LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ TÁC ĐỘNG ĐẾN HIỆU LỰC VACXIN DỊCH TẢ HEO TRÊN HEO CON Ở CÁC TỈNH PHÍA NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. TRẦN ĐÌNH TỪ PGS.TS. NGUYỄN NGỌC HẢI Thành phố Hồ Chí Minh – 2011 2 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan những kết quả trình bày trong luận án này là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào. Tác giả Nguyễn Thị Thu Hồng 3 LỜI CẢM ƠN  Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: PGS. TS. Trần đình Từ PGS. TS. Nguyễn Ngọc Hải Đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận án này.  Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu, Phòng Đào tạo sau đại học trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, cùng toàn thể quý thầy cô trong khoa chăn nuôi thú y đã giúp đỡ và khích lệ tôi thực hiện luận án tốt nghiệp này.  Tôi xin được tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ban Tổng Giám Đốc công ty Thuốc Thú Y TW NAVETCO, Ban Giám Đốc Trung Tâm Nghiên Cứu Thú Y, Phòng Đảm Bảo Chất Lượng, bộ môn Hóa Sinh Miễn Dịch và đặc biệt là tất cả thành viên của bộ môn nghiên cứu Siêu Vi Trùng nơi tôi làm việc, đã tạo điều kiện, hỗ trợ và chung sức giúp tôi hoàn thành luận án này.  Tôi chân thành cảm ơn TS. Peter Daniels – Phó Viện truởng và ông Chris Morrissy – Trưởng phòng dự án và tập thể thành viên thuộc phòng chẩn đoán của Australian Animal Health Laboratory – CSIRO đã thực hiện giúp tôi một số thí nghiệm trong luận án này.  Tôi cũng xin cảm ơn Ban Giám Đốc cùng các cán bộ phòng kỹ thuật của công ty cổ phần chăn nuôi Phú Sơn đã tạo thuận lợi cho tôi triển khai các thí nghiệm trong luận án tiến sĩ.  Tôi xin được tri ân gia đình và người thân đã dành cho tôi tình yêu thương cùng với sự động viên khích lệ để tôi an tâm hoàn thành chương trình tiến sĩ. 4 TÓM TẮT Luận án “Nghiên cứu một số yếu tố tác động đến hiệu lực vacxin dịch tả heo trên heo con ở các tỉnh phía Nam” được thực hiện nhằm xác định ảnh hưởng của sự khác biệt phân nhóm di truyền virut dịch tả heo (DTH), đáp ứng miễn dịch của vài lịch tiêm vacxin và sự nhiễm PCV2 đến hiệu quả tiêm phòng vacxin DTH. Các kết quả nghiên cứu được trình bày sau: 1. Nghiên cứu ảnh hưởng của sự khác biệt phân nhóm di truyền virut DTH đối với hiệu lực vacxin DTH. Dựa vào giải trình tự ba đoạn gien 5’NTR, E1E2 và NS5B, 37 phân lập virut DTH ở 14 tỉnh thành phía Nam Việt Nam từ năm 2000 2009 được xếp vào nhóm 2.1 và 2.2. Gây bệnh thực nghiệm cho heo với hai phân lập virut DTH nhóm 2.1. Tiêm virut DTH chủng CanTho32009 cho hai heo với liều 107,5TCID50heo và virut DTH chủng DongNai42009 cho hai heo với liều 106,0TCID50heo. Hai chủng virut này có tiến trình gây bệnh chậm với các dấu hiệu lâm sàng và virut huyết đặc trưng của DTH; và tất cả heo bị chết trong vòng 20 ngày. Tiêm virut DTH chủng CanTho320092 (được phân lập từ heo bị chết do tiêm virut DTH chủng CanTho32009) cho ba heo đã được miễn dịch bằng vacxin DTH tế bào NAVETCO; tất cả heo vacxin đều khỏe mạnh và không có virut huyết mặc dù đã được công độc với liều 107,3TCID50 của virut DTH thuộc nhóm 2.1. Điều này cho thấy hiệu quả của vacxin DTH hiện đang sử dụng tại Việt Nam không bị tác động bởi virut DTH thực địa thuộc nhóm 2.1. 2. Nghiên cứu hiệu quả miễn dịch khi áp dụng một số lịch tiêm vacxin DTH thông qua sử dụng phương pháp NPLA và thử nghiệm công cường độc. (1) Đáp ứng miễn dịch trên heo con được tiêm vacxin DTH NAVETCO trước khi bú sữa đầu: Kết quả cho thấy kháng thể đo được trên heo tiêm và không tiêm vacxin cho đến 30 ngày tuổi vẫn là kháng thể thụ động (KTTĐ) do mẹ truyền sang qua sữa đầu. Tất cả heo tiêm vacxin mặc dù không có kháng thể (hiệu giá kháng thể (HGKT) trung hòa < 3log2), hoặc có kháng thể (HGKT trung hòa ≥ 3log2) tại thời điểm công cường độc (30 ngày tuổi), đã được bảo hộ hoàn toàn; 5 ngược lại các heo đối chứng có cùng HGKT đều bị mắc bệnh và chết sau công cường độc. Điều đó chứng tỏ mũi tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu đã bảo hộ heo chống lại công cường độc. (2) Đáp ứng miễn dịch trong thử nghiệm tiêm vacxin DTH NAVETCO hai lần, lúc trước khi bú sữa đầu và 21 ngày tuổi: So sánh lượng kháng thể tạo thành giữa hai lô heo cùng quy trình tiêm này dựa theo HGKT mẹ truyền trước khi tiêm mũi hai, lần lượt là 2,8 ± 0,9log2 (gồm 12 heo) và 5,8 ± 0,8log2 (gồm 11 heo). Sau khi tiêm vacxin lúc 21 ngày, trung bình HGKT lúc 180 ngày tuổi hầu như tương đương nhau giữa hai lô heo vacxin, lần lượt là 4,3 ± 2,2log2 và 4,8 ± 2,3log2. Tất cả năm heo từ hai lô vacxin được bảo hộ hoàn toàn khi công cường độc lúc 120 ngày tuổi, ba heo đối chứng có dấu hiệu điển hình của DTH và chết trong vòng 7 ngày sau công cường độc. Điều này chứng tỏ lịch tiêm vacxin này có hiệu quả miễn dịch trên cả hai lô heo, không tùy thuộc lượng KTTĐ hiện diện khi tiêm vacxin lần hai lúc 21 ngày. Ngoài ra, kết quả đáp ứng hình thành kháng thể trên heo tiêm vacxin DTH NAVETCO hai lần ở một quy trình khác (trước khi bú sữa đầu và 30 ngày tuổi), tương tự như diễn biến kháng thể của lịch tiêm vacxin trước khi bú sữa đầu và 21 ngày. (3) Đáp ứng miễn dịch khi áp dụng lịch tiêm vacxin DTH hai lần, lúc 21 ngày và 51 ngày tuổi: So sánh kháng thể tạo thành trên heo tiêm vacxin DTH NAVETCO (46 heo) và vacxin Pestvac (42 con). Trung bình HGKT lúc 110 ngày và 170 ngày tuổi hầu như tương đương nhau giữa hai lô vacxin (P>0,05). Tất cả tám heo tiêm vacxin đều sống sót khi công cường độc lúc 130 ngày tuổi, trong khi hai heo đối chứng có dấu hiệu điển hình của DTH và một heo chết sau 7 ngày công cường độc, chứng tỏ lịch tiêm phòng này có hiệu quả. (4) Đáp ứng miễn dịch trong lịch tiêm vacxin DTH tế bào NAVETCO một lần: Thực hiện trên bốn heo 6 tuần tuổi không còn kháng thể thụ động, những heo này đã tạo đáp ứng kháng thể trong vòng 4 tuần đầu sau khi tiêm và ổn định với hiệu giá ≥ 5log2 cho đến 38 tuần tuổi. 6 (5) Xác định tuổi tiêm vacxin DTH lần đầu trên đàn heo nuôi thực địa. Dựa vào phân bố HGKT mẹ truyền trên 1363 heo con từ 1 đến 5 tuần tuổi ở tỉnh Đồng Nai, Long An và Đồng Tháp, cho thấy tỷ lệ heo được bảo hộ (HGKT ≥ 5log2) lúc 3 tuần tuổi chỉ còn là 42,85%, 42,11% và 24,33%. Điều này cho thấy thời điểm thích hợp để tiêm vacxin lần đầu là 3 tuần tuổi. 3. Xác định ảnh hưởng của việc nhiễm PCV2 đến đáp ứng kháng thể sau tiêm vacxin DTH. Thực hiện trên hai đàn heo ở trại. Đàn một gồm bốn ổ heo được xem như đối chứng để xác định heo nhiễm PCV2. Đàn hai gồm mười ổ heo được xác định HGKT kháng virut DTH lúc 20, 50, 110 và 170 ngày tuổi sau khi đã tiêm vacxin DTH NAVETCO lúc 21 ngày và 51 ngày tuổi. Ngoài ra, từ đàn heo hai này, tách muời heo trước khi tiêm vacxin, chuyển về nuôi cách ly ở NAVETCO và tiêm vacxin cho tám heo vào cùng thời điểm với đàn heo hai tại trại (lúc 21 và 51 ngày tuổi); hai heo đối chứng còn lại không tiêm vacxin DTH. Mười heo chuyển về NAVETCO đã không còn kháng thể kháng PCV2 trong quá trình theo dõi. Kết quả cho thấy trung bình HGKT kháng virut DTH tương đương nhau trên heo nhiễm PCV2 (đàn hai ở trại) và heo không nhiễm PCV2 (heo ở NAVETCO). Nghiên cứu này minh họa rằng PCV2 không ảnh hưởng đến đáp ứng kháng thể sau tiêm phòng vaccine DTH. Tóm lại, chủng virut DTH thực địa thuộc nhóm di truyền 2.1 đang lưu hành và việc nhiễm PCV2 không ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch sau tiêm phòng bệnh DTH; đồng thời, hiệu quả của một số lịch tiêm phòng vacxin cho heo con đã được khẳng định. 7 SUMMARY The study “TO EXAMINE FACTORS INFLUENCING THE EFFICACY OF CLASSICAL SWINE FEVER VACCINATION TO YOUNG PIG IN PROVINCES OF SOUTHERN VIETNAM” was conducted with the aim to determine the effects of classical swine fever virus (CSFV) genotype, vaccination programs and infection of porcine circovirus type 2 (PCV2) on CSF vaccine efficacy. The results were followed as: 1. The influence of CSFV genotype on CSF vaccine efficacy Based on the sequence of three regions 5’NTR, E1E2 and NS5B in the CSFV genome, 37 isolates from 14 provinces during 2000 2009 were clustered in two subgroups (2.1 and 2.2). Pigs were challenged by injecting two isolates of the 2.1 genotype, of which two pigs exposed to CanTho32009 at the dose of 107,5TCID50 and two pigs to DongNai42009 at the dose of 106,0TCID50. The challenged pigs showed a delayed course of sickness with typical CSFV clinical signs and viremia, and all pigs died with severe signs in 20 postinfection days. The isolate CanTho320092 from the dead pig was used to challenge three pigs that were injected cell culture CSFV vaccine (C strain). The pigs remained healthy and had no viremia although the challenge dose was 107,3TCID50 of CSFV genotype 2.1, indicating CSFV genotype 2.1 did not influence the efficacy of the current CSF vaccine. 2. The immune response of pigs in different CSF vaccination programs, being determined by neutralization peroxidase link assay (NPLA) and challengeexposure (1) Immune response of piglets to CSF vaccine injected prior to colostrum intake: The results showed that the antibodies of vaccinated and unvaccinated pigs up 30 days of age were still derived from their vaccinated dams. All vaccinated pigs even with neutralizing antibody titer < 3log2 at the time of challenge (30 days of age) were fully protected, while the unvaccinated control pigs with the same antibody titers got sick and died after virulent challenge. It indicates the vaccination 8 for newly born piglets prior to colostrum suckling could provide a good protection against virulent challenge. (2) Efficacy of the twodose CSF vaccination program prior to colostrum suckling and at 21 days of age: The serological conversion was observed in the two groups of vaccinated pigs, of which maternalderived antibody (MDA) titers were of 2.8 ± 0.9log2 (12 pigs) and 5.8 ± 0.8log2 (11 pigs), respectively, before the second shot. The average antibody titers at 180 days of age were almost similar between the two groups of vaccinated pigs (4.3 ± 2.2log2 and 4.8 ± 2.3log2, respectively) after the injection at 21 days old. Five vaccinated pigs from the two groups were completely protected from a virulent CSFV challenge at 130 days of age, while three control pigs showed typically clinical signs of CSF and died at day 7 after challenge, indicating the twodose vaccination schedule was effective in both groups irrespective of MDA titer. Besides that, antibody response of pigs in another twodose CSF vaccination program prior to colostrum suckling (Day 0) and at 30 days of age, had the same pattern as that of pigs vaccinated at Day 0 and Day 21 of age. (3) Efficacy of the twodose CSF vaccination program 21 and 51 days of age: A comparison of serological conversion was conducted in pigs vaccinated with NAVETCO vaccine (46 pigs) and with Pestvac vaccine (42 pigs). The average antibody titers at 110 and 170 days old were similar between the two groups of vaccinated pigs. All of eight vaccinated pigs were completely protected from a virulent CSFV challenge at 130 days of age, while two control pigs showed typically clinical signs of CSF, of which one died at day 7 after challenge, indicating this vaccination schedule was effective. (4) Efficacy of the onedose CSF vaccination program: The program was applied for four pigs of six weeks old when MDA completely decreased. Antibody response was observed in the first 4 weeks after injection and lasted at titers ≥ 5log2 till 38 weeks of age. 9 (5) Determining the age for the first shot of vaccine against CSF in pigs in field: Based on the distribution of CSF colostrum antibody in 1 to 5 week old pigs in Đong Nai, Long An and Đong Thap provinces, about 42.85%, 42.11% and 24.33% of piglets, respectively, had an average antibody titer ≥ 5log2 at 3 weeks of age. This result indicated the appropriate time for the first shot is 3 weeks of age. 3. The effect of PCV2 infection on the immune response to CSF vaccination Two groups of pigs from a farm were used in this experiment. The first group of 4 litters was a control to monitor PCV2 antibody. The second group of 10 litters of pigs whose serum was taken at 20, 50, 110 and 170 days old to examine antibody against CSF virus after injecting CSF vaccine at 21 and 51 days old. From the second group of pigs, 10 pigs were chosen before vaccination and transferred to the experimental station of NAVETCO, of which eight pigs were vaccinated at the same age as the second group on farm, 21 and 51 days old; other two pigs were not vaccinated as the control. The results showed the similarity in titers of antibody against CSF virus in the pigs with (the second group on farm) and without PCV2 infection (pigs at NAVETCO), demonstrating the PCV2 infection does not influence the antibody response to CSF vaccination. These results indicated the genotype 2.1 of the field CSFV and PCV2 infection had no effect on the immune response to CSF vaccination; and the efficiency of some CSF vaccination programs was confirmed. 10 MỤC LỤC Chương .............................................................................................................. Trang Trang tựa ...................................................................................................................... i Lời cam đoan .............................................................................................................. ii Cảm ơn ...................................................................................................................... iii Tóm tắt ....................................................................................................................... iv Summary .................................................................................................................. vii Mục lục........................................................................................................................ x Danh sách chữ viết tắt .............................................................................................. xvi Danh sách các bảng ............................................................................................... xviii Danh sách các hình .................................................................................................... xx Danh sách các biểu đồ .............................................................................................. xxi Danh sách các sơ đồ ................................................................................................. xxi MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 Chương 1. TỔNG QUAN ......................................................................................... 4 1.1 Tình hình bệnh DTH ........................................................................................ 4 1.1.1 Trên thế giới ................................................................................................. 4 1.1.2 Ở Việt Nam ................................................................................................... 5 1.2 Đặc điểm sinh học của virut DTH ................................................................... 6 1.2.1 Hình thái và phân loại virut DTH ................................................................ 6 1.2.2 Hệ gien của virut và kháng nguyên đích ...................................................... 6 1.2.3 Dịch tễ phân tử của virut DTH ..................................................................... 8 1.3 Các thể bệnh DTH ......................................................................................... 13 1.3.1 Cơ chế sinh bệnh ........................................................................................ 13 1.3.2 Thể cấp tính ................................................................................................ 14 1.3.3 Thể mãn tính ............................................................................................... 15 1.3.4 Thể phát bệnh muộn ................................................................................... 16 1.4 Đáp ứng miễn dịch trong bệnh DTH ............................................................. 17 11 1.4.1 Miễn dịch thụ động ..................................................................................... 18 1.4.2 Miễn dịch chủ động .................................................................................... 20 1.4.2.1 Miễn dịch dịch thể ................................................................................... 21 1.4.2.2 Miễn dịch qua trung gian tế bào .............................................................. 23 1.4.3 Miễn dịch niêm mạc ................................................................................... 24 1.4.4 Hiện tượng dung nạp miễn dịch trên heo con ........................................... 24 1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch DTH sau khi tiêm vacxin DTH .............................................................................................................. 25 1.5.1 Tính đa dạng di truyền của virut DTH thực địa ......................................... 27 1.5.2 Quy trình tiêm phòng vacxin DTH ............................................................. 29 1.5.2.1 Kháng thể thụ động (Kháng thể mẹ truyền) ............................................ 29 1.5.2.2 Thời điểm tiêm vacxin DTH lần đầu ....................................................... 34 1.5.2.3 Số lần tiêm vacxin ................................................................................... 35 1.5.3 PCV2 gây ức chế miễn dịch ....................................................................... 37 1.5.3.1 Tình hình nhiễm PCV2 ............................................................................ 37 1.5.3.2 Cơ chế sinh bệnh của PCV2 .................................................................... 38 1.5.3.3 Đặc tính sinh miễn dịch của PCV2 .......................................................... 38 1.5.3.4 Tác động PCV2 đến đáp ứng miễn dịch sau tiêm vacxin của một số bệnh ....................................................................................................... 40 1.6 Các phương pháp chẩn đoán bệnh DTH........................................................ 42 1.6.1 Chẩn đoán lâm sàng .................................................................................... 42 1.6.2 Chẩn đoán phi lâm sàng.............................................................................. 43 1.6.2.1 Chẩn đoán virut ....................................................................................... 43 1.6.2.2 Chẩn đoán huyết thanh ............................................................................ 45 1.6.2.3 Chẩn đoán bằng kỹ thuật phân tử (Phương pháp PCR) .......................... 45 1.7 Vacxin DTH và chương trình kiểm soát bệnh DTH ..................................... 47 1.7.1 Vacxin DTH ............................................................................................... 47 1.7.2 Kiểm soát bệnh DTH .................................................................................. 48 12 Chương 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................... 50 2.1 Thời gian và địa điểm .................................................................................... 50 2.2 Vật liệu thí nghiệm ........................................................................................ 50 2.2.1 Các sinh phẩm ............................................................................................ 50 2.2.2 Các bộ kit và hóa chất................................................................................. 51 2.2.3 Heo .............................................................................................................. 51 2.3 Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 51 2.4 Bố trí thí nghiệm ............................................................................................ 56 2.4.1 Đánh giá ảnh hưởng của khác biệt nhóm di truyền virut DTH phân lập đối với hiệu lực vacxin DTH ..................................................................... 56 2.4.1.1 Khảo sát phân nhóm của các phân lập virut DTH thực địa ở một số tỉnh thành phía Nam từ năm 2000 đến 2009 .................................................. 56 2.4.1.2 Khảo sát đặc điểm bệnh lý do virut DTH phân nhóm 2.1 gây ra trên heo ................................................................................................ 58 2.4.1.3 Đánh giá hiệu lực vacxin DTH tế bào phân nhóm 1.1 khi công cường độc với một virut DTH chủng thực địa phân nhóm 2.1 .......................... 59 2.4.2 Đánh giá hiệu quả miễn dịch của một số lịch tiêm phòng vacxin DTH..... 60 2.4.2.1 Đáp ứng miễn dịch tạo thành đến 30 ngày tuổi trên heo tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu........................................................................ 60 2.4.2.2 Đánh giá đáp ứng miễn dịch của lịch tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu và 21 ngày tuổi ........................................................................... 62 2.4.2.3 Đánh giá đáp ứng miễn dịch của lịch tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu và 30 ngày tuổi .......................................................................... 62 2.4.2.4 Đánh giá đáp ứng miễn dịch của lịch tiêm vacxin DTH lúc 21 ngày và 51 ngày tuổi ............................................................................................. 63 2.4.2.5 Đánh giá đáp ứng kháng thể sau một lần tiêm vacxin DTH tế bào NAVETCO .............................................................................................. 64 2.4.2.6 Xác định tuổi tiêm vacxin DTH lần đầu dựa vào hiệu giá kháng thể thụ động trên đàn heo nuôi ở thực địa ............................................................ 65 13 2.4.3 Khảo sát đáp ứng kháng thể khi tiêm vacxin DTH NAVETCO trên heo con nhiễm PCV2 ......................................................................................... 65 2.4.3.1 Xác định heo nhiễm PCV2 thực địa dựa trên kháng thể kháng PCV2.... 65 2.4.3.2 Đánh giá ảnh hưởng của nhiễm PCV2 đến đáp ứng kháng thể kháng virut DTH sau tiêm vacxin DTH NAVETCO lúc 21 ngày và 51 ngày tuổi ................................................................................................... 66 2.5 Kỹ thuật xét nghiệm ...................................................................................... 66 2.5.1 Quy trình thử nghiệm công cường độc ....................................................... 66 2.5.2 Phương pháp trung hòa nối kết enzym (NPLA) – Định lượng HGKT trung hòa ..................................................................................................... 66 2.5.3 Phát hiện virut DTH trong tế bào bằng phương pháp nhuộm miễn dịch kết nối với peroxidase (Ipx) ............................................................................. 67 2.5.4 Phương pháp chuẩn độ virut DTH trên tế bào dòng PK15 ........................ 68 2.5.5 Phương pháp ELISA phát hiện kháng nguyên ........................................... 68 2.5.6 Kỹ thuật RTPCR ....................................................................................... 68 2.5.7 Phương pháp xác định trình tự nucleotide .................................................. 68 2.5.8 Phương pháp IPMA (Immuno Peroxidase Monolayer Assay) .................. 69 2.5.9 Phương pháp đếm số lượng bạch cầu ......................................................... 70 2.6 Xử lý thống kê ............................................................................................... 70 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 71 3.1 Ảnh hưởng của khác biệt nhóm di truyền virut DTH phân lập đối với hiệu lực vacxin DTH .................................................................................. 71 3.1.1 Phân nhóm di truyền của các phân lập virut DTH thực địa ở một số tỉnh thành phía Nam từ năm 2000 đến 2009 ..................................................... 71 3.1.1.1 Phân bố địa lý của các virut DTH thuộc phân nhóm 2.1 và 2.2 ............. 76 3.1.1.2 Tính ổn định về nhóm di truyền của virut DTH thực địa ....................... 78 3.1.2 Diễn biến bệnh trên heo khi tiêm hai chủng virut DTH phân nhóm 2.1 gây ra ......................................................................................... 81 3.1.2.1 Đặc điểm lâm sàng bệnh tích ............................................................... 81 14 3.1.2.2 Virut huyết, virut trong dịch mũi và số lượng bạch cầu ......................... 83 3.1.3 Hiệu lực vacxin DTH đối với virut DTH chủng CanTho320092 ............ 87 3.1.3.1 Đặc điểm bệnh lý ..................................................................................... 88 3.1.3.2 Số lượng bạch cầu, virut huyết và kháng thể kháng virut DTH .............. 93 3.2 Hiệu quả miễn dịch của một số lịch tiêm vacxin DTH ................................. 96 3.2.1 Đáp ứng miễn dịch tạo thành trên heo con được tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu .................................................................................. 96 3.2.1.1 Diễn biến hiệu giá kháng thể kháng virut DTH trên heo sơ sinh được tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu ..................................................... 96 3.2.1.2 Khả năng bảo hộ heo vào thời điểm 30 ngày sau khi tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu .................................................................................. 98 3.2.2 Đáp ứng miễn dịch của lịch tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu và 21 ngày tuổi .............................................................................................. 102 3.2.2.1 Diễn biến đáp ứng kháng thể trên heo được tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu và 21 ngày tuổi ........................................................................ 102 3.2.2.2 Khả năng bảo hộ heo được tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu và 21 ngày tuổi ............................................................................................. 104 3.2.3 Đáp ứng miễn dịch của lịch tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu và 30 ngày tuổi ............................................................................................. 106 3.2.4 Đáp ứng miễn dịch của lịch tiêm vacxin DTH lúc 21 ngày và 51 ngày tuổi ............................................................................................ 109 3.2.4.1 Diễn biến kháng thể trên heo tiêm vacxin DTH lúc 21 ngày và 51 ngày tuổi (heo nuôi tại trại)............................................................................ 109 3.2.4.2 Diễn biến kháng thể trên heo tiêm vacxin DTH lúc 21ngày và 51 ngày tuổi (heo nuôi cách ly tại NAVETCO) ................................................ 112 3.2.4.3 Khả năng bảo hộ heo được tiêm vacxin DTH lúc 21ngày và 51 ngày tuổi......................................................................................................... 113 3.2.5 Đáp ứng kháng thể sau một lần tiêm vacxin DTH tế bào NAVETCO .... 116 15 3.2.6 Xác định tuổi tiêm vacxin DTH lần đầu đối với đàn heo nuôi ở thực địa .................................................................................................... 118 3.2.7 Khuyến cáo về các lịch tiêm vacxin DTH ................................................ 122 3.3 Đáp ứng kháng thể sau tiêm vacxin DTH trên heo con nhiễm PCV2 ......... 124 3.3.1 Xác định heo nhiễm PCV2 thực địa dựa trên kháng thể kháng PCV2 hình thành từ 50 ngày tuổi................................................................................ 124 3.3.2 Ảnh hưởng PCV2 đến đáp ứng kháng thể kháng virut DTH sau tiêm vacxin DTH lúc 21 ngày và 51 ngày tuổi ............................................. 129 Chương 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................ 133 4.1 Kết luận........................................................................................................ 133 4.1.1 Ảnh hưởng của khác biệt nhóm di truyền virut DTH đến hiệu lực vacxin DTH .............................................................................................. 133 4.1.2 Hiệu quả miễn dịch của một số lịch tiêm vacxin DTH ........................... 133 4.1.3 Đáp ứng kháng thể sau tiêm vacxin DTH trên heo con nhiễm PCV2 ...... 134 4.2 Đề nghị ........................................................................................................ 134 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ ......... 135 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 137 PHỤ LỤC ......................................................................................................... 159 Phụ lục 1 ....................................................................................................... 159 Phụ lục 2 ....................................................................................................... 160 Phụ lục 3 ....................................................................................................... 160 Phụ lục 4 ....................................................................................................... 161 Phụ lục 5 ....................................................................................................... 164 Phụ lục 6 ....................................................................................................... 166 Phụ lục 7 ....................................................................................................... 167 Phụ lục 8 ....................................................................................................... 168 16 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt AAHL Australian Animal Health Laboratory Phòng thí nghiệm thú y Úc AEC Amino Ethyl Carbazol BC Bạch cầu BDV Border disease virus Virut gây bệnh biên giới ở cừu BVDV Bovine viral diarrhoea virus Virut gây bệnh tiêu chảy bò Chủng C Chinese strain Chủng Trung Quốc CPE Cytopathic effect Tác động bệnh lý tế bào CSFV Classical swine fever virus Virut dịch tả heo DC Dendritic cell Tế bào tua DIVA Differentiating infected from vaccinated animals Phân biệt thú chủng vacxin và thú nhiễm DNA Deoxyrionucleic acid DNMD Dung nạp miễn dịch DTH Dịch tả heo EMEM Minimum essential medium with Earles salts Môi trường nuôi cấy EMEM cần thiết tối thiểu ELISA Enzymelinked immunosorbent assay Phản ứng miễn dịch hấp phụ nối kết enzym END Exaltation of Newcastle disease Tăng cường bệnh Newcastle EVL Efficient vaccination level Ngưỡng tiêm phòng hiệu quả FAT Fluorescent antibody test Xét nghiệm kháng thể huỳnh quang FAVN Fluorescent antibody virus neutralising Trung hòa virut với kháng thể huỳnh quang GPE Guinea pig embryo Phôi chuột lang FCS Fetal calf serum Huyết thanh bào thai bê HCLV Hog cholera lapinized virus Virut dịch tả heo thỏ hóa HGKT Hiệu giá kháng thể HGKTTĐ Hiệu giá kháng thể thụ động HPR Horseradish peroxidase IgA Immunoglobulin A Globulin miễn dịch lớp A IgM Immunoglobulin M Globulin miễn dịch lớp M IgG Immunoglobulin G Globulin miễn dịch lớp G IFN Interferon Chất cản nhiễm IHA Indirect haemagglutination assay Phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp IHC Immunohistochemistry Hóa mô miễn dịch IPMA Immunoperoxidase monolayer assay Phản ứng miễn dịch peroxidase đơn lớp 17 IPX Immunoperoxidase test Kỹ thuật nhuộm miễn dịch nối kết enzyme Peroxidase KTTĐ Kháng thể thụ động Mab Monoclonal antibody Kháng thể đơn dòng MDCĐ Miễn dịch chủ động NAVETCO National Veterinery Company Công ty thuốc thú y trung ương NI Neutralising index Chỉ số trung hòa NPLA Neutralising peroxidaselinked assay Phản ứng trung hòa nối kết enzym peroxidase OIE Organisation international des épizooties Tổ chức Thú y thế giới PBS Phosphate buffer saline Dung dịch đệm PBS PCR Polymerase chain reaction Phản ứng tạo chuỗi do polymerase PCVAD Porcine circovirus associated disease Bệnh liên quan circovirut ở heo PCV2 Porcine circovirus type 2 PD Protective dose Liều bảo hộ PID Pig infective dose Liều gây nhiễm heo PDNS Porcine dermatitis nephropathy syndrome Hội chứng bệnh lý thận và viêm da ở heo PK Pig kidney Thận heo PMWS Porcine multisystemic wasting syndrome Hội chứng còi sau cai sữa ở heo PPL Passive protective dose Ngưỡng bảo hộ thụ động PPV Porcine Parvovirus của Porcine Parvovirus PRRS Porcine reproductive and respiratory syndrome Hội chứng hô hấp và rối loạn sinh sản trên heo RNA Ribonucleic acid RTPCR Reversetranscriptase PCR PCR phiên mã ngược TCID Tissue culture infectious dose Liều gây nhiễm tế bào VNT Virus neutralising test Xét nghiệm trung hòa virut 18 DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng Trang 1.1. Tổng đàn heo và số ổ dịch DTH từ năm 2001 2005 ở Việt Nam ....................... 5 1.2. Tóm tắt các phân nhóm virut dịch tả heo ở Châu Á .......................................... 13 1.3. Mối liên quan giữa hiệu giá kháng thể và khả năng bảo hộ ............................... 22 2.1. Danh sách các chủng virut DTH đã sử dụng để lập cây di truyền ..................... 57 2.2. Danh sách các chủng virut DTH tham khảo ở Việt Nam .................................. 58 3.1. Phân nhóm di truyền của các chủng virut DTH thực địa ................................... 72 3.2. Diễn biến thân nhiệt, số lượng bạch cầu, virut huyết và virut dịch ngoáy mũi trên heo sau khi tiêm virut DTH chủng CanTho32009 và chủng Dongnai42009 ....................................................................................... 84 3.3. Tỷ lệ (%) tương đồng trình tự nucleotide của chuỗi gien E1E2 giữa vacxin DTH tế bào NAVETCO đối với các virut DTH thực địa ..................... 87 3.4. Tình trạng virut huyết, số lượng bạch cầu và kháng thể trên heo sau công cường độc với virut DTH chủng CanTho320092 ........................................... 94 3.5. Biến thiên kháng thể của heo con có và không tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu đến 30 ngày tuổi ở thí nghiệm1 ................................................. 96 3.6. Diễn biến hiệu giá kháng thể của 70 heo con được tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu ở thí nghiệm 2 ............................................................................ 98 3.7. Diễn biến kháng thể và bệnh lý vào lúc trước và sau khi công cường độc lúc 30 ngày tuổi trên heo đã tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu (Thí nghiệm 1) ................................................................................................... 99 3.8. Diễn biến kháng thể và bệnh lý vào lúc trước và sau khi công cường độc lúc 30 ngày tuổi trên heo đã tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu (Thí nghiệm 2) ................................................................................................. 100 3.9. Đáp ứng kháng thể trên heo con được tiêm vacxin theo lịch tiêm trước khi bú sữa đầu và 21 ngày tuổi .............................................................................. 103 19 3.10. Diễn biến kháng thể và bệnh lý sau khi công cường độc lúc 120 ngày tuổi trên heo tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu và 21 ngày tuổi ................. 105 3.11. Đáp ứng kháng thể đến 30 ngày tuổi trên heo sau khi tiêm vacxin DTH vào thời điểm trước khi bú sữa đầu ................................................................ 107 3.12. Đáp ứng kháng thể trên heo khi tiêm vacxin DTH vào thời điểm trước khi bú sữa đầu và 30 ngày tuổi ........................................................................... 108 3.13. Phân bố hiệu giá kháng thể thụ động của heo con 21 ngày tuổi .................... 109 3.14. Trung bình hiệu giá kháng thể trên heo trước và sau khi tiêm vacxin DTH lúc 21 ngày và 51 ngày tuổi (heo nuôi tại trại) ............................................. 110 3.15. Diễn biến HGKT trên heo sau khi tiêm vacxin DTH lúc 21 ngày và 51 ngày tuổi (heo nuôi tại NAVETCO) ........................................... 112 3.16. Dấu hiệu lâm sàng, phát hiện virut và tỷ lệ bảo hộ trên heo sau công cường độc DTH lúc 130 ngày tuổi ................................................................ 114 3.17. Diễn biến kháng thể thụ động kháng DTH trên heo con từ 1 5 tuần tuổi ở tỉnh Đồng Nai, Long An và Đồng Tháp .................................................... 119 3.18. Diễn biến kháng thể kháng PCV2 trên bốn ổ heo .......................................... 124 3.19. Diễn biến kháng thể kháng PCV2 trên mười ổ heo ....................................... 126 3.20. Diễn biến kháng thể kháng PCV2 trên 10 heo nuôi ở khu thí nghiệm .......... 129 3.21. Diễn biến kháng thể kháng DTH và PCV2 trên heo tiêm vacxin DTH lúc 21 ngày và 51 ngày tuổi ................................................................................. 130 20 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình Trang 1.1. Cấu trúc các vùng trên bộ gien mã hóa protein tương ứng của Pestivirus........... 7 1.2. Cây phả hệ thể hiện mối quan hệ giữa 3 nhóm chính và các phân nhóm của virut DTH dựa trên gen E2 (190nt) .................................................................. 10 1.3. Tiến trình của bệnh DTH thể cấp tính ................................................................ 15 1.4. Tiến trình của bệnh DTH thể mãn tính .............................................................. 16 1.5. Tiến trình của bệnh DTH thể trước khi sinh ...................................................... 17 1.6. Các nguyên nhân dẫn đến thất bại sau tiêm phòng vacxin ............................... 26 1.7. Sự hiện diện của KTTĐ làm chậm sự đáp ứng miễn dịch chủ động ............................ 30 1.8. Hình thành đáp ứng miễn dịch sơ cấp và miễn dịch thứ cấp ............................. 35 1.9. Mức độ bảo hộ hình thành tương ứng với số lần tiêm vacxin ........................... 36 2.1. Tế bào PK 15 bị nhiễm virut DTH ..................................................................... 67 2.2. Đĩa NPLA chuẩn ................................................................................................ 67 2.3. Tế bào PK15 không nhiễm PCV2 ...................................................................... 69 2.4. Tế bào PK15 nhiễm PCV2 ................................................................................ 69 3.1. Cây di truyền dựa trên vùng 433 nucleotide của gien 5’NTR ........................... 73 3.2. Cây di truyền dựa trên vùng 671 nucleotide của vùng gien E1E2.................... 74 3.3. Cây di truyền dựa trên vùng 449 nucleotide của gien NS5B ............................. 75 3.4. Phân bố địa lý của các virut DTH thực địa nhóm 2.1và 2.2 .............................. 77 3.5. Heo 19: Xuất huyết da ........................................................................................ 90 3.6. Heo 19: Xuất huyết hạch bẹn nông .................................................................... 90 3.7. Heo 19: Xuất huyết các hạch vùng đầu.............................................................. 91 3.8. Heo 14: Ruột già chứa phân táo bón .................................................................. 91 3.9. Heo 14: Loét van hồi manh tràng ....................................................................... 92 3.10. Heo 14: Sưng đầu xương sườn ......................................................................... 92 21 DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ Trang 1.1. Miễn dịch thụ động và chủ động trên heo con sau tiêm vacxin ......................... 40 3.1. Thân nhiệt heo sau khi tiêm virut dịch tả heo chủng CanTho32009 (heo 2 và heo 7) và chủng DongNai42009 (heo 4 và heo 5) ..................................... 82 3.2. Thân nhiệt heo sau khi công cường độc bằng virut dịch tả heo chủng CanTho320092 .............................................................................................. 89 3.3. Diễn biến kháng thể sau tiêm vacxin DTH lúc 6 tuần tuổi ............................. 116 3.4. Phân bố heo có kháng thể DTH và kháng thể có hiệu giá ≥ 5log2 trên heo con từ 1 – 5 tuần tuổi ở tỉnh Đồng Nai, Long An và Đồng Tháp .................... 120 3.5. Diễn biến kháng thể kháng PCV2 của bốn ổ heo ............................................ 125 3.6. Diễn biến kháng thể kháng PCV2 của mười ổ heo .......................................... 127 3.7. Diễn biến kháng thể kháng DTH và PCV2 trên heo tiêm vacxin DTH lúc 21 ngày và 51 ngày tuổi ....................................................................................... 131 DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ Trang 2.1. Các bước thực hiện thí nghiệm về ảnh hưởng của khác biệt nhóm di truyền virut DTH đến hiệu lực vacxin DTH ..................................................... 53 2.2. Các bước thực hiện thí nghiệm về hiệu quả miễn dịch của một số lịch tiêm vacxin DTH ....................................................................................................... 54 2.3. Các bước khảo sát ảnh hưởng của nhiễm PCV2 đến đáp ứng kháng thể sau tiêm vacxin DTH lúc 21 ngày và 51 ngày tuổi ................................................. 55

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Người hướng dẫn khoa học:

PGS TS TRẦN ĐÌNH TỪ

Thành phố Hồ Chí Minh – 2011

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan những kết quả trình bày trong luận án này là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu nêu trong luận án là trung thực

và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào

Tác giả

Nguyễn Thị Thu Hồng

 Tôi xin được tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ban Tổng Giám Đốc công ty Thuốc Thú Y TW NAVETCO, Ban Giám Đốc Trung Tâm Nghiên Cứu Thú Y, Phòng Đảm Bảo Chất Lượng, bộ môn Hóa Sinh Miễn Dịch và đặc biệt là tất cả thành viên của bộ môn nghiên cứu Siêu Vi Trùng nơi tôi làm việc, đã tạo điều kiện,

hỗ trợ và chung sức giúp tôi hoàn thành luận án này

 Tôi chân thành cảm ơn TS Peter Daniels – Phó Viện truởng và ông Chris Morrissy – Trưởng phòng dự án và tập thể thành viên thuộc phòng chẩn đoán của Australian Animal Health Laboratory – CSIRO đã thực hiện giúp tôi một

số thí nghiệm trong luận án này

 Tôi cũng xin cảm ơn Ban Giám Đốc cùng các cán bộ phòng kỹ thuật của công ty cổ phần chăn nuôi Phú Sơn đã tạo thuận lợi cho tôi triển khai các thí nghiệm trong luận án tiến sĩ

 Tôi xin được tri ân gia đình và người thân đã dành cho tôi tình yêu thương cùng với sự động viên khích lệ để tôi an tâm hoàn thành chương trình tiến sĩ

1 Nghiên cứu ảnh hưởng của sự khác biệt phân nhóm di truyền virut DTH đối với hiệu lực vacxin DTH

Dựa vào giải trình tự ba đoạn gien 5’NTR, E1/E2 và NS5B, 37 phân lập

virut DTH ở 14 tỉnh thành phía Nam Việt Nam từ năm 2000 - 2009 được xếp vào nhóm 2.1 và 2.2 Gây bệnh thực nghiệm cho heo với hai phân lập virut DTH nhóm 2.1 Tiêm virut DTH chủng CanTho3/2009 cho hai heo với liều 107,5TCID50/heo và virut DTH chủng DongNai4/2009 cho hai heo với liều 106,0TCID50/heo Hai chủng virut này có tiến trình gây bệnh chậm với các dấu hiệu lâm sàng và virut huyết đặc trưng của DTH; và tất cả heo bị chết trong vòng 20 ngày Tiêm virut DTH chủng CanTho3/2009-2 (được phân lập từ heo bị chết do tiêm virut DTH chủng CanTho3/2009) cho ba heo đã được miễn dịch bằng vacxin DTH tế bào NAVETCO; tất cả heo vacxin đều khỏe mạnh và không có virut huyết mặc dù đã được công độc với liều 107,3TCID50 của virut DTH thuộc nhóm 2.1 Điều này cho thấy hiệu quả của vacxin DTH hiện đang sử dụng tại Việt Nam không bị tác động bởi virut DTH thực địa thuộc nhóm 2.1

2 Nghiên cứu hiệu quả miễn dịch khi áp dụng một số lịch tiêm vacxin DTH thông qua sử dụng phương pháp NPLA và thử nghiệm công cường độc

(1) Đáp ứng miễn dịch trên heo con được tiêm vacxin DTH NAVETCO trước khi bú sữa đầu: Kết quả cho thấy kháng thể đo được trên heo tiêm và không tiêm vacxin cho đến 30 ngày tuổi vẫn là kháng thể thụ động (KTTĐ) do mẹ truyền sang qua sữa đầu Tất cả heo tiêm vacxin mặc dù không có kháng thể (hiệu giá kháng thể (HGKT) trung hòa < 3log2), hoặc có kháng thể (HGKT trung hòa ≥ 3log2) tại thời điểm công cường độc (30 ngày tuổi), đã được bảo hộ hoàn toàn;

ngược lại các heo đối chứng có cùng HGKT đều bị mắc bệnh và chết sau công cường độc Điều đó chứng tỏ mũi tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu đã bảo hộ heo chống lại công cường độc

(2) Đáp ứng miễn dịch trong thử nghiệm tiêm vacxin DTH NAVETCO hai lần, lúc trước khi bú sữa đầu và 21 ngày tuổi: So sánh lượng kháng thể tạo thành giữa hai lô heo cùng quy trình tiêm này dựa theo HGKT mẹ truyền trước khi tiêm mũi hai, lần lượt là 2,8 ± 0,9log2 (gồm 12 heo) và 5,8 ± 0,8log2 (gồm 11 heo) Sau khi tiêm vacxin lúc 21 ngày, trung bình HGKT lúc 180 ngày tuổi hầu như tương đương nhau giữa hai lô heo vacxin, lần lượt là 4,3 ± 2,2log2 và 4,8 ± 2,3log2 Tất cả năm heo từ hai lô vacxin được bảo hộ hoàn toàn khi công cường độc lúc 120 ngày tuổi, ba heo đối chứng có dấu hiệu điển hình của DTH và chết trong vòng 7 ngày sau công cường độc Điều này chứng tỏ lịch tiêm vacxin này có hiệu quả miễn dịch trên cả hai lô heo, không tùy thuộc lượng KTTĐ hiện diện khi tiêm vacxin lần hai lúc 21 ngày Ngoài ra, kết quả đáp ứng hình thành kháng thể trên heo tiêm vacxin DTH NAVETCO hai lần ở một quy trình khác (trước khi bú sữa đầu và 30 ngày tuổi), tương tự như diễn biến kháng thể của lịch tiêm vacxin trước khi bú sữa đầu và

21 ngày

(3) Đáp ứng miễn dịch khi áp dụng lịch tiêm vacxin DTH hai lần, lúc 21 ngày và 51 ngày tuổi: So sánh kháng thể tạo thành trên heo tiêm vacxin DTH NAVETCO (46 heo) và vacxin Pestvac (42 con) Trung bình HGKT lúc 110 ngày

và 170 ngày tuổi hầu như tương đương nhau giữa hai lô vacxin (P>0,05) Tất cả tám heo tiêm vacxin đều sống sót khi công cường độc lúc 130 ngày tuổi, trong khi hai heo đối chứng có dấu hiệu điển hình của DTH và một heo chết sau 7 ngày công cường độc, chứng tỏ lịch tiêm phòng này có hiệu quả

(4) Đáp ứng miễn dịch trong lịch tiêm vacxin DTH tế bào NAVETCO một lần: Thực hiện trên bốn heo 6 tuần tuổi không còn kháng thể thụ động, những heo này đã tạo đáp ứng kháng thể trong vòng 4 tuần đầu sau khi tiêm và ổn định với hiệu giá ≥ 5log2 cho đến 38 tuần tuổi

(5) Xác định tuổi tiêm vacxin DTH lần đầu trên đàn heo nuôi thực địa

Dựa vào phân bố HGKT mẹ truyền trên 1363 heo con từ 1 đến 5 tuần tuổi ở tỉnh Đồng Nai, Long An và Đồng Tháp, cho thấy tỷ lệ heo được bảo hộ (HGKT ≥ 5log2) lúc 3 tuần tuổi chỉ còn là 42,85%, 42,11% và 24,33% Điều này cho thấy thời điểm thích hợp để tiêm vacxin lần đầu là 3 tuần tuổi

3 Xác định ảnh hưởng của việc nhiễm PCV2 đến đáp ứng kháng thể sau tiêm vacxin DTH

Thực hiện trên hai đàn heo ở trại Đàn một gồm bốn ổ heo được xem như đối chứng để xác định heo nhiễm PCV2 Đàn hai gồm mười ổ heo được xác định HGKT kháng virut DTH lúc 20, 50, 110 và 170 ngày tuổi sau khi đã tiêm vacxin DTH NAVETCO lúc 21 ngày và 51 ngày tuổi Ngoài ra, từ đàn heo hai này, tách muời heo trước khi tiêm vacxin, chuyển về nuôi cách ly ở NAVETCO và tiêm vacxin cho tám heo vào cùng thời điểm với đàn heo hai tại trại (lúc 21 và 51 ngày tuổi); hai heo đối chứng còn lại không tiêm vacxin DTH Mười heo chuyển về NAVETCO đã không còn kháng thể kháng PCV2 trong quá trình theo dõi Kết quả cho thấy trung bình HGKT kháng virut DTH tương đương nhau trên heo nhiễm PCV2 (đàn hai ở trại) và heo không nhiễm PCV2 (heo ở NAVETCO) Nghiên cứu này minh họa rằng PCV2 không ảnh hưởng đến đáp ứng kháng thể sau tiêm phòng vaccine DTH

Tóm lại, chủng virut DTH thực địa thuộc nhóm di truyền 2.1 đang lưu hành

và việc nhiễm PCV2 không ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch sau tiêm phòng bệnh DTH; đồng thời, hiệu quả của một số lịch tiêm phòng vacxin cho heo con đã được khẳng định

SUMMARY

The study “TO EXAMINE FACTORS INFLUENCING THE EFFICACY

OF CLASSICAL SWINE FEVER VACCINATION TO YOUNG PIG IN PROVINCES OF SOUTHERN VIETNAM” was conducted with the aim to determine the effects of classical swine fever virus (CSFV) genotype, vaccination programs and infection of porcine circovirus type 2 (PCV2) on CSF vaccine efficacy The results were followed as:

1 The influence of CSFV genotype on CSF vaccine efficacy

Based on the sequence of three regions 5’NTR, E1/E2 and NS5B in the CSFV genome, 37 isolates from 14 provinces during 2000 - 2009 were clustered in two subgroups (2.1 and 2.2) Pigs were challenged by injecting two isolates of the 2.1 genotype, of which two pigs exposed to CanTho3/2009 at the dose of

107,5TCID50 and two pigs to DongNai4/2009 at the dose of 106,0TCID50 The challenged pigs showed a delayed course of sickness with typical CSFV clinical signs and viremia, and all pigs died with severe signs in 20 post-infection days The isolate CanTho3/2009-2 from the dead pig was used to challenge three pigs that were injected cell culture CSFV vaccine (C strain) The pigs remained healthy and had no viremia although the challenge dose was 107,3TCID50 of CSFV genotype 2.1, indicating CSFV genotype 2.1 did not influence the efficacy of the current CSF vaccine

2 The immune response of pigs in different CSF vaccination programs, being determined by neutralization peroxidase link assay (NPLA) and challenge-exposure

(1) Immune response of piglets to CSF vaccine injected prior to colostrum intake: The results showed that the antibodies of vaccinated and unvaccinated pigs

up 30 days of age were still derived from their vaccinated dams All vaccinated pigs even with neutralizing antibody titer < 3log2 at the time of challenge (30 days of age) were fully protected, while the unvaccinated control pigs with the same antibody titers got sick and died after virulent challenge It indicates the vaccination

for newly born piglets prior to colostrum suckling could provide a good protection against virulent challenge

(2) Efficacy of the two-dose CSF vaccination program - prior to colostrum suckling and at 21 days of age: The serological conversion was observed in the two groups of vaccinated pigs, of which maternal-derived antibody (MDA) titers were

of 2.8 ± 0.9log2 (12 pigs) and 5.8 ± 0.8log2 (11 pigs), respectively, before the second shot The average antibody titers at 180 days of age were almost similar between the two groups of vaccinated pigs (4.3 ± 2.2log2 and 4.8 ± 2.3log2, respectively) after the injection at 21 days old Five vaccinated pigs from the two groups were completely protected from a virulent CSFV challenge at 130 days of age, while three control pigs showed typically clinical signs of CSF and died at day

7 after challenge, indicating the two-dose vaccination schedule was effective in both groups irrespective of MDA titer Besides that, antibody response of pigs in another two-dose CSF vaccination program - prior to colostrum suckling (Day 0) and at 30 days of age, had the same pattern as that of pigs vaccinated at Day 0 and Day 21 of age

(3) Efficacy of the two-dose CSF vaccination program - 21 and 51 days of age: A comparison of serological conversion was conducted in pigs vaccinated with NAVETCO vaccine (46 pigs) and with Pestvac vaccine (42 pigs) The average antibody titers at 110 and 170 days old were similar between the two groups of vaccinated pigs All of eight vaccinated pigs were completely protected from a virulent CSFV challenge at 130 days of age, while two control pigs showed typically clinical signs of CSF, of which one died at day 7 after challenge, indicating this vaccination schedule was effective

(4) Efficacy of the one-dose CSF vaccination program: The program was applied for four pigs of six weeks old when MDA completely decreased Antibody response was observed in the first 4 weeks after injection and lasted at titers ≥ 5log2till 38 weeks of age

(5) Determining the age for the first shot of vaccine against CSF in pigs in field: Based on the distribution of CSF colostrum antibody in 1 to 5 week - old pigs

in Đong Nai, Long An and Đong Thap provinces, about 42.85%, 42.11% and 24.33% of piglets, respectively, had an average antibody titer ≥ 5log2 at 3 weeks of age This result indicated the appropriate time for the first shot is 3 weeks of age

3 The effect of PCV2 infection on the immune response to CSF vaccination

Two groups of pigs from a farm were used in this experiment The first group of 4 litters was a control to monitor PCV2 antibody The second group of 10 litters of pigs whose serum was taken at 20, 50, 110 and 170 days old to examine antibody against CSF virus after injecting CSF vaccine at 21 and 51 days old From the second group of pigs, 10 pigs were chosen before vaccination and transferred to the experimental station of NAVETCO, of which eight pigs were vaccinated at the same age as the second group on farm, 21 and 51 days old; other two pigs were not vaccinated as the control The results showed the similarity in titers of antibody against CSF virus in the pigs with (the second group on farm) and without PCV2 infection (pigs at NAVETCO), demonstrating the PCV2 infection does not influence the antibody response to CSF vaccination

These results indicated the genotype 2.1 of the field CSFV and PCV2 infection had no effect on the immune response to CSF vaccination; and the efficiency of some CSF vaccination programs was confirmed

MỤC LỤC

Chương Trang

Trang tựa i

Lời cam đoan ii

Cảm ơn iii

Tóm tắt iv

Summary vii

Mục lục x

Danh sách chữ viết tắt xvi

Danh sách các bảng xviii

Danh sách các hình xx

Danh sách các biểu đồ xxi

Danh sách các sơ đồ xxi

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 4

1.1 Tình hình bệnh DTH 4

1.1.1 Trên thế giới 4

1.1.2 Ở Việt Nam 5

1.2 Đặc điểm sinh học của virut DTH 6

1.2.1 Hình thái và phân loại virut DTH 6

1.2.2 Hệ gien của virut và kháng nguyên đích 6

1.2.3 Dịch tễ phân tử của virut DTH 8

1.3 Các thể bệnh DTH 13

1.3.1 Cơ chế sinh bệnh 13

1.3.2 Thể cấp tính 14

1.3.3 Thể mãn tính 15

1.3.4 Thể phát bệnh muộn 16

1.4 Đáp ứng miễn dịch trong bệnh DTH 17

1.4.1 Miễn dịch thụ động 18

1.4.2 Miễn dịch chủ động 20

1.4.2.1 Miễn dịch dịch thể 21

1.4.2.2 Miễn dịch qua trung gian tế bào 23

1.4.3 Miễn dịch niêm mạc 24

1.4.4 Hiện tượng dung nạp miễn dịch trên heo con 24

1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch DTH sau khi tiêm vacxin DTH 25

1.5.1 Tính đa dạng di truyền của virut DTH thực địa 27

1.5.2 Quy trình tiêm phòng vacxin DTH 29

1.5.2.1 Kháng thể thụ động (Kháng thể mẹ truyền) 29

1.5.2.2 Thời điểm tiêm vacxin DTH lần đầu 34

1.5.2.3 Số lần tiêm vacxin 35

1.5.3 PCV2 gây ức chế miễn dịch 37

1.5.3.1 Tình hình nhiễm PCV2 37

1.5.3.2 Cơ chế sinh bệnh của PCV2 38

1.5.3.3 Đặc tính sinh miễn dịch của PCV2 38

1.5.3.4 Tác động PCV2 đến đáp ứng miễn dịch sau tiêm vacxin của một số bệnh 40

1.6 Các phương pháp chẩn đoán bệnh DTH 42

1.6.1 Chẩn đoán lâm sàng 42

1.6.2 Chẩn đoán phi lâm sàng 43

1.6.2.1 Chẩn đoán virut 43

1.6.2.2 Chẩn đoán huyết thanh 45

1.6.2.3 Chẩn đoán bằng kỹ thuật phân tử (Phương pháp PCR) 45

1.7 Vacxin DTH và chương trình kiểm soát bệnh DTH 47

1.7.1 Vacxin DTH 47

1.7.2 Kiểm soát bệnh DTH 48

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 50

2.1 Thời gian và địa điểm 50

2.2 Vật liệu thí nghiệm 50

2.2.1 Các sinh phẩm 50

2.2.2 Các bộ kit và hóa chất 51

2.2.3 Heo 51

2.3 Nội dung nghiên cứu 51

2.4 Bố trí thí nghiệm 56

2.4.1 Đánh giá ảnh hưởng của khác biệt nhóm di truyền virut DTH phân lập đối với hiệu lực vacxin DTH 56

2.4.1.1 Khảo sát phân nhóm của các phân lập virut DTH thực địa ở một số tỉnh thành phía Nam từ năm 2000 đến 2009 56

2.4.1.2 Khảo sát đặc điểm bệnh lý do virut DTH phân nhóm 2.1 gây ra trên heo 58

2.4.1.3 Đánh giá hiệu lực vacxin DTH tế bào phân nhóm 1.1 khi công cường độc với một virut DTH chủng thực địa phân nhóm 2.1 59

2.4.2 Đánh giá hiệu quả miễn dịch của một số lịch tiêm phòng vacxin DTH 60

2.4.2.1 Đáp ứng miễn dịch tạo thành đến 30 ngày tuổi trên heo tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu 60

2.4.2.2 Đánh giá đáp ứng miễn dịch của lịch tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu và 21 ngày tuổi 62

2.4.2.3 Đánh giá đáp ứng miễn dịch của lịch tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu và 30 ngày tuổi 62

2.4.2.4 Đánh giá đáp ứng miễn dịch của lịch tiêm vacxin DTH lúc 21 ngày và 51 ngày tuổi 63

2.4.2.5 Đánh giá đáp ứng kháng thể sau một lần tiêm vacxin DTH tế bào NAVETCO 64

2.4.2.6 Xác định tuổi tiêm vacxin DTH lần đầu dựa vào hiệu giá kháng thể thụ động trên đàn heo nuôi ở thực địa 65

2.4.3 Khảo sát đáp ứng kháng thể khi tiêm vacxin DTH NAVETCO trên heo

con nhiễm PCV2 65

2.4.3.1 Xác định heo nhiễm PCV2 thực địa dựa trên kháng thể kháng PCV2 65

2.4.3.2 Đánh giá ảnh hưởng của nhiễm PCV2 đến đáp ứng kháng thể kháng virut DTH sau tiêm vacxin DTH NAVETCO lúc 21 ngày và 51 ngày tuổi 66

2.5 Kỹ thuật xét nghiệm 66

2.5.1 Quy trình thử nghiệm công cường độc 66

2.5.2 Phương pháp trung hòa nối kết enzym (NPLA) – Định lượng HGKT trung hòa 66

2.5.3 Phát hiện virut DTH trong tế bào bằng phương pháp nhuộm miễn dịch kết nối với peroxidase (Ipx) 67

2.5.4 Phương pháp chuẩn độ virut DTH trên tế bào dòng PK15 68

2.5.5 Phương pháp ELISA phát hiện kháng nguyên 68

2.5.6 Kỹ thuật RT-PCR 68

2.5.7 Phương pháp xác định trình tự nucleotide 68

2.5.8 Phương pháp IPMA (Immuno Peroxidase Monolayer Assay) 69

2.5.9 Phương pháp đếm số lượng bạch cầu 70

2.6 Xử lý thống kê 70

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 71

3.1 Ảnh hưởng của khác biệt nhóm di truyền virut DTH phân lập đối với hiệu lực vacxin DTH 71

3.1.1 Phân nhóm di truyền của các phân lập virut DTH thực địa ở một số tỉnh

thành phía Nam từ năm 2000 đến 2009 71

3.1.1.1 Phân bố địa lý của các virut DTH thuộc phân nhóm 2.1 và 2.2 76

3.1.1.2 Tính ổn định về nhóm di truyền của virut DTH thực địa 78

3.1.2 Diễn biến bệnh trên heo khi tiêm hai chủng virut DTH phân nhóm 2.1 gây ra 81

3.1.2.1 Đặc điểm lâm sàng - bệnh tích 81

3.1.2.2 Virut huyết, virut trong dịch mũi và số lượng bạch cầu 83

3.1.3 Hiệu lực vacxin DTH đối với virut DTH chủng CanTho3/2009-2 87

3.1.3.1 Đặc điểm bệnh lý 88

3.1.3.2 Số lượng bạch cầu, virut huyết và kháng thể kháng virut DTH 93

3.2 Hiệu quả miễn dịch của một số lịch tiêm vacxin DTH 96

3.2.1 Đáp ứng miễn dịch tạo thành trên heo con được tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu 96

3.2.1.1 Diễn biến hiệu giá kháng thể kháng virut DTH trên heo sơ sinh được tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu 96

3.2.1.2 Khả năng bảo hộ heo vào thời điểm 30 ngày sau khi tiêm vacxin DTH

trước khi bú sữa đầu 98

3.2.2 Đáp ứng miễn dịch của lịch tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu và 21 ngày tuổi 102

3.2.2.1 Diễn biến đáp ứng kháng thể trên heo được tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu và 21 ngày tuổi 102

3.2.2.2 Khả năng bảo hộ heo được tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu và 21 ngày tuổi 104

3.2.3 Đáp ứng miễn dịch của lịch tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu và 30 ngày tuổi 106

3.2.4 Đáp ứng miễn dịch của lịch tiêm vacxin DTH lúc 21 ngày và 51 ngày tuổi 109

3.2.4.1 Diễn biến kháng thể trên heo tiêm vacxin DTH lúc 21 ngày và 51 ngày tuổi (heo nuôi tại trại) 109

3.2.4.2 Diễn biến kháng thể trên heo tiêm vacxin DTH lúc 21ngày và 51 ngày tuổi (heo nuôi cách ly tại NAVETCO) 112

3.2.4.3 Khả năng bảo hộ heo được tiêm vacxin DTH lúc 21ngày và 51 ngày tuổi 113

3.2.5 Đáp ứng kháng thể sau một lần tiêm vacxin DTH tế bào NAVETCO 116

3.2.6 Xác định tuổi tiêm vacxin DTH lần đầu đối với đàn heo nuôi ở

thực địa 118

3.2.7 Khuyến cáo về các lịch tiêm vacxin DTH 122

3.3 Đáp ứng kháng thể sau tiêm vacxin DTH trên heo con nhiễm PCV2 124

3.3.1 Xác định heo nhiễm PCV2 thực địa dựa trên kháng thể kháng PCV2 hình thành từ 50 ngày tuổi 124

3.3.2 Ảnh hưởng PCV2 đến đáp ứng kháng thể kháng virut DTH sau tiêm vacxin DTH lúc 21 ngày và 51 ngày tuổi 129

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 133

4.1 Kết luận 133

4.1.1 Ảnh hưởng của khác biệt nhóm di truyền virut DTH đến hiệu lực vacxin DTH 133

4.1.2 Hiệu quả miễn dịch của một số lịch tiêm vacxin DTH 133

4.1.3 Đáp ứng kháng thể sau tiêm vacxin DTH trên heo con nhiễm PCV2 134

4.2 Đề nghị 134

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ 135

TÀI LIỆU THAM KHẢO 137

PHỤ LỤC 159

Phụ lục 1 159

Phụ lục 2 160

Phụ lục 3 160

Phụ lục 4 161

Phụ lục 5 164

Phụ lục 6 166

Phụ lục 7 167

Phụ lục 8 168

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

AAHL Australian Animal Health Laboratory Phòng thí nghiệm thú y Úc

AEC Amino Ethyl Carbazol

BDV Border disease virus Virut gây bệnh biên giới ở cừu BVDV Bovine viral diarrhoea virus Virut gây bệnh tiêu chảy bòChủng C Chinese strain Chủng Trung Quốc

CPE Cytopathic effect Tác động bệnh lý tế bào

CSFV Classical swine fever virus Virut dịch tả heo

DIVA Differentiating infected from

quangFAVN Fluorescent antibody virus

neutralising

Trung hòa virut với kháng thể huỳnh quang

GPE Guinea pig embryo Phôi chuột lang

FCS Fetal calf serum Huyết thanh bào thai bê

HCLV Hog cholera lapinized virus Virut dịch tả heo thỏ hóa

HPR Horseradish peroxidase

IgA Immunoglobulin A Globulin miễn dịch lớp A

IgM Immunoglobulin M Globulin miễn dịch lớp M

IgG Immunoglobulin G Globulin miễn dịch lớp G

IHA Indirect haemagglutination assay Phản ứng ngưng kết hồng cầu

gián tiếpIHC Immunohistochemistry Hóa mô miễn dịch

IPMA Immunoperoxidase monolayer assay Phản ứng miễn dịch peroxidase

đơn lớp

IPX Immunoperoxidase test Kỹ thuật nhuộm miễn dịch nối

kết enzyme Peroxidase

Mab Monoclonal antibody Kháng thể đơn dòng

NAVETCO National Veterinery Company Công ty thuốc thú y trung ương

NI Neutralising index Chỉ số trung hòa

NPLA Neutralising peroxidase-linked assay Phản ứng trung hòa nối kết

enzym peroxidase OIE Organisation international des

épizooties

Tổ chức Thú y thế giới

PBS Phosphate buffer saline Dung dịch đệm PBS

PCR Polymerase chain reaction Phản ứng tạo chuỗi do polymerasePCVAD Porcine circovirus associated disease Bệnh liên quan circovirut ở heoPCV2 Porcine circovirus type 2

PID Pig infective dose Liều gây nhiễm heo

PDNS Porcine dermatitis nephropathy

syndrome

Hội chứng bệnh lý thận và viêm

da ở heo

PMWS Porcine multisystemic wasting

syndrome

Hội chứng còi sau cai sữa ở heo

PPL Passive protective dose Ngưỡng bảo hộ thụ động

PPV Porcine Parvovirus của Porcine Parvovirus

PRRS Porcine reproductive and respiratory

syndrome

Hội chứng hô hấp và rối loạn sinh sản trên heo

RNA Ribonucleic acid

RT-PCR Reverse-transcriptase PCR PCR phiên mã ngược

TCID Tissue culture infectious dose Liều gây nhiễm tế bào

VNT Virus neutralising test Xét nghiệm trung hòa virut

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng Trang

1.1 Tổng đàn heo và số ổ dịch DTH từ năm 2001- 2005 ở Việt Nam 5

1.2 Tóm tắt các phân nhóm virut dịch tả heo ở Châu Á 13

1.3 Mối liên quan giữa hiệu giá kháng thể và khả năng bảo hộ 22

2.1 Danh sách các chủng virut DTH đã sử dụng để lập cây di truyền 57

2.2 Danh sách các chủng virut DTH tham khảo ở Việt Nam 58

3.1 Phân nhóm di truyền của các chủng virut DTH thực địa 72

3.2 Diễn biến thân nhiệt, số lượng bạch cầu, virut huyết và virut dịch ngoáy mũi trên heo sau khi tiêm virut DTH chủng CanTho3/2009 và chủng Dongnai4/2009 84

3.3 Tỷ lệ (%) tương đồng trình tự nucleotide của chuỗi gien E1/E2 giữa vacxin DTH tế bào NAVETCO đối với các virut DTH thực địa 87

3.4 Tình trạng virut huyết, số lượng bạch cầu và kháng thể trên heo sau công cường độc với virut DTH chủng CanTho3/2009-2 94

3.5 Biến thiên kháng thể của heo con có và không tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu đến 30 ngày tuổi ở thí nghiệm1 96

3.6 Diễn biến hiệu giá kháng thể của 70 heo con được tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu ở thí nghiệm 2 98

3.7 Diễn biến kháng thể và bệnh lý vào lúc trước và sau khi công cường độc lúc 30 ngày tuổi trên heo đã tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu (Thí nghiệm 1) 99

3.8 Diễn biến kháng thể và bệnh lý vào lúc trước và sau khi công cường độc lúc 30 ngày tuổi trên heo đã tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu (Thí nghiệm 2) 100

3.9 Đáp ứng kháng thể trên heo con được tiêm vacxin theo lịch tiêm trước khi bú sữa đầu và 21 ngày tuổi 103

3.10 Diễn biến kháng thể và bệnh lý sau khi công cường độc lúc 120 ngày tuổi

trên heo tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu và 21 ngày tuổi 105

3.11 Đáp ứng kháng thể đến 30 ngày tuổi trên heo sau khi tiêm vacxin DTH vào thời điểm trước khi bú sữa đầu 107

3.12 Đáp ứng kháng thể trên heo khi tiêm vacxin DTH vào thời điểm trước khi bú sữa đầu và 30 ngày tuổi 108

3.13 Phân bố hiệu giá kháng thể thụ động của heo con 21 ngày tuổi 109

3.14 Trung bình hiệu giá kháng thể trên heo trước và sau khi tiêm vacxin DTH lúc 21 ngày và 51 ngày tuổi (heo nuôi tại trại) 110

3.15 Diễn biến HGKT trên heo sau khi tiêm vacxin DTH lúc 21 ngày và 51 ngày tuổi (heo nuôi tại NAVETCO) 112

3.16 Dấu hiệu lâm sàng, phát hiện virut và tỷ lệ bảo hộ trên heo sau công cường độc DTH lúc 130 ngày tuổi 114

3.17 Diễn biến kháng thể thụ động kháng DTH trên heo con từ 1 - 5 tuần tuổi ở tỉnh Đồng Nai, Long An và Đồng Tháp 119

3.18 Diễn biến kháng thể kháng PCV2 trên bốn ổ heo 124

3.19 Diễn biến kháng thể kháng PCV2 trên mười ổ heo 126

3.20 Diễn biến kháng thể kháng PCV2 trên 10 heo nuôi ở khu thí nghiệm 129

3.21 Diễn biến kháng thể kháng DTH và PCV2 trên heo tiêm vacxin DTH lúc 21 ngày và 51 ngày tuổi 130

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình Trang

1.1 Cấu trúc các vùng trên bộ gien mã hóa protein tương ứng của Pestivirus 7

1.2 Cây phả hệ thể hiện mối quan hệ giữa 3 nhóm chính và các phân nhóm của virut DTH dựa trên gen E2 (190nt) 10

1.3 Tiến trình của bệnh DTH thể cấp tính 15

1.4 Tiến trình của bệnh DTH thể mãn tính 16

1.5 Tiến trình của bệnh DTH thể trước khi sinh 17

1.6 Các nguyên nhân dẫn đến thất bại sau tiêm phòng vacxin 26

1.7 Sự hiện diện của KTTĐ làm chậm sự đáp ứng miễn dịch chủ động 30

1.8 Hình thành đáp ứng miễn dịch sơ cấp và miễn dịch thứ cấp 35

1.9 Mức độ bảo hộ hình thành tương ứng với số lần tiêm vacxin 36

2.1 Tế bào PK 15 bị nhiễm virut DTH 67

2.2 Đĩa NPLA chuẩn 67

2.3 Tế bào PK15 không nhiễm PCV2 69

2.4 Tế bào PK15 nhiễm PCV2 69

3.1 Cây di truyền dựa trên vùng 433 nucleotide của gien 5’NTR 73

3.2 Cây di truyền dựa trên vùng 671 nucleotide của vùng gien E1/E2 74

3.3 Cây di truyền dựa trên vùng 449 nucleotide của gien NS5B 75

3.4 Phân bố địa lý của các virut DTH thực địa nhóm 2.1và 2.2 77

3.5 Heo 19: Xuất huyết da 90

3.6 Heo 19: Xuất huyết hạch bẹn nông 90

3.7 Heo 19: Xuất huyết các hạch vùng đầu 91

3.8 Heo 14: Ruột già chứa phân táo bón 91

3.9 Heo 14: Loét van hồi manh tràng 92

3.10 Heo 14: Sưng đầu xương sườn 92

ngày và 51 ngày tuổi 131

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ Trang

2.1 Các bước thực hiện thí nghiệm về ảnh hưởng của khác biệt nhóm di

truyền virut DTH đến hiệu lực vacxin DTH 53

2.2 Các bước thực hiện thí nghiệm về hiệu quả miễn dịch của một số lịch tiêm

vacxin DTH 54

2.3 Các bước khảo sát ảnh hưởng của nhiễm PCV2 đến đáp ứng kháng thể sau

tiêm vacxin DTH lúc 21 ngày và 51 ngày tuổi 55

MỞ ĐẦU

Bệnh dịch tả heo (DTH) là bệnh truyền nhiễm gây thiệt hại trầm trọng về mặt kinh tế cho nền chăn nuôi heo (Terpstra, 1991 [166]); là bệnh quan trọng hàng đầu cần phải phòng chống để phát triển ngành chăn nuôi heo ở Việt Nam (Nguyễn Tiến Dũng, 2002 [9]) Đã có nhiều công trình nghiên cứu về bệnh lý, dịch tễ, chẩn đoán

và phát triển vacxin phòng bệnh DTH (Đào Trọng Đạt và ctv, 1989 [13]; Phạm Văn Chức và ctv, 1985 [5]; Nguyễn Tiến Trung và ctv, 1985 [23]), kết quả các nghiên cứu này được áp dụng trong phòng chống, ngăn ngừa dịch bệnh DTH; góp phần đáng kể trong việc phát triển ngành chăn nuôi heo ở Việt Nam

Thế nhưng, vấn đề đáng quan tâm hiện nay đối với DTH là bệnh thường xảy

ra chủ yếu ở thể mãn tính và thể nhiễm trước khi sinh (Nguyen Thu Ha, 2008 [117]) Thêm vào đó, kết quả phân tích di truyền virut DTH từ các mẫu phân lập từ heo bệnh DTH ở cả 2 miền Nam, Bắc cho thấy chỉ duy nhất một phân lập virut phát hiện năm 1991 (VN 91) thuộc phân nhóm 1.1, còn tất cả các phân lập virut DTH thu thập từ năm 2001-2003 và 2007-2008 thuộc phân nhóm 2.1 và 2.2 Trong khi các chủng virut vacxin DTH nhược độc đang sử dụng lại thuộc phân nhóm 1.1 Như vậy chưa có sự tương đồng về nhóm di truyền giữa các chủng virut DTH đang lưu hành phổ biến trong thực địa với các chủng vacxin hiện hành (Kamakawa và ctv, 2006 [84]; Nguyễn Thế Vinh và ctv, 2007 [25]; Trần Thị Dân và ctv, 2008 [7]) Vấn đề cần làm rõ là sự khác biệt về phân nhóm giữa các virut DTH thực địa với các virut DTH vacxin có phải là một trong những nguyên nhân dẫn đến thất bại của chương trình kiểm soát bệnh DTH bằng vacxin hay không (Nguyễn Ngọc Hải, 2007 [15])

Bên cạnh đó, một số các yếu tố khác cũng có ảnh hưởng đến hiệu quả của việc tiêm chủng vacxin DTH như kháng thể mẹ truyền, lứa tuổi tiêm vacxin lần đầu (Terpstra và Wenvoort, 1987 [163]; Vandeputte và ctv, 2001 [175]), lịch tiêm vacxin (Lai và ctv, 1980 [94]; Suradhat và Damrongwatanapokin, 2003 [156]; Suradhat và ctv, 2007 [158]) Để tránh ảnh hưởng của kháng thể mẹ truyền, có thể xác định thời điểm tiêm vacxin lần đầu thích hợp dựa vào lứa tuổi heo (Phạm Văn

Chức và ctv, 1985 [5]; Bùi Quang Anh, 2001 [1]; Nguyễn Tiến Dũng và ctv, 2003 [10]), hoặc dựa trên hiệu giá kháng thể thụ động (HGKTTĐ) không ảnh hưởng đến hiệu lực vacxin (Suvintrakon và ctv, 1993 [160]; Parchariyanon và ctv, 1994 [126])

Do vậy, xây dựng lịch tiêm phòng cũng là một điều quan trọng cần được tiến hành

Ngoài ra, sự cộng nhiễm với các tác nhân gây bệnh khác cũng có thể là một yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả tiêm chủng vacxin DTH (Suradhat và ctv, 2007 [158]) Porcine circovirus týp 2 (PCV2) là tác nhân gây hội chứng còi sau cai sữa ở heo (Post Weaning Multisystemic Wasting - PMWS), gây ức chế miễn dịch trên heo bệnh (Chianini và ctv, 2003 [40]; Nielsen và ctv, 2003 [118]), do đó PCV2 có thể có ảnh hưởng đến hiệu lực của vacxin DTH (Qiu và ctv, 2006 [138]) Ở nước ta, PCV2 được phát hiện ở một số tỉnh thành từ năm 2000 với tỷ lệ nhiễm 38,97% nhưng đến 2006 tỷ lệ nhiễm đã tăng đến 96,47%, chứng tỏ PCV2 đang lưu hành phổ biến trong chăn nuôi heo (Nguyễn Tiến Hà, 2008 [14]) Tuy tỷ lệ tiêm chủng vacxin DTH đạt 81,4% nhưng bệnh DTH vẫn xảy ra liên tục trong năm (Báo cáo tổng kết công tác thú y vùng TP HCM, 2002 [2]) Như vậy yếu tố tác động thường xuyên và gây ức chế miễn dịch trên heo như PCV2 liệu có ảnh hưởng đến hiệu lực vacxin DTH sau khi tiêm cho heo con hay không cũng là vấn đề có tính chất thời sự trong chăn nuôi heo

Để góp phần giải quyết các vấn đề thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành đề tài của luận án: “Nghiên cứu một số yếu tố tác động đến hiệu lực vacxin dịch tả heo trên heo con ở các tỉnh phía Nam“

Mục tiêu nghiên cứu

1 Đánh giá ảnh hưởng của khác biệt phân nhóm di truyền virut DTH đến hiệu lực vacxin DTH thể hiện qua các yêu cầu thực hiện: Khảo sát phân nhóm của các phân lập virut DTH thực địa ở một số tỉnh thành phía Nam từ năm 2000 đến 2009; khảo sát diễn biến bệnh trên heo khi gây nhiễm bởi phân lập virut DTH phân nhóm 2.1 và đánh giá hiệu lực vacxin DTH đối với một phân lập virut DTH thực địa thuộc phân nhóm 2.1

2 Đánh giá hiệu quả miễn dịch của một số lịch tiêm vacxin DTH, bao gồm: Hiệu quả của việc tiêm vacxin DTH trước khi bú sữa đầu; lịch tiêm vacxin DTH lần đầu lúc trước khi bú sữa đầu và lần sau lúc 21 ngày tuổi hoặc 30 ngày tuổi; lịch tiêm vacxin DTH lúc 21 ngày và 51 ngày tuổi; lịch tiêm vacxin DTH tế bào NAVETCO

và xác định tuổi tiêm vacxin DTH lần đầu trên đàn heo nuôi ở thực địa

3 Khảo sát ảnh hưởng của cộng nhiễm PCV2 đến đáp ứng kháng thể sau tiêm chủng vacxin DTH trên heo con với yêu cầu: Xác định heo nhiễm PCV2 thực địa dựa trên sự biến động kháng thể kháng PCV2 và đánh giá ảnh hưởng nhiễm PCV2 đến đáp ứng kháng thể sau tiêm vacxin DTH lúc 21 ngày và 51 ngày tuổi

Những đóng góp mới và ý nghĩa thực tiễn

- Vaccine DTH thuộc phân nhóm di truyền 1.1 vẫn có hiệu lực chống lại các virus DTH thuộc phân nhóm di truyền 2.1 đang lưu hành trên thực địa

- Tiêm phòng vaccine DTH cho heo sơ sinh trước khi bú sữa đầu tuy không làm thay đổi lượng kháng thể vẫn có khả năng bảo hộ chống lại công cường độc

Chương 1

TỔNG QUAN 1.1 Tình hình bệnh DTH

1.1.1 Trên thế giới

Về địa lý, bệnh DTH có tính chất phân bố toàn cầu, Edwards (1998) [60] cho rằng bệnh xảy ra ở tất cả các lục địa hay tất cả các nước có chăn nuôi heo Đã có nhiều nước xây dựng thành công chương trình thanh toán DTH và có những vùng được đánh giá là an toàn như Canada, Pháp, Mỹ, Úc, New Zealand, Nhật và Nam Phi (Paton và Grelser- Wlike, 2003 [132]) Ở Nam Mỹ, Áchentina không xảy ra dịch từ 1999 và ngừng tiêm vacxin vào tháng 4 - 2004 Tuy nhiên sự tái xuất hiện DTH luôn là mối nguy cơ, và những nơi trước đây không có bệnh thì trong những năm gần đây DTH lại xảy ra Tại Anh khi áp dụng chính sách giết loại bắt buộc đã thanh toán bệnh DTH, và sau 14 năm vắng mặt, virut này đã xuất hiện trong 16 trại heo vào các tháng 6 - 11 năm 2000 (Paton, 2002 [131]) Ở Tây Âu, nơi có nền chăn nuôi heo công nghiệp lớn, vẫn còn những ổ dịch DTH đáng kể, chẳng hạn những ổ dịch địa phương xuất hiện gần đây ở Đức, Bỉ, Ý, Hà Lan và Tây Ban Nha với những thiệt hại kinh tế nghiêm trọng Ngoài ra, bệnh còn xuất hiện dưới dạng dịch địa phương ở châu Á, Nam Mỹ, Trung Mỹ, và Mêhico; gần đây là những ổ dịch ở Áchentina, Costa Rica và Haiti (Fríasp-Leupoureau, 2003 [66]) Ngoài ra, tình hình nhiễm virut DTH trên heo rừng trong thời gian gần đây có khuynh hướng lan rộng đến các nước không thuộc châu Âu như Nga, Croatia và các quốc gia châu Á

Vấn đề đáng quan tâm hiện nay là các chủng virut DTH giảm độc lực Những chủng virut này thường gây ra hiện tượng nhiễm bệnh dai dẳng và không điển hình, khó nhận thấy về mặt lâm sàng, chỉ chẩn đoán được sau khi virut đã lây sang đàn khác Đó là nguyên nhân chính giải thích tại sao các chương trình thanh toán bệnh DTH của một số nước không mang lại hiệu quả (Terpstra, 1991 [166])

Lý do khác ảnh hưởng đến việc tái xuất hiện DTH là các nước EU đã bỏ việc tiêm

chủng vacxin từ năm 1991 Heo mắc bệnh DTH xảy ra ở một số vùng có nguồn

bệnh từ heo rừng và lây lan khi được vận chuyển (Rassow, 1997 [139])

Mặc dù nền chăn nuôi trên thế giới hiện đang đối đầu với những tổn thất về

kinh tế trầm trọng do những bệnh động vật lây truyền qua biên giới như bệnh lở

mồm long móng, cúm gia cầm,… nhưng bệnh DTH vẫn là một trong những bệnh

được ưu tiên hàng đầu để giải quyết (Domenech và ctv, 2006 [57])

1.1.2 Ở Việt Nam

Ở Việt Nam, bệnh DTH được phát hiện vào các năm 1923 - 1924 bởi

Houdemer (Đào Trọng Đạt và Trần Thị Tố Liên, 1989 [13]) Từ những năm 1980,

việc tiêm phòng vacxin đã khống chế được các ổ dịch lớn trên đàn heo Mặc dù vậy,

cho đến nay bệnh vẫn tồn tại và diễn biến ngày càng phức tạp, có nhiều thay đổi về

triệu chứng lâm sàng, bệnh tích cũng như độ tuổi mẫn cảm Theo Cục thú y, tuy

bệnh DTH không nổ ra những ổ dịch lớn và gây thiệt hại như những năm 1960 -

1970 nhưng bệnh DTH vẫn là mối đe dọa lớn đối với ngành chăn nuôi heo, gây khó

khăn cho chăn nuôi và xuất khẩu (Lê Minh Chí, 1998 [4]); vì vậy đây là bệnh bắt

buộc phải tiêm chủng vacxin Từ năm 2000 tới nay, chăn nuôi heo ngày càng phát

triển ổn định với số lượng heo gia tăng đều đặn, song song với các ổ dịch DTH xuất

hiện lẻ tẻ và liên tục qua các năm (bảng 1.1)

Bảng 1.1: Tổng đàn heo và số ổ dịch DTH từ năm 2001- 2005 ở Việt Nam

Năm 2001 2002 2003 2004 2005

Số lượng heo 21.000.000 23.169.000 24.884.000 26.143.000 27.435.000

Số ổ dịch DTH 15.483 19.894 13.947 12.105 9.773

(Nguồn: Nguyen Thu Ha, 2008 [117])

Cụ thể trong năm 2008, DTH đã xảy ra ở 483 xã thuộc 105 huyện của 30 tỉnh

thành; chủ yếu xảy ra ở các địa phương có tỷ lệ tiêm chủng thấp hoặc không tiêm

chủng Từ 25/01/2009 đến ngày 04/02/2009 bệnh DTH đã xảy ra ở 3 hộ thuộc của 1

xã của huyện Đức Thọ, tỉnh Hà Tĩnh gây chết 275 heo trên đàn heo 485 con Nguyên nhân xảy ra dịch là do kết quả tiêm chủng vacxin DTH đợt II/2008 của tỉnh

này đạt tỷ lệ rất thấp (trích dẫn từ Báo cáo của Cục Thú Y năm 2009 [3]) Trong

những năm gần đây, bệnh DTH ở các tỉnh thành phía Nam như sau: năm 2007, DTH xảy ra ở 7 tỉnh với 1.407 heo bệnh và 1.143 heo chết; năm 2008, DTH xảy ra

ở 5 tỉnh với 185 ổ dịch, 1.459 heo bệnh và 1.114 heo chết; và năm 2009 có 101 ổ dịch, 1.032 heo bệnh và 885 heo chết trong 5 tỉnh (trích dẫn theo Báo cáo tổng kết công tác thú y của Trung Tâm Thú Y Vùng 6 năm 2007, 2008 và 2009 [2])

1.2 Đặc điểm sinh học của virut DTH

1.2.1 Hình thái và phân loại virut DTH

Virut DTH là virut ARN, có vỏ bọc là lipoprotein Dưới kính hiển vi điện tử, virut có cấu trúc hình cầu với nucleocapside đối xứng khối, được bao bọc bởi một

vỏ ngoài (envelope) Virion có đường kính 40 - 50nm, đường kính của khối nucleocapside là 29nm

Virut DTH thuộc họ Flaviviridae, chi Pestivirus, loài virut DTH

Họ Flaviviridae có 3 chi: Flavivirus, Hepacivirus và Pestivirus

Chi Pestivirus bao gồm 4 loài: virus DTH (Classical swine fever virus - CSFV), virus gây bệnh tiêu chảy ở bò (Bovine viral diarrhea virus - BVDV): gồm BVDV-1, BVDV-2 và virus gây bệnh border ở cừu (Border disease virus - BDV)

Loài thứ năm được xem xét là chủng phân lập (H138) trên hươu cao cổ ở Kenya cách đây 30 năm (Becher và ctv, 1999 [31]; Lihong và ctv, 2009 [99]) Mặc dù có vật chủ tự nhiên là bò nhưng BVDV có thể gây bệnh cho heo và hươu Vật chủ tự nhiên của BDV là cừu, tuy nhiên đã có trường hợp trâu bò nhiễm tự nhiên với BDV Riêng virut DTH có vật chủ duy nhất là heo nhà và heo rừng

1.2.2 Hệ gien của virut và kháng nguyên đích

Bộ gien RNA của virut dịch tả heo là chuỗi đơn, mạch dương dài khoảng 12,3 kb, không có đuôi poly A ở đầu 3’ Bộ gien RNA này bao gồm một khung đọc

mở (open reading frame - ORF) dài liên tục nằm giữa 2 đầu không mã hoá (nontranslated region - NTR) 5’ và 3’ (Meyers và ctv, 1989 [111]; Becher và ctv,

1999 [31]) Vùng không mã hoá ở đầu 5’ dài khoảng 400 nucleotide với nhiều bộ ba AUG và trình tự các nucleotide được bảo tồn cao, có lẽ vì cần để duy trì cấu trúc gấp phức tạp Vùng này liên quan đến việc kiểm soát sự dịch mã polyprotein và sự

tái sản bộ gien của virut Ngoài ra, một khung đọc mở dài, đơn lẻ, dịch mã khoảng

4.000 axit amin; gồm 4 protein cấu trúc (C, Erns (hay E0), E1, E2) và 8 protein

không cấu trúc (Npro, p7, NS2-3 (NS2, NS3), NS4A, NS4B, NS5A và NS5B) Polyprotein này của virut được sắp xếp theo trình tự (từ đầu N đến đầu C) như sau

Npro, C, Erns, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A và NS5B (hình 1.1)

Hình 1.1: Cấu trúc các vùng trên bộ gien mã hóa protein tương ứng của Pestivirus

(Nguồn: Kabongo, 2005 [83]) Gien mã hoá glycoprotein E2 (vỏ bọc chính của virut DTH và cũng là đích

chính cho các kháng thể trung hoà virut) dài khoảng 1.200 nucleotide, gien này gồm

một số vùng biến đổi nhiều (Meyers và ctv, 1996 [112]) Glycoprotein E2 (gp55) là

protein có tính sinh miễn dịch nhiều nhất của virut DTH, tạo kháng thể trung hòa và

bảo hộ chống lại công cường độc (Weiland và ctv, 1990 [183]; Chen và ctv, 2008

[39]) Trước đây, E2 không được coi là một kháng nguyên đối với tế bào T (Kimman và ctv, 1993 [88]) Gần đây, Ceppi và ctv (2005 [36]) xác định E2 như là

kháng nguyên đích đối với các tế bào T gây độc và cũng là yếu tố quyết định tính

độc của virut DTH Tuy nhiên, E2 là một trong các phần biến đổi nhiều nhất trong

bộ gien của Pestivirus (Parchariyanon và ctv, 1999 [127])

Glycoprotein Erns được xem là kháng nguyên đích thứ hai đối với kháng thể

trung hòa (Weiland và ctv, 1992 [183]), và cũng góp phần vào việc quyết định tính

độc của virut DTH (Meyers và ctv, 1999 [113]) Bên cạnh các protein cấu trúc, một protein không cấu trúc cũng có liên quan đến tính độc của virut DTH là Npro khi dựa

vào thí nghiệm đột biến loại bỏ protein này Cho tới nay, mặc dù chưa có các thí

nghiệm rõ ràng về yếu tố quyết định tính độc của các chủng virut DTH trên heo;

nhưng trong thực địa thì tính độc của virut là vấn đề chính được quan tâm Những chủng virut DTH có độc lực cao thì lây lan nhanh chóng trong quần thể heo nhạy cảm và “dễ dàng” phát hiện do chúng gây cho heo nhiều biểu hiện lâm sàng và thường gây chết heo Ngược lại, ổ dịch do chủng virut DTH có độc lực trung bình thì không dễ nhận diện do virut chỉ gây ra các triệu chứng nhẹ và trong vài trường hợp heo có thể phục hồi Hơn thế nữa, khi heo nhiễm chủng virut có độc lực yếu hoặc trung bình sẽ bị nhiễm virut dai dẳng và có thể thải virut trong thời gian dài (Moennig và ctv, 2003 [115]) Biết được độc lực của virut DTH trong ổ dịch DTH

sẽ hỗ trợ trong việc dự đoán hoặc mô hình về sự lây lan của virut và từ đó góp phần vào việc lựa chọn các biện pháp khống chế bệnh thích hợp nhất

1.2.3 Dịch tễ phân tử trong bệnh dịch tả heo

Virut DTH là một RNA virut tương đối ổn định (Vanderhallen và ctv, 1999 [176]), chỉ có một týp huyết thanh (serotype), nhưng có sự đa dạng về tính kháng nguyên và tính di truyền Sự đa dạng kháng nguyên giữa virut DTH và các

Pestivirus trên thú nhai lại được xác định bằng cách sử dụng kháng thể đơn dòng

(monoclonal antibody - Mab) và phản ứng trung hòa virut với kháng thể đa dòng (Edwards và ctv, 1991 [61])

Phương pháp phân tích tính đa dạng kháng nguyên bằng bộ Mab rất nhạy và

minh họa được mức độ đa dạng kháng nguyên giữa virut DTH và các Pestivirus

Đây là phương pháp đầu tiên được dùng để xác định đặc điểm kháng nguyên của các phân lập virut DTH trên thế giới (Edwards và Sands, 1990 [58]; Kosmidos và ctv, 1995 [92]; Nishimori và ctv, 1996 [120]; Mendoza và ctv, 2007 [110]) Có nhiều bộ Mab được phát triển như Edwards và ctv (1991) [59] sử dụng bộ gồm 30 Mab để phân biệt virut DTH thực địa, virut DTH vacxin với các Pestivirus khác Một bộ Mab khác được phát triển bởi Nishimori và ctv (1996) [120] đã phân loại 20 virut DTH thành 6 týp kháng nguyên Hoặc Zhu và ctv (2009) [184] dùng bộ kháng thể gồm 28 Mab kháng virut DTH, BVDV và BDV để xác định tính đa dạng kháng nguyên của 21 phân lập virut DTH từ 1996 đến 2006 ở Trung Quốc Cũng theo các tác giả này, vì chưa có bộ Mab chuẩn nên rất khó so sánh kết quả xếp loại các phân

lập virut dựa trên Mab, nên hiện nay chỉ có một số ít các phân lập virut được phân tích đặc điểm kháng nguyên bằng Mab

Phân tích di truyền virut DTH đóng góp rất lớn trong việc nghiên cứu dịch tễ học, đóng vai trò quan trọng trong việc xác định nguồn gốc của bệnh và đặc biệt là

về sự lan truyền và tiến hoá của virut Sự tương đồng về trình tự nucleotide (nt) của các virut DTH phân lập gần đây với những phân lập trước đó có thể chỉ ra rằng dịch bệnh nổ ra là do chủng mới hoặc là do chủng đã tồn tại trước đó Phân tích cây di truyền đã chứng minh có sự liên hệ giữa nhóm di truyền và nguồn gốc địa lý (Vilcek và cs, 1996 [180])

Các đoạn gien thường được giải trình tự và phân tích cây di truyền là đoạn không mã hoá đầu 5’ NTR (gồm 150 nucleotide), gien mã hoá glycoprotein E2 (190 nucleotide) và NS5B (409 nucleotide) (Lowing và ctv, 1996 [103]; Meyers và ctv,

1996 [112]; Paton và ctv, 2000 [130]) Dựa vào việc so sánh các vùng gien 5’NTR, E2 và NS5B của virut DTH để phân loại thì virut DTH được chia thành 3 nhóm gien, với mỗi nhóm có 3 hoặc 4 phân nhóm (subgroup) Nhóm 1 gồm các phân nhóm 1.1, 1.2, 1.3, nhóm 2 gồm các phân nhóm 2.1, 2.2, 2.3 và nhóm 3 gồm các phân nhóm 3.1, 3.2, 3.3, 3.4 (Paton và ctv, 2000 [130])

Các phân lập virut DTH thuộc nhóm 3 dường như chỉ xuất hiện ở Châu Á, trong khi tất cả các phân lập virut DTH được phát hiện ở châu Âu trong 15 năm qua thuộc một trong các phân nhóm của nhóm 2 (2.1, 2.2 hoặc 2.3) Các virut DTH này khác biệt rõ với virut DTH lịch sử thuộc nhóm 1 (là các virut DTH được sử dụng như là virut DTH tham chiếu phòng thí nghiệm) Các phân lập virut DTH hiện tại thuộc nhóm 1 tiếp tục gây ra các ổ dịch ở Nam Mỹ, Trung Mỹ và Caribbean Điều quan trọng là tất cả các virut DTH thuộc cả 3 nhóm đều được phát hiện ở những vùng khác nhau tại Châu Á (hình 1.2)

Hình 1.2: Cây phả hệ thể hiện quan hệ giữa 3 nhóm chính và các phân nhóm của virut DTH dựa trên gien E2 (190nt) (Nguồn: Paton và ctv, 2000 [130])

* Phân nhóm di truyền của virut DTH ở các nước châu Á

- Nhật: virut Japanese Hokkaido phân lập từ năm 1966 thuộc phân nhóm 1.1, trong khi đó phân lập Osaka vào năm 1971 thuộc phân nhóm 2.3 và phân lập Kanagawa vào năm 1974 thuộc phân nhóm 3.4 Theo Harasawa và Giangaspero (1999 [79]) nghiên cứu sự đa dạng di truyền ở vùng 5’NTR và NS5B của 16 dòng virut DTH điển hình được phân lập ở Nhật trải qua khoảng thời gian 35 năm (từ năm 1951 đến năm 1986) cho thấy ở Nhật có cả 3 nhóm virut DTH

- Ấn Độ: phân tích di truyền dựa vào đoạn 5’NTR của 17 mẫu phân lập virut DTH trong 3 năm (2006 - 2009) cho thấy chúng thuộc 2 phân nhóm 1.1 và 2.2 Trong đó, virut thuộc 1.1 lưu hành nổi trội hơn trong dịch tễ DTH hiện nay (Patil và ctv, 2009 [129]) Tuy nhiên, Desai và ctv (2010 [56]) cũng dựa vào đoạn gien này

để phân tích di truyền 9 phân lập virut thực địa cho thấy có 6 virut thuộc phân nhóm

1.1 (gồm các chủng virut cũ và virut mới) và cả 3 phân lập virut mới phát hiện gần đây đều thuộc phân nhóm 2.1 Như vậy, ở Ấn Độ các virut DTH lưu hành hiện nay thuộc phân nhóm 1.1, 2.1 và 2.2

- Thái Lan: theo Pachariyanon và ctv (1999 [127]) phân tích cây di truyền cho thấy các virut phân lập vào những năm 1980 thuộc phân nhóm 1.1 và 1.2, và vào những năm 1990 thuộc phân nhóm 2.2 và 3.3

- Lào: các virut DTH phân lập được ở Lào thuộc nhóm 2 Stuart và ctv (2004

[152]; 2005 [153]) giải trình tự đoạn gien E2 và phân tích cây di truyền gồm 27

virut DTH phân lập từ các ổ dịch xảy ra ở Lào từ năm 1997 đến 1999 cho thấy các virut DTH thuộc phân nhóm 2.1 chỉ được tìm thấy ở Bắc - Trung Lào, trong khi đó phân nhóm 2.2 phân bố ở Nam - Trung Lào Do các phân lập virut này chỉ thu thập trong 2,5 năm nên tác giả cho rằng không thể đánh giá được mức độ biến đổi tạm thời của các phân lập virut DTH

- Hàn Quốc: qua phân tích cây di truyền của 24 phân lập virut DTH ở Hàn

Quốc từ năm 1988 đến 2003 dựa trên một phần gien E2 (dài 190 nucleotide) kết quả

các virut phân lập thực địa từ năm 1988 đến 1999 thuộc phân nhóm 3.2, hình thành một nhánh riêng, độc lập so với các virut DTH ở các nước khác Ngược lại, các virut phân lập trong suốt giai đoạn dịch DTH từ năm 2002 - 2003 được xếp vào nhóm 2.1 Các virut thuộc nhóm 2.1 này cho thấy có sự quan hệ di truyền gần (tương đồng từ 92,1 - 100% về nucleotide) với các virut DTH được báo cáo từ Trung Quốc và Đài Loan vào năm 1998 - 2001 (Cha và ctv, 2007 [37])

- Trung Quốc: dựa theo phân tích cây di truyền cho thấy 103 trong số 110 mẫu phân lập thực địa thuộc nhóm 2.1, 2 2 và 2.3 (chiếm 93,6%), đặc biệt trong đó

có 90/96 (94%) mẫu phân lập được từ năm 1997 - 1999 Trong khi 7 phân lập virut còn lại (chiếm 6,4%), bao gồm cả 2 chủng virut DTH Trung Quốc tham chiếu là chủng Shimen và HCLV (chủng vacxin giảm độc), thuộc phân nhóm 1.1 Tuy nhiên không có virut nào thuộc phân nhóm 1.2 (với chủng tham chiếu là Brescia) Kết quả cho thấy các phân lập virut DTH nổi trội trong khoảng thời gian 1993 - 1999 khác nhau về mặt di truyền với 2 chủng tham chiếu trên (Tu và ctv, 2001 [172]) Trong

khảo sát về tính đa dạng di truyền dựa trên glycoprotein E2 của các phân lập virut thu thập ở Nam Trung Quốc gần đây (Ning và ctv, 2008 [119]) cho thấy virut thuộc phân nhóm 2.1 nổi trội chiếm 33 trong số 34 phân lập (với 19 phân lập thu thập trong năm 2004 - 2007), còn lại 1 phân lập thuộc nhóm 2.2 Tương tự Zhu và ctv (2009 [184]) khi khảo sát 21 phân lập virut DTH từ 1996 - 2006 ghi nhận 13 phân lập thuộc nhóm 2.1, 4 phân lập thuộc nhóm 2.2, số virut còn lại thuộc nhóm 1.1 và 2.3; đặc biệt trong năm 2006 có tới 8/9 phân lập virut thuộc nhóm 2.1 Như vậy các phân lập virut DTH gần đây ở Nam Trung Quốc có sự thay đổi so với các phân lập virut trước kia, kể cả chủng vacxin Sự thay đổi này có thể phản ánh khả năng thích ứng của virut đối với các sức ép chọn lọc trong cơ thể vật chủ

- Việt Nam: theo nghiên cứu của Kamakawa và ctv (2006 [84]) trên 16 mẫu phân lập virut DTH từ các ổ dịch ở đồng bằng sông Cửu Long từ 2002 - 2003, chủ yếu thuộc phân nhóm 2.2 và kế đến là phân nhóm 2.1 Các tác giả nhận định các virut này có cùng phân nhóm với các phân lập virut ở các nước có chung biên giới với vùng đồng bằng Cửu Long như Trung Quốc, Lào, Thái Lan, Cambodia, Myanma và Tibet Qua phân tích di truyền virut DTH từ 19 mẫu phân lập ở heo bệnh DTH ở cả hai miền Nam Bắc trong giai đoạn 2001-2003 (Nguyễn Thế Vinh và ctv, 2007 [25]) cho thấy các phân lập virut DTH ở Việt Nam và một số nước trong khu vực (như Trung Quốc, Lào và Thái Lan) thuộc nhóm 2 Như vậy nhóm 2 đang

có chiều hướng thay thế các nhóm khác và trở thành nhóm chính gây bệnh DTH trong khu vực Hay nói cách khác, đã có sự chuyển đổi quần thể virut DTH từ nhóm

1 và nhóm 3 sang nhóm 2 (Chen và ctv, 2008 [39])

Tóm lại, có tính đa dạng đáng kể về sự phân bố các phân lập virut DTH khắp châu Á và các phần còn lại của thế giới Nhóm 2 phân bố nhiều nhất ở Châu Á, ở Việt Nam và Lào chỉ có phân nhóm 2.1 và 2.2 (Stuart, 2008 [154]) (bảng 1.2)

Bảng 1.2: Tóm tắt các phân nhóm virut dịch tả heo ở Châu Á

Khu vực Quốc gia Phân nhóm gien Nguồn

Trung tâm/Nam Á Trung Quốc 1.1, 2.1, 2.2, 2.3 Tu và ctv, 2001

Đông Á Nhật 1.1, 1.2, 2.2, 3.4 Sakoda và ctv, 1999

Đông Á Hàn quốc 3.2 Paton và ctv, 2000

Đông Á Đài Loan 2.1, 2.2, 3.4 Pan và ctv, 2005

Đông - Nam Á Lào 2.1, 2.2 Stuart và ctv, 2004, 2005 Đông - Nam Á Thái Lan 1.1, 2.1, 2.2, 3.4 Parchariyanon và ctv, 2000 Đông - Nam Á Malaysia 1.2, 2.1 Lowings và ctv, 1996

Đông - Nam Á Việt Nam 2.1, 2.2 Kamakawa và ctv, 2006

(Nguồn: Stuart, 2008 [154]) 1.3 Các thể bệnh DTH

1.3.1 Cơ chế sinh bệnh

Các trường hợp lây nhiễm bệnh tự nhiên với các chủng độc lực cao được đặc trưng bởi các giai đoạn: nhiễm virut ở hạch, ở máu và ở phủ tạng Khoảng 7 giờ sau khi xâm nhập vào vật chủ qua đường tiêu hóa, virut vào hạch hạnh nhân, đây là vị trí nhân lên đầu tiên Chỉ 24 giờ sau khi nhiễm, virut đã tràn ngập hệ thống lâm ba rồi vào máu và gây hiện tượng nhiễm virut huyết (viremia) lần thứ nhất Theo tuần hoàn, virut đến định vị, sinh sản và phá hủy những tế bào nội mạc mao mạch (máu

và bạch huyết), những mảnh vỡ sẽ tụ lại làm tắc mạch, dẫn đến nhồi máu ở lách, xuất huyết và hoại tử ruột Nhiễm virut huyết xảy ra lần thứ hai vào 5 - 6 ngày sau khi nhiễm Đây là thời điểm xuất hiện các triệu chứng của bệnh Số lượng virut trong máu sẽ đạt tối đa vào ngày thứ 7 sau khi nhiễm Sự suy yếu hệ thống miễn dịch do virut DTH tạo thuận lợi cho sự phụ nhiễm vi sinh vật khác dẫn đến rối loạn tuần hoàn nghiêm trọng và gây chết heo bệnh thể cấp tính Ngoài ra, virut còn có thể nhân lên trong bạch cầu đơn nhân, đại thực bào và tế bào nội mạc gây ra sự cảm nhiễm dai dẳng mà không bị trung hòa bởi kháng thể (Marie-Frédérique và ctv,

2006 [104]) Trường hợp đặc biệt là sự nhiễm từ nái qua nhau thai không gây chết phôi Hiện tượng này có thể dẫn đến sự dung nạp miễn dịch, heo con sinh ra nhiễm

và bài thải virut dai dẳng nhưng không tạo kháng thể (Nguyễn Tiến Dũng và ctv,

2002 [9])

Thời kỳ ủ bệnh trên từng cá thể heo thường kéo dài từ 3 - 10 ngày Do tiến trình lây bệnh từ heo qua heo diễn ra chậm nên trong đàn heo nhiễm bệnh, triệu chứng bệnh trên heo chỉ rõ ràng sau nhiều tuần nhiễm virut DTH, giai đoạn này gọi

là thời kỳ ủ bệnh của đàn Tính độc của các phân lập virut DTH rất khó xác định bởi

vì biểu hiện bệnh còn phụ thuộc vào lứa tuổi, giống heo, tình hình sức khỏe và tình trạng miễn dịch của heo (Depner và ctv, 1997 [52]; Moening và ctv, 2003 [115]; trích dẫn theo Potier và ctv, 2006 [135])

mắt, chảy nước mũi, táo bón và sau đó ỉa chảy Dấu hiệu thần kinh thường xuất hiện

như yếu hai chân sau, rối loạn vận động và co giật Heo bị xuất huyết ở tai, đuôi, bụng và phần hông suốt tuần thứ 2 và thứ 3 sau khi nhiễm virut và cho tới lúc chết Virut được thải ra trong chất tiết và chất thải của heo bệnh Virut DTH làm giảm bạch cầu trầm trọng và gây ức chế miễn dịch dẫn đến nhiễm trùng kế phát ở đường tiêu hóa và hô hấp Dấu hiệu của việc nhiễm trùng kế phát có thể làm nhầm lẫn hoặc che phủ các triệu chứng điển hình nhất của DTH và gây khó khăn trong chẩn đoán DTH lâm sàng Heo lớn (heo thịt và heo giống) bị nhiễm virut DTH, có những dấu hiệu lâm sàng ít đặc trưng và hồi phục với sự sản xuất kháng thể khoảng 2 đến 3 tuần sau khi nhiễm virut (Laevens và ctv, 1998 [95]) Heo mắc bệnh mà không chết trong vòng 4 tuần sau khi nhiễm bệnh thì có thể phục hồi nếu hàm lượng kháng thể trung hòa cao hoặc chuyển thành thể mãn tính (hình 1.3)

Một số chủng virut DTH như chủng Brescia (Ressang, 1973 [140]), chủng Eystrup (Mittelholzer và ctv, 2000 [114]) hay chủng virut DTH cường độc quốc gia

(Nguyễn Vĩnh Phước, 1970 [21]; Phạm Văn Chức và ctv, 1985 [6]) có thể gây ra thể bệnh này và thường gây chết heo trong vòng 10 - 14 ngày sau khi tiêm

về hô hấp hoặc tiêu hóa hoặc kết hợp Heo gầy còm dần, sau đó chết trong thời gian

từ 1 đến 3 tháng (hình 1.4)

Hình 1.4: Tiến trình của bệnh DTH thể mãn tính

(Nguồn: Depner và Porntrakulpipat, 2000 [53])

Do các dấu hiệu lâm sàng của thể mãn tính thường không điển hình, nhiều bệnh khác có biểu hiện tương tự, vì thế cần được quan tâm chẩn đoán phân biệt với DTH Nghiên cứu về tính gây bệnh của virut DTH chủng UK2000/7.1 thuộc phân nhóm 2.1 trên heo 10 tuần tuổi, Everett và ctv (2009 [63]) nhận thấy các triệu chứng nổi bật như sau: các dấu hiệu lâm sàng xuất hiện hơi muộn nhưng sau đó giữ ổn định với triệu chứng chủ yếu là kết mạc mắt sưng đỏ và phân mềm hoặc tiêu chảy; không có bệnh tích lách nhồi huyết và xuất huyết da Tác giả kết luận chủng virut DTH phân nhóm 2.1 này có tiến trình gây bệnh xảy ra chậm so với các chủng virut

có độc lực cao như Brescia hay Eystrup (phân nhóm 1.1); nhưng gần giống với các virut phân nhóm 2.1 và 2.3 mới phân lập gần đây (Floegel-Niesmann và ctv, 2003 [65])

1.3.4 Thể phát bệnh muộn

Nái nhiễm virut DTH thường không có biểu hiện lâm sàng, nhưng virut DTH

có thể truyền qua nhau, do đó gây nhiễm cho phôi Hậu quả của nhiễm virut DTH qua nhau thai chủ yếu phụ thuộc vào tuổi của thai và độc lực của virut Nhiễm vào giai đoạn đầu của thai kỳ có thể gây sẩy thai, sinh thai chết, thai khô, dị dạng; làm giảm khả năng sinh sản của nái (Moennig và ctv, 2003 [115])

Nái mang thai giai đoạn 50 - 70 ngày mà bị nhiễm virut DTH có thể dẫn đến tình trạng sinh ra heo con bị nhiễm virut dai dẳng, những heo này thường không có biểu hiện bất thường ngay sau khi sinh và sống được nhiều tháng Tuy nhiên, heo thường chậm lớn, còi cọc và thỉnh thoảng bị run bẩm sinh Những heo này bị nhiễm virut huyết suốt đời và virut huyết có thể chỉ giảm trong thời gian ngắn do heo nhận được kháng thể sữa đầu Suốt quá trình sống, những heo con này luôn bài thải một

số lượng lớn virut và là nguồn chứa, lây lan và duy trì sự nhiễm bệnh trong quần thể (Van Oirschot và Terpstra, 1977 [178]) Tiến trình bệnh trong trường hợp này được xem như DTH thể phát bệnh muộn và cuối cùng heo sẽ chết (hình 1.5) Virut DTH gây rối loạn sinh sản là chủng có độc lực yếu như chủng 331 và các chủng phân lập

từ heo bị bệnh mãn tính

Hình 1.5: Tiến trình của bệnh DTH thể trước khi sinh

(Nguồn: Depner và Porntrakulpipat, 2000 [53])

1.4 Đáp ứng miễn dịch trong bệnh DTH

Miễn dịch chống bệnh DTH là một mô hình miễn dịch cổ điển của ba kiểu đề kháng chính đối với sự nhiễm bệnh Đó là đề kháng tự nhiên, đề kháng do miễn dịch thụ động và đề kháng do miễn dịch chủ động

Sự đề kháng tự nhiên xảy ra dựa trên khác biệt gien giữa các động vật khác loài và trong cùng một loài Tất cả động vật khác ngoài heo đều có sức đề kháng

mạnh đối với DTH Trong cùng một loài, cho dù DTH là một trong những bệnh gây chết heo nhiều nhất, nhưng đôi khi có một vài heo trong từng đàn có khả năng đề kháng bệnh DTH Số lượng heo này thường không nhiều; có lẽ ít hơn 5% số heo trong đàn có miễn dịch tự nhiên đối với DTH (Howard., 1971 [82])

1.4.1 Miễn dịch thụ động

Nhiều nghiên cứu cho rằng nái có thai khi được tiêm vacxin virut giảm độc

sẽ tạo đủ lượng kháng thể và khi heo con bú sữa đầu sẽ nhận được lượng kháng thể giúp heo chống lại sự nhiễm bệnh DTH (Biron, 1987 [32]) Kháng thể IgG khuyếch tán qua ruột của heo sơ sinh trong khoảng 24 - 48 giờ đầu của đời sống và đi trực tiếp vào trong máu Kháng thể thụ động (KTTĐ) tuy bảo vệ heo con trong vài tuần đầu nhưng không ngăn được sự nhân lên và thải virut cường độc (Terpstra, 1977 [161])

Có sự tương quan về hàm lượng kháng thể trong huyết thanh giữa heo mẹ

và heo con HGKTTĐ tăng đều đặn và đạt đỉnh cao khoảng 5 - 7 giờ sau khi bú và ngang bằng hoặc cao hơn HGKT của nái mẹ (Vandeputte và ctv, 2001 [175]) Nhận định này phù hợp với các kết quả nghiên cứu khác khi so sánh HGKT ở heo mẹ, sữa đầu và heo con, cho thấy HGKT của heo mẹ cao nhất vào thai kỳ cuối, và giảm dần sau khi sinh HGKT sữa đầu thì cao gấp 10 lần so với HGKTTĐ trên heo con 48 giờ tuổi HGKTTĐ cao nhất trên heo sơ sinh trong giai đoạn 24 - 48 giờ sau khi sinh và HGKTTĐ này cao hơn HGKT trong huyết thanh heo mẹ sau khi sinh (theo dẫn liệu của Lin và Lee, 1981 [101]) Thêm vào đó, khi khảo sát về mối liên quan giữa hàm lượng kháng thể trên heo mẹ và kháng thể ở heo con nhằm mục đích xác định thời điểm tiêm vacxin lần đầu trên heo con thông qua HGKT trên heo mẹ Tác giả Nguyễn Thị Thu Hồng và ctv (2003 [18]) nhận thấy trên heo con 2 ngày tuổi thì hiệu giá KTTĐ trong huyết thanh heo con bú sữa đầu gần như bằng với hiệu giá kháng thể trung hòa có trong huyết thanh heo mẹ sau khi đẻ 2 ngày với hệ số tương quan R = 0,89 (P<0,001) Nếu không phơi nhiễm với virut DTH thì thời gian bán hủy của KTTĐ sẽ khoảng 2 tuần (Coggins, 1964 [44]), hoặc 7,9 ngày (Vandeputte

và ctv, 2001 [175]), hay 10 ngày (Nguyễn Thị Thu Hồng và ctv, 2003 [18]) Nhóm

tác giả khác (Jin và ctv, 2000 [77]) nhận thấy mặc dù heo nái được tiêm vacxin cùng thời điểm và có cùng mức kháng thể, và ngay cả khi heo con cùng một mẹ, thì mức KTTĐ của chúng cũng khá khác nhau Các tác giả cho rằng có thể do: mỗi nái

có khả năng tiết sữa khác nhau, sự tiết sữa thì khác nhau giữa các bầu vú của cùng nái mà bầu vú thì lại cố định cho mỗi heo con, và mỗi heo con có khả năng hấp thụ kháng thể sữa đầu khác nhau

Thời gian bảo hộ thụ động và mức độ miễn dịch thụ động ở heo con tùy thuộc vào điều kiện tiêm chủng heo mẹ, đặc biệt là thời gian từ khi tiêm chủng đến khi đẻ (Corthier và Charley, 1978 [46]) Shanyi và ctv (2000 [147]) dùng phương pháp IHA kiểm tra các mức kháng thể trên heo nái được tiêm vacxin và nhận thấy nái được tiêm các liều vacxin khác nhau sẽ truyền các mức kháng thể khác nhau cho heo con, kháng thể mẹ tăng khi liều gây miễn dịch tăng

Ngưỡng bảo hộ của KTTĐ:

Mức độ bảo hộ do kháng thể mẹ truyền tùy thuộc chủ yếu vào hàm lượng KTTĐ trong huyết thanh heo con tại thời điểm công cường độc Tác giả Corthier (1976 [45]), khi nghiên cứu về miễn dịch thụ động đã kết luận rằng heo con được bảo hộ thụ động nếu trong huyết thanh của chúng có một mức tối thiểu kháng thể trung hòa từ sữa đầu được gọi là “ngưỡng bảo hộ thụ động” (Passive protection level: PPL) với chỉ số trung hòa (Neutralising Index: NI) = 2,5 Khi NI thấp hơn PPL thì kháng thể sữa đầu không bảo vệ heo con chống lại bệnh DTH KTTĐ với hiệu giá cao sẽ bảo hộ heo con chống bệnh DTH ở các mức độ khác nhau

Theo Parchariyanon và ctv (1994 [126]), bằng phương pháp NPLA thì hiệu giá KTTĐ > 7log2 sẽ bảo hộ heo con không có dấu hiệu lâm sàng đối với bệnh Nhưng cũng có nghiên cứu cho rằng hiệu giá KTTĐ từ 6log2 là có thể bảo hộ heo con (Nguyễn Thị Thu Hồng, 2003 [17]) Tuy nhiên, với mức hiệu giá KTTĐ cao phải cần thời gian dài hơn để kháng thể này giảm tới mức không ảnh hưởng đến hiệu quả tiêm vacxin, và thời gian heo nhạy cảm với virut có thể sẽ kéo dài hơn