xạ Rơnghen (XRD) để xác định cấu trúc pha của các mẫu tổng hợp được

- Phương pháp phổ hồng ngoại (FT-IR) để xác định các nhóm chức của các mẫu nano CUR/CS/SiO2-Fe3O4, CS/SiO2-Fe3O4, SiO2-Fe3O4, và nano Fe3O4

- Phương pháp hiển vi điện tử quét (SEM) để xác định hình thái bề mặt vật liệu

- Phương pháp phổ hấp phụ electon (UV-Vis) nhằm xác định nồng độ trước và sau khi gắn curcumin trong dung dịch

- Phương pháp từ kế mẫu rung (VSM) để xác định tính chất từ của vật liệu tổng hợp

- Phương pháp đẳng nhiệt hấp phụ (BET) nhằm xác định diện tích bề mặt của vật liệu

- Phương pháp phân tích nhiệt trọng lượng TGA là đánh giá sự biến đổi khối lượng mẫu khi tăng nhiệt độ để suy ra quá trình lý hóa xảy ra khi nung mẫu

- Phương pháp xác định tính độc tế bào ung thư (cytotoxic assay) là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện In-vitro

6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

- Tổng hợp và đặc trưng vật liệu các mẫu CUR/CS/SiO2-Fe3O4, CS/SiO2-Fe3O4, SiO2-Fe3O4, và nano Fe3O4

- Khảo sát lượng Curcumin gắn và nhả trên vật liệu nano Fe3O4

- Khảo sát khả hoạt tính gây độc tế bào ung thư trên dòng tế bào ung thư phổi A549 của vật liệu curcumin thương mại và CUR/CS/SiO2-Fe3O4

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Lọc-Hóa dầu, trường Đai học Mỏ - Địa chất đã cung cấp cho tôi những ý kiến đóng góp và tạo điều kiện thuận lợi trong thời gian thực tập tại Phòng thí nghiệm của Bộ môn để thực hiện các nội dung trong luận văn

Những lời cảm ơn sau cùng xin dành cho ba, mẹ những người luôn ở bên cạnh chia sẻ, bảo ban cũng như động viên tôi trong suốt thời gian qua, và tôi cũng muốn gửi lời cảm ơn đến những người thân đã hết lòng quan tâm và tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn này

Hà Nội, 08 tháng 03 năm 2017

Học viên thực hiện

Lương Văn Sơn

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Vật liệu nano curcumin

1.1.1 Nguồn gốc

Curcumin được chiết xuất hoàn toàn từ tự nhiên, curcumin hay bột nghệ, tinh bột nghệ là tinh chất của nghệ chỉ chiếm 2÷5 % trong củ nghệ [8, 3, 7] Nghệ còn có tên là uất kim, khương hoàng Tên khoa học Curcuma loga L (Curcuma domestica Lour) Thuộc họ gừng Zigiberaceae, thân rễ gọi là khương hoàng (Rhizoma Curcumae longa) và rễ gọi là uất kim (Radix Curcumae longae) [7]

Nghệ vàng phân bố rộng rãi trên khắp các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới, tại Châu Á như Ấn Độ, Trung Quốc và Việt Nam Việt Nam là một nước nông nghiệp nhiệt đới nóng ẩm ở vùng Đông Nam Châu Á, chính điều kiện trên phù hợp với loại cây lấy củ như: Gừng, nghệ, tỏi, hành, Trong đó cây nghệ được trồng rộng rãi, ở nước ta cây nghệ được trồng khá phổ biến với nhiều chủng loại đa dạng và phong phú Có thể nói Việt Nam là quốc gia có nguồn nguyên liệu dồi dào và phong phú cho việc chiết xuất curcumin

1.1.2 Ứng dụng trong đời sống

Curcumin là một chất trong củ nghệ được sử dụng như một gia vị phổ biến ở Ấn Độ Có 2 loại curcuminoit khác là desmethoxycurcumin và bis-desmethoxycurcumin Cáccurcuminoit là các polyphenol và là chất tạo màu vàng cho củ nghệ Curcumin có thể tồn tại ít nhất ở hai dạng tautome là keto

và enol Cấu trúc dạng enol ổn định hơn về mặt năng lượng ở pha rắn và dạng dung dịch [5, 6]

Curcumin là phẩm màu thực phẩm tự nhiên có ký hiệu E100(i) [8] và được dùng để nhuộm màu cho nhiều loại thực phẩm khác nhau như dầu, mỡ, nhũ tương mỡ, kem, sản phẩm rau quả, bánh kẹo, bánh mì, thịt, cá, trứng và

các sản phẩm từ thịt, cá, trứng, gia vị, súp, nước sốt, đồ uống, đồ ăn tráng miệng [1]

Củ nghệ là phần thân rễ của loài này được sử dụng trong các món ăn dân tộc, các loại bột carry và súp như là một loại phẩm màu thực phẩm và gia

vị chính Trong y học dân tộc Phương Đông, tính chất làm giảm đau, chống viêm và diệt trừ khối u của Nghệ vàng đã được phát hiện và áp dụng trong các bài thuốc dân gian nhằm trị viêm loét nội tạng và ung bướu Trong củ Nghệ vàng có hoạt chất rất quý đó là curcumin, nó có khả năng tiêu diệt tế bào ung thư rất mạnh và có hoạt tính chống oxi hóa cao gấp 8 lần Vitamin E [8]

Trong những năm gần đây curcumin được ứng dụng và nghiên cứu tạo

ra các nano curcumin thương mại được bán rộng rãi trên thị trường

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của curcuminoids curcumin, demethoxy

curcumin và bis-demethoxy curcumin

1.1.3 Ứng dụng của curcumin trong y học

Củ nghệ bắt đầu được sử dụng trong y học Ayurveda tại Ấn Độ từ khoảng năm 1900 TCN để chữa trị một loạt các loại bệnh tật [10] Nghiên cứu của các nhà khoa học vào cuối thế kỷ 20 đã xác định curcumin đóng vai trò

quan trọng trong các hoạt tính sinh học của củ nghệ [10] Dựa trên những nghiên cứu trong ống nghiệm (In-vitro) và trên động vật, các nhà khoa học đưa ra giả thuyết khả năng chữa bệnh hoặc ngăn ngừa bệnh của curcumin Hiện tại, các tác động này chưa được xác nhận trên người Tuy nhiên, cho tới năm 2008, rất nhiều thử nghiệm lâm sàng ở người đang được thử nghiệm để nghiên cứu về tác dụng của curcumin trong việc điều trị các bệnh như: Viêm tủy, ung thư tụy, hội chứng loạn sản tủy, ung thư ruột kết, bệnh vẩy nến, bệnh alzheimer [11]

Theo nghiên cứu cũng cho thấy curcumin có tính chất chống ung thư [12, 13], chống oxi hóa, chống viêm khớp, chống thoái hóa, chống thiếu máu cục bộ [14] và kháng viêm [15] Khả năng kháng viêm có thể là do sự ngăn chặn tổng hợp sinh học của eicosanoit [16] Curcumin là một chất có triển vọng lớn trong điều trị viêm gan B, C và nhiễm HIV [17] Theo quan điểm của các nhà khoa học, và một con số rất lớn các nghiên cứu cho thấy curcumin có tác dụng tốt cho não, các notron, giảm stress, trầm cảm, trạng thái lo âu [3]

Đặc biệt, khả năng chống ung thư do curcumin ngăn chặn cả 3 quá trình hình thành, phát triển và di căn của ung thư mà không làm ảnh hưởng đến các tế bào lành tính bên cạnh, không có các tác dụng phụ, đồng thời còn làm giảm độc tính của hóa trị, xạ trị [17]

1.2 Vật liệu nano từ tính sử dụng làm chất mang truyền dẫn thuốc

1.2.1 Vật liệu nano oxit sắt từ

1.2.1.1 Cấu trúc tinh thể

Nano Fe3O4 là hợp chất oxit phổ biến của nguyên tố sắt, vật liệu này thuộc họ ferrite spinel có hai phân mạng từ không tương đương và tương tác giữa các phân mạng là phản sắt từ, vật liệu Fe3O4 có cấu trúc spinel đảo

Công thức phân tử: FeO.Fe2O3 = Fe.Fe2O4

Mô hình ion: [Fe3+]A[Fe3+Fe2+]BO

42-Các ion O2- hình thành nên mạng lập phương tâm mặt với hằng số mạng a= 0,8398 nm Các ion Fe3+, Fe2+ có bán kính ion nhỏ hơn sẽ phân bố trong khoảng trống giữa các ion O2- Ion Fe2+ chiếm 1/4 ở vị trí bát diện và ion Fe3+ chiếm 1/8 ở vị trí tứ diện và 1/4 ở vị trí bát diện Cấu trúc này được

mô tả như hình 1.2, trong đó một ô cơ bản bao gồm 8 ô đơn vị và công thức Fe24O32 phân bố như sau: Fe3+8A[Fe2+8Fe3+8]BO32, trong đó A là vị trí tứ diện,

B là vị trí bát diện [18]

Hình 1.2 Cấu trúc tinh thể của vật liệu nano Fe3O4 [30]

1.2.1.2 Tính chất từ

Do lớp vỏ 3d của sắt từ có 4 electron chưa ghép đôi nên nguyên tử sắt

có lực từ mạnh Ion Fe2+ có 4 electron chưa ghép đôi ở lớp vỏ 3d và Fe3+ có 5 electron chưa ghép đôi ở lớp vỏ 3d Do vậy, khi tinh thể oxit sắt từ hình thành

từ nguyên tử Fe2+ và Fe3+ chúng có thể ở trạng thái sắt từ, phản từ hoặc cộng hưởng từ [19]

Khi kích thước vật liệu từ tính giảm xuống nano mét thì cấu trúc đa momen ở thể khối được thay thế bởi cấu trúc đơn momen trong mỗi hạt và tỷ

lệ các nguyên tử bề mặt có thể so sánh được với nguyên tử khối [19]

Lúc này, các tính chất của vật liệu từ xuất hiện nhiều hiện tượng mới khác biệt so với vật liệu khối như: Đặc tính siêu thuận từ, dị hướng bề mặt

hay cấu trúc vỏ lõi với lớp vỏ spin nghiêng Có thể nói từ tính trong vật liệu nano phần lớn do sự đóng góp của hiệu ứng bề mặt và hiệu ứng kích thước

a Momen từ

Momen từ, hay momen lưỡng cực từ là đại lượng vật lý, đặc trưng cho

độ mạnh yếu của nguồn từ Trong trường hợp đơn giản là một dòng điện kín, momen lưỡng cực từ được định nghĩa bởi:

S

m I= ∫∫da (1.1) Với da= r2sinθ.dr.dθ là vi phân véctơ diện tích (có độ lớn là diện tích, chiều là véctơ pháp tuyến của mặt đó, xác định từ quy tắc bàn tay phải, I là cường độ dòng điện Trong trường hợp một điện tích chuyển động quay, momen từ sẽ được cho bởi biểu thức:

2 1

.r sin

2 v

m= ∫∫∫r J θdrd dθ φ(1.2) Với J là mật độ dòng điện

Trong vật lý nguyên tử, vật lý hạt nhân, người ta dùng khái niệm momen từ của các hạt, có đơn vị là magneton Bohr (hay Bohr magneton, ký hiệu là µB) Momen từ của các hạt liên quan đến chuyển động nội tại của các hạt (chuyển động spin) hoặc momen từ của nguyên tử được tạo ra từ momen

từ tổng cộng của các hạt (chuyển động spin) và chuyển động trên quỹ đạo của các hạt Trong một hệ hạt, momen từ được xác định bởi tổng momen từ của các hạt thành phần [20]

Hình 1.3 Mô hình momen từ

b Tính chất từ của vật liệu phụ thuộc vào nhiệt độ

Từ độ của vật liệu ferrite không chỉ phụ thuộc vào từ trường ngoài mà còn phụ thuộc mạnh vào nhiệt độ Mặc dù tương tác trao đổi giữa các momen

từ trong vật liệu ferrite là lớn, nhưng vật liệu sắt từ và cộng hưởng từ trở nên rối loạn và mất từ hóa của chúng khi vượt quá nhiệt độ Curie “TC” (850 K), tại nhiệt độ này momen từ bằng không và phản sắt từ vật liệu bị mất từ hóa của chúng khi vượt quá nhiệt độ Néel “TN” Các oxit sắt từ ổn định ở nhiệt độ phòng, không ổn định ở nhiệt độ cao và có thể mất đi từ tính của chúng theo thời gian [19]

Nhiệt độ Curie thể hiện tính chất nội tại của vật liệu và được khảo sát

đo đạc thông qua đường đo từ độ theo nhiệt độ Ở vùng nhiệt độ thấp, sự phụ thuộc của từ độ theo nhiệt độ được lý giải theo lý thuyết sóng spin được đưa

ra bởi Bloch vào năm 1930 [21]

c.Tính chất từ liên quan đến hiệu ứng kích thước

Cũng như các vật liệu từ khác, ở kích thước nano mét tính chất từ của hạt nano Fe3O4 cũng chịu ảnh hưởng bởi các hiệu ứng kích thước và cả hiệu ứng bề mặt

Động thái siêu thuận từ của các hạt nano oxit sắt có thể là do kích thước của chúng Các hiệu ứng kích thước được nghiên cứu nhiều nhất trong

các hạt nano từ là giới hạn đơn momen và giới hạn siêu thuận từ Thông thường trạng thái từ của vật liệu từ được quyết định bởi sự cạnh tranh của các dạng năng lượng như: Năng lượng dị hướng, năng lượng tĩnh từ, năng lượng Zeman, năng lượng trao đổi Các dạng năng lượng này cạnh tranh với nhau theo xu hướng làm cực tiểu năng lượng toàn hệ, do vậy cấu hình của vật liệu

từ thường được chia thành các cấu trúc momen từ Khi kích thước của khối vật liệu giảm tới một giá trị tới hạn nào đó, sự hình thành vách momen sẽ trở nên không thuận lợi về mặt năng lượng và vật liệu sẽ có cấu trúc đơn momen Trong hạt đơn momen các spin được sắp xếp theo cùng một hướng Kích thước tới hạn của đơn momen lần đầu tiên được đưa ra bởi Frenkel và Dorfman [22]

Bằng thực nghiệm, Morrish và cộng sự đã tính toán giới hạn đơn momen của hạt nano Fe3O4 là 50 nm [23] Trong khi đó nghiên cứu của nhóm tác giả Batlle đưa ra kích thước giới hạn đơn đô men của hạt nano Fe3O4 là

128 nm [24] Nghiên cứu của nhóm tác giả Krishnan đưa ra kích thước tới hạn đơn momen của hạt Fe3O4 cỡ 83 nm [25]

Theo tính toán lý thuyết, kích thước lớn nhất cho trạng thái siêu thuận

từ của hạt nano Fe3O4 là 26 nm và nhiệt độ Blocking ở kích thước này là 300

K [25] Tuy nhiên, nhiều công bố dựa trên kết quả nghiên cứu thực nghiệm cho thấy giá trị kích thước giới hạn siêu thuận từ ở nhiệt độ phòng hạt nano Fe3O4 không thống nhất Dunlop công bố kích thước siêu thuận từ của hạt nano Fe3O4 là 30 nm [26]

Các kết quả nghiên cứu thực nghiệm cho thấy dưới kích thước giới hạn siêu thuận từ giá trị nhiệt độ Blocking phụ thuộc nhiều vào kích thước hạt Nhóm tác giả Caruntu nghiên cứu khá chi tiết về tính chất từ của hạt nano Fe3O4 ở các kích thước khác nhau Nghiên cứu cho thấy giá trị nhiệt độ Blocking tăng lên khi tăng kích thước hạt [27]

Hình 1.4 mô tả sự phụ thuộc của lực kháng từ vào kích thước hạt Dưới kích thước giới hạn của trạng thái siêu thuận từ, rõ ràng các hạt không nhớ được trạng thái từ dư sau khi tắt từ trường và chúng không có tính từ trễ

Hình 1.4 Đồ thị mô tả sự phụ thuộc của lực kháng từ vào kích thước hạt [28]

d Tính chất liên quan đến hiệu ứng bề mặt

Khi kích thước vật liệu từ giảm đến cỡ nanomét thì số nguyên tử trên bềmặt là tương đối lớn so với tổng số nguyên tử của vật liệu, do đó hiệu ứng

bề mặt đóng vai trò quan trọng và ảnh hưởng nhiều đến tính chất từ Hiệu ứng

bề mặt làm giảm momen từ bão hòa và là nguyên nhân chính tạo ra dị hướng trong các hạt nano Fe3O4

Sự suy giảm của từ độ bão hòa được quan sát bằng thực nghiệm trong nhiều hệ hạt nhỏ và được giải thích bằng sự tồn tại của lớp vỏ không từ (lớp chết từhoặc lớp spin nghiêng) trên bề mặt hạt [29]

Hình 1.5 Mô hình với cấu trúc vỏ-lõi của một hạt nano oxit sắt từ [29]

Theo tác giả Gangopadhyay và cộng sự, sự suy giảm momen từ bão hòa theo kích thước trong các hạt từ nano có liên quan tới tỷ lệ đáng kể của diện tích bề mặt so với khối Các hạt được xem như các quả cầu với phần lõi

có cấu trúc spin định hướng song song và từ độ bão hòa tương tự như của mẫu khối đơn tinh thể lý tưởng (hình 1.5) Trong khi đó phần vỏ có cấu trúc spin bất trật tự do các sai lệch về cấu trúc tinh thể và sự khuyết thiếu các ion,

do đó có thể coi từ độ phần vỏ bé hơn nhiều so với phần lõi Khi kích thước hạt giảm, phần vỏ không từ đóng góp đáng kể vào toàn bộ thể tích của hạt do

đó mô men từ giảm [30]

Tác giả Coey và cộng sự khi nghiên cứu các hạt ferrite từ γ-Fe2O3 đưa

ra nhận định rằng: Sự xếp nghiêng một cách hỗn loạn của các spin bề mặt tạo nên các tương tác phản sắt từ cạnh tranh giữa các phân mạng đã làm giảm

MS Do đó giá trị momen từ bão hòa trong các hạt nano oxit sắt thường nhỏ hơn trong vật liệu khối [31]

Khi giảm kích thước hạt, năng lượng dị hướng bề mặt sẽ chiếm ưu thế

so với năng lượng dị hướng từ tinh thể và năng lượng tĩnh từ do tỷ số các nguyên tử trên bề mặt hạt so với bên trong hạt tăng lên Do đó dị hướng bề mặt ảnh hưởng đến momen từ và lực kháng từ

1.2.1.3 Tương tác giữa các hạt sắt từ

Tương tác giữa các hạt nano từ phụ thuộc vào tính chất nội tại, khoảng cách và môi trường giữa các hạt Trong các hệ hạt nano từ thường bao gồm hai loại tương tác là tương tác lưỡng cực giữa các hạt và tương tác trao đổi qua bề mặt của các hạt gần nhau Tuy nhiên tương tác trao đổi qua bề mặt các hạt gần nhau thường xuất hiện trong các vật liệu nano phản sắt từ Trong hệ hạt nano sắt từ và ferrite từ tương tác lưỡng cực đóng vai trò chủ yếu

Các hạt đơn momen từ được xem như có một momen từ khổng lồ (so với momen từ của một spin đơn lẻ) và tạo ra quanh nó một từ trường khá lớn

tại các vị trí lân cận Do đó khi xét đến trạng thái của hạt nano từ thì tương tác lưỡng cực giữa các hạt là yếu tố không thể bỏ qua Năng lượng tương tác lưỡng cực giữa các hạt trong một hệ hạt nano từ được tính theo biểu thức:

2 0 3

4

Ed

d

µ µ π

≈ (1.3) Trong đó µ0 là độ từ thẩm chân không, µ là momen từ riêng của một hạt và d là khoảng cách giữa hai hạt Tuy nhiên khi so sánh với tương tác trao đổi trong vật liệu khối thì tương tác lưỡng cực giữa các hạt nano là yếu

Nhiều công bố cho rằng trong các hệ hạt đơn momen thì tương tác giữa các hạt có thể thay đổi trạng thái khóa của từng hạt đơn lẻ và dẫn tới hiện tuợng đóng băng tập thể Trong các ứng dụng y sinh, năng lượng tương tác lưỡng cực giữa các hạt phải thỏa mãn đủ nhỏ để tránh hiện tượng kết đám trong dung dịch Trên thực tế năng lượng tương tác lưỡng cực giữa các hạt trong dung dịch không thể bỏ qua [32]

1.2.1.4 Phương pháp chế tạo hạt nano sắt từ

Tùy theo từng yêu cầu ứng dụng người ta có thể điều chế các hạt nano

từ tính trong vùng kích thước siêu nhỏ (untrasmall size), siêu thuận từ (superparamagnetic size), vùng kích thước lớn hàng chục nano mét bằng nhiều phương pháp vật lý hóa học khác nhau

Một số phương pháp hiện nay đang được sử dụng trong các phòng thí nghiệm của Việt Nam cũng như trên thế giới có thể kể đến như sau: Phương pháp đồng kết tủa [33], sol-gel [34], nhiệt phân [35], thủy phân [36] Để ứng dụng trong y sinh, hạt nano từ thường được chế tạo theo các phương pháp hóa học

Trong các phương pháp trên, phương pháp sol-gen (vi nhũ tương) là phương pháp khá đơn giản, chi phí thấp Hạt nano Fe3O4 khi được chế tạo bằng phương pháp này có kích thước nhỏ và đồng đều, bề mặt của chúng có

bao phủ một lớp –OH, đây là một nhóm chức quan trọng trong việc tạo liên kết với các chất hoạt hóa bề mặt

Thuật ngữ sol-gel được đề cập đến bởi Schulman và Friend trong thập niên 40 Từ thời gian này, vi nhũ có một lĩnh vực ứng dụng rộng lớn, từ hoàn nguyên dầu tới tổng hợp vật liệu nano Phương pháp sol-gel có nhiều ứng dụng rộng rãi từ thu hồi dầu (oil recovery) tới tổng hợp vật liệu hạt có kích thước nano (nanoparticles) Việc thực hành đầy đủ đầu tiên của hệ vi nhũ nước trong dầu để tổng hợp vật liệu nano được giới thiệu năm 1982 Từ đó, phương pháp này có một ứng dụng được mở rất rộng trong lĩnh vực xúc tác,

từ các phản ứng xảy ra ở nhiệt độ phòng như isome hóa butan tới các phản ứng nhiệt độ cao như phản ứng cháy có xúc tác metan [37]

Nhũ tương là một hệ phân tán cao của hai chất lỏng mà thông thường không hòa tan được với nhau Thể trong (thể được phân tán) là các giọt nhỏ được phân tán trong thể ngoài (chất phân tán) Tùy theo môi trường chất phân tán mà người ta gọi ví dụ như là nhũ tương nước trong dầu hay nhũ tương dầu trong nước

Hệ nhũ tương nước trong dầu là phổ biến hơn để tổng hợp nhiều loại hạt nano kích thước khác nhau Để tạo độ bền cho nhũ tương có thể cho thêm các chất hoạt tính bề mặt Việc làm giảm sức căng bệ mặt giữa nước và dầu sẽ làm dung dịch trong hơn [38]

Hệ vi nhũ tương có thể tạo ra những ngăn rất nhỏ gọi là droplet, được tạo nên nhờ tính lưỡng cực của chất hoạt động bề mặt, được làm đầy bằng nước Trong droplet này, một lượng chất hòa tan được trong nước có thể phân tán Kích thước của các hạt nano sẽ phụ thuộc vào kích thước của các droplet này Do đó, kích thước các hạt nano có thể được thay đổi và điều chỉnh bằng cách thay đổi kích thước các droplet [39]

1.2.1.4 Ứng dụng của vật liệu

Các ứng dụng của hạt nano từ được chia làm hai loại gồm ứng dụng ngoài cơ thể và trong cơ thể Một số ứng dụng tiêu biểu trong rất nhiều ứng dụng đã và đang được nghiên cứu như:

- Các ứng dụng ngoài cơ thể gồm: Phân tách và chọn lọc tế bào nhằm tách những tế bào cần nghiên cứu ra khỏi các tế bào khác

- Các ứng dụng trong cơ thể gồm: Dẫn thuốc, tăng độ tương phản trong ảnh cộng hưởng từ và nhiệt từ trị ung thư

a Phân tách và chọn lọc tế bào

Trong y sinh học, người ta thường xuyên phải tách một loại thực thể sinh học nào đó ra khỏi môi trường của chúng để làm tăng nồng độ khi phân tích hoặc cho các mục đích khác Phân tách tế bào sử dụng các hạt nano từ tính là một trong những phương pháp thường được sử dụng Quá trình phân tách được chia làm hai giai đoạn: Đánh dấu thực thể sinh học cần nghiên cứu,

và tách các thực thể được đánh dấu ra khỏi môi trường bằng từ trường

Việc đánh dấu được thực hiện thông qua các hạt nano từ tính Hạt nano thường dùng là hạt oxit sắt Các hạt này được bao phủ bởi một loại hóa chất

có tính tương hợp sinh học như là dextran, polyvinyl alcohol (PVA), Đây là cách rất hiệu quả và chính xác để đánh dấu tế bào Các hạt từ tính được bao phủ bởi các chất hoạt hóa tương tự các phân tử trong hệ miễn dịch đã có thể tạo ra các liên kết với các tế bào hồng cầu, tế bào ung thư phổi, vi khuẩn, tế bào ung thư đường tiết niệu và thể golgi [40] Đối với các tế bào lớn, kích thước của các hạt từ tính đôi lúc cũng cần phải lớn, có thể đạt kích thước vài trăm nano mét

b Dẫn truyền thuốc

Một trong những nhược điểm quan trọng nhất của hóa trị liệu đó là tính không đặc hiệu Khi vào trong cơ thể, thuốc chữa bệnh sẽ phân bố không tập trung nên các tế bào mạnh khỏe bị ảnh hưởng do tác dụng phụ của thuốc Chính vì thế việc dùng các hạt từ tính như là hạt mang thuốc đến vị trí cần thiết trên cơ thể (thông thường dùng điều trị các khối u ung thư) đã được nghiên cứu từ những năm 1970 [41], những ứng dụng này được gọi là dẫn truyền thuốc bằng hạt từ tính Có hai lợi ích cơ bản là: (i) thu hẹp phạm vi phân bố của các thuốc trong cơ thể nên làm giảm tác dụng phụ của thuốc; và (ii) giảm lượng thuốc điều trị

Hạt nano từ tính có tính tương hợp sinh học được gắn kết với thuốc điều trị Lúc này hạt nano có tác dụng như một hạt mang Thông thường hệ thuốc/hạt tạo ra một chất lỏng từ và đi vào cơ thể thông qua hệ tuần hoàn Khi các hạt đi vào mạch máu, người ta dùng một gradient từ trường ngoài rất mạnh để tập trung các hạt vào một vị trí nào đó trên cơ thể Một khi hệ thuốc/hạt được tập trung tại vị trí cần thiết thì quá trình nhả thuốc có thể diễn

ra thông qua cơ chế hoạt động của các enzym hoặc các tính chất sinh lý học

do các tế bào ung thư gây ra như độ pH, quá trình khuyếch tán hoặc sự thay đổi của nhiệt độ

Quá trình vật lý diễn ra trong việc dẫn truyền thuốc cũng tương tự như trong phân tách tế bào Gradient từ trường có tác dụng tập trung hệ thuốc/hạt Hiệu quả của việc dẫn truyền thuốc phụ thuộc vào cường độ từ trường, gradient từ trường, thể tích và tính chất từ của hạt nano

Nghiên cứu dẫn truyền thuốc đã được thử nghiệm rất thành công trên động vật, đặc biệt nhất là dùng để điều trị u não Việc dẫn truyền thuốc đến các u não rất khó khăn vì thuốc cần phải vượt qua hàng rào băng cách giữa não và máu, nhờ có trợ giúp của hạt nano từ có kích thước 10-20 nm, việc dẫn

truyền thuốc có hiệu quả hơn rất nhiều Việc áp dụng phương pháp này đối với người tuy đã có một số thành công, nhưng còn rất khiêm tốn [42, 43]

c Nhiệt từ trị ung thư

Nhiệt từ trị ung thư là phương pháp điều trị ung thư dựa trên việc đốt nóng các tế bào bằng việc sử dụng hạt nano từ Trong quá trình này các hạt nano từ được đưa tới các khối u ung thư Tại đó, dưới tác động của từ trường xoay chiều, các hạt nano từ có thể sinh nhiệt lên tới nhiệt độ đủ để tiêu diệt tế bào ung thư hoặc làm tăng hiệu quả của quá trình hóa trị Ưu điểm của phương pháp nhiệt từ trị như sau: Tác động trực tiếp và tập trung lên khối u;

Có thể khống chế được nhiệt độ đủ để tiêu diệt tế bào ung thư mà tế bào thường có thể chịu đựng được; do đó làm giảm tác dụng phụ đối với các tế bào khỏe mạnh xung quanh khối u; Có tác dụng phụ ít hơn so với các phương pháp khác như: hóa trị, xạ trị [44]

Tuy nhiên, trong luận văn này chúng tôi tập trung nghiên cứu ứng dụng hạt nano Fe3O4 trong hệ thống phân phối thuốc curcumin

1.2.1.5 Ưu và nhược điểm của vật liệu oxit sắt từ trong ứng dụng làm vật liệu truyền dẫn thuốc

Ưu điểm: Ưu điểm của vật liệu oxit sắt từ như đã được đề cập phần

trên và nó đã trở thành vật liệu có triển vọng trong ứng dụng sử dụng làm vật liệu truyền dẫn thuốc Do các hạt nano từ tính có có tính chất từ độc đáo và khả năng hoạt động ở cấp độ tế bào và phân tử trong tương tác sinh học [45] Mặc dù vậy, sự an toàn và hiệu quả của việc sử dụng các hạt nano kim loại vẫn đang gây tranh cãi giữa các nhà khoa học [46]

Nhược điểm: Các hạt nano sắt từ không ổn định trong không khí và dễ

dàng tích tụ sau khi tổng hợp, dẫn tới không tương thích bề mặt hóa học Đây

sẽ cản trở nghiêm trọng là nhược điểm ứng dụng của chúng trong lĩnh vực y sinh học, đặc biệt để sử dụng trong cơ thể con người [45, 47]

Do đó, Cần thiết phải phủ thêm một lớp phủ lên bề mặt Fe3O4, nó sẽ cung cấp một lớp bề mặt hóa học trơ tương thích với Fe3O4 để giúp tồn tại trong cơ thể sống và làm việc tốt nhắm tới những mục tiêu cụ thể [40, 47, 48] Các hạt nano Fe3O4 thường được bao phủ xung quanh bởi một hợp chất cao phân tử có tính tương hợp sinh học như PVA, detran, hoặc silica Chất bao phủ có tác dụng chức năng hóa bề mặt để có thể liên kết với các nhóm chức khác [40, 48, 49]

1.2.2 Vật liệu nano silica-oxit sắt từ cấu trúc nhân vỏ

Nhằm khắc phục các nhược điểm của vật liệu nano oxit sắt từ Trong số các vật liệu phủ, silica rất hứa hẹn bởi vì lớp vỏ silica đủ dày có thể ngăn chặn các nhân Fe3O4 tiếp xúc hóa học với chất lỏng ăn mòn trung gian, ổn định nhiệt, chống kết tụ các hạt nano Fe3O4, độc tính thấp, ổn định hóa học [48] và quan trọng nhất là những lợi thế của việc có một bề mặt được làm giàu với silica là sự hiện diện của các nhóm silanol bề mặt có thể dễ dàng phản ứng với các tác nhân khớp nối đồng hóa trị khác nhau để đính kèm các phối tử cụ thểvới các hạt nano từ tính Đã làm cho nó trở thành một vật liệu đầy hứa hẹn của sinh học ứng dụng [49]

1.3 Mô hình In-vitro và phương pháp xác định tính độc tế bào ung thư 1.3.1 Mô hình In-vitro

Việc tìm kiếm các phương pháp kiểm tra và thử nghiệm sản phẩm các hợp chất mới tránh sử dụng động vật đã là một mục tiêu của cộng đồng khoa học trong nhiều năm Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế báo trong khoa độc học thì hiện nay đang phát triển với tốc độ đáng lưu ý bởi vậy hiện nay sự lựa chọn thay thế sử dụng động vật đang đã trở thành vấn đề thực tế

Điều này sẽ có tác dụng rất lớn vào khả năng của khoa học để thực hiện các bước đột phá thực sự hướng tới sự thay thế hoàn toàn các loài động vật sử dụng Phương pháp tiếp cận mới sử dụng kiến thức mở rộng của chúng ta về sinh học tế bào và việc sử dụng các gen sẽ giúp cung cấp các mô hình In-vitro cái mà có thể tương quan chặt chẽ hơn với các phản ứng mô trong ống nghiệm

In-vitro trong tiếng Latinh nghĩa là "trong ống nghiệm" là một phương pháp nghiên cứu trong sinh học thực nghiệm cho phép người nghiên cứu sử dụng thành phần, hay bộ phận của một sinh vật (thường ở quy mô tế bào hay

vi khuẩn) dưới dạng cô lập được khỏi môi trường thông thường của nó, để có thể nghiên cứu và phân tích chi tiết hơn trước khi thực hiện trên sinh vật sống Nói cách khác, đây là thử nghiệm thường được gọi là "thí nghiệm trong ống nghiệm"

Khắc phục được những yếu điểm của các thử nghiệm dùng cơ thể sinh học bậc cao Các thử nghiệm In-vitro này thường cho kết quả nhanh, độ lặp lại cao và rẻ hơn nhiều mà độ nhạy của phép thử nghiệm cũng tương đương trong đa số các trường hợp [50] Phương pháp này đã cung cấp một lựa chọn hữu ích để nghiên cứu sự tương tác giữa các tế bào và chủ biểu mô xảy ra trong quá trình nhiễm độc

CHƯƠNG 2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC

NGHIỆM 2.1 Hóa chất

Tween–80 (98%), Butanol, n-heptan, FeCl2.4H2O (99%), Fe(NO3)3.9H2O (99,5%); Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB), acid acetic băng (99,5%), chitosan với độ đề acetyl hóa là 85%, dung dịch NH3 (25%); Curcumin; Ethanol (99%); Aceton (99%); Đệm phosphate pH = 7,4 Các hóa chất được sử dụng có xuất xứ từ Aldrich, Merck và Trung Quốc với

độ tinh khiết cao

FBS của GIBCO, Invitrogen, TCA (Sigma), SRB (Sigma), chất tham khảo: Ellipticine và các dòng tế bào ung thư do GS TS J M Pezzuto, Trường Đại học Hawaii và GS Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia cung cấp

Bước 2: Tương tự, đối với hỗn hợp B chứa 56 ml NH3 28% được phân tán trong 45 ml bao gồm 10 ml Tween-80, 10 ml Butanol và 15 ml n-heptan

Hỗn hợp A, B được khuấy riêng trong 30 phút với tốc độ 800 vòng/phút ở nhiệt độ phòng, để hình thành nên hệ nhũ tương nghịch nước trong dầu

Bước 3: Sau đó, Cho từ từ hỗn hợp B trong bước 2 vào hỗn hợp A trong bình 3 cổ đã chuẩn bị trong bước 1 Thời gian thực hiện phản ứng là 24 giờ Nhiệt độ phản ứng được duy trì ở nhiệt độ phòng, toàn bộ quá trình thực hiện phản ứng được thực hiện trong môi trường khí trơ N2

Bước 4: Mẫu tổng hợp xong được lắng, lọc rửa bằng nước và cồn đến trung trung tính (pH=7)

Quy trình rửa: Phản ứng sau khi kết thúc, bình phản ứng được để nguội

tự nhiên đến nhiệt độ phòng và trong quá trình làm nguội hỗn hợp vẫn tiếp tục được khuấy và sục khí N2

Sản phẩm được siêu âm trong nước cất và lọc rửa nhiều lần đến khi trung hòa bazơ (pH ≈ 7) trước khi rửa lại với cồn

Sản phẩm các hạt oxit sắt từ (nano Fe3O4) sau khi lọc rửa được sấy khô

ở 40 oC qua đêm trong môi trường chân không.Việc bảo quản sản phẩm cũng được bảo quản trong các lọ thủy tinh có nút kín và được điền khí trơ

Sơ đồ khối của quy trình tổng hợp được đưa ra ở hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ khối quá trình tổng hợp nano Fe3O4

Sản phẩm là nano oxit sắt từ (nano Fe3O4)

Sản phẩm được sấy khô ở 40

oC qua đêm trong môi trường

chân không

56mL NH3 28% được phân tán trong 45mL bao gồm 10mL Tween-80, 10mL Butanol và 15mL n-heptan(hỗn hợp B)

Hình 2.2 Hệ thiết bị phản ứng tổng hợp nano Fe3O4 trong phòng thí nghiệm

Hình 2.3 Các hạt nano Fe3O4 sau khi được sấy khô

2.2.2 Tổng hợp vật liệu silica phủ lên nano Fe 3 O 4

Bề mặt các hạt nano oxit sắt từ được phủ lên một lớp silica để tạo ra các hạt nano SiO2-Fe3O4 dạng nhân vỏ (SiO2-Fe3O4) theo phương pháp Stöber

Bước 1: Quá trình tổng hợp, sử dụng 200 mghạt nano sắt từ đã tổng hợp phân tán trong 25 ml nước đề ion và 175 ml ethanol, hỗn hợp sau đó được siêu âm trong 30 phút, khuấy mạnh (400 vòng/phút) và được sục khí N2 trong toàn bộ quá trình

Bước 2: Sau đó, sử dụng 3,5 ml TEOS (0,25%) (Tetraethyl orthosilicate, Si(OC2H5)4) đã được phân tán trong 6 ml dung dịch amoniac (25%) nhỏ từ từ vào hỗn hợp trên, phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ phòng, khuấy liên tục và quá trình phủ hoàn thành sau 14 giờ phản ứng

Bước 3: Silica đã phủ lên nano oxit sắt từ được tách ra khỏi dung dịch bằng cách lắng thông qua từ trường bên ngoài (sử dụng nam châm đất hiếm)

và sau đó được rửa kỹ bằng nước đề ion đến khi pH = 7 sau đó tiếp tục rửa với cồn và sấy khô ở 40 oC quan đêm trong môi trường chân không

Hình 2.4 Sơ đồ khối quá trình phủ silica lên vật liệu nano Fe3O4

2.2.3 Phủ chitosan lên vật liệu nano SiO 2 -Fe 3 O 4

Quá trình phủ chitosan được thực hiện theo 3 bước:

Bước 1: Phân tán 0,1 g vật liệu SiO2-Fe3O4vào hỗn hợp 200 ml nước và 1,5 mg CTAB trong điều kiện khuấy trộn mạnh

Bước 2: Hòa tan 0,8 g chitosan trong 170 ml dung dịch axit axetic (1%) sau đó nhỏ vào hỗn hợp phản ứng ở bước 1 và gia nhiệt hỗn hợp trên đạt 40oC

và quá trình phủ hoàn thành sau 14 giờ phản ứng

Bước 3: Chitosan đã gắn lên vật liệu SiO2-Fe3O4 được tách ra khỏi dung dịch bằng cách lắng thông qua từ trường bên ngoài (sử dụng nam châm)

và sau đó được rửa kỹ bằng nước đề ion đến khi pH = 7 sau đó tiếp tục rửa với aceton và sấy khô ở 40 oC qua đêm trong môi trường chân không

Sơ đồ khối được đưa ra ở hình 2.5

Hình 2.5 Sơ đồ khối quá trình phủ chitosan lên vật liệu SiO2-Fe3O4

2.2.4 Hấp phụ curcumin lên vật liệu CS/SiO 2 -Fe 3 O 4

Quá trình hấp phụ curcumin được thực hiện bằng cách:

Pha hỗn hợp curcumin bằng cách hòa tan 35 mg curcumin hòa tan trong 10 ml cồn tuyệt đối

Cho 40 mg CS/SiO2-Fe3O4 đã tổng hợp ở trên phân tán vào 40 ml nước

đề ion

Trộn hai hỗn hợp ở trên lại với nhau và siêu âm 15 phút, sau đó tiếp tục khuấy mạnh hỗn hợp trong 2 giờ Toàn bộ quá trình được thực hiện ở nhiệt độ phòng và ở môi trường khí trơ

Tại mỗi khoảng thời gian cố định mẫu được lấy ra và phần dung dịch

đã loại bỏ các hạt nano từ được tách ra khỏi bởi nam châm trước khi đem

Phân tán 0,1 g nano SiO2-Fe3O4

vào hỗn hợp 200 ml nước và 1,5

mg CTAB (hỗn hợp A)

Hòa tan 0,8g chitosan trong 170

ml dung dịch axit axetic (1%) (hỗn hợp B)

Nhỏ từ từ hỗn hợp B vào hỗn

hợp A, và quá trình phủ hoàn

thành sau 14 giờ phản ứng

phân tích bằng phổ UV-vis, phần dung dịch và các hạt nano từ đều được đưa trở lại dung dịch sau đó

Sản phẩm thu được được tách bằng cách sử dụng nam châm để lắng (sử dụng nam châm đất hiếm) các hạt xúc tác rồi bỏ phần dung dịch Sản phẩm sau đó được sấy khô ở 40 oC qua đêm trong môi trường chân không

Sơ đồ khối được đưa ra ở hình 2.6

Hình 2.6 Sơ đồ khối quá trình tổng hợp CUR/CS/SiO2-Fe3O4

2.2.5 Nhả curcumin theo mô hình In-vitro

Quá trình nhả curcumin được nghiên cứu trong dung dịch đệm muối photphat (PBS) tại pH = 7,4 giống với môi trường pH trong máu, quá trình được thực hiện như sau:

Sử dụng 300 mg CUR/CS/SiO2-Fe3O4 phân tán trong dung dịch PBS ở

37oC và dưới điều kiện khuấy ở tốc độ 150 vòng/phút Tương tự như thực

Hòa tan 35 mg curcumin

hòa tan trong 10 ml cồn

tuyệt đối (hỗn hợp A)

hiện quá trình hấp phụ curcumin, tại mỗi khoảng thời gian cố định mẫu được lấy ra và phần dung dịch đã loại bỏ các hạt nano từ được tách ra khỏi bởi nam châm trước khi đem phân tích bằng phổ UV-vis, phần dung dịch và các hạt nano từ đều được đưa trở lại dung dịch sau đó

Hình 2.7 Máy sử dụng đo UV-Vis lỏng tại Viện hóa Học

2.2.6 Thử sinh học xác định tính độc trên tế bào ung thư phổi A549

2.2.6.1 Nuôi cấy tế bào ung thư A549

Dòng tế bào ung thư A549 được nuôi cấy dưới dạng đơn lớp trong môi trường nuôi cấy DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 10

mM HEPES, và 1,0 mM sodium pyruvate, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO)

Tế bào được cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37 oC, 5% CO2

2.2.6.2 Xác định tính độc tế bào ung thư

Phương pháp thử độ độc tế bào ung thư In-vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt TBUT ở điều kiện In-vitro Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Monks (1991) Phép thử tiến hành xác định hàm lượng

protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB) Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị

OD càng lớn Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:

- Pha chất thử thành các dải nồng độ thích hợp

- Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm

- Chất thử đã pha ở các nồng độ vào các giếng của đĩa 96 giếng, thêm

tế bào đã điều chỉnh nồng độ phù hợp ở trên vào các giếng này sao cho nồng

độ chất thử trong giếng là 100 µg/ml; 20 µg/ml; 4 µg/ml; 0,8 µg/ml;

- Ủ trong tủ ấm 48 giờ Giếng không có chất thử nhưng có TBUT (190 µl) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0 Sau 1 giờ, giếng đối chứng ngày 0

tế bào sẽ được cố định bằng Trichloracetic acid – TCA

- Sau 48 giờ, tế bào được cố định bằng TCA trong 1 giờ, được nhuộm bằng SRB trong 30 phút ở 37 oC, rửa 3 lần bằng acetic acid rồi để khô ở nhiệt độ phòng

- 10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB, lắc nhẹ trong 10 phút

- Đọc kết quả OD ở bước sóng 515-540 nm trên máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad)

- Phần trăm ức chế sự phát triển của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau:

[OD (chất thử) – OD (ngày 0)] x 100 Phần trăm ức chế = 100% -

OD (đối chứng âm) – OD (ngày 0)