Nghiên cứu vi nấm trong nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) và cá lóc (Channa striata) thâm canh

GIỚI THIỆU 1.1 Giới thiệu Vi nấm là một trong những tác nhân gây bệnh ở động vật thủy sản và bệnh do vi nấm đã và đang gây thiệt hại cho nghề nuôi thủy sản ở nhiều quốc gia trên thế giới. Vi nấm bậc thấp với đa dạng thành phần loài gây bệnh và nhiễm ở các giai đoạn khác nhau trên động vật thủy sản, trong đó đặc biệt là Achlya và Saprolegnia là các giống vi nấm thường gây bệnh trên các loài cá nước ngọt với các sợi nấm phát triển nhanh và tạo thành búi màu trắng như bông gòn (Bruno and Woo, 1994; Yanong, 2003). Vi nấm nhiễm trên động vật thủy sản thông thường là bệnh mãn tính, tuy nhiên cũng gây thiệt hại kinh tế cho nghề nuôi thủy sản. Điển hình như nghiên cứu về các giai đoạn phát triển của cá chình (Anguilla Anguilla), cá hồi bạc (Oncorhynchus kisutch) nuôi ở Nhật Bản cho thấy tỉ lệ cá chết hằng năm do nhiễm vi nấm rất cao, khoảng 50% (Bruno and Woo, 1994; Hatai and Hoshiai, 1994). Tỉ lệ cá chết ở 5 loài cá hồi nuôi ở Nhật Bản lên đến 100% khi bị nhiễm vi nấm S. parasitica (Hussein and Hatai, 2002). Vi nấm Saprolegnia sp. gây cảm nhiễm trên cá nheo (Ictalurus punctatus) cho thấy 92% cá nheo bị bệnh có dấu hiệu tổn thương trên da và tỉ lệ chết lên đến 67% sau 21 ngày (Bly et al., 1992). Bên cạnh đó, vi nấm bậc cao bao gồm là Fusarium moniliforme và F. udum được phát hiện gây bệnh phổ biến trên một số loài cá nuôi nước ngọt ở Ấn Độ như cá chành dục (Channa punctatus), cá chốt giấy (Mystus tengra), cá leo (Wallago attu), cá trôi Ấn Độ (Labeo rohita), cá chạch bông (Mastaceamblus armatus), cá đòng đong (Puntius sophore) và cá ngạnh (Barbus rana) (Deepa et al., 2000). Ở Ai Cập, nghiên cứu đã phát hiện cá dĩa (Symphysodon) bị nhiễm vi nấm F. solani, F. oxysporum và F. moniliform với tỉ lệ lần lượt là 50; 33,3 và 16,7% (El-Ghany et al., 2014). Ở Tây Ban Nha, nhóm nghiên cứu của Cutuli et al. (2015) tìm thấy sự hiện diện của F. oxysporum ở vết thương dưới da cá rô phi (Oreochromis niloticus). Đặc biệt một số nghiên cứu gần đây đã phát hiện các vi nấm phức nhiễm trên động vật thủy sản như F. incarnatum-equiseti complex (FIESC) và F. solani species complex (FSSC) nhiễm trên trứng cá (Odontesthes bonariensis) hay F. oxysporum species complex (FOSC) nhiễm trên cơ cá vằn (Danio rerio) nuôi ở Hàn Quốc (Marino et al., 2016; Kulatunga et al., 2017).

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

ĐẶNG THỤY MAI THY

NGHIÊN CỨU VI NẤM TRONG NUÔI

CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) VÀ

CÁ LÓC (Channa striata) THÂM CANH

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

Mã ngành 62620301

Cần Thơ, 2017

3.3 Vật liệu nghiên cứu 28

3.3.1 Môi trường nuôi cấy vi nấm, thuốc kháng sinh, 28

3.3.2 Dụng cụ và thiết bị 28

3.4 Phương pháp nghiên cứu 29

3.4.1 Xác định thành phần giống loài vi nấm trong môi trường ao nuôi 30

3.4.1.1 Phương pháp thu mẫu 30

3.4.1.2 Phương pháp phân tích mẫu nước 30

3.4.1.3 Phương pháp định danh vi nấm 30

3.4.2 Xác định thành phần giống loài vi nấm nhiễm trên cá tra và cá lóc 31

3.4.2.1 Phương pháp thu mẫu 31

3.4.2.2 Phương pháp phân lập vi nấm 33

3.4.3 Nghiên cứu đặc điểm bệnh học vi nấm gây bệnh ở cá tra và cá lóc 33

3.4.3.1 Nguồn cá tra và cá lóc khỏe sử dụng ở thí nghiệm cảm nhiễm 33

3.4.3.2 Phương pháp nuôi cấy sinh bào tử vi nấm 34

3.4.3.3 Thí nghiệm cảm nhiễm 1 trên cá tra: 34

3.4.3.4 Thí nghiệm cảm nhiễm 2 trên cá tra: 35

3.4.3.5 Thí nghiệm cảm nhiễm 3 trên cá tra: 36

3.4.3.6 Thí nghiệm cảm nhiễm 4 trên cá lóc: 37

3.4.3.7 Thí nghiệm cảm nhiễm 5 trên cá lóc: 38

3.4.3.8 Thí nghiệm cảm nhiễm 6 trên cá tra và cá lóc: 39

3.4.4 Phương pháp định danh vi nấm 40

3.4.4.1 Phương pháp định danh truyền thống 40

3.4.4.2 Phương pháp sinh học phân tử định danh vi nấm 40

3.4.5 Phương pháp mô học 42

3.4.6 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi nấm gây bệnh trên cá tra và cá lóc 42

3.4.6.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển của vi nấm 42

3.4.6.2 Ảnh hưởng của pH đến khả năng phát triển của vi nấm 43

3.4.6.3 Ảnh hưởng của độ mặn đến khả năng phát triển của vi nấm 43

3.4.6.4 Khả năng sử dụng carbohydrat của vi nấm 43

3.4.6.5 Khả năng sử dụng nitrite của vi nấm 44

3.4.7 Nghiên cứu ảnh hưởng của hóa chất và thảo dược đến vi nấm trong điều kiện phòng thí nghiệm 44

3.4.8 Thí nghiệm sử dụng cỏ mực phòng bệnh do vi nấm trong điều kiện phòng thí nghiệm 46

3.4.9 Phương pháp xử lý số liệu 47

CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48

4.1 Vi nấm trong môi trường ao nuôi cá tra và cá lóc 48

4.1.1 Thành phần vi nấm trong môi trường ao nuôi cá tra và cá lóc 48

4.1.2 Đặc điểm hình thái vi nấm trong môi trường ao nuôi 51

4.2 Thành phần vi nấm nhiễm trên cá tra và cá lóc theo chu kỳ nuôi 57

4.3 Thành phần vi nấm nhiễm trên cá tra ở thời điểm cá bệnh 59

4.3.1 Thành phần vi nấm nhiễm trên cá tra giống 59

4.3.2 Thành phần vi nấm nhiễm trên cá tra bệnh giai đoạn nuôi thương phẩm 62

4.4 Đặc điểm bệnh học của vi nấm gây bệnh ở cá tra 63

4.4.1 Khả năng gây bệnh của 5 giống vi nấm ở cá tra 63

4.4.2 Khả năng gây bệnh của các chủng Fusarium sp ở cá tra 65

4.4.3 Khả năng gây bệnh của các chủng Fusarium sp ở các mật độ khác nhau 67

4.4.4 Biến đổi mô học ở cá tra bệnh do Fusarium incarnatum-equiseti species complex (FIESC) 69

4.4.5 Kết quả định danh vi nấm gây bệnh trên cá tra 72

4.4.5.1 Đặc điểm hình thái Fusarium incarnatum-equiseti complex (FIESC) gây bệnh trên cá tra 72

4.4.5.2 Kết quả định danh vi nấm bằng phương pháp sinh học phân tử 73

4.5 Thành phần vi nấm nhiễm trên cá lóc bệnh 76

4.5.1 Dấu hiệu bệnh lý 76

4.5.2 Thành phần và tỉ lệ vi nấm nhiễm trên cá lóc bệnh 77

4.6 Đặc điểm bệnh học của vi nấm gây bệnh ở cá lóc 79

4.6.1 Khả năng gây bệnh của 5 giống vi nấm phân lập ở cá lóc 79

4.6.2 Khả năng gây bệnh của Achlya bisexualis ở cá lóc 81

4.6.3 Khả năng gây bệnh của Achlya bisexualis ở cá lóc và cá tra 84

4.6.4 Biến đổi mô học ở cá lóc bệnh do vi nấm 86

4.6.5 Kết quả định danh nấm gây bệnh trên cá lóc 90

4.6.5.1 Đặc điểm hình thái của Achlya gây bệnh trên cá lóc 90

4.6.5.2 Kết quả định danh vi nấm bằng phương pháp sinh học phân tử 92

4.7 Đặc điểm sinh học của vi nấm gây bệnh trên cá tra và cá lóc 94

4.7.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của vi nấm 94

4.7.2 Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của vi nấm 96

4.7.3 Ảnh hưởng của độ mặn đến sự phát triển của vi nấm 98

4.7.4 Khả năng sử dụng carbohydrat của vi nấm 99

4.7.5 Ảnh hưởng của nitrite đến sự phát triển của vi nấm 100

4.8 Ảnh hưởng của hóa chất đến sự phát triển của Achlya bisexualis và Fusarium

incarnatum-equiseti complex (FIESC) 101

4.8.1 Bronopol 101

4.8.2 CuSO 4 104

4.8.3 Iodine 107

4.9 Ảnh hưởng của cỏ mực và diệp hạ châu đến sự phát triển của Achlya bisexualis và Fusarium incarnatum-equiseti complex (FIESC) 111

4.10 Thử nghiệm bổ sung cỏ mực vào thức ăn cho cá tra và cá lóc cảm nhiễm vi nấm 113 4.10.1 Kết quả cảm nhiễm vi nấm Fusarium incarnatum-equiseti complex trên cá tra cho ăn thức ăn bổ sung cỏ mực 113

4.10.2 Kết quả cảm nhiễm vi nấm Achlya bisexualis trên cá lóc cho ăn thức ăn bổ sung cỏ mực 114

CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 117

5.1 Kết luận 117

5.2 Đề xuất 118

TÀI LIỆU THAM KHẢO 119

PHỤ LỤC A 138

PHỤ LỤC B 141

PHỤ LỤC C 144

PHỤ LỤC D 148

PHỤ LỤC E 153

PHỤ LỤC F 158

PHỤ LỤC G 176

DANH SÁCH BẢNG

Số

bảng

3.1 Số mẫu cá tra thu định kỳ ở ao nuôi thâm canh 31

3.3 Số mẫu cá lóc thu định kỳ ở ao nuôi thâm canh 32

3.6 Nghiệm thức thí nghiệm cảm nhiễm 5 giống vi nấm ở cá tra 35 3.7 Các chủng Fusarium sp ở thí nghiệm cảm nhiễm 35 3.8 Nghiệm thức thí nghiệm cảm nhiễm Fusarium sp ở cá tra 36 3.9 Nghiệm thức thí nghiệm cảm nhiễm Fusarium sp ở mật độ bào tử khác

3.11 Nghiệm thức thí nghiệm cảm nhiễm 5 giống vi nấm ở cá lóc 38 3.12 Các chủng Achlya bisexualis thí nghiệm cảm nhiễm 38 3.13 Các nghiệm thức thí nghiệm cảm nhiễm Achlya bisexualis ở cá lóc 39 3.14 Thí nghiệm cảm nhiễm Achlya bisexualis ở cá lóc và cá tra 40

3.16 Hóa chất và nồng độ sử dụng trong nghiên cứu 44

3.18 Nghiệm thức thí nghiệm sử dụng cỏ mực ở cá tra và cá lóc 47 4.1 Thành phần vi nấm trong môi trường ao nuôi cá tra và cá lóc ở các địa

4.2 Thành phần và số chủng vi nấm trong ao nuôi cá tra và cá lóc

4.3 Thành phần và số chủng vi nấm nhiễm trên cá tra và cá lóc theo chu kỳ

4.4 Thành phần vi nấm nhiễm ở các cơ quan của cá tra và cá lóc 58 4.5 Số lượng chủng vi nấm phân lập ở cá tra bệnh 63 4.6 Tỉ lệ nhiễm Fusarium incarnatum-equiseti complex (FIESC) trên bóng

hơi cá tra cảm nhiễm với mật độ bào tử khác nhau 68 4.7

Kết quả mối tương quan trình tự ITS rDNA của 5 chủng Fusarium

incarnatum-equiseti species complex (FIESC) với các chủng trong

FUSARIUM-ID

74 4.8 Thành phần vi nấm trên cá lóc ở các địa điểm thu mẫu 77 4.9 Tỉ lệ nhiễm vi nấm ở các cơ quan trên cá lóc 78

4.16 Ảnh hưởng của nitrite đến sự phát triển của vi nấm 101 4.17 Khả năng ức chế của bronopol đối với A.bisexualis và Fusarium

incarnatum-equiseti complex (FIESC) ở các thời gian thí nghiệm 103

4.18 Khả năng ức chế của CuSO4 đối với A.bisexualis và Fusarium

incarnatum-equiseti complex (FIESC) ở các mức thời gian 106

4.19 Khả năng ức chế của iodine đối với A.bisexualis và Fusarium

incarnatum-equiseti complex (FIESC) ở các mức thời gian 108

4.20 Ảnh hưởng của nồng độ cỏ mực và diệp hạ châu đến sợi nấm 111 4.21 Ảnh hưởng của cỏ mực và diệp hạ châu đến tỉ lệ nẩy mầm của bào tử vi

4.1 Tỉ lệ % vi nấm trong môi trường nước ao nuôi cá tra và cá lóc thâm canh 49 4.2 Đặc điểm hình thái vi nấm Achlya và Saprolegnia 52 4.3 Đặc điểm hình thái vi nấm Aspergillus và Fusarium 53

4.5 Đặc điểm hình thái vi nấm Geotrichum, Acremonium và Trichoderma 56 4.6 Cá tra giống (Pangasianodon hypophthalmus) bị nhiễm vi nấm 60 4.7 Tỉ lệ % các giống vi nấm nhiễm ở cá tra giống 60 4.8 Tỉ lệ % vi nấm nhiễm ở các cơ quan của cá tra giống 61 4.9 Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bị bệnh trương bóng hơi 62 4.10 Tỉ lệ chết tích lũy (%)của cá tra cảm nhiễm các giống vi nấm 64

4.11 Tỉ lệ chết tích lũy (%) của cá tra nhiễm vi nấm Fusarium sp 65

4.13 Tỉ lệ chết tích lũy (%) của cá tra nhiễm Fusarium sp ở các mật độ bào tử

4.14 Mô bóng hơi cá tra bệnh thu ở ao nuôi thâm canh (H&E) 69 4.15 Mô bóng hơi cá tra cảm nhiễm Fusarium incarnatum-equiseti complex 71 4.16 Đặc điểm hình thái của vi nấm Fusarium incarnatum-equiseti complex 73 4.17 Cây phát sinh loài dựa trên trình tự ITS rDNA của 5 chủng vi nấm

Fusarium incarnatum-equiseti species complex (FIESC) 75

4.23 Tỉ lệ chết tích lũy (%) của cá lóc và cá tra cảm nhiễm Achlya bisexualis 85

Số

hình

4.25 Biến đổi mô da cá lóc nhiễm vi nấm (H&E) 87

4.27 Đặc điểm hình thái của vi nấm Achlya bisexualis 91 4.28 Cây phát sinh loài dựa trên trình tự ITS rDNA của vi nấm Achlya

4.29 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tỉ lệ nẩy mầm (%) của bào tử vi nấm 95 4.30 Ảnh hưởng của bronopol đến sự phát triển của sợi nấm 102 4.31 Ảnh hưởng của bronopol đến sự phát triển của bào tử 103 4.32 Ảnh hưởng của CuSO4 đến sự phát triển của sợi nấm 105 4.33 Ảnh hưởng của CuSO4 đến sự phát triển của bào tử 105 4.34 Ảnh hưởng của iodine đến sự phát triển của sợi nấm 107 4.35 Ảnh hưởng của iodine đến sự phát triển của bào tử 108

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

BioEdit Biological sequence alignment editor

ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long

DNA Deoxyribose Nucleic Acid

dNTP Deoxyribonucleoside Triphosphate

FIESC Fusarium incarnatum-equiseti complex

GYA Glucose Yeast Agar

ITS Internal Transcribed Space

MEGA Molecular Evolutionary Genetics Analysis MIC Nồng độ ức chế tối thiểu

MT 2-methyl-4isothiazolin-3-one

NCBI National of Centre Biotechnology Information

NTĐC Nghiệm thức đối chứng

PCR Polymerase Chain Reaction

PDA Potato Dextrose Agar

rDNA Ribosomal Deoxyribose Nucleic Acid

RNA Ribonucleic Acid

Taq Thermus aquaticus

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 Giới thiệu

Vi nấm là một trong những tác nhân gây bệnh ở động vật thủy sản và bệnh

do vi nấm đã và đang gây thiệt hại cho nghề nuôi thủy sản ở nhiều quốc gia trên thế giới Vi nấm bậc thấp với đa dạng thành phần loài gây bệnh và nhiễm ở các

giai đoạn khác nhau trên động vật thủy sản, trong đó đặc biệt là Achlya và

Saprolegnia là các giống vi nấm thường gây bệnh trên các loài cá nước ngọt với

các sợi nấm phát triển nhanh và tạo thành búi màu trắng như bông gòn (Bruno and Woo, 1994; Yanong, 2003) Vi nấm nhiễm trên động vật thủy sản thông thường là bệnh mãn tính, tuy nhiên cũng gây thiệt hại kinh tế cho nghề nuôi thủy

sản Điển hình như nghiên cứu về các giai đoạn phát triển của cá chình (Anguilla

Anguilla), cá hồi bạc (Oncorhynchus kisutch) nuôi ở Nhật Bản cho thấy tỉ lệ cá

chết hằng năm do nhiễm vi nấm rất cao, khoảng 50% (Bruno and Woo, 1994; Hatai and Hoshiai, 1994) Tỉ lệ cá chết ở 5 loài cá hồi nuôi ở Nhật Bản lên đến

100% khi bị nhiễm vi nấm S parasitica (Hussein and Hatai, 2002) Vi nấm

Saprolegnia sp gây cảm nhiễm trên cá nheo (Ictalurus punctatus) cho thấy 92%

cá nheo bị bệnh có dấu hiệu tổn thương trên da và tỉ lệ chết lên đến 67% sau 21

ngày (Bly et al., 1992)

Bên cạnh đó, vi nấm bậc cao bao gồm là Fusarium moniliforme và F

udum được phát hiện gây bệnh phổ biến trên một số loài cá nuôi nước ngọt ở Ấn

Độ như cá chành dục (Channa punctatus), cá chốt giấy (Mystus tengra), cá leo

(Wallago attu), cá trôi Ấn Độ (Labeo rohita), cá chạch bông (Mastaceamblus

armatus), cá đòng đong (Puntius sophore) và cá ngạnh (Barbus rana) (Deepa et al., 2000) Ở Ai Cập, nghiên cứu đã phát hiện cá dĩa (Symphysodon) bị nhiễm vi

nấm F solani, F oxysporum và F moniliform với tỉ lệ lần lượt là 50; 33,3 và 16,7% (El-Ghany et al., 2014) Ở Tây Ban Nha, nhóm nghiên cứu của Cutuli et

al (2015) tìm thấy sự hiện diện của F oxysporum ở vết thương dưới da cá rô phi

(Oreochromis niloticus) Đặc biệt một số nghiên cứu gần đây đã phát hiện các vi nấm phức nhiễm trên động vật thủy sản như F incarnatum-equiseti complex (FIESC) và F solani species complex (FSSC) nhiễm trên trứng cá (Odontesthes

bonariensis) hay F oxysporum species complex (FOSC) nhiễm trên cơ cá vằn

(Danio rerio) nuôi ở Hàn Quốc (Marino et al., 2016; Kulatunga et al., 2017)

Cá tra là loài cá nuôi truyền thống mang lại giá trị kinh tế và xuất khẩu chủ lực của Việt Nam Hơn nữa bệnh do vi nấm đã xuất hiện cũng làm giảm hiệu quả kinh tế và ảnh hưởng đến nghề nuôi cá này, điển hình như bệnh trương bóng hơi trên cá tra Bệnh xuất hiện trong một vài năm gần đây và các mẫu cá tra bệnh đã

ghi nhận được các loài Fusarium oxysporum, Fusarium subglutinans và

Fusarium sp nhiễm trên bóng hơi (Phạm Minh Trúc và ctv., 2012; Phạm Minh

Đức và ctv., 2012) Nhưng nghiên cứu này chỉ dừng lại ở dạng định tính, chưa

xác định tác nhân gây ra bệnh trương bóng hơi và đặc điểm bệnh học của vi nấm

Fusarium một cách hệ thống, thông tin về bệnh học vẫn còn giới hạn

Tương tự như cá tra, nghiên cứu về bệnh cá lóc nói chung và bệnh do nấm gây ra nói riêng vẫn còn hạn chế Cho đến nay, các nghiên cứu về bệnh vi nấm trên cá lóc đang dừng lại ở mức xác định thành phần loài vi nấm nhiễm ở cá bệnh

Nghiên cứu của Kitancharoen et al (1995) lần đầu tiên phát hiện Achlya

klebsiana nhiễm trên cá lóc ở Myanmar Ngoài ra, Saraswathi et al (2015) cho

biết trong số 9 loài cá nghiên cứu thì cá lóc là đối tượng dễ bị nhiễm đồng thời

nhiều loài vi nấm Achlya khác nhau Vi nấm Achlya bisexualis được ghi nhận

nhiễm trên trứng cá rô phi, trứng cá tra dầu và cá rô phi bột ở Thái Lan (Panchai

et al., 2007; Abking et al., 2012) Ở Việt Nam, kết quả khảo sát mầm bệnh trên cá

lóc nuôi thâm canh trong ao đã phân lập được 4 giống vi nấm là Achlya sp.,

Fusarium sp., Acremonium sp., Geotrichum sp và chỉ xuất hiện ở 3 tháng nuôi

đầu tiên, đặc biệt vi nấm Achlya sp chỉ xuất hiện ở tháng nuôi thứ nhất và thứ ba (Phạm Minh Đức và ctv., 2012) Như vậy, nghiên cứu một cách hệ thống về mầm

bệnh vi nấm trong môi trường ao nuôi cá tra và cá lóc cũng như xác định tác nhân gây bệnh do vi nấm và khảo sát hóa chất, thảo dược diệt vi nấm là cần thiết nhằm

có được hệ thống cơ sở dữ liệu khoa học để kiểm soát mầm bệnh này

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định thành phần vi nấm trong môi trường ao nuôi cá tra và cá lóc thâm canh, đặc điểm bệnh học của vi nấm gây bệnh trên cá tra và cá lóc, hóa chất và thảo dược sử dụng phòng trị bệnh vi nấm

Từ đó cung cấp thông tin về vi nấm và bệnh do vi nấm trên cá, đóng góp các dữ liệu khoa học làm cơ sở đề xuất giải pháp phòng trị bệnh do vi nấm gây ra góp phần quản lý dịch bệnh tổng hợp và phát triển nghề nuôi cá bền vững

1.3 Phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu tập trung tìm hiểu về mầm bệnh vi nấm nhiễm trên cá tra, cá lóc và vi nấm xuất hiện trong môi trường nước ao nuôi nhằm cung cấp dẫn liệu khoa học về mầm bệnh vi nấm phục vụ công tác đào tạo và ứng dụng cho thực tiễn sản xuất

1.4 Nội dung nghiên cứu

1) Nghiên cứu thành phần giống vi nấm trong môi trường nuôi và trên cá tra bệnh và cá lóc bệnh

2) Nghiên cứu đặc điểm bệnh học của vi nấm gây bệnh ở cá tra và cá lóc 3) Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi nấm gây bệnh

4) Nghiên cứu ảnh hưởng của hóa chất và thảo dược đến vi nấm gây bệnh và thử nghiệm phòng bệnh do nấm trong điều kiện phòng thí nghiệm

1.5 Ý nghĩa của nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu cung cấp và bổ sung thông tin chuyên về vi nấm

nhiễm trên cá tra và cá lóc Đặc biệt vi nấm Achlya bisexualis là tác nhân gây bệnh trên cá lóc và Fusarium incarnatum-equiseti complex là tác nhân gây bệnh

trương bóng hơi trên cá tra nuôi thâm canh và các đặc điểm bệnh học của hai loài

vi nấm này Đồng thời, nghiên cứu đã đánh giá ảnh hưởng của hóa chất và thảo dược đến vi nấm gây bệnh, đây là cơ sở khoa học cần thiết để đề xuất các giải pháp hiệu quả trong phòng và trị bệnh do vi nấm nhiễm trên cá tra và cá lóc Bên cạnh ý nghĩa khoa học và ứng dụng trong thực tiễn, luận án còn giúp nâng cao kiến thức, năng lực nghiên cứu cho người tham gia và là nguồn tài liệu tham khảo

bổ sung cho nghiên cứu và giảng dạy sinh viên và học viên cao học

1.6 Điểm mới của luận án

Đã định danh và lưu giữ được các giống loài vi nấm trong môi trường ao nuôi thâm canh cũng như vi nấm nhiễm trên cá tra và cá lóc

Nghiên cứu đã xác định vi nấm Fusarium incarnatum-equiseti complex (FIESC) là tác nhân gây bệnh trương bóng hơi ở cá tra Ứng dụng phương pháp

truyền thống và sinh học phân tử xác định các đặc điểm hình thái, di truyền và

sinh học của các chủng FIESC gây bệnh Mô tả đặc điểm mô bệnh học bóng hơi

bị bệnh do FIESC

Nghiên cứu cũng xác định vi nấm Achlya bisexualis có khả năng gây bệnh

trên cá lóc Tương tự, phương pháp truyền thống và sinh học phân tử được ứng

dụng để xác định các đặc điểm hình thái, di truyền và sinh học của các chủng A

bisexualis gây bệnh Đồng thời mô tả biến đổi cấu trúc mô da cơ cá lóc bị nhiễm

vi nấm A bisexualis

Đánh giá tác động của hóa chất và thảo dược đến Fusarium

incarnatum-equiseti complex và Achlya bisexualis và thử nghiệm sử dụng cỏ mực phòng bệnh

do hai loài vi nấm này gây ra

Các phương pháp và kết quả của nghiên cứu có thể được ứng dụng trong nghiên cứu về bệnh do vi nấm trên cá nuôi

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Đặc điểm của vi nấm

2.1.1 Cấu tạo vi nấm

Vi nấm là vi sinh vật nhân thực, sống dị dưỡng, không có diệp lục tố, hấp thụ dinh dưỡng qua vách tế bào bằng cách tiết những enzymes vào vật chủ (de

Hoog et al., 2000) Sợi nấm có dạng hình ống bên trong chứa chất nguyên sinh có

thể lưu động, sợi nấm có phân nhánh hay không phân nhánh tùy thuộc loài Phần lớn sợi nấm có dạng trong suốt, tuy nhiên ở một số loài vi nấm thì sợi nấm mang sắc tố nên sợi nấm có màu tối hay màu sặc sỡ, đôi khi sắc tố còn có khả năng tiết

ra môi trường bên ngoài Sợi nấm sinh trưởng vô hạn về chiều dài nhưng lại hữu hạn về đường kính, thường dao động từ 1-30 µm và kích thước sợi nấm phổ biến

từ 5-10 µm Vách tế bào nấm cấu tạo bởi vi sợi chitin và có hoặc không có

celluloz (Webster, 1970; Phạm Minh Đức và ctv, 2015)

Hình 2.1: Cấu trúc của sợi nấm

Ty thể, mạng nội chất, dịch bào hay không bào, thể Golgi sinh bào nang, thành tế bào,

màng tế bào và hạch nhân (Nguyễn Lân Dũng và ctv, 2006)

nội chất

Ty thể

Đoạn tăng trưởng

Hạt không bào

Nhân được bao bọc bởi màng nhân và trên màng nhân có nhiều lỗ nhỏ, trong nhân có hạch nhân Nhân của tế bào nấm có hình cầu hay bầu dục với màng đôi phospholipid và protein dầy 0,02 m, bên trong màng nhân chứa RNA và DNA Sợi nấm thường có nhiều nhân tập trung ở phần ngọn, các tế bào phía sau ngọn thường chỉ có 1-2 nhân Tế bào vi nấm còn có các cơ quan giống như trong

tế bào các sinh vật có nhân thực khác Tế bào vi nấm gồm ty thể, mạng nội chất, dịch bào hay không bào, thể ribô, bào nang, thể golgi sinh bào nang, các giọt lipid, các tinh thể và các vi thể đường kính 0,5-1,5 nm, các thể vôrônin đường kính 0,2 µm, thể chitô đường kính 40-70 nm Trên màng nguyên sinh chất có một

số phần có kết cấu gấp nếp hay xoắn lại gọi là biên thể màng hay biên thể Đầu sợi nấm có hình trụ, phần đầu gọi là vùng kéo dài Giai đoạn sợi nấm sinh trưởng

và phát triển đây là vùng thành tế bào phát triển nhanh chóng, vùng này có thể dài đến 30 µm Ở đoạn dưới của sợi nấm có thành tế bào dày và không có khả năng sinh trưởng Màng nguyên sinh chất thường bám sát vào thành tế bào Tại phần già nhất của sợi nấm thường xảy ra hiện tượng tự tan hoặc bị tan rã dưới tác dụng của các men phân cắt do các vi sinh vật khác sinh ra Cũng có những phần sợi nấm già, lipid tích tụ nhiều và kết hợp với thành tế bào tạo nên một màng dày, tạo thành những bào tử áo Loại bào tử này có thể giúp sợi nấm tồn tại được qua

những điều kiện môi trường khắc nghiệt (Webster, 1970; Phạm Minh Đức và ctv,

Lớp Nấm roi (Mastigomycetes): Sợi nấm không ngăn vách, động bào tử

1-2 roi, đẳng giao, di giao, noãn giao, hầu hết sống trong nước

Lớp Nấm noãn (Oomycetes): Sợi nấm phát triển nhưng chưa có vách ngăn ngang Ðộng bào tử có 2 roi, sinh sản hữu tính noãn giao Lớp nấm này phần lớn

ký sinh hoặc hoại sinh trên các động vật ở trong nước

Lớp Nấm tiếp hợp (Zygomycetes): Nấm có khuẩn ty phát triển và phân nhánh Sợi nấm không có vách ngăn ngang, màng tế bào chủ yếu là chitosan – chitin Sinh sản vô tính với bào tử trong túi còn gọi là bào tử bất động, nấm chứa rất nhiều túi bào tử Số ít loài nấm sinh sản với bào tử vách dày, bào tử đính Sinh sản hữu tính với sự phân chia giao tử trong đó 2 giao tử phát triển từ khuẩn ty khác nhau Hai giao tử hợp nhau thành bào tử có vách dày gọi là bào tử tiếp hợp Bào tử tiếp hợp chống chịu sự khô hạn và những yếu tố bất lợi của môi trường;

vỏ bào tử có màu đặc trưng ở nhiều loài nấm nhất định

Lớp Nấm nang (Ascomycetes): Nhóm nấm xuất hiện ở hầu hết các vùng

có khí hậu khác nhau và phát triển phổ biến trong đất, vùng nuớc mặn, nước ngọt, hoại sinh trên xác bã động thực vật và ký sinh trên thực vật và động vật Hệ sợi nấm rất phát triển, sợi nấm có vách ngăn ngang chưa hoàn chỉnh Phân biệt với các nhóm nấm khác là nang chứa các bào tử sinh sản Sinh sản vô tính bằng bào

tử ngoại sinh (đính bào tử), sinh sản hữu tính bằng các bào tử túi Trong một số loài, sinh sản vô tính với bào tử phấn, bào tử vách mỏng hay bào tử vách dày Quá trình sinh sản hữu tính xảy ra sự tiếp hợp của 2 tế bào có nhân đơn bội trên 2 sợi nấm khác tính nhau hình thành hợp tử lưỡng bội (2n) và phân chia 3 lần với lần đầu giảm nhiễm tạo thành 8 nhân đơn bội, và hợp tử trở thành túi chứa bào tử túi Nang hợp thành nhóm gọi là bào nang, thể quả bào tử có dạng ly hay dạng bình Bào tử không có roi trong tất cả các chu kỳ sinh truởng

Lớp Nấm đảm (Basidiomycetes): Hệ sợi nấm rất phát triển, phân nhánh, sợi nấm có vách ngăn ngang chưa hoàn chỉnh Sinh sản vô tính bằng đính bào tử, sinh sản hữu tính bằng bào tử đảm hình thành ngoài đảm Tùy theo cách hình thành đảm và vách ngăn mà phân chia ra các loại đảm: đảm đơn bào (hay đảm không vách) gặp ở phần lớn các nấm đảm, đảm đa bào (hay đảm có vách ngăn ngang hoặc vách ngăn dọc) Sống trên ký chủ thực vật trong tự nhiên

Lớp Nấm bất toàn (Deuteromyces): nấm có hệ sợi phát triển, sợi nấm đa bào, có vách ngăn ngang Sinh sản vô tính bằng bào tử đính, bất động, phát triển bên ngoài cuống bào tử đính Bào tử đính có hình dạng, kích thước, màu sắc thay đổi, đơn nhân hoặc đa nhân, có vách ngăn ngang, dọc hoặc không, hình trứng (oval), thuôn dài, hình cầu, dạng sao, dạng hơi cong, dạng sợi, hình đĩa, dạng cuộn xoắn,… Hiện tại, các nghiên cứu về sinh sản hữu tính của lớp nấm này còn hạn chế Số lượng loài của lớp này khá lớn và chiếm 50% tổng số loài nấm và hầu hết thuộc về nấm bậc cao Phần lớn nấm bất toàn ký sinh, một số ít hoại sinh Một số lớn nấm bất toàn thuỷ sinh và được tìm thấy trong cả môi trường biển và

nước ngọt, đa số các cá thể hoại sinh hoặc ký sinh, là nguyên nhân gây một số

bệnh trên thực vật và động vật

Trên môi trường thạch và trên một số cơ chất trong tự nhiên, bào tử nấm,

tế bào nấm hoặc một đoạn sợi nấm có thể phát triển thành một hệ sợi nấm có hình dạng nhất định gọi là khuẩn lạc nấm Giai đoạn cuối của sự phát triển khuẩn lạc

sẽ xảy ra sự kết mạng giữa các sợi nấm với nhau làm cho cả khuẩn lạc là một hệ thống liên thông mật thiết với nhau, thuận tiện cho việc vận chuyển chất dinh dưỡng đến toàn bộ hệ sợi nấm Đặc điểm về hình thái, kích thước, màu sắc và bề mặt của khuẩn lạc nấm có ý nghĩa quan trọng trong định danh các chủng vi nấm

2.1.3 Đặc điểm sinh sản của vi nấm

 Sinh sản dinh dƣỡng

Vi nấm sinh sản bằng cách đoạn sợi: từ một đoạn sợi nấm tách riêng ra phát triển thành hệ sợi mới

Vi nấm sinh sản bằng cách nảy chồi: tế bào nấm men bắt đầu trưởng thành

sẽ nẩy ra một chồi nhỏ Chồi lớn dần lên, một phần nhân của tế bào được chuyển sang chồi, rồi tách hẳn ra thành một nhân mới Tế bào mới sinh ra sẽ tạo ra đủ vách ngăn để ngăn cách hẳn với tế bào mẹ Trên mỗi tế bào mẹ có thể nẩy sinh ra vài chồi ở những vị trí khác nhau Tế bào con sau khi được hình thành sẽ tách rời khỏi tế bào mẹ hoặc vẫn đính trên tế bào mẹ và tiếp tục nẩy sinh các chồi mới

Vi nấm sinh sản bằng bào tử vách dày: một số tế bào riêng biệt trên sợi nấm có vách dày lên, tích chứa chất dự trử, do đó chịu được những điều kiện bất lợi trong khi các tế bào bên cạnh chết đi, gọi là bào tử vách dày Gặp điều kiện thuận lợi bào tử nầy sẽ nẩy mầm thành sợi nấm mới (Webster, 1970)

Vi nấm sinh sản bằng bào tử phấn: đầu sợi nấm đứt ra thành những tế bào riêng biệt có vách mỏng, gọi là các bào tử phấn, bào tử sau đó sẽ phát triển thành sợi mới Hiện tượng này thường thấy khi nấm sống trong môi trường lỏng

 Sinh sản vô tính

Bào tử nội sinh thường gặp ở các nấm bậc thấp Khi bào tử phòng vỡ, các bào tử được phóng thích ra ngoài và mỗi bào tử phát triển thành một sợi nấm mới Bào tử phòng được hình thành trên những sợi nấm đặc biệt, phía đầu sợi nấm này thường to và phát triển sâu vào trong bào tử phòng còn gọi là đài trụ Ðối với các nấm ở nước, bào tử thường có roi (động bào tử), còn đối với các nấm ở cạn, bào

tử không có roi

Bào tử ngoại sinh hay đính bào tử là bào tử không nằm bên trong bào tử phòng mà nằm ngoài các tế bào sản sinh ra chúng (ngoại sinh), thường xếp thành chuỗi hoặc thành khối, ở đầu các cuống đính bào tử Cuống loại bào tử này thường gặp ở các nấm bậc cao (Webster, 1970)

 Sinh sản hữu tính

Ðối với các nấm bậc thấp, sinh sản hữu tính đẳng giao, dị giao, noãn giao hay tiếp hợp hợp tử sau khi được hình thành trải qua giai đoạn nghỉ tương đối ngắn, phân chia giảm nhiễm tạo thành động bào tử hay những sợi ngắn có mang túi chứa bào tử hay bào tử đính (Webster, 1970)

Ở các nấm bậc cao, sự sinh sản hữu tính gồm hai tế bào sinh sản kết hợp chất nguyên sinh với nhau nhưng nhân thì vẫn riêng rẽ trong một thời gian sau đó tạo thành những tế bào có 2 nhân cho đến khi hình thành tế bào sinh bào tử thì 2 nhân mới kết hợp và phân chia giảm nhiễm Tế bào sinh bào tử có thể cho ra các bào tử ở bên trong gọi là bào tử túi hoặc các bào tử ở bên ngoài là bào tử đảm

Nhìn chung, nấm phân bố trên toàn thế giới và tồn tại phát triển ở đa dạng môi trường sống và thành phần loài khác nhau Nấm là sinh vật phân hủy chính ở các hệ sinh thái trên cạn và dưới nước Nấm sống hoại sinh hay cộng sinh do quá trình phân hủy những vật chất hữu cơ thành những phân tử vô cơ và sau đó những chất này sẽ được đồng hóa ở thực vật hay những sinh vật khác Nhiều loại nấm kí

sinh gây bệnh trên con người, thực vật và động vật Phân loại và định danh vi

nấm đặc biệt là vi nấm gây bệnh là cần thiết Tuy nhiên căn cứ vào các đặc điểm

về hình thái, kích thước, màu sắc và bề mặt của khuẩn lạc nấm, các hình thức sinh sản thông thường định danh đến các giống nấm nhưng rất ít định danh chính xác

đến loài (Coker, 1923; de Hoog et al., 2000) Phương pháp sinh học phân tử được

ứng dụng phổ biến để định danh đến các loài vi nấm Các kỹ thuật phân tử cho phép phát hiện định danh mầm bệnh vi nấm với độ tin cậy, chính xác cao Các gen 18S rRNA đã được sử dụng rộng rãi cho các loài vi nấm Trình tự Internal Transcribed Sequence (ITS) được sử dụng phổ biến khi phân tích các loài nấm

(White et al., 1990; Phadee et al., 2004) Hay trình tự của đoạn translation

elongation factor 1-alpha (TEF) được sử dụng để định danh các loài thuộc nhóm

Fusarium đặc biệt là các loài Fusarium phức (Geiser et al., 2004; O’Donnell et al., 2010) Vì vậy, phương pháp định danh truyền thống kết hợp phương pháp

sinh học phân tử giúp định danh chính xác các loài vi nấm cần được ứng dụng

2.2 Một số nghiên cứu vi nấm trong môi trường nước

Nghiên cứu sự phân bố và đa dạng thành phần vi nấm ở các loại thủy vực khác nhau đã được thực hiện, cụ thể như xác định vi nấm trong môi trường nước

ở sông Nile, Ấn Độ cho thấy vi nấm thay đổi về thành phần và số lượng theo mùa trong suốt 24 tháng nghiên cứu Trong đó, có 3 giống xuất hiện với tần suất cao

(19-24 tháng) là Achlya, Saprolegnia và Dictyuchus và 3 giống Isoachlya,

Leptolegnia và Pythium chỉ xuất hiện từ 6-11 tháng (El-Hissy et al., 1982)

Hơn nữa, nghiên cứu vi nấm trong môi trường nước ở thượng nguồn sông

Ai Cập đã tìm thấy sự đa dạng thành phần loài gồm 45 loài thuộc 8 giống nấm tạo

bào tử và 35 loài thuộc 26 giống nấm sợi Trong đó, Achlya rodriguazina,

Isoachlya toruloides, Saprolegnia luxurians và 14 loài nấm sợi được phát hiện

lần đầu tiên Số lượng vi nấm thu được nhiều nhất ở những vùng nước có nhiệt độ

thấp hoặc vừa so với vùng có hàm lượng hữu cơ và oxy hòa tan cao Achlya (13 loài) và Saprolegnia (12 loài) là giống nấm tạo bào tử đã được phát hiện thường xuyên nhất trong khi Triscelophorus (2 loài), Anguillospora (2 loài) và

Alatospora (1 loài) là giống nấm sợi phổ biến trong nước (El-Hissy et al., 1992)

Ngoài ra, Khallil et al (1993) đã chứng minh vi nấm ở sông Ai Cập cũng

phân bố khác nhau theo tháng và có đến 58 loài vi nấm được phát hiện trong đó giống Saprolegniales và Perenosporales có 32 loài và giống Hyphomycetes có 26

loài Achlya racemosa, Dictyuchus sterile, Alatospora acuminate và

Trisclophorus monosporus là loài phổ biến nhất Đa số loài nấm xuất hiện nhiều

nhất vào mùa đông so với mùa hè, đồng thời một số loài xuất hiện quanh năm Nấm cũng thu được nhiều nhất ở vùng có nhiệt độ thấp hay vừa, hàm lượng hữu

cơ và oxy hòa tan cao Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng muối hòa tan và

pH không khác nhau theo tháng và cũng không ảnh hưởng đến quần thể nấm Bên cạnh đó, nghiên cứu đa dạng vi nấm ở hồ Aswan High, Ai Cập cũng tìm thấy 29 loài nấm thuộc 11 giống và mẫu nước thu được nhiều vi nấm nhất vào thời điểm như nhiệt độ thấp (15,9 – 20,3 OC), pH từ 7,4 – 8,3 Nhưng mẫu nước ở nơi có nhiệt độ cao (20,6 – 33,1 OC), pH biến động từ 6,3 đến 9,2, oxy hòa tan 4,5 – 10,6 mg/L, hàm lượng muối hòa tan 149 – 303 mg/L và chất hữu cơ 2,0 – 51,1 mg/L

có ít nấm nhất Saprolegnia và Pythium thu được thường xuyên trong suốt thời gian nghiên cứu trong khi Aphanomyces, Dictyuchus, Pythiopsis, Leptomitus,

Allomyces và Blastocladiopsis ít phát hiện (El-Hissy et al., 1996)

El-Nagdi and Nasser (2000) phát hiện 21 loài nấm thuộc 10 giống từ 23 mẫu nước thu được trong các hồ chứa nước mưa ở Ả rập Saudi bằng cách sử

dụng giá thể ở nhiệt độ 20-22OC Các giống nấm thường xuất hiện gồm:

Allomyces (3 loài), Aqualinderella (1 loài), Dictyuchus (2 loài) và Pythium (3

loài) Có 4 loài (Allomyces macrogynus, Aqualinderella fermentans, Pythium

rostratum và Pythium ultimum) lần đầu được tìm thấy ở Ả rập Saudi Các loài

nấm xuất hiện thường xuyên là Aspergillus flavus, A fumigatus A niger, A

flavus var columnaris, Acremonium stictum, Cladosporium herbarum, Fusarium oxysporum và Penicillium corylophilum

Sự đa dạng của vi nấm trong môi trường nước được Shearer et al (2007)

báo cáo trong đó các nhóm nấm thường thấy trong hệ thống môi trường thủy sinh gồm Ascomycetes (ngoại trừ nấm men), Basidiomycetes, Chytridiomycetes và Saprolegniales thuộc lớp Oomycetes Có khoảng 3.000 loài nấm và 138 loài Saprolegniales tồn tại trong môi trường nước Ascomycetes và Chytridiomycetes

có số lượng loài chiếm đa số Đa dạng thành phần vi nấm trong môi trường nước được tìm thấy chủ yếu ở khu vực ôn đới kế đến là vùng nhiệt đới châu Á

Nghiên cứu ở hồ Dumaratarai Talab, Ấn Độ trong suốt 12 tháng đã phân

lập được 91 loài nấm chủ yếu các giống như Zygomycotina, Ascomycotina và

Anamorphic Thành phần loài nấm không giống nhau suốt năm nhưng có sự khác

biệt theo mùa Vi nấm thu được nhiều nhất vào mùa đông, có đến 55 loài xuất hiện do vào thời gian này nhiệt độ thấp và có tình trạng ứ đọng nước tạo điều kiện thuận lợi cho các bào tử nấm nảy mầm, tồn tại và phát triển Vào mùa mưa, nước trong hồ có sự trao đổi ra vào làm giảm hàm lượng chất hữu cơ và hoạt hóa các chất dinh dưỡng làm giảm thành phần loài nấm Thấp nhất là 23 loài vào mùa khô

do lượng nước thấp và nhiệt độ cao ảnh hưởng đến đến các yếu tố cần thiết làm giảm sự phát triển của nấm Số lượng nấm cao nhất vào tháng 12 (33 loài) và thấp nhất vào tháng 3 (5 loài) (Saju, 2011) Ngoài ra, đánh giá tính đa dạng, tần suất xuất hiện các loài nấm trong nước ở sông Mahanadi, Ấn Độ cho thấy có 31 loài

nấm thuộc 20 giống được phân lập và định danh Aspergillus niger xuất hiện nhiều nhất (83,33%), Rhizopus sp (75%), A flavus và A fumigatus (58,33%) Các loài nấm Cladosporium oxysporum, Fusarium, Aspergillus, Penicillium,

Curvularia, Cladosporium, Rhizopus, Trichoderma cũng được tìm thấy (Parveen

et al., 2011)

Ở đông bắc Phần Lan, sự xuất hiện vi nấm trong môi trường ở sông Supraśl được thu và sử dụng phương pháp giá thể để phân tích đã phát hiện được

các loài nấm gây bệnh trên cá như: Achlya orion, Aphanomyces laevis,

Dictyuchus monosporus, Saprolegnia ferax, S monoica và S parasitica Nấm

gây bệnh trên người gồm Aspergillus candidus, Candida albicans, Lagenidium

humanum, Penicillium mycetomagenum, Rhizophydium keratinophilum và Trichosporon cutaneum Và nấm gây bệnh trên cây như Achlya racemosa, Pythium butleri, P myriotylum và P debaryanum Các chỉ tiêu thủy lý hóa cũng

được phân tích nhưng không ảnh hưởng đến sự hiện diện của nấm trong môi trường Tổng số 21 loài vi nấm thu được trong môi trường ở sông Springs khi sử dụng hạt hemp và da rắn làm giá thể Các loài nấm thường xuyên thu được bao

gồm Achlya apiculata, Aphanomyces laevis, Dictyuchus monosporus, Pythium

debaryanum và Saprolegnia ferax (Kiziewicz, 2004; Kiziewicz, 2012) Bên cạnh

đó, nghiên cứu đa dạng sinh học của các loài nấm trong thủy sản ở Trung Quốc cho thấy có 962 loài nấm được báo cáo trong đó 782 loài ở nước ngọt và 213 loài

ở nước lợ mặn nhưng có đến 26 loài tìm thấy ở cả 2 loại thủy vực Ở vùng nước ngọt có 25 loài Chytridiomycetes, 256 loài Ascomycetes, 416 loài

Hyphomycetes, 63 loài Oomycetes và 22 loài Zygomycetes (Hu et al., 2013)

Như vậy, vi nấm tồn tại trong môi trường nước ngọt ở các khu vực trên thế giới đa dạng thành phần loài trong đó cũng có sự hiện diện của các loài vi nấm có khả năng gây bệnh trên động vật thủy sản Tuy nhiên, xác định số lượng và thành phần vi nấm trong các ao nuôi động vật thủy sản vẫn còn hạn chế Sự biến động thành phần vi nấm theo thời gian và ảnh hưởng của nó đến đối tượng nuôi cũng cần được tìm hiểu

2.3 Nghiên cứu vi nấm gây bệnh trên động vật thủy sản trên thế giới

2.3.1 Bệnh do vi nấm Saprolegniasis

 Phân loại

Phân loại vi nấm trên cơ sở hình thái như đặc điểm sinh sản vô tính và hữu tính của các chủng vi nấm Vi nấm bậc thấp kí sinh trên động vật thủy sản chủ yếu thuộc lớp Oomycotea gồm nhiều giống khác nhau nhưng chủ yếu 3 giống

Saprolegnia, Achlya, Aphanomyces gây bệnh phổ biến trên động vật thủy sản

Ngành: Heterokonta

Lớp: Oomycotea

Bộ: Saprolegniales Họ: Saprolegniaceae

Giống: Saprolegnia, Achlya, Aphanomyces

 Vi nấm Saprolegnia

Vòng đời của Saprolegnia gồm sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính

Động bào tử sơ cấp (có dạng hạt với hai roi ở sau) được phóng thích ra khỏi túi sinh bào tử và di chuyển trong môi trường nước Sau đó sẽ bị bao lại hình thành bào nang sơ cấp Động bào tử thứ cấp (dạng thận và hai roi nằm bên) sẽ được phóng thích khỏi bào nang sơ cấp Động bào tử thứ cấp tồn tại thời gian dài hơn động bào tử sơ cấp và cũng được bao lại thành bào nang thứ cấp Bào nang thứ cấp này có thể chết đi hoặc nảy chồi tạo thành sợi nấm mới và trong một số trường hợp có thể phóng thích trở lại động bào tử thứ cấp khi gặp điều kiện

không thuận lợi cho sự nảy chồi (Johnson et al., 2002)

Có ít loài Achlya có hình thức sinh sản hữu tính (Johnson et al., 2002)

Hình 2.2: Đặc điểm hình thái cơ bản túi động bào tử của vi nấm thuộc lớp Oomycotea

1 Saprolegnia; 2 Achlya; 3 Aphanomyces; 4 Leptolegnia (Noga, 1993)

 Dấu hiệu bệnh lý

Bệnh do vi nấm Saprolegniasis thường được gọi là bệnh nấm thủy mi Động vật thủy sản nhiễm Saprolegniasis quan sát thấy sợi nấm màu trắng, xám, nâu trên da, vây và mang Đầu tiên vi nấm nhiễm một vùng nhỏ sau đó lan rộng

và có thể bao phủ toàn bộ cơ thể, sợi nấm phát triển dầy đặc tạo thành búi trông giống như bông gòn Bệnh có thể cấp tính nhưng thường bệnh do vi nấm này kéo dài và mãn tính (Noga, 1996; Hoffman, 1999) Quan sát mẫu tươi hay nhuộm cotton blue dưới kính hiển vi cho thấy các sợi nấm dài, không có vách ngăn, không hoặc có phân nhánh Ở phần đầu một số sợi nấm có các túi chứa động bào

tử hình cầu Vi nấm Saprolegnia nhiễm trên trứng cá có nhiều sợi nấm phát triển

dầy đặc và tua tủa trong môi trường nước Bệnh thường xuất hiện khi cá bị xây xát, hoặc bị tổn thương vùng da, vây do vi khuẩn hay ký sinh trùng gây ra

Hình 2.3: Vòng đời của vi nấm Saprolegnia

(Raven et al., 1992)

Sinh sản

vô tính

Sinh sản hữu tính

 Phân bố và lan truyền bệnh

Oomycetes là lớp nấm cơ hội gây hoại sinh khi cơ thể cá bị các tổn thương

vật lý và stress Saprolegnia tồn tại trong nước đã và đang ảnh hưởng rất lớn đến

đến các loài cá trong tự nhiên và cá nuôi (Pickering and Willoughby, 1982)

Nhóm vi nấm Oomycetes thường là tác nhân thứ cấp gây bệnh trong điều kiện sau

khi cá nhiễm vi khuẩn, kí sinh trùng và ảnh hưởng các yếu tố môi trường khác Tuy nhiên, một số nghiên cứu đã cho thấy vi nấm này là tác nhân gây bệnh đầu tiên trên cá và trứng cá (Willoughby, 1978; Walser and Phelp, 1993) Có 8 giống

nấm được báo cáo gây nhiễm trong tự nhiên và nhân tạo bao gồm: Saprolegnia,

Achlya, Aphanomyces, Calyptratheca, Thraustothea, Leptolegnia, Pythiopsis và Leptomitus nhưng chỉ có 3 giống Saprolegnia, Achlya và Aphanomyces thường

gây bệnh trong thủy sản (Hatai and Hoshiai, 1993; Bly et al., 1992)

Bệnh do vi nấm gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi cá hồi Atlantic Salmon

salar trong suốt những năm 1960s ở Anh và nam Ireland Cá nhiễm vi nấm có

những vết loét và hoạt tử ở lớp da cơ Saprolegnia parasitica được phát hiện ở cá

bệnh và là tác nhân gây bệnh này (Willoughby, 1969; Robert, 1993) Bệnh do

Saprolegnia cũng gây hao hụt lớn cho các trang trại sản xuất giống cá hồi

Atlantic ở Ireland và Na Uy và cá hồi bạc ở Nhật (Smith, 1994; Langvad, 1994;

Hatai and Hoshiai, 1992) S parasitica và S diclina được phát hiện là nguyên nhân làm chết các loài cá nuôi như cá hồi đốm, cá hồi bạc và cá ayu Plecoglossus

altivelis ở Nhật, Úc và Mỹ (Yuasa and Hatai, 1995; Mueller and Whisler, 1994)

Cá bệnh do lớp nấm Oomycetes bị nhiễm theo nhiều nguồn khác nhau như

từ cá tự nhiên đến cá nuôi, từ trứng cá, nguồn nước cấp vào, dụng cụ thiết bị và phương tiện vận chuyển Bệnh do nấm này lan truyền trực tiếp từ cá hoặc từ trứng

và không có kí chủ trung gian (Singhal et al., 1987) Nghiên cứu cho thấy da là cơ

quan đầu tiên tiếp xúc với mầm bệnh do vi nấm và sự gia tăng bài tiết chất nhầy trên da sau khi tiếp xúc với động bào tử thứ cấp giúp giảm kí sinh trên da cá Ngoài ra, chất sản sinh từ lớp chất nhầy bên ngoài có thể hạn chế sợi nấm phát

triển thành bào tử (Wood et al., 1988) Phản ứng của tế bào giúp phát hiện lớp

chất nhầy bên ngoài do đó lớp màng nhầy hoạt động đầu tiên như hàng rào sinh lý chống lại sự xâm nhiễm của nấm Tuy nhiên, chất nhầy trên bề mặt cơ thể cá gây

ra sự hình thành bào nang của động bào tử từ các chủng nấm Saprolegnia gây

bệnh kết quả làm phá hủy tế bào biểu mô và mất tế bào goblet, chấy nhầy tiết ra không ngừng ở giai đoạn này các bào tử nấm có khả năng nhiễm vào cá (Bruno and Wood, 1994)

Saprolegnia chủ yếu là nguyên nhân gây bệnh bên ngoài cơ thể bằng phản

ứng viêm nhẹ Các vết thương rất hiếm tổn thương đến hệ cơ Tế bào biểu mô bị phá vỡ là kết quả của sự điều hòa áp suất thẩm thấu với sự giảm rất nhiều chất dịch cơ thể và bị nhiễm bởi các tác nhân gây bệnh khác Hội chứng bệnh “winter kill” trên cá nheo ở đông nam Mỹ do nấm gây ra liên quan đến việc nhiệt độ bị giảm đột ngột (dưới 15oC), hàm lượng ammonia cao và các nguyên nhân gây sốc khác (Howe, 1998) Ngoài ra, các yếu tố môi trường được cho rằng là kết quả của

sự tổn thương các tế bào biểu mô, tổn thương lớp chất nhầy, giảm số lượng tế bào tiết chất nhầy hoặc việc giảm sự tăng tiết chất nhầy làm cho động bào tử có thể

bám chặt và nhiễm vào cơ thể (Quiniou et al., 1998)

Khi thu mẫu hàng tháng tại 12 vùng nuôi thủy sản ở Tehran đã định danh

được 5 loài Saprolegnia và 2 loài Achlya xuất hiện thường xuyên Ngoài ra

Isoachlya, Leptolegniella, Protoachlya và Pythiopsis xuất hiện với tần xuất thấp Saprolegnia ferax xuất hiện nhiều khi nhiệt độ nước lạnh vào mùa thu và đông, Saprolegnia litolaris và A chlorata tìm thấy nhiều nhất vào các tháng hè A debaryana có vào các tháng hè và thu (Nejadsattari, 2000) Vi nấm gây bệnh trên

các loài cá nuôi nước ngọt như cá tra, cá Barbodes gonionotus và cá Cirrhinus

cirhosus và cá tự nhiên như cá rô, cá lóc,… ở Banglades Có 19 chủng nấm được

định danh thuộc các giống Saprolegnia, Achlya và Aphanomyces (Zahura et al.,

2004)

Xác định tác nhân gây bệnh do Saprolegnia trên cá nheo Mỹ được thực

hiện bằng thí nghiệm hạ nhiệt độ môi trường nước nhanh chóng từ 22oC giảm đến

10oC kết quả cho thấy 92% cá nhiễm nấm trên da và tỉ lệ chết là 67% sau 21 ngày cảm nhiễm Kết quả mô bệnh học cho thấy có sợi nấm trên da cá bệnh và chưa

phát hiện vi khuẩn hay bạch cầu xung quanh vùng có nấm nhiễm (Bly et al., 1992) Gây nhiễm vi nấm S parasitica trên cá hồi (Oncorhynchus mykiss) bằng

cách tạo vết trầy xước và làm mất nước, gia tăng nhiệt độ nước và kết hợp 2 phương pháp Kết quả cho thấy 25,9% cá gây sốc bằng tạo vết trầy xước và tăng nhiệt độ bị nhiễm bệnh nhưng có đến 77,8% cá bệnh khi kết hợp cả 2 phương pháp Cá thí nghiệm bị nhiễm nấm sau 5 ngày (Howe and Stehly, 1998) Thí nghiệm trên cá rô phi bằng cách làm sạch chất nhầy bên ngoài và tạo vết thương cho thấy cá vừa gây sốc bằng cách làm sạch chất nhầy và tạo vết thương bị nhiễm nấm Đồng thời, ở cá gây sốc bằng cách kết hợp tạo vết thương trên da và hạ

nhiệt độ nhanh chóng dễ nhiễm nấm hơn (Osman et al., 2008)

Bên cạnh đó, các chủng nấm S.diclina, Achlya sp., A ambisexualis và

Aphanomyces sp được gây nhiễm trên trứng cá trê (Clarias gariepinus) với các

mật độ từ 101

-104 bào tử/ml Kết quả tỉ lệ nhiễm cao nhất và tỉ lệ nở thấp nhất ở mật độ 104 bào tử/ml A ambisexualis có độc lực cao hơn các chủng nấm khác

Quan sát mô học, trứng cá có nhiều bào tử và các khuẩn ty phát triển xâm nhập

vào tế bào chất (Hanjavanit et al., 2008) Ảnh hưởng của vi nấm Saprolegnia và

Achlya trên trứng của cá da trơn (Pangasianodon gigas) ở Mekong và nước bể

ương trong điều kiện thí nghiệm cho thấy nhiệt độ tối ưu cho vi nấm phát triển là

30oC Saprolegnia và Achlya có thể tồn tại ở độ mặn 10-25ppt Đặc biệt,

Saprolegnia sp có thể chịu đựng độ mặn đến 30 ppt Các chủng vi nấm phát triển

ở pH 4-11 nhưng pH tối ưu cho Saprolegnia là 6 và Achlya là 5 (Abking et al.,

2012) Cá chép Ấn độ nuôi trong ao ở vùng Đông bắc Ấn độ thường bị bệnh vào các tháng của mùa đông và gây chết với tỉ lệ cao Nguyên nhân gây bệnh được

xác định do nấm Saprolegnia vì nhiệt độ trong nước từ 22oC giảm nhanh còn 8 o

C

và duy trì trong nhiều tháng, ngược lại pH lại tăng đến 9 và hàm lượng oxy hòa

tan giảm 4ppm (Das et al., 2012) Tỉ lệ chết của cá rô phi giai đoạn giống khác nhau khi cảm nhiễm với 6 loài Achlya spp ở mật độ 1x104 bào tử/ml trong đó tỉ

lệ chết cao nhất là A klebsiana BKKU1003 (88,8%), thấp nhất A.bisexualis BKKU1007 (33,3%); tỉ lệ chết của A diffusa BKKU1012 là 77,7%, A prolifera BKKU1125 và Achlya sp BKKU1127 có tỉ lệ chết bằng nhau 66,6% và Achlya

sp BKKU1117 là 55,5% (Panchai et al., 2015)

2.3.2 Bệnh do vi nấm Fusarium

 Phân loại

Ngành: Ascomycota

Lớp: Sordariomycetes Bộ: Hypocreales Họ: Hypocreaceae

Giống: Fusarium

 Vi nấm Fusarium

Fusarium sinh sản vô tính tạo thành chủ yếu 3 dạng bào tử tiểu bào tử, đại bào tử và bào tử vách dày Tiểu bào tử có cấu trúc đơn giản hình cầu hoặc hình trứng thường đơn nhân Tiểu bào tử được hình thành từng cụm và các bào tử đính xung quanh các sợi nấm Đại bào tử có kích thước dài, hình thuyền, có vách ngăn được hình thành từ các cụm bào tử đính ở phần đầu các sợi nấm Bào tử vách dày được hình thành ở giữa các sợi nấm có hình tròn hoặc hình trứng Bào tử vách

dày có thể phát triển đơn hoặc thành chuỗi, tách ra và hình thành các ống mầm nếu gặp điều kiện thuận lợi Dạng bào tử này rất bền và tồn tại độc lập trong thời gian dài Tuy nhiên không phải tất cả các loài đều sinh sản vô tính tạo thành 3

loại bào tử nhưng chỉ có 20% loài Fusarium được phát hiện quá trình sinh sản (Aoki and O’Donnell, 1999; de Hoog et al., 2000)

 Phân bố và lan truyền bệnh

Tôm sú (P monodon) hay tôm he Nhật (P japonicus) khi bị nhiễm vi nấm

Fusarium thường có dấu hiệu bệnh lý là mang tôm có màu đen Tôm ấu trùng bị

bệnh nấm thường nhạt màu, bỏ ăn đột ngột, ở giai đọan zoae có hiện tượng đứt phần đuôi, ấu trùng tôm chết rải rác đến hàng loạt Quan sát tiêu bản tươi thấy sợi nấm phát triển bao phủ cơ thể ấu trùng

Các loài ở giống Fusarium bao gồm Fusarium solani, F moniliforme và F

oxysporum được tìm thấy ở tôm he Nhật bệnh đen mang Trong số các loài thì F solani thường được báo cáo là tác nhân gây bệnh quan trọng F solani được phát

hiện ở động vật thủy sản bao gồm giáp xác và cá nước mặn Hatai et al (1978) đã chứng minh F solani gây bệnh đen mang trên tôm he Nhật từ các vết thương ở

mang Vi nấm sinh ra các đại bào tử và tiểu bào tử trên cuống bào tử đính và các bào tử có vách dày Ngoài ra, vi nấm gây bệnh cũng được tìm thấy ở trong cát trong ao và có thể tồn tại trong một thời gian dài

Hình 2.4: Hình thái vi nấm Fusarium (de Hoog et al., 2000)

(a) cuống bào tử đính đại bào tử; (b) đại bào tử, (c) bào tử vách dày, (d) tiểu bào tử

Fusarium moniliforme cũng được tìm thấy gây bệnh đen mang trên tôm he

Nhật ở các nông trại tư nhân ở Nhật (Rhoobunjongde et al., 1991) Khuẩn lạc của

vi nấm phát triển trên môi trường PDA cho thấy mặt trên khuẩn lạc có màu kem trắng, sợi nấm mịn, mặt dưới có màu tím Sợi nấm trong suốt có đường kính 2,5 – 6,0µm

Vi nấm nhiễm và gây bệnh đen mang ở tôm sú Penaeus monodon ở Việt Nam là Fusarium incarnatum Tôm bệnh cũng có dấu hiệu đen mang Khi cảm

nhiễm nấm này trên tôm he Nhật trong điều kiện phòng thí nghiệm cũng cho dấu hiệu bệnh tương tự Nhiệt độ tối ưu cho nấm phát triển từ 20-30oC, nấm phát triển mạnh ở 35oC nhưng không phát triển ở 5 và 40o

C (Khoa et al., 2004)

Fusarium oxysporum cũng được báo cáo trên tôm he Nhật Sợi nấm có

vách ngăn và bào tử hình thuyền quan sát thấy trên tiêu bản tươi ở mang tôm

bệnh Khuẩn lạc F oxysporum phát triển tốt trên PDA ở 250C Hệ sợi nấm mảnh, giống như nỉ tạo sắc tố trên môi trường PDA từ màu trắng chuyển sang xanh ở giữa, từ hồng đến tím sậm tùy thuộc thời gian nuôi (Khoa and Hatai, 2005) Vi

nấm F oxysporum cũng được phát hiện trên cá tráp đỏ Pagrus major ở Nhật Các

trường hợp cá bệnh đều không có dấu hiệu bệnh lý bên ngoài nhưng bên trong thận sưng và không màu, các cơ quan khác đều bình thường Khi phân lập nấm ở thận trên môi trường SA ở 25oC thu được chủng nấm thuần (Hatai et al., 1986)

Ngoài ra, Fusarium moniliforme và Fusarium udum được phát hiện gây bệnh trên một số loài cá nuôi nước ngọt như Barbus rana, Channa punctatus,

Labeo rohita, Mastacembelus armatus, Mystus tengra, Puntius sophore và Wallago attu ở Ấn độ Dấu hiệu bệnh lý ở cá nuôi giống như 2 loài cá C punctatus và P sophore trong tự nhiên Tỉ lệ chết do bệnh gây ra từ 40-80% ở các

loài cá nuôi Vi nấm Fusarium nhiễm trên cá thường vào mùa hè đến mùa mưa (Deepa et al., 2000)

Ở cá parrotfish bệnh do Fusarium solani cho thấy các tổn thương ở lớp

biểu bì ở bên ngoài cơ thể bao gồm mất da, có khối u hay xù vảy Quá trình này dẫn đến hoại tử viêm da, tế bào cơ bị mất đến xoang cơ thể sau cùng cá chết Diễn biến của bệnh nhanh chóng chỉ xảy ra trong vài ngày đến 2 tuần phụ thuộc vào

yếu tố chất lượng môi trường nước Tuy nhiên, các vết thương ở cá Pterophyllum

scalare khi nhiễm F solani cũng bắt đầu ở xung quanh cơ quan đường bên khi

gặp điều kiện thuận lợi vết thương bắt đầu phát triển thành các nốt chứa đầy chất dịch Tiếp tục sẽ tạo thành các vết loét nghiêm trọng trên da bắt đầu ở phần đầu sau đó nhanh chóng lan rộng đến nắp mang và cơ quan đường bên Ở các vùng bị

viêm da cơ dạng hạt mãn tính có các sợi nấm hiện diện khi quan sát mô học (Yanong, 2003)

Gần đây, một số nghiên cứu đã phát hiện các loài Fusarium phức gây bệnh trên động vật thủy sản Nghiên cứu của Marino et al (2016) phát hiện trứng cá

Odontesthes bonariensis nhiễm 2 loài Fusarium là Fusarium incarnatum-equiseti

complex (FIESC) và Fusarium solani complex (FSSC) Fusarium oxysporum species complex (FOSC) nhiễm trên cơ cá ngựa (Danio rerio) nuôi ở Hàn Quốc

Đầu tiên, vi nấm xuất hiện thành từng vệt màu trắng trong nước sau đó phát triển dày đặc trên thành bể và nhiễm vào cá Thí nghiệm cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm vi nấm dưới da cá cho thấy có sự hiện diện các sợi nấm FOSC trong cơ cá

(Kulatunga et al., 2017)

2.3.3 Bệnh do vi nấm khác

Bên cạnh các giống vi nấm gây bệnh phổ biến trên động vật thủy sản thì một số vi nấm khác cũng được phát hiện nhiễm và gây bệnh trên các đối tượng khác nhau Vi nấm gây bệnh có thể từ các nguồn khác nhau như thức ăn được tồn trữ trong điều kiện ấm nhiệt độ hơn 27oC, độ ẩm hơn 62% tạo điều kiện thuận lợi

cho độc tố do nấm sản sinh Aflatoxin là độc tố do nấm Aspergillus flavus và A

parasiticus Cá nhiễm độc tố có dấu hiệu như mang nhợt nhạt, thiếu máu và chậm

phát triển Cá nước ấm miễn dịch với độc tố này hơn cá nước lạnh Cá da trơn bị nhiễm độc gây ra các tổn thương ở các cơ quan như gan, thận, tỳ tạng, tim và ống

tiêu hóa Ngoài ra, ochratoxin là độc tố sinh ra do một số loài Aspergillus và

Penicillium làm hoại tử gan thận và gây chết ở cá hồi (Yanong, 2003)

Tsadu et al (2004) phân lập được loài Aspergillus niger từ da-cơ, mang

và vây của 18 loài cá ở Nigeria Ở Ấn độ, Fusarium và Aspergillus niger là 2 loài

vi nấm lần đầu tiên được tìm thấy trên cá trê và cá chốt giấy (Chauhan, 2012) Cá

Catla catla bệnh có tỉ lệ nhiễm nấm ở mắt là 24,32%, mang 18,91%, da và đầu

16,21% và định danh được 3 giống vi nấm nhiễm trên cá là Aspergillus,

Blastomyces và Penicillium (Iqbal and Saleemi, 2013) Riêng Aspergillus terreus

được chứng minh chỉ nhiễm trên cá trê (Clarias batrachus), cá chành dục (Channa punctatus) và cá da trơn (Heteropneustes fossilis) (Shrivastava, 1996) hay trên cá vàng nuôi trong bể cũng nhiễm A niger (Chauhan et al., 2014)

Protoachlya cũng không gây bệnh trên cá lóc nhưng nghiên cứu trên cá

chình Nhật bản phát hiện Protoachlya paradoxa gây các khối u trên cơ Tỉ lệ chết

ở cá sau khi gây cảm nhiễm P paradoxa bằng phương pháp tiêm cao nhất là

80%, phương pháp ngâm và tạo vết thương là 60% và thấp nhất 20% khi ngâm cá

trong vi nấm (Yu-chen et al 2010; Zhan-Zhuang et al., 2011)

Ngoài ra, nghiên cứu của Ke et al (2010) đã phát hiện Mucor

circinelloides gây bệnh trên cá da trơn Pelteobagrus fulvidraco với tỉ lệ chết đến

100% sau 45 ngày gây nhiễm bằng phương pháp tạo vết thương Nhiệt độ tối ưu

cho vi nấm phát triển là 30oC và không tồn tại ở 40oC Vi nấm gây biến đổi trong

mô ở nội quan của cá có thể lây truyền qua đường máu

Bệnh do vi nấm cũng xuất hiện trên một số loài cá ở Việt Nam Nghiên

cứu của Bùi Quang Tề (2006) cho thấy bệnh nấm thủy mi do các giống nấm

Leptolegnia, Saprolegnia và Achlya gây ra với các dấu hiệu bệnh lý như trên da

xuất hiện các vùng trắng xám, các sợi nấm nhỏ mềm Sau vài ngày sợi nấm phát

triển đan chéo thành từng búi trắng có thể nhìn thấy bằng mắt thường Bệnh xuất

hiện trên nhiều loài cá nước ngọt và thường xảy ra khi nhiệt độ nước từ 18-25o

C

Ngoài ra, nghiên cứu trên cá rô đồng nuôi thâm canh trong ao bị bệnh nấm

nhớt đã phân lập được các nhóm vi nấm thuộc giống Fusarium, Acremonium và

Geotrichum Nhiệt độ tối ưu cho các chủng nấm phát triển là 30oC Nồng độ NaCl

tốt nhất cho các chủng nấm Fusarium, Acremonium và Geotrichum phát triển lần

lượt là 2-4%; 1% và 1% và giá trị pH thích hợp là 4-11 (Trần Ngọc Tuấn và

Phạm Minh Đức, 2010)

Kết quả nghiên cứu về mầm bệnh vi nấm nhiễm trên cá lóc nuôi thâm canh

ở Đồng Tháp là vi nấm bậc thấp thuộc giống nấm thủy mi Achlya Gần đây,

nghiên cứu cá lóc nuôi ao thâm canh tại An Giang và Đồng Tháp đã phân lập

được trên cơ 3 chủng vi nấm bậc thấp và 11 chủng vi nấm bậc cao Tuy nhiên các

chủng vi nấm này chỉ xuất hiện trong 3 tháng đầu của chu kỳ nuôi Trong đó,

Achyla xuất hiện trong tháng nuôi thứ 1 Các giống nấm Acremonium, Fusarium

và Geotrichum lần đầu tiên phân lập được ở cá lóc nuôi thâm canh và nhiễm ở

tháng thứ 2 và 3 (Nguyễn Thị Thúy Hằng, 2011; Phạm Minh Đức và ctv, 2012)

Tóm lại, vi nấm gây bệnh trên động vật thủy sản trên thế giới đã được

nghiên cứu từ lâu đời Các kết quả nghiên cứu cho thấy Saprolegnia và Achlya là

các giống vi nấm bậc thấp gây bệnh phổ biến trên các loài cá trong tự nhiên và cá

nuôi Bên cạnh đó, vi nấm bậc cao như Fusarium, Aspergillus,… cũng được báo

cáo là tác nhân gây bệnh trên cá Các loài vi nấm khác nhau gây ra các dấu hiệu

bệnh lý khác nhau trên cá bệnh nhưng chủ yếu vi nấm gây bệnh ở da-cơ vì đây là

cơ quan tiếp xúc trực tiếp với môi trường nước Sự đa dạng thành phần vi nấm nhiễm trên các loài cá khác nhau được báo cáo trong những năm gần đây Riêng ở Việt Nam, bệnh do vi nấm đã và đang xuất hiện trong những năm gần đây Các nghiên cứu tập trung phân lập và định danh vi nấm nhiễm trên cá nhưng rất ít báo cáo xác định tác nhân gây bệnh của các loài vi nấm nhiễm này Định đề Koch (1882) cho rằng các nguyên lý cơ bản để xác định một tác nhân gây nhiễm là nguyên nhân của bệnh thì vi sinh vật phải hiện diện trong vật chủ, được phân lập

từ vật chủ và phát triển trong môi trường nuôi cấy, vi sinh vật phải gây bệnh chuyên biệt khi truyền cho vật chủ khỏe và sau đó vi sinh vật phải được phát hiện

từ vật chủ được truyền bệnh này Vì vậy, xác định thành phần vi nấm nhiễm trên

cá kết hợp với xác định tác nhân gây bệnh là cần thiết làm cơ sở khoa học cho các nghiên cứu chuyên sâu và ứng dụng trong kiểm soát vi nấm

2.4 Nghiên cứu hóa chất phòng trị bệnh do vi nấm ở động vật thủy sản

2.4.1 Bronopol

Bronopol có công thức cấu tạo 2-Bromo-2-Nitropropane-1,3-Diol (C3H6BrNO4) Sản phẩm thương mại thường được sử dụng trong nuôi trồng thủy sản như PycezeTM và Cress 50% Bronopol được xem như chất ức chế emzyme và

có tác dụng phá vỡ màng tế bào Bronopol dùng để điều trị bệnh do vi nấm ngoại

kí sinh và xử lý trứng ở động vật thủy sản (Noga, 2010)

Thí nghiệm đánh giá hiệu quả của bronopol vào trị vi nấm

(Saprolegnia sp.) ở cá hồi Oncorhynchus mykiss gồm nghiệm thức tắm cá với

nồng độ 20 mg/L bronopol trong 30 phút trong 15 ngày và nghiệm thức tắm trong thời gian tương tự không sử dụng hóa chất, các nghiệm thức được lặp lại hai lần Kết quả cho thấy tỉ lệ nhiễm vi nấm ở cá trong suốt thời gian thí nghiệm từ 70%

và 40% giảm xuống 0% trong khi nghiệm thức không có bronopol tăng từ 45% lên 74% và 35% đến 55% (Branson, 2002)

Bronopol được dùng để diệt vi nấm thay thế cho malachite green trong trại sản xuất giống cá hồi bằng cách tắm trứng cá hồi 30 phút mỗi ngày ở nồng độ từ 50-100 mg/L từ giai đoạn trứng thụ tinh đến giai đoạn có điểm mắt, kết quả cho thấy bronopol có tác dụng rất tốt trong việc hạn chế sự nhiễm vi nấm và tăng tỉ lệ

nở của cá (Oono et al., 2007) Cùng năm, Oono and Haitai nghiên cứu so sánh

khả năng kháng vi nấm của bronopol và 2-methyl-4isothiazolin-3-one (MT) ở các

loài vi nấm thuộc giống Saprolegnia nhiễm trên cá Nồng độ ức chế tối thiểu của

bronopol là 100-200 mg/L nhưng MT là 31 mg/L Hiệu quả kháng vi nấm ở sợi

nấm của bronopol có nồng độ là 100-200 mg/L trong 30 phút và MT là 25-50 mg/L trong 30 phút Ở bào tử vi nấm, nồng độ bronopol là 100 mg/L trong 60 phút và MT là 25-50 mg/L trong 60 phút Như vậy, MT có hiệu quả kháng các vi

nấm Saprolegnia hơn bronopol Tương tự, nhóm nghiên cứu của Oono et al

(2008) đã chứng minh hiệu quả sử dụng của 2-methyl-4isothiazolin-3-one (MT)

để kháng vi nấm so với bronopol (BP) thường được sử dụng như chất kháng vi nấm trong các trại ương nuôi trên trứng cá ayu và cá hồi Kết quả cho thấy khi sử dụng cả hai hoại hóa chất ở nồng độ 50-100 mg/L tắm trứng cá trong 30 phút mỗi ngày từ giai đoạn trứng thụ tinh đến khi điểm mắt xuất hiện hiệu quả hơn so với đối chứng không sử dụng bronopol ở cả 2 loài cá Thử nghiệm bronopol với liều

lượng 30 mg/L, tắm trong thời gian 60 phút có thể diệt nấm thủy mi (Achlya

bisexualis) nhiễm trên cá lóc (Channa striata) giai đoạn cá giống trong điều kiện

phòng thí nghiệm (Phạm Minh Đức và Trần Ngọc Tuấn, 2012)

Thí nghiệm ảnh hưởng của bronopol đến 5 chủng nấm Fusarium gây bệnh trên tôm cho thấy F graminearum bị ức chế ở nồng độ 2000 ppm F oxysporum

bị ức chế 50% ở nồng độ 12,5 ppm và không diệt được vi nấm ở nồng độ 2000

ppm F incarnatum không bị ảnh hưởng của hóa chất bronopol F solani và F

moniliforme bị ức chế mạnh ở nồng độ 2000 ppm (Khoa, 2005) Bronopol ở nồng

độ 200 ppm có khả năng ức chế khả năng nẩy mầm của bào tử vi nấm và nồng độ

1600 ppm có thể hạn chế sự phát triển của Fusarium sp nhiễm ở cá tra bệnh

trương bóng hơi (Nguyễn Thị Cho và Phạm Minh Đức, 2014)

2.4.2 Iodine

Iodine cũng là một chất sát trùng được dùng trong nuôi trồng thủy sản Iodine được sử dụng dưới dạng hợp chất povidone iodine chủ yếu dùng xử lý môi trường và sát trùng dụng cụ Dung dịch bicarbonate iodophores dùng để xử lý trứng cá sau 1 giờ thụ tinh nhằm diệt các tác nhân gây bệnh bao gồm sợi nấm trên

bề mặt của trứng Alderman and Polglase (1984) đã chứng minh trứng được tắm iodine ở nồng độ 100 mg/L trong thời gian 30 phút tốt hơn 15 phút Trứng cá

nheo Ictalurus punctatus được rửa qua dung dịch iodine hai lần/ngày với các

nồng độ 50, 100 hoặc 200 mg/L sẽ tăng tỉ lệ nở (Walser and Phelp, 1993)

Ngoài ra, iodine được sử dụng để xử lý trứng cá bơn đen Psetta maxima

Linnaeus, 1758 với các nồng độ 100, 500, 1500 và 3000 ppm trong 10 phút nhằm hạn chế các vi sinh vật gây bệnh như vi khuẩn và vi nấm cho thấy ở nồng độ 3000 ppm trứng có tỉ lệ nở thấp hơn 70±6,08% Nhóm trứng không xử lý hóa chất và iodine ở nồng độ 100 ppm có tỉ lệ nở cao hơn các nhóm còn lại lần lượt

97,6±1,42% và 91,3±4,04% Nồng độ iodine 100 ppm thích hợp xử lý trứng ở

giai đoạn phôi dâu sớm (Aydin et al., 2011) Thêm vào đó, trứng cá hồi Salmo

trutta (L.) cũng được xử lý bằng iodine trong giai đoạn ấp trứng ở các trại sản

xuất giống và có hiệu quả tốt ở giai đoạn trước khi có điểm mắt (Zawada et al.,

2014)

2.4.3 Đồng sunfat

Đồng sunfate (CuSO4)là hóa chất cũng được sử dụng phổ biến trong nuôi trồng thủy sản như xử lý môi trường và trị bệnh do kí sinh trùng trên cá Sử dụng đồng sunfat để phòng trị bệnh do vi nấm cũng được nghiên cứu Sử dụng CuSO4

để xử lý vi nấm nhiễm trong quá trình ấp trứng cá nheo Mỹ với các nồng độ khác nhau 2,5; 5; 10; 20 và 40 mg/L, thời gian xử lý mỗi ngày đến giai đoạn có điểm mắt Kết quả thí nghiệm cho thấy nồng độ CuSO4 tối ưu là 10 mg/L cho tỉ lệ sống

của cá bột là 40% (Straus et al., 2011) Ngoài ra, tỉ lệ sống của cá trê bột (Clarias gariepinus) là 40,2% ở nồng độ 10 mg/L và nồng độ CuSO4 tối ưu để

xử lý cá bột trong quá trình ương ở giai đoạn trước khi cho ăn là 2 mg/L (Ataguba

et al 2013) Gần đây, CuSO4 cũng được thử nghiệm gây nhiễm Saprolegnia spp

trên trứng cá sunshine bass ở nồng độ 10; 20 và 40 mg/L cũng cho tỉ lệ sống ở

giai đoạn cá bột cao hơn khi trứng không được xử lý (Straus et al., 2016)

Nghiên cứu xác định ảnh hưởng CuSO4 đối với các loài Achlya nhiễm trên

cá rô phi (Oreochromis nilotucus) ở Thái Lan kết quả cho thấy sau 1 giờ ở nồng

độ 100 mg/L CuSO4 có thể kháng lại sự phát triển sợi nấm của các chủng vi nấm

gồm A klebsiana, A diffusa, A prolifera và Achlya sp đồng thời nồng độ ≥50 mg/L bào tử các chủng vi nấm này không nẩy mầm (Panchai et al., 2016) Thử nghiệm đánh giá ảnh hưởng của đồng sunfat trên Fusarium oxysporum species complex (FOSC) nhiễm trên cá vằn (Danio rerio) nuôi ở Hàn Quốc cho thấy nồng độ 200 mg/mL có hiệu quả ức chế vi nấm (Kulatunga et al., 2017)

Nhìn chung, các loại hóa chất như bronopol, đồng sunfat và iodine được sử dụng trong nuôi trồng thủy sản trong và ngoài nước Các hóa chất này thường được sử dụng để xử lý môi trường và phòng trị các bệnh do kí sinh trùng và vi nấm ở các giai đoạn khác nhau trên trứng và cá Tuy nhiên, đánh giá ảnh hưởng

và hiệu quả sử dụng của các loại hóa chất này đến vi nấm nhiễm trên các đối

tượng thủy sản vẫn còn giới hạn

2.5 Một số nghiên cứu thảo dƣ c phòng trị bệnh ở động vật thủy sản

Trong nuôi trồng thủy sản, các sản phẩm có nguồn gốc từ thảo dược ngày càng được quan tâm để thay thế các hoá chất khử trùng, diệt mầm bệnh, diệt tạp độc hại và các thuốc kháng sinh Trên thế giới có rất nhiều báo cáo đã công bố về tác động của thảo dược lên việc phòng và trị bệnh trên động vật thủy sản Cụ thể,

nghiên cứu sử dụng chiết xuất từ các cây Cinnamomum verum, Allium sativum

Linn, Eugenia caryophyllus và Thymus vulgaris kháng lại vi khuẩn Streptococcus agalactiae cho thấy chiết xuất từ vỏ cây C verum có hiệu quả kháng khuẩn cao

nhất và nồng độ ức chế tối thiểu là 0,15 mg/mL Thí nghiệm sử dụng chất chiết

xuất và vỏ cây C verum bổ sung vào thức ăn cho cá điêu hồng giống trong 17

ngày sau đó cảm nhiễm S agalactiae thì cá có tỉ lệ chết thấp khi bổ sung vỏ cây tỉ

lệ 3:26 (w/w) Chất chiết xuất từ C verum có tiềm năng trong việc phòng bệnh và gia tăng sức khỏe ở cá điêu hồng bệnh do vi khuẩn (Alsaid et al., 2010)

Ngoài ra, nghiên cứu bổ sung chất chiết xuất từ thảo dược của Trung Quốc

là Lonicera japonica và Ganoderma lucidum vào thức ăn cho cá rô phi kết quả

làm tăng khả năng thực bào và kích thích hoạt động của lysozyme trong thời gian

thí nghiệm (Yin et al., 2008) Nghiên cứu ngâm cá chép (Cyprinus carpio) cảm nhiễm với vi khuẩn A.hydrophila nồng độ 108 CFU/mL với thảo dược Ấn Độ

(Azdirachta indica) ở nồng độ 1g/lít trong 10 phút liên tục trong 30 ngày cho thấy

số lượng bạch cầu, hồng cầu và hàm lượng protein huyết thanh tăng có ý nghĩa

thống kê so với cá đối chứng (Harikrishnan et al., 2010)

Hơn nữa, thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn A hydrophila trên cá rô phi sông Nile (O niloticus) sau 12 tuần cho ăn thức ăn có bổ sung trà xanh (C sinensis)

với các hàm lượng khác nhau (0; 0,125; 0,25; 0,5; 1,0 hoặc 2,0 g/kg) Kết quả cho thấy hàm lượng 0,5 g/kg có thể tăng đề kháng và ức chế đối với vi khuẩn

Aeromonas hydrophila (Abdel-Tawwab et al., 2010) Ngoài ra, khi sử dụng cây

G gummi-gutta bổ sung vào thức ăn với hàm lượng 500, 1.000, 2.000 và 3.000

mg/kg cho cá tra cũng làm gia tăng miễn dịch không đặc hiệu, đặc biệt ở hàm lượng 2.000 mg/kg sẽ thúc đẩy quá trình tăng trưởng, sinh miễm dịch và giảm lipid đáng kể (Prasad and Priyanka, 2011)

Hoạt tính kháng vi nấm Achlya gây bệnh trên cá rô phi (Oreochromis niloticus) của bốn loại thảo dược ở Thái Lan như vỏ cây lựu (Punica granatum), mận (Syzygium gratum), me rừng (Phyllanthus Emblica), chiêu liêu (Terminalia chebula) với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) lần lượt là:

1.000, 4.000, 2.000 và 2.000 mg/L Dịch chiết từ vỏ cây lựu có hiệu quả nhất

trong việc ức chế sự nảy mầm của bào tử Achlya với nồng độ là 250, 500 mg/L

trong 6 giờ Nồng độ an toàn của dịch chiết vỏ quả lựu trên cá là 63-2000 mg/L

trong 30 phút (Panchai et al, 2015)

Cỏ mực Eclipta alba và diệp hạ châu Phyllanthus niruri là một trong các

loài cây dược liệu phân bố phổ biến ở Việt Nam Thành phần hóa học của cỏ mực chứa các chất flavonoid, glycosidetriterpene saponin, alkaloid Tương tự, diệp hạ châu cũng có flavonoid, alcaloid phyllanthin và các hợp chất hypophyllanthin, niranthin, phylteralin Nghiên cứu thành phần hóa học và khả năng kháng nấm

của cỏ mực Eclipta alba bằng phương pháp chiết xuất sử dụng các dung môi khác

nhau cho thấy chiết xuất bằng ethanol thì cỏ mực có thành phần hóa học gồm flavonoid, saponins, alkaloids, tannins, terpenoids và cardiac glycodides nhiều hơn so với các dung môi chloroform, benzene, dầu hỏa và nước Kết quả thử nghiệm khả năng kháng nấm của các chất chiết xuất từ cỏ mực cho thấy

alkaloids, flavonoid và saponins có khả năng kháng Fusarium solani (Hussain et

al., 2011)

Nghiên cứu bổ sung 0,01; 0,1 và 1% chất chiết xuất từ lá cỏ mực vào thức

ăn cho cá rô phi Oreochromis mosambicus cho thấy các chỉ tiêu miễn dịch không

đặc hiệu đều tăng và tăng cường khả năng kháng bệnh do vi khuẩn trên cá

(Christybapita et al., 2007) Ngoài ra, sử dụng lá cỏ mực Eclipta alba chiết xuất

bằng nước và cồn ngâm cá trê Clarias batrachus trọng lượng 70-80 g với nồng độ

10 và 20 ppm hằng ngày trong thời gian 28 ngày cho thấy tổng tế bào hồng cầu

và bạch cầu đều tăng và cỏ mực chiết xuất bằng cồn có hiệu quả hơn (Mishra and Gupta, 2013)

Ở Việt Nam, nghiên cứu đánh giá hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh trên

cá của 30 loại cây thuốc nam ở đồng bằng sông Cửu Long cho thấy các cây thuốc này đều có khả năng kháng khuẩn (MIC=16-2048μg/ml) Hoạt phổ mạnh trên cả

3 loại vi khuẩn thử nghiệm là bàng, ổi, trầu không và tràm (MIC=64-512 μg/ml)

Tác động mạnh nhất trên Aeromonas hydrophila là bàng (MIC=128 μg/ml);

Edwardsiella ictaluri là sâm đại hành (MIC=16 μg/ml); Edwardsiella tarda là rau

mương (MIC=32 μg/ml) Trong các cây có khả năng kháng khuẩn mạnh, cây ổi

có hiệu suất chiết xuất cao nhất (5,37%) và kế đến là cây Tràm (3,37%) (Huỳnh Kim Diệu, 2010) Ngoài ra, đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của diệp hạ châu

(Phyllanthus niruri) và cỏ mực (Eclipta prostrate) cho thấy diệp hạ châu ảnh hưởng rất mạnh đến Edwardsiella tarda (MIC = 64-512 µg/ml), Aeromonas

hydrophila (MIC=512-1024 µg/ml) Cỏ mực cũng tác động mạnh đến Edwardsiella tarda (MIC=256-512 µg/ml), Edwardsiella ictaluri (MIC=512

µg/ml) và Aeromonas hydrophila (MIC=256-512 µg/ml) (Huỳnh Kim Diệu và Lê

Thị Loan Em, 2011)

Nhìn chung, thảo dược đã và đang được sử dụng trong nuôi trồng thủy sản

ở nhiều quốc gia trên thế giới Sử dụng các chiết xuất từ thảo dược trên cá cũng được nghiên cứu nhằm tăng sức đề kháng, phòng và trị bệnh do kí sinh trùng, vi khuẩn và nấm Tuy nhiên, báo cáo thử nghiệm đánh giá hoạt tính của các loại thảo dược phòng trị bệnh trên cá ở đồng bằng sông Cửu Long còn rất ít Chiết xuất từ thảo dược kháng nấm gây bệnh trên cá cần được nghiên cứu trong thời gian gần đây

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tư ng nghiên cứu

Mầm bệnh vi nấm bao gồm vi nấm bậc thấp và vi nấm bậc cao nhiễm trên cá

tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi thâm canh và cá lóc (Channa striata)

nuôi ao thâm canh và vi nấm xuất hiện trong môi trường nước ao nuôi là đối tượng nghiên cứu của luận án

3.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thu mẫu bệnh phẩm (cá tra và cá lóc) và môi trường nước ao nuôi ở một số tỉnh đồng bằng sông Cửu Long gồm An Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long, Đồng Tháp

và Trà Vinh; phân lập, định danh, nghiên cứu đặc điểm sinh học, thí nghiệm cảm nhiễm và thí nghiệm khảo sát hóa chất và thảo dược diệt vi nấm gây bệnh được thực hiện từ tháng 01 năm 2013 đến tháng 6 năm 2016 tại phòng thí nghiệm vi nấm thuộc Bộ môn Bệnh học thủy sản, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ

3.3 Vật liệu nghiên cứu

3.3.1 Môi trường nuôi cấy vi nấm, thuốc kháng sinh, hóa chất và thảo dư c

Môi trường nuôi cấy vi nấm gồm: môi trường thạch Glucose Yeast-extract Agar (GYA) thành phần môi trường thạch bao gồm 1% glucose (Himedia, Ấn độ), 0,25% yeast-extract glucose (Himedia, Ấn độ) và 1,5% agar glucose (Himedia, Ấn độ); môi trường lỏng Glucose Yeast-extract (GY) bao gồm 1% glucose và 0,25% yeast-extract Thuốc kháng sinh streptomycine (Vemedim, Việt Nam) và ampiciline (Vemedim, Việt Nam) được sử dụng trong quá trình phân lập

vi nấm

Hóa chất bronopol (Cress 50, Chile); đồng sulphate (Merck, Đức) và iodine (Merck, Đức) được sử dụng trong thí nghiệm khảo sát mức độ diệt vi nấm Ngoài

ra, thảo dược bao gồm cỏ mực (Eclipta Prostrata) và diệp hạ châu (Phyllanthus

niruri) được sử dụng trong thí nghiệm đánh giá mức độ ức chế của vi nấm

3.3.2 Dụng cụ và thiết bị

Dụng cụ và thiết bị chủ yếu được sử dụng cho quá trình phân lập, định danh, thí nghiệm cảm nhiễm và khảo sát hóa chất hoặc chiết xuất thảo dược lên sự phát triển của vi nấm gây bệnh bao gồm ống cắt vi nấm số 2, thước kẹp, tủ cấy vi sinh (Esco, Singapore), tủ ủ ấm (Memmert, Đức), kính hiển vi đảo chiều (Carl Zeiss,

Đức), kính hiển vi sinh học (Carl Zeiss, Đức),…và những dụng cụ, thiết bị phổ biến khác dùng cho nghiên cứu vi nấm

3.4 Phương pháp nghiên cứu

Hình 3.1: Sơ đồ nghiên cứu cá bệnh do vi nấm

Thu mẫu môi trường nước ao

nuôi và cá (định kỳ 1 lần/tháng)

Thu mẫu cá tra và cá lóc bệnh

Phân lập vi nấm (nước và cá) Định danh vi nấm (hình thái)

Xác định đặc điểm bệnh học của vi nấm gây bệnh trên cá

Chọn vi nấm phân lập trên cá bệnh

Cá tra

Xác định đặc điểm sinh học của vi nấm gây bệnh trên cá tra và cá lóc

(nhiệt độ, pH, độ mặn, carbohydrate và nitrite)

Định danh vi nấm gây bệnh (đặc điểm hình thái, giải trình tự gen)

Cá lóc

Xác định ảnh hưởng của hóa chất và thảo dược đến vi nấm gây bệnh

Thử nghiệm sử dụng thảo dược trên cá bệnh do vi nấm trong điều kiện

phòng thí nghiệm Thí nghiệm cảm nhiễm xác định khả năng gây bệnh của vi nấm trên cá

Mô học

3.4.1 Xác định thành phần giống loài vi nấm trong môi trường ao nuôi cá tra

và cá lóc thâm canh

3.4.1.1 Phương pháp thu mẫu

Mẫu nước ở 6 ao cá tra và 6 ao cá lóc nuôi thâm canh tại tỉnh An Giang và Cần Thơ được thu với nhịp thu mẫu hàng tháng theo chu kỳ nuôi Tổng số 60 mẫu nước được thu tại ao cá tra và cá lóc trong 5 đợt của chu kỳ nuôi Phương pháp thu mẫu nước ao nuôi được thực hiện như sau: thu 1 lít mẫu nước ở 5 vị trí khác nhau (4 góc và giữa ao) ở độ sâu 50cm; giữ mát mẫu nước trong thùng xốp

và chuyển về phòng thí nghiệm tiến hành phân lập vi nấm

3.4.1.2 Phương pháp phân tích mẫu nước

Phương pháp phân lập vi nấm trong môi trường nước ao nuôi được thực

hiện theo Johnson et al (2002) như sau: cho 1 mL nước ao vào đĩa petri có môi

trường thạch GYA; dùng que thủy tinh hình chữ L trải đều mẫu nước trên mặt thạch và ủ ở 28C từ 3-5 ngày Thí nghiệm được lặp lại 5 lần Vi nấm phát triển

và được cấy chuyền để có được chủng vi nấm thuần cho nghiên cứu tiếp theo

Mẫu môi trường nước ao nuôi được bổ sung thêm giá thể (30 hạt mè) cho

vi nấm phát triển và giữ trong điều kiện nhiệt độ phòng Sau 5-7 ngày quan sát vi nấm phát triển trên các giá thể sau đó tiến hành phân lập trên môi trường thạch

GYA để có được chủng vi nấm thuần (Johnson et al., 2002)

3.4.1.3 Phương pháp định danh vi nấm

Các chủng vi nấm thuần phân lập từ môi trường nước ao nuôi cá tra và cá lóc thâm canh được định danh xác định thành phần giống vi nấm theo các phương pháp như sau:

 Vi nấm bậc thấp

Phương pháp nuôi cấy nấm bậc thấp sinh sản vô tính theo Gam et al

(1980) Cắt 2-3 khối agar chứa nấm thuần cho vào môi trường lỏng GY (1% glucose và 0,25% Yeast-extract) và ủ ở 28C khoảng 3-5 ngày Cắt sợi nấm phát triển và rửa 3 lần qua nước cất vô trùng sau đó cho vào 2 đĩa petri trong đó 1 đĩa petri có nước cất vô trùng (25 ml/đĩa) và 1 đĩa petri có nước cất và bổ sung hạt

mè làm giá thể, tiếp tục ủ ở 28C Sau khoảng 12-18 giờ quan sát hình thái sinh sản vô tính và hữu tính bằng kính hiển vi đảo chiều ở vật kính 10X và 40X

Vi nấm được định danh theo khóa phân loại của Johnson et al (2002) dựa

vào các đặc điểm khuẩn lạc, hình thái và kích thước sợi nấm và bào tử trong quá trình sinh sản của các chủng vi nấm phân lập được

 Vi nấm bậc cao

Phương pháp nuôi cấy trên lame kính theo de Hoog et al (2000) Dùng

dao cắt khối môi trường GYA đặt lên phiến kính được gác trên que thủy tinh hình chữ V, bên dưới là lớp giấy thấm có nước cất vô trùng Cấy vi nấm vào bốn mặt bên của khối thạch, sau đó đặt lamen lên trên khối thạch này Ủ mẫu ở 28 0C trong 5 ngày, khi nấm phát triển bao phủ lamen Tiến hành cho 1 giọt thuốc nhuộm cotton blue lên phiến kính và đặt lamen có vi nấm lên trên phiến kính Quan sát mẫu dưới kính hiển vi ở vật kính 10X và 40X

Vi nấm được định danh theo khóa phân loại của de Hoog et al (2000) dựa

vào các đặc điểm màu sắc khuẩn lạc trên môi trường GYA, đặc điểm hình thái sợi nấm và kích thước, đặc điểm cuống bào tử và bào tử của các chủng nấm phân lập

3.4.2 Xác định thành phần giống loài vi nấm nhiễm trên cá tra và cá lóc 3.4.2.1 Phương pháp thu mẫu

 Mẫu cá tra:

Mẫu thu định kỳ: tổng số 153 mẫu cá tra trong 6 ao nuôi thâm canh cũng

được thu ở An Giang và Cần Thơ với nhịp thu mẫu hàng tháng (5 tháng) theo chu

kỳ nuôi cùng thời điểm với thu mẫu nước trong ao (Bảng 3.1)

Bảng 3.1: Số mẫu cá tra thu định kỳ ở ao nuôi thâm canh Địa điểm Số ao Thời gian