Tổng quan về staphylococcus aureus và đề xuất biện pháp phòng ngừa

Chương I: Giới thiệu 1.1. Đặt vấn đề Trong xã hội hiện nay tình trạng ngộ độc thực phẩm ở trên thế giới và Việt Nam là rất cao. Tình trạng này chưa có dấu hiệu dừng lại và càng ngày càng tăng. Qua kiểm tra cho thấy hầu hết các vụ ngộ độc thực phẩm này là do vi sinh vật gây ra. Đây là điều đã được cảnh báo và đã có cách thức phòng ngừa nhưng vẫn xảy ra các vụ ngộ độc tập thể gây nguy hiểm và có thể dẫn đến tử vong. Hầu hết các vụ ngộ độc thực phẩm thường là do Salmonella, E.coli, Staphylococcus aureus và một số loài khác gây ra. Đặc biệt Staphylococcus aureus là 1 trong những vi sinh vật gây ngộ độc cao nhất. Ngoài ra Clostridium botulium và nấm mốc cũng là những loài gây ngộ độc thực phẩm cho con người. Chính vì vậy chúng ta cần phải tìm hiểu những yếu tố gây bệnh của các vi sinh vật này để có những cách phòng ngừa có hiệu quả hơn. Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi đã tiến hành thục hiện bài khóa luận: “Tổng quan về Staphylococcus aureus và đề xuất biện pháp phòng ngừa lậy nhiễm trên thực phẩm”. Nội dung bài khóa luận này sẽ đáp ứng cho ta một cái nhìn tổng quan về một số độc tố vi sinh vật gây bệnh trên thực phẩm, phương pháp xác định và các biện pháp phòng chống lây nhiễm vi sinh vật trên thực phẩm.

Chương I: Giới thiệu

1.1 Đặt vấn đề

Trong xã hội hiện nay tình trạng ngộ độc thực phẩm ở trên thế giới và Việt

Nam là rất cao Tình trạng này chưa có dấu hiệu dừng lại và càng ngày càng tăng.Qua kiểm tra cho thấy hầu hết các vụ ngộ độc thực phẩm này là do vi sinh vật gây ra.Đây là điều đã được cảnh báo và đã có cách thức phòng ngừa nhưng vẫn xảy ra các

vụ ngộ độc tập thể gây nguy hiểm và có thể dẫn đến tử vong

Hầu hết các vụ ngộ độc thực phẩm thường là do Salmonella, E.coli,

Staphylococcus aureus và một số loài khác gây ra Đặc biệt Staphylococcus aureus là

1 trong những vi sinh vật gây ngộ độc cao nhất Ngoài ra Clostridium botulium vànấm mốc cũng là những loài gây ngộ độc thực phẩm cho con người

Chính vì vậy chúng ta cần phải tìm hiểu những yếu tố gây bệnh của các vi

sinh vật này để có những cách phòng ngừa có hiệu quả hơn

Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi đã tiến hành thục hiện bài khóa luận:

“Tổng quan về Staphylococcus aureus và đề xuất biện pháp phòng ngừa lậy nhiễmtrên thực phẩm”

Nội dung bài khóa luận này sẽ đáp ứng cho ta một cái nhìn tổng quan về một

số độc tố vi sinh vật gây bệnh trên thực phẩm, phương pháp xác định và các biệnpháp phòng chống lây nhiễm vi sinh vật trên thực phẩm

1.2 Mục đích

Nghiên cứu về những độc tố vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm và đi sâu

tìm hiểu, tổng quan về một số loài thường xuyên gây nhiễm trong thực phẩm như:Clostridium botulinum và độc tố botulin, nấm mốc và các độc tố thường gặp của nấmmốc

Quan trong nhất là tìm hiểu tổng quan về Staphylococcus aureus và đề xuất

một số biện pháp phòng ngừa lây nhiễm vi sinh vật này trên thực phẩm

1.3 Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu các đặc điểm về hình thái, cấu tạo, di truyền, hoạt động sinh lí,

hóa học… của 1 số nhóm vi sinh vật

Nghiên cứu các cơ chế gây độc, độc tính và của 1 số nhóm vi sinh vật gây

bệnh cho người và động vật

Nghiên cứu về các phương pháp phát hiện và đề xuất biện pháp phòng ngừa

lây nhiễm trên thực phẩm

Chương II: Tổng quan

2.1 Một số độc tố vi sinh vật trong thực phẩm

2.1.1 Độc tố botulin

2.1.1.1 Giới thiệu về Clostridium botulinum

Clostridium botulinum là trực khuẩn, kỵ khí bắt buộc Clostridium botulinum

tồn tại ở trong đất, nước thải, bùn, đầm lầy, hồ và các vùng nước ven biển, thực vật

và trong hệ thống đường ruột của cá Trái cây và rau quả có thể bị nhiễm độc từ đất,

cá bị nhiễm độc từ nước Ngoài ra, các thực phẩm khác nhau có thể bị nhiễm độc từnhiều nguồn nhất định

Clostridium botulinum phát triển thuận lợi ở 26-28 0 C, chúng tiết ra độc tố

toxin botulinum, sinh khí hydro sulfur (H 2 S) và sinh hơi

Về đặc điểm nuôi cấy các tế bào này nhạy cảm và không phát triển với nồng

độ pH thấp (<4,6), nồng độ muối cao trên 1% có thể ngăn cản sự phát triển của vikhuẩn Clostridium botulinum không thể sử dụng lactose như là một nguồn carbonchính

2.1.1.2 Giới thiệu về độc tố botulin

a Cấu trúc

Độc tố botulin được tổng hợp như là một chuỗi polypeptide duy nhất với

trọng lượng phân tử 150000 dalton, ở cấu trúc này phần độc tố có hoạt lực tương đốithấp

Khi bị một số enzyme của vi khuẩn và trypsin tách ra thì độc tố này tạo thành

2 chuỗi nhẹ gồm 1 đầu chứa carboxyl (mảnh A) có trọng lượng phân tử là 50000dalton và nặng gồm 1 đầu chứa amino (mảnh B) có trọng lượng phân tử là 100000dalton được nối với nhau bằng cầu nối disulfur có gắn với 1 phân tử Zn

Các đoạn ở điểm cắt A của độc tố trên một trọng lượng phân tử cơ bản trở

thành độc tố mạnh nhất trong tự nhiên

Hình 2.1: Cấu trúc của độc tố botulin

b Cơ chế độc tố botulin

Tính gây bệnh của Clostridium botulinum phụ thuộc hoàn toàn vào việc sản

xuất độc tố thần kinh Các độc tố hoạt động trên dây thần kinh ngoại vi tiết ra

acetylcholine để ngăn chặn sự phóng thích acetylcholine ở đoạn giao thần kinh cơ.Điều này ngăn cản cơ hoạt động bình thường và là nguyên nhân gây ra bệnh bại liệt.Hoạt động của độc tố khởi đầu bởi những cách sau:

- Nhiễm độc sơ cấp: đây là kết quả của việc tiêu thụ các loại thực phẩm trong

đó bị nhiễm các bào tử sản xuất ra các độc tố

- Sự truyền nhiễm sơ cấp đi theo sau bởi nhiễm độc: đây là kết quả từ việc uốngthực phẩm có chứa bào tử Clostridium botulinum sản sinh, phát triển và sản xuất độc

tố trong ruột Sau khi ăn phải chất độc được sản xuất trong cơ thể, nó được hấp thụbởi các phần trên của đường tiêu hóa Từ đường tiêu hóa nó đi qua máu và hệ thốngbạch huyết đến chỗ nối thần kinh cơ ngoại vi Quá trình nhiễm độc thần kinh nàygồm 4 bước:

+ Độc tố ràng buộc: tại miền ràng buộc của chuỗi nặng các chất độc thần kinh

liên kết với các thụ thể protein và lipid gangliosides (một nhóm thuộc các chất

glucolipid trong não, gan, lá lách và hồng cầu) trên màng tế bào thần kinh

+ Tiếp thu độc tố: độc tố thần kinh được tiếp thu bằng năng lương phụ thuộc

vào quá trình thâm nhập nội bào Độc tố được đưa vào bên trong cơ quan nội bào làtrung gian giữa các miền di dời của chuỗi nặng.

+ Sự di chuyển qua màng tế bào: chất độc thần kinh của chuỗi nhẹ di chuyển

theo mạch máu ở cơ quan nội bào đến tế bào thông qua sự tăng giảm pH Độ pH của

cơ quan nội bào được chuỗi nhẹ cho phép di chuyển từng phần thông qua các kênhhình thành bởi chuỗi nặng Những kênh này điều chỉnh sự chuyển động của chuỗinhẹ vào trong tế bào chất Ngoài ra, chuỗi nhẹ sẽ tách ra thông qua sự giảm bớt củamối nối disulphide, đây là liên kết duy nhất của 2 chuỗi

+ Gây tắt nghẽn do sự giải phóng acetylcholine: chuỗi nhẹ của độc tố thần kinh

là 1 endoprotease chúng liên kết với các thụ thể N-ethylmaleimide nhạy cảm với cácyếu tố thủy phân protein Những protein này giải phóng các chất truyền thần kinhđặc biệt là acetylcholine

Enzyme thủy phân các protein độc tố ngăn cản sự hợp thành các túi tiết

acetylcholine trên bề mặt bên trong của màng tế bào với các màng nơron trước khớpthần kinh (sinap) Điều này dẫn đến việc ức chế để giải phóng acetylcholine tạinhững khớp thần kinh tiết acetylcholine ngoại vi, đó cũng chính là mục đích hoạtđộng của độc tố botulin Đầu tiên các dây thần kinh của não bị ảnh hưởng gây tê liệtsau đó đến các dây thần kinh vận động và các cơ bắp

2.1.2 Độc tố nấm mốc

2.1.2.1 Giới thiệu chung về nấm mốc

a Hình thái

Nấm mốc là vi sinh vật không có diệp lục tố nên không có khả năng tự tổng

hợp các chất dinh dưỡng cho chính bản thân Do đó, chúng chỉ phát triển trên nguồndinh dưỡng có sẵn

Nấm mốc là loài vi sinh vật phát triển thành hình sợi phân nhánh Những sợi

phân nhánh này phát triển thành từng đám, người ta gọi là khuẩn ty Khuẩn ty khiphát triển trên môi trường đặc thường phân ra 2 loại: khuẩn ty ký sinh và khuẩn ty

dinh dưỡng.

Hai loại khuẩn ty này đóng vai trò và nhiệm vụ khác nhau, khuẩn ty dinh

dưỡng có nhiệm vụ hút chất dinh dưỡng, khuẩn ty ký sinh có vai trò là sinh sản mỗisợi nấm thì phát triển thành những bộ phận khác nhau

Nấm mốc không di chuyển được vì không có cơ quan vận chuyển, nấm mốc

chỉ phát triển trong điều kiện môi trường thoáng khí

So với vi khuẩn nấm mốc chịu được nhiệt độ và độ acid thấp hơn, đây là 1

trong những đặc điểm cơ bản cần thiết trong quá trình phân lập nấm mốc

Về màu sắc và hình thái khối lượng bào tử cũng có nhiều kiểu khác nhau

b Cấu tạo

Do cấu tạo đặc biệt, nấm mốc hoàn toàn khác với vi khuẩn và nấm men Dựa

vào cấu tạo người ta chia nấm mốc ra làm 2 loại:

- Loại nấm mốc có vách ngăn: đây là trường hợp khuẩn ty tạo thành do 1 chuỗi

tế bào nối tiếp nhau Ngăn cách 2 tế bào là một màng ngăn Tế bào nấm thường có

đủ cơ quan của 1 tế bào, trong đó quan trọng là có nhân thường thấy ở Aspergillus vàPenicillium

- Loại nấm mốc không có vách ngăn: đây là những nấm mốc nhiều hạch, giữa

các hạch không có màng ngăn, hầu hết các tế bào nấm không có lớp vỏ cellulose như

ở thực vật mà có lớp vỏ kitin như ở lớp vỏ cứng của sâu bọ Tế bào nấm rất giàu cáchoạt tính sinh học và giàu kháng sinh nên đã được con người sử dụng nấm mốc sảnxuất những sản phẩm phục vụ cho đời sống

Hình 2.2: Nấm mốc Aspergillus

Hình 2.3: Penicillium chrysogenum

c Hình thức sinh sản

+, Sinh sản sinh dưỡng

Nấm mốc có thể sinh sản phát triển bằng khuẩn ty, trong lòng khuẩn ty có sự

xuất hiện của một hay nhiều tế bào hình cầu, có màng dầy bao bọc, bên trong cónhiều chất dự trữ Gặp điều kiện thuận lợi thì các tế bào hình cầu này sẽ phát triểnthành một sợi nấm mới

Nấm mốc còn có thể sinh sản bằng hạch nấm, đây là 1 khối hình tròn đều, bên

trong là một tổ chức sợi xốp và thường có màu trắng khi gặp điều kiện thuận lợichúng sẽ phát triển bình thường

+, Sinh sản vô tính

Đây là kiểu sinh sản chủ yếu bằng bào tử, các bào tử có thể được tạo thành từ

những phương pháp sau:

- Bào tử được tạo thành do sự cắt đoạn của các sợi nấm

- Bào tử có thể được tạo thành từ tế bào sinh bào tử bằng cách nảy chồi

- Bào tử được tạo thành bằng cách ngăn vách với tế bào ngay khi bào tử mới

hình thành

Ngoài ra nấm mốc còn có thể sinh sản bằng hữu tính bằng cách sinh sản bằng

bào tử tiếp hợp

2.1.2.2 Giới thiệu về mycotoxin

Có đến 30-40% số nấm mốc đã được phân loại để có thể sản sinh ra độc tố với

liều lượng và độc tính khác nhau, nhiều loại nấm mốc khác nhau có thể sản sinh racùng một loại độc tố Một loài nấm mốc có thể sản sinh ra các loại độc tố khác nhautùy thuộc vào điều kiện môi trường và cơ chất Các loại độc tố này được gọi chung làmycotoxin

Mycotoxin là các hợp chất trao đổi bậc 2 có độc tính và do một số vi nấm

tổng hợp trong quá trình trao đổi chất xảy ra ở tế bào trong các điều kiện xác địnhMycotoxin là độc tố có khả năng gây độc cấp và mãn tính trên động vật và

con người Hội chứng độc do ăn phải mycotoxin được gọi chung là mycotoxicoses

Sự sinh trưởng của nấm mốc trên thực phẩm rất phổ biến ở khí hậu ấm và ẩm cóhàng trăm loại mycotoxin được sản sinh từ các giống Aspergillus, Penicillium vàFusarium

Mycotoxin có thể được phân loại theo bản chất và cấu trúc hóa học, theo tác

nhân tổng hợp mycotoxin hoặc theo bệnh lý do mycotoxin gây nên

Những mycotoxin thường gặp trong chuỗi thực phẩm là:

Có thể tìm thấy aflatoxin trong các loại thực phẩm khác nhau như: ngô, gạo,

bánh mì và các loại hat chứa dầu

Aflatoxin là một sản phẩm trao đổi thứ cấp bậc hai trong quá trình phát triển

của vi nấm, nó không phải là chất dự trữ và cũng không phải là chất cặn bã

a Nguồn gốc

Các chủng nấm mốc tổng hợp aflatoxin chủ yếu thuộc Aspergillus flavus,

A.parasiticus, A.nomius Loài Penicillium puberulum có thể sản sinh ra các aflatoxinnhưng với số lượng ít

Không phải tất cả các chủng Aspergillus flavus được khảo sát đều sản sinh ra

aflatoxin, chỉ có 71% các chủng là có khả năng sản sinh ra aflatoxin, trong đó 23%các chủng sản sinh aflatoxin ở mức cao nhất

Loài Aspergillus flavus có ở khắp mọi nơi: đất, các hợp chất hữu cơ, các loại

hạt nhưng chủ yếu là các loại hạt có dầu A flavus thường gặp trên lúa mì, trên cácphế phẩm bột sống và trong bánh mì Ngoài ra, A flavus còn được tìm thấy trên ngô,gạo, trên các sợi bông và hạt bông

A flavus rất dễ nhận biết, A flavus có các bào tử tương đối lớn màu vàng nâu

đến hơi lục Chủng này thích hợp phát triển trong điều kiện khí hậu ẩm và nóng,

nhiệt độ thích hợp để sản sinh A flavus là từ 25 0 C-28 0 C, ở nhiệt độ trên 45 0 C A.flavus sẽ bị ức chế

Trong nuôi cấy độc tố aflatoxin B 1 được tạo ra nhiều nhất, sau đó là aflatoxin

G 1 , tiếp sau là aflatoxin B 2 , độc tố aflatoxin G 2 rất ít xuất hiện và ít nguy hiểm hơn.Aflatoxin B 1 phát triển ở nhiệt độ 25 0 C-28 0 C còn aflatoxin G 1 phát triển ở nhiệt độ

30 0 C

b, Cấu trúc của aflatoxin

Các aflatoxin B 1 , B 2 , G 1 , G 2 đã được nghiên cứu và xác định cấu tạo hóa học.Công thức của aflatoxin B 1 là C 17 H 12 O 6 , công thức của aflatoxin G 1 là C 17 H 12

O 7 Trong

cấu trúc phân tử của 2 aflatoxin B 1 và G 1 có nhóm lacton và metoxyl, không có nhómhydroxyl tự do Aflatoxin B 1 chứa 1 vòng lacton còn aflatoxin G 1 chứa 2 vòng lacton.Sau đó, hai aflatoxin B 2 , G 2 cũng được phát hiện Chúng có công thức hóa

học hoàn toàn giống aflatoxin B 1 , G 1 chỉ khác là nối đôi trong vòng hydrofuran đã bịkhử Công thức của aflatoxin B 2 là C 17 H 14 O 6 , còn công thức của aflatoxin G 2 là

C 17 H 14 O 7

Hình 2.4: Cấu trúc phân tử của aflatoxin B 1 , B 2 , G 1 và G 2

Năm 1963 trong nghiên cứu chất độc ở sữa và thịt bò đã ăn phải thực phẩm có

aflatoxin Alicroft và Carnaghan đã nhận thấy trong 2 loại thực phẩm này có dẫn

xuất của aflatoxin B 1 và B 2 Độc tố này được gọi là “độc tố sữa”, là các chất hydroxylhóa của aflatoxin B1 và B2 tại vị trí 9a lần lượt được gọi là aflatoxin M 1 và M 2 Côngthức nguyên của aflatoxin M 1 là: C 17 H 12 O 7 , công thức nguyên của aflatoxin M 2 là:

C 17 H 14 O 7

Hình 2.5: Cấu trúc phân tử của aflatoxin M 1

Hình 2.6: Cấu trúc phân tử của aflatoxin M 2

c Cơ chế gây độc của aflatoxin

Aflatoxin có khả năng liên kết với DNA trong nhân tế bào, sự liên kết này gây

ức chế enzyme polymerase của RNA làm hạn chế sự tổng hợp RNA và gây ức chếpolymerase t-RNA Đây là nguyên nhân làm giảm sự tổng hợp protein trong tế bào.Ngoài ra, vòng lacton, -lacton không bão hòa có trong phân tử aflatoxin

làm cho chất này có hoạt tính gây ung thư, đồng thời vòng lacton này gây ức chế

tổng hợp DNA trong nhân tế bào và làm rối loạn sự tăng trưởng bình thường của tếbào

Các quá trình gây độc của aflatoxin lên tế bào qua 5 giai đoạn:

- Tác động qua lại với DNA ức chế các polymerase chịu trách nhiệm tổng hợp

DNA và RNA

- Ngưng tổng hợp DNA

- Giảm tổng hợp DNA và ức chế tổng hợp RNA truyền tin

- Biến đổi hình thái nhân tế bào

- Giảm tổng hợp protein

d Độc tính của aflatoxin

Độc tính của aflatoxin có hai loại đó là độc tính cấp và độc tính mãn

- Độc tính cấp là sự ngộ độc cấp tính thể hiện bằng cái chết của các động vật thí

nghiệm trong những khoảng thời gian thay đổi tùy theo khả năng chịu đựng của từngloài Giải phẫu bệnh cho thấy hoại tử và chảy máu ở nhu mô gan, viêm tiểu cầu thậncấp, tụ máu ở phổi gan dần mất màu còn thể tích thì tăng lên Khi không có nối đôi

ở vòng furan đầu thì độc tính giảm đi 4,5 lần Như vậy B 1 độc hơn B 2 và G 1 độc hơn

G 2 Và độc tính cũng giảm khi có hai vòng lacto (G 1 và G 2 ) do đó aflatoxin loại B độc

hơn loại G Độc tính của aflatoxin rất cao và làm tổn thương đến tế bào

- Độc tính mãn là những triệu chứng do nhiễm độc mãn tính Biểu hiện đầu

tiên là ăn kém ngon và chậm lớn, thậm chí xuống cân, gan là nơi chịu ảnh hưởngnặng nhất của chất độc Ảnh hưởng về mặt hóa sinh lên tế bào đã có nhiều nghiêncứu về sự tác động của aflatoxin trên các acid nucleic và sự tổng hợp protein.

2.1.2.4 Ochratoxin

Có thể tìm thấy ochratoxin trong lúa mì, ngô, lúa mạch, bột mì, gạo, hạt cà

phê và các thức ăn gia súc hỗn hợp khác nhau

Các mẫu thực phẩm chứa ochratoxin A (OTA) như nho, ngũ cốc, cà phê Sự

nhiễm OTA phụ thuộc rất nhiều vào xuất xứ địa lý của nguyên liệu

a Nguồn gốc

Các chủng nấm mốc có khả năng tổng hợp ochratoxin chưa được xác định,

nhưng một số nghiên cứu gần đây lại cho thấy các chủng nấm mốc có thể rất khácnhau trên các đối tượng khác nhau và thuộc vào giống nấm mốc phổ biến Aspergillus

và Penicillium

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự phát triển của nấm mốc sản sinh ra

ochratoxin khác nhau và việc hình thành ochratoxin từ chúng phụ thuộc rất khácnhau về nhiệt độ, độ ẩm, hoạt động nước của sản phẩm và bản chất sản phẩm

Các chủng sinh ochratoxin khác nhau theo khu vực địa lý, khí hậu và bản chất

của sản phẩm bi nhiễm Các chủng tổng hợp ochratoxin cũng có thể tổng hợp đồngthời nhiều loại mycotoxin như acid penicillic hoặc citrinin

b Cấu trúc của ochratoxin

Cấu tạo hóa học thì ochratoxin A là hợp chất của izocumarin liên kết với 1

nhóm L-phenylalamin Độc tính của achratoxin khác nhau liên quan tới việc nhómhydroxyl phenol được tách ra khó hay dễ

Hình 2.8: Cấu trúc các độc tố của fumonisin B 1 , B 2 , B 3

c Cơ chế gây độc của fumonisin

Cấu trúc của fumonisin gần giống với cấu trúc của sphingosin, điều này cho

phép giả định là fumonisin có thể ảnh hưởng tới trao đổi chất của sphingosin trong

cơ thể Sphingosin là các tiền chất của mọi sphingolipid, bao gồm sphingomyelin,ceramid và gangliosid

Độc tính của fumonisin B 1 liên quan mật thiết tới các hiệu ứng lên sự trao đổi

chất các sphingolipid, bao gồm các quá trình sinh tổng hợp mới, tích lũy các

sphingolipid tự do, quá trình thải loại các sphingolipid phức tạp, tăng cường phângiải các sphingoid tự do, tăng hàm lượng các lipid và sphingosin Các hiệu ứng nàydẫn đến hàng loạt các phản ứng sinh hóa gây ra các sự nhiễm độc khác nhau

Các fumonisin có tính đặc hiệu tới sự tổng hợp các sphingosin, thể hiện ở sự

ức chế serin Không phát hiện các hiệu ứng tương tự của fumonisin đến sự tổng hợpcác phosphatidylserin, phosphatidylcholin và các acid béo

Vị trí hoạt động của fumonisin là sphingosin và sphingosin N transacetylase

trong phản ứng kết hợp của thiolase với sphingosin và sphingosin để tạo thành

dihydroceramid và ceramid

Do sự ức chế của fumonisin, số lượng tế bào gan giảm xuống 25% sau 24 giờ

và 50% sau 4 ngày, các hoạt động của fumonisin nhạy cảm với tế bào gan hơn so với

tế bào thận

Sự nhiễm fumonisin lâu dài ở nồng độ cao có thể gây ra các ảnh hưởng ở mức

tế bào hoàn toàn khác với sự ảnh hưởng của sphingolipid

Do các tế bào não rất giàu sphingolipid nên các tổn thương thần kinh có thể

do sự nhiễm độc fumonisin B 1 gây nên Hoạt tính gây ung thư của fumonisin B 1 cũng

trên thức ăn gia súc Người ta đã phân lập được patulin trên ngũ cốc, trên các sản

phẩm dạng hạt, trên hoa quả Thực phẩm có khả năng nhiễm patulin cao nhất là táo

và các sản phẩm từ táo

Hình 2.9: Cấu trúc phân tử của patulin

c Cơ chế gây độc của patulin

Patulin là một độc tố gây tổn hại cho DNA hoặc các NST trong 1 thời gian

ngắn Ngoài ra, patulin còn ngăn cản sự hô hấp hiếu khí, làm giảm sự hoạt động củatriphosphatase adenosine

Patulin kích thích các sợi DNA gây vỡ các tế bào Hela và làm NST bị sai lệch

dẫn đến DNA, protein và sự tổng hợp RNA đều bị ảnh hưởng

Nghiên cứu cơ chế của các tế bào liên kết với độc tính đường ruôt của patulin,

người ta nhân thấy 2 tế bào biểu mô ruột ở người (HT-29- D4 và CaCO-2- 14) đã tiếpxúc với mycotoxin, dẫn đến các chịu trứng viêm ruột do patulin gây ra

d Độc tính của patulin

Patulin ảnh hưởng đến hoạt động của một số enzym như ATPase, alkaline

phosphatase, aldolase, hexokinase, đồng thời kích hoạt enzym glycogen

phosphorylase làm cho nồng độ glucose trong máu tăng 60%

Patulin ức chế sự tổng hợp của các protein, được coi là chất độc có khả năng

gây ung thư cho người

Hoạt tính suy giảm miễn dịch của patulin củng đã được phát hiện Patulin có

liên quan tới các chứng xung huyết, gây loét niêm mạc, đặc biệt là niêm mạc ruột.2.2 Tổng quan về Staphylococcus aureus

Ngày 09/04/1880 bác sĩ người Scotland Alexander Ogston đã trình bày tại hội

nghị lần thứ 9 hội phẫu thuật Đức một báo cáo khoa học, trong đó ông sử dụng khái

niệm tụ cầu khuẩn (staphylococcus) và trình bày tương đối đầy đủ vai trò của vikhuẩn này trong các bệnh lý sinh mủ lâm sàng

Đến năm 1881 Ogston đã thành công trong việc gây bệnh thực nghiệm, đây làtiền đề cho những nghiên cứu về S.aureus sau này

Đến năm 1884 Rosenbach đã thực hiện một loạt các nghiên cứu tỉ mỉ hơn về

vi khuẩn này Và ông đã đặt tên cho vi khuẩn này là Staphylococcus aureus

Năm 1926 Julius von Daranyi là người đầu tiên phát hiện mối tương quan

giữa sự hiện diện hoạt động men coagulase huyết tương của vi khuẩn với khả nănggây bệnh của nó Tuy nhiên mãi đến năm 1948 phát hiện này mới được chấp nhậnrộng rãi

2.2.2 Phân loại

2.2.2.1 Phân loại khoa học

Về phân loại khoa học Staphylococcus aureus được xếp vào:

Loài: Staphylococcus aureus

Tên khoa học là: Staphylococcus aureus Rosenbach 1884

Căn cứ vào sự nhạy cảm của phag, người ta chia tụ cầu thành typ phag

Những bộ phage cho phép xếp loại phần lớn các chủng tụ cầu thành bốn nhóm phagchính Định typ phage tụ cầu để xác định các nhóm tụ cầu khác nhau

2.2.3 Hình thái

Staphylococcus aureus (còn được gọi là tụ cầu vàng) có dạng hình cầu, gram

(+), đường kính 0,8 – 1m và đứng thành hình chùm nho, hình thức tập hợp này do

vi khuẩn phân bào theo nhiều chiều trong không gian

Trong bệnh phẩm thì vi khuẩn thường thường họp lại từng đôi một hay tạo

thành những đám nhỏ Vi khuẩn này không di động, không có lông, không sinh nhabào và thường không có vỏ

Hình 2.10: Hình thái đặc trưng của Staphylococcus aureus

2.2.4 Đặc điểm

2.2.4.1 Tính chất nuôi cấy

Staphylococcus aureus phát triển dễ dàng ở môi trường thông thường, là vi

khuẩn kỵ khí tùy nghi Phát triển được ở nhiệt độ 10 - 45 0 C, mọc tốt ở 37 0 C nhưngtạo sắc tố tốt ở 20 0 C

Ở môi trường canh thang thì sau 5 - 6 giờ làm đục môi trường, sau 24 giờ thì

làm đục rõ, để lâu có thể lắng cặn

Ở môi trường thạch, khuẩn lạc tròn lồi, bóng láng, óng ánh, đường kính

khoảng 1 - 2 mm, có thể có màu vàng đậm, màu vàng cam hoặc màu trắng, tương đốilớn sau 24 giờ

2.2.6 Các yếu tố độc lực

2.2.6.1 Các protein bề mặt và các protein tiết ra môi trường

Protein A (SPA): tất cả các chủng tế bào tụ cầu vàng đều có lớp protein A bao

xung quanh Lớp protein này có tác dụng gắn phần Fc của IgG và do đó vô hiệu hóatác dụng của kháng thể này IgG là loại kháng thể có tỷ lệ cao nhất (70%) trong cácloại kháng thể và đóng vai trò quan trọng nhất trong chống nhiễm trùng

Protein gắn fibronecctin A và B (fibronecctin binding Proteins A and B,

FnBPA, FnBPB) bám vào thụ thể fibronecctin trên bề mặt tế bào biểu mô, gen mãhóa đã được xác dịnh là FnBPA và FnBPB Yếu tố kết tụ A và B ( Clumping factor

A and B, CIfA, CIfB): adherin gắn vào fibronecctin tạo các yếu tố kết tụ CIfA vàCIfB hoạt hóa gây ngưng tụ tiểu cầu.

Protein gắn collagen (collagen binding Proteins, Can): adherin đẩy mạnh sự

gắn kết của protein với collagen, sự tương tác với collagen là bước quan trọng trongviệc thúc đẩy sự gắn kết của vi khuẩn gây tổn hại mô Sư gắn kết này gây ra bệnhviêm xương tủy và nhiễm trùng khớp

Protein gắn sialoprotein xương (Bone sialoprotein binding Proteins, Bbp):

adherin cho sialoprotein xương gây ức chế các Bbp với các tế bào tụ cầu, làm giảmkhả năng đề kháng của xương gây ra các bệnh về viêm khớp

Protein nhạy cảm plasmin (Plasmin – sensitive Protein, PIs): là protein có bề

mặt lớn, có thể tương tác với vi khuẩn và tế bào cơ thể như là fibronectin, kháng thể.Làm cho vi khuẩn không thể bám dính được

Protein liên quan tới Biofilm (Biofilm – associated Proteins , Bap): cấu trúc

của biofilm là các vi khuẩn và lớp vỏ glycocalyx bản chất là polysaccharide có thểtương tác với vi khuẩn đang xâm nhập tổ chức, giúp các vi khuẩn này bám vào thành

tế bào, không bi đào thải ra bên ngoài, tránh được các tác động của thực bào, khángthể và kháng sinh

Protein gắn elastin (elastin binding Proteins, EbpS): adherin đẩy mạnh sự gắn

kết của các protein với elastin gây ảnh hưởng đến động mạch và làm cho máu ngưnglưu thông trong cơ thể

Protein gắn ngoại tế bào (Extracellular matrix – binding Proteins, Ehb):

protein cộng hợp rất lớn ở vách tụ cầu vàng, thúc đẩy sự kết dính các protein với vậtĐộc tố này có bản chất là protein, chúng tạo ra các protein nhiều thành phần

và gây tổn hại màng, không chịu nhiệt và gây độc cho bạch cầu người và thỏ, khônggây độc cho bạch cầu các loài động vật khác Nó cũng có tác dụng hoại tử da thỏMột số chủng S.aureus tiết ra 1 loại độc tố gọi là Panton-Valentine leucocidin

(PVL), độc tố này có mặt trong cơ thể người khỏe mạnh (khoảng 0,6%) gây triệu

chứng bệnh viêm khớp, viêm phổi ở người.

PVL là 1 synergohymenotropic exotoxin Đây là 1 độc tố thuộc họ độc tố gồm

2 thành phần và hoạt động thông qua sự hỗ trợ của 2 protein Độc tố này gây ức chếcác tế bào bạch cầu hạt, đại thực bào kích thích bạch cầu ở người tạo ra các enzyme(glucuronidaza và lysozyme), các thành phần chemotactic (Leucotriene-B4 và

interleukin-8) và chất chuyển hóa oxy gây hoại tử các tế bào

Các PVL hoạt động mạnh gây vỡ màng và phân giải tế bào, sau đó tác động

lên các tế bào chủ như bạch cầu trung tính Ngoài ra, PVL còn làm tổn thương các

mô, tạo các tế bào máu ngoại vi trong quá trình lây nhiễm sinh bệnh viêm phổi.Leucocidin bao gồm 2 mảnh F và S và có thể tách rời bằng sắc ký ion, trọng

lượng phân tử là 32000 và 38000 Dalton Nếu tách rời hai mảnh này thì mất tác dụnggây độc

c Hyaluronidase

Enzyme này phân giải các acid hyaluronic của mô liên kết, đây là 1 thành

phần chính của cơ chất ngoại bào của các mô trong cơ thể

Enzyme này nhiễm vào mô và tạo ra 1 nguồn carbon và năng lượng giúp vi

khuẩn lan tràn vào mô

Các nghiên cứu cho thấy các protein từ Staphylococcus aureus UAMS-1thể

hiện dạng đột biến do 2 protein sarA và sarA agar gây ra, và sự tham gia của proteinsarA là điều quan trọng của độc tính trong quá trình hoạt động của hyaluronidase.Vai trò chính của S.aureus hyaluronidase vẫn chưa được tìm hiểu rõ ràng, chỉ

biết sự tham gia của sarA là 1 yếu tố quan trọng đối với 1 số độc tính được thể hiệnbởi S.aureus hyaluronidase

Các coagulase có thể cô lập được hyaluronidase trong 1 số trường hợp, các

phản ứng DNAse là 1 trong những yếu tố giúp cho hyaluronidase hoạt động

d Coagulase

Capsular polysaccharide (CP) chống lại các cơ chế phòng vệ của cơ thể cũng

như đề kháng kháng sinh Các CP bảo vệ vi khuẩn chống lại sự thực bào bằng cáchkhông cho các kháng thể tạo hiện tượng opsonin hóa trên vách vi khuẩn

Do không có hiện tượng opsonin hóa nên các đại thực bào và bạch cầu trung

tính tiếp cận kém hoặc không thể tiếp cận được vi khuẩn

Các thực bào không tiêu diệt được vi khuẩn thì càng cố gắng tiết nhiều

cytokine hơn nữa nhằm làm sạch vi khuẩn xâm nhập, nhưng chính điều này lại thuhút các bạch cầu đa nhân và đại thực bào khác đến ổ viêm

Phần lớn các CP chống lại được thực bào là do ngăn cản các tế bào thực bào

bám, ức chế sinh C3 convertase và C3b của bổ thể, hoặc che phủ C3b làm cho thựcbào không nhận ra

Các chủng S.aureus phân lập từ bệnh nhiễm trùng thể hiện một mức độ cao

polysaccharide nhưng nhanh chóng bị mất khả năng khi nuôi cấy trong phòng thínghiệm

Chức năng của các capsular polysacharide không phải hoàn toàn là độc tính

b Protein A

Protein A là một protein bề mặt của S.aureus mà IgG gắn kết các phân tử theovùng Fc Các mảnh Fc này là của globulin miễn dịch Chính nhờ hiện tượng gắn kếtnày mà số lượng mảnh Fc giảm xuống mảnh Fc của globulin miễn dịch có vai tròquan trọng trong hiện tượng opsonin hóa Trong huyết thanh vi khuẩn làm cho IgGphá vỡ opsonization và phagocytosis

Các mảnh Fc chính là các receptor cho các đại thực bào, quá trình gắn kết trêngiúp cho tụ cầu vàng tránh không bị thực bào bởi các đại thực bào

Đột biến của S.aureus thiếu protein A có hiệu quả hơn phagocytosed trong

ống nghiệm, các đột biến trong các trường hợp bị lây nhiễm thí nghiệm có hiệntượng giảm độc tính

c Exofoliative exotoxins

Đây là một ngoại độc tố, gây nên hội chứng phỏng rộp và chốc lở da (scaded

skin syndrome) ở trẻ em, gồm 2 loại là ETA và ETB.

 Cơ chế gây bệnh:

Số loại SE khác nhau ở nhiều tài liệu khác nhau tùy thuộc vào năm phát hiện

và vai trò của các SE trong các vụ ngộ độc thực phẩm do tụ cầu Do số lượng SE khálớn nên rất cần thiết phải phân loại và sắp xếp chúng

Năm 1962, người ta đưa ra hệ thống sắp xếp các độc tố theo bảng chữ cái

Đầu tiên 5 loại SE được tìm thấy và phân loại dựa vào tính chất kháng nguyên củachúng, đó là độc tố A (SEA), độc tố B (SEB), độc tố C (SEC), độc tố D (SED) và

độc tố E (SEE) Trong đó SEC được chia thành SEC 1 , SEC 2 , SEC 3 Sau đó, các SEmới cùng với các gen tương ứng được tìm thấy và đánh dấu từ SEG đến SER và

SEU Không có độc tố SEF, vì F là ký tự để chỉ TSST-1

Tuy nhiên sự liên quan giữa các SE mới này đến các vụ ngộ độc thì chưa rõ,

hiện nay hầu hết các bộ test thương mại chỉ thích hợp để xác định các độc tố từ SEAđến SEE là các độc tố thường gặp nhất trong các vụ ngộ độc, khoảng 5% các vụ ngộđộc do các độc tố enterotoxin mà ta chưa biết gây ra

Trong các loại độc tố trên thì SEA thường gặp nhất trong các vụ ngộ độc do tụ

cầu Các dòng S.aureus tạo độc tố SEA có tần số cao nhất trong các mẫu thực phẩm(61.5%) và trên những người khỏe mạnh (53,6%)

SEA là nguyên nhân của 75% các vụ ngộ độc do tụ cầu, tiếp đến là SED, SEC

và SEB, các vụ dịch do SEE thường rất ít gặp

 Tính chất:

SE là những protein đơn giản, hút ẩm, dễ tan trong nước và nước muối, là

những protein cơ bản, độ đẳng điện pI là 7-8,6, trừ SEG và SEH có độ đẳng điện pItuần tự là 5,6 và 5,7 Độ ẩm cao nhất là 277 nm, cao hơn so với những protein thôngthường

Dù có 1 mức độ tương đồng giữa các SE, nhưng vẫn có sự khác nhau giữa các

trình tự amino acid làm cho các độc tố có các vị trí kháng nguyên khác nhau

SE giàu lysine, acid aspartic, acid glutamid và tyrosine Hầu hết có vòng

cystein tạo cấu trúc thích hợp có thể liên quan đến hoạt tính gây nôn Chúng có tính

ổn định cao, kháng với hầu hết các enzyme phân hủy protein và vì thế chúng giữ

được hoạt tính trong ống tiêu hóa sau khi được ăn vào bụng

Chúng còn kháng với chymotrypsine, rennin và papain Đặc biệt, tính bền

nhiệt là một trong những tính chất quan trọng nhất của các SE trong lĩnh vực an toànthực phẩm Chúng không bị phân hủy ở 100 0 C trong 30 phút, thậm chí ở 121 0 C trong

28 phút thì những SE vẫn giữ được hoạt tính sinh học (khi thí nghiệm trên mèo)

Tính kháng nhiệt của SE trong thực phẩm cao hơn so với môi trường nuôi cấy

 Cơ chế độc lực:

Hoạt tính siêu kháng nguyên tác động trực tiếp của SE với thụ thể kháng

nguyên tế bào T và phức hợp của tế bào hòa màng của tế bào nhận diện kháng

nguyên

Sự nhận diện kháng nguyên là bước đầu tiên trong đáp ứng miễn dịch tế bào

và đó cũng là vấn đề then chốt quyết định mức độ chuyên biệt của đáp ứng miễn

dịch Một kháng nguyên thông thường nhận diện được thụ thể tế bào T bằng cách

hình thành những peptide gắn kết với phức hợp hòa màng MHC ở lớp I hoặc II Chỉ

1 vài tế bào T có thể nhận biết được một kháng nguyên chuyên biệt trên phức hợp

hòa màng của tế bào nhận diện kháng nguyên

Trong khi đó, các độc tố siêu kháng nguyên tác động trực tiếp lên nhiều tế bào

T bằng cách nhận diện các chuỗi V chuyên biệt của thụ thể kháng nguyên tế bào T.Các độc tố này có thể lien kết chéo với thụ thể kháng nguyên tế bào T và phức hợptương đồng lớp 2 của tế bào nhận diện kháng nguyên

Chính sự liên kết chéo này dẫn đến việc hoạt hóa không chuyên biệt làm tăng

nhanh lượng tế bào T và lượng interleukin khổng lồ là những yếu tố có tể liên quanđến cơ chế gây độc của SE Do đó, SE có thể hoạt hóa 10% tế bào T của chuột,

trong khi những kháng nguyên thông thường kích hoạt ít hơn 1% tế bào T

Hình 2.11: Hoạt tính siêu kháng nguyên SE

Theo hình 2.11 thì các siêu kháng nguyên kích thích tế bào T Siêu kháng

nguyên ràng buộc trực tiếp lớp II của tế bào nhận diện (MHC II) và các rãnh bênngoài kháng nguyên, sinh ra 1 lượng lớn cytokines gây ra các triệu chứng sốc độchại

Ngoài ra SE còn có hoạt tính gây nôn khi đi vào cơ thể SE tác động trực tiếp

lên biểu mô ruột và kích thích trung khu gây nôn dẫn đến những triệu chứng của ngộđộc thực phẩm Đặc điểm chung nhất của các SE là vòng cystine, đây là yếu tố quantrọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính gây nôn

2.2.7 Tình hình nhiễm Staphylococcus aueus trên thế giới và tại Việt Nam hiệnnay

2.2.7.1 Tình hình nhiễm S.aureus trên thế giới

Trên thế giới các vụ ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật chiếm khoảng 70%

tổng số ca ngộ độc thực phẩm Tại các nước châu Á S.aureus là nguyên nhân hàngđầu gây ra các vụ ngộ độc

Ở châu Mỹ điển hình là Hoa Kỳ những vụ ngộ độc thực phẩm chủ yếu đều do

S.aureus gây ra, theo thống kê cho thấy từ 1972-1976 ngộ độc S.aureus chiếm 21,4%trong tổng số các vụ ngộ độc Từ năm 1983-1987 con số này thấp hơn với chỉ 5,2%.Theo một thống kê mới nhất thì đến tháng 9 năm 2009 Hoa Kỳ có 32 vụ ngộ độcthực phẩm liên quan đến S.aureus chiếm 10,3% trong tổng số các vụ ngộ độc

Những phân tích gần đây cho thấy tại Hoa Kỳ hàng năm có khoảng 48000

người tử vong vì MRSA (Methicillin resistant Staphylococcus aureus) Ước tính cókhoảng 19000 người Mỹ tử vong vì MRSA trong năm 2005

Ở châu Á các vụ nhiễm S.aureus chủ yếu ở các nước Nhật Bản, Trung Quốc

và trong khu vực Đông Nam Á

Ở Trung Quốc trong năm 2008 đã xảy ra 1 vụ ngộ độc S.aureus ở trẻ em vì

uống sữa bị nhiễm S.aureus Còn ở Nhật cũng đã có 2 vụ ngộ độc S.aureus lớn vàotháng 8 năm 1955 làm ngộ độc hơn 1936 em học sinh tại 5 trường tiểu học ở Tokyo

và tháng 6 năm 2006 làm 14780 người bị ngộ độc ở vùng Kansai Nguyên nhân của

2 vụ ngộ độc này đều do họ đã uống sữa có nhiễm S.aureus của tập đoàn Snow.Chương III: Các phương pháp phát hiện và đề xuất biện pháp

phòng ngừa lây nhiễm trên thực phẩm

3.1 Tổng quan

Staphylococcus aureus là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy ý, hình cầu, gram

dương, có thử nghiệm coagulase, phản ứng DNAse, phosphatease (+), có khả nănglên men và sinh acid từ mannitol, trehalose, sucrose

Một số dòng có khả năng làm tan máu trên môi trường thạch máu, đường kính

vòng tan máu phụ thuộc vào từng chủng nhưng đều nhỏ hơn đường kính của khuẩnlạc

Sự hiện diện với mật độ cao của S.aureus trong thực phẩm chỉ thị điều kiện vệ

sinh và kiểm soát nhiệt độ kém của quá trình chế biến

Khóa luận: Tổng quan về Staphylococcus aureus và đề xuất biện pháp phòng ngừalây nhiễm trên thực phẩm

GVHD: KS Huỳnh Văn Thành 37 SVTH: Nguyễn Trần Hải Hoàng

- Cân 10g mẫu cho vào túi PE vô trùng, thêm 90ml dung dịch pha loãng, đồng

nhất mẫu bằng máy dập mẫu khoảng 30 giây

- Chuẩn bị dãy pha loãng mẫu thích hợp tùy theo mức nhiễm của từng loại mẫu,sau khi cấy bằng một thể tích xác định trên môi trường BP sẽ xuất hiện 20-200 khuẩn

3.2.3.2 Phân lập trên môi trường chọn lọc

- Cấy 0,1ml mẫu đã pha loãng vào môi trường BP Dùng que cấy tam giác trải

đều mẫu trên bề mặt môi trường cho đến khi khô (khoảng 10 phút) Giữ nguyên đĩatrong khoảng 1 giờ sau đó lật úp lại Mỗi độ pha loãng làm 3 đĩa môi trường thạch

BP Đem ủ ở 35 0 C- 37 0 C trong 45- 48 giờ Chọn đĩa chứa 20-200 khuẩn lạc, hoặccác đĩa có độ pha loãng thấp hơn nhưng có sự xuất hiện điển hình các khuẩn lạc đặctrưng của S aureus Khuẩn lạc đặc trưng của S.aureus có hình dạng tròn, lồi, ẩm ướt,đường kính khoảng từ 2-3mm, có vầng sáng đục bao quanh

- Đối với môi trường thạch máu làm tương tự như các bước trên môi trường

thạch BP Nhưng chỉ ủ ở 37 0 C trong 24 giờ

- Sau 24 giờ khuẩn lạc trên môi trường thạch BP có đường kính khoảng

0,5-1mm, lồi, đen bóng có vòng sáng rộng khoảng 1-2mm bao quanh Sau 48 giờ thìkhuẩn lạc S.aureus có đường kính khoảng 1-1,5mm, màu đen bóng, lồi, có vòngtrắng đục hẹp và vòng sáng rộng khoảng 2-4mm quanh khuẩn lạc

- Khuẩn lạc của một số chủng S.aureus có thể không tạo vòng sáng quanh

khuẩn lạc như trên Cần đếm và đánh dấu cả hai dạng khuẩn lạc

- Trên môi trường thạch máu sau 24 giờ ủ thì S.aureus cho khuẩn lạc bóng

loáng, đục, lồi có màu xám hay vàng nhạt, đường kính khoảng 1-2mm Hầu hếtS.aureus có vùng tan máu, tuy nhiên một số dòng không tạo vùng tan máu này

- Các chủng phân lập từ thực phẩm đông lạnh hoặc khô đã được lưu trữ trong

thời gian dài thì phát xuất hiện các khuẩn lạc đặc trưng ít hơn

Hình 3.1: Khuẩn lạc đặc trưng của S.aureus trên môi trường BP

3.2.3.3 Khẳng định

- Dùng que cấy vòng cấy 5 khuẩn lạc đặc trưng và không đặc trưng từ môi

trường thạch BP sang môi trường thạch TSA, đem ủ ở 37 0 C trong 24 giờ.

- Cấy sinh khối vi khuẩn từ môi trường TSA vào các mẫu ống nghiệm chứa

huyết tương thỏ và ủ ở 37 0 C theo dõi kết quả phản ứng đông huyết tương sau cáckhoảng thời gian 2, 4, 6, 8 và 24 giờ

- Tỷ lệ khẳng định dựa trên số khuẩn lạc đặc trưng hoặc không đặc trưng Thựchiện tương tự với các khuẩn lạ đặc trưng trên môi trường thạch máu

- Kết quả thử nghiệm là (+) khi khối đông huyết tương hình thành, kết quả là (-)khi không có hình thành khối đông, hỗn dịch vẫn đồng nhất như ống không cấy

- Ngoài ra ta có thể lấy sinh khối vi khuẩn cho vào những ống nghiệm nhỏ chứa0,2 - 0,3ml môi trường BHI Để nghiêng môi trường thạch BHI và đem đi ủ ở 18-

24 0 C trong 35 giờ

- Thêm 0,5ml huyết tương cho vào môi trường thạch nghiêng BHI, trộn kỹ vàđem ủ ở 35 0 C, kiểm tra định kì qua 6 giai đoạn hình thành khối đông huyết tương.Kết quả dương tính khi khối đông vẫn nằm trên mặt thạch nghiêng ngay cả khi đảongược ống nghiệm

Hinh 3.2: Kết quả thử nghiệm coagulase

3.2.3.4 Kết quả

Mật độ S.aureus trong mẫu được tính như sau:

Mật độ (CFU/g hay CFU/ml) =

Trong đó:

F: độ pha loãng

N t : tổng số khuẩn lạc đặc trưng

N a : tổng số khuẩn lạc không đặc trưng

H t : tỉ số giữa số khuẩn lạc đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so

với số khuẩn lạc đặc trưng

H a : tỉ số giữa khuẩn lạc không đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định

(+) so với số khuẩn lạc không đặc trưng

3.2.4 Định lượng S.aureus bằng phương pháp MPN

Phương pháp này được dùng để định lượng S.aureus trong mẫu có mật độ

S.aureus thấp nhưng mật độ vi sinh vật cạnh tranh cao, khó có thể xác định bằngphương pháp đếm khuẩn lạc

3.2.4.1 Phương pháp

- Dung dịch mẫu được pha loãng với 3 độ pha loãng 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 Tùy theoyêu cầu về độ chính xác của kết quả phân tích mà có thể sử dụng phương pháp MPNvới 9 hay 15 ống nghiệm ( 3 độ pha loãng lặp lai 3 hoặc 5 lần )

- Môi trường được sử dụng là canh MSB Cấy 1ml dịch mẫu có độ pha loãng

khác nhau vào ống nghiệm chứ 10ml môi trường, ủ ở 37 0 C trong 48 giờ

- Các ống nghiệm có vi sinh vật phát triển sẽ làm đục môi trường và cho kết

quả (+) Tiếp tục phân lập khuẩn lạc đơn trên môi trường thạch BP, đem ủ ở 37 0 Ctrong 48 giờ

- Chọn các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường BP để thực hiện thử nghiệm

khẳng định S.aureus tương tự như phương pháp đếm khuẩn lạc

- Các đĩa cho kết quả khẳng định S.aureus (+) được đối chiếu với các ống

nghiệm trong hệ thống các dãy ống nghiệm ban đầu và ghi lại số ống nghiệm (+)tương ứng với mỗi độ pha loãng