Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng tạo enzym protease của vi khuẩn Bacillus subtilis natto

Hiện này tại Việt nam, tai biến mạch máu não là căn bệnh gây tử vong thứ 2 sau các bệnh về tim mạch, khoảng 200.000 người mắc bệnh/năm và có tới 50% tử vong. Nattokinase là một enzym tiêu huyết khối mạch mẽ và mọt enzym thuộc nhóm của protease. Protease là enzym được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất như chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm pho mát, làm mềm thịt, bổ sung để làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp… Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp protease đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều hơn. Tuy nhiên giá thành chế phẩm protease còn khá cao, do đó cũng hạn chế việc sử dụng rộng rãi enzym trong sản xuất. Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật. Tuy nhiên nguồn enzyme ở vi sinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn… Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống. Vì vậy, Bacillus subtilis natto có khả năng tạo enzym protease này và những enzym khác như amylase, vv. Vì vậy chung tôi tiến hành khóa luận “Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng tạo enzym protease của vi khuẩn Bacillus subtilis natto”.

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện này tại Việt nam, tai biến mạch máu não là căn bệnh gây tử vongthứ 2 sau các bệnh về tim mạch, khoảng 200.000 người mắc bệnh/năm và cótới 50% tử vong

Nattokinase là một enzym tiêu huyết khối mạch mẽ và mọt enzymthuộc nhóm của protease

Protease là enzym được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một sốngành sản xuất như chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm pho mát, làm mềmthịt, bổ sung để làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phếphụ phẩm trong chế biến thực phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế,nông nghiệp…

Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồncung cấp protease đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm đượctạo ra nhiều hơn Tuy nhiên giá thành chế phẩm protease còn khá cao, do đócũng hạn chế việc sử dụng rộng rãi enzym trong sản xuất Protease phân bố ởthực vật, động vật, vi sinh vật Tuy nhiên nguồn enzyme ở vi sinh vật phongphú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn…

Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme

ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống

Vì vậy, Bacillus subtilis natto có khả năng tạo enzym protease này và

những enzym khác như amylase, vv Vì vậy chung tôi tiến hành khóa luận

“Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng tạo enzym protease của vi khuẩn Bacillus subtilis natto” Khóa luận gồm có hai mục

tiêu:

1 Xác định enzym do Bacillus subtilis natto tạo ra

2 Khảo sát một số thông số ảnh hưởng đến khả năng tạo enzym protease của Bacillus subtllis natto.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1.1 Phân loại khoa học

Giới: Bacteria; Ngành : Firmicutes; Lớp: Bacilli; Bộ: Bacillales; Họ: Bacillaceae; Chi: Bacillus; Loài: Bacillus subtilis.

1.1.2 Đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis

Bacillus subtilis là loại trực khuẩn hình que, bắt màu Gram (+), hiếu khí Đa số các chủng Bacillus subtilis có khả năng hình thành nội bào tử cho

phép vi khuẩn chịu được điều kiện khắc nhiệt của môi trường như nhiệt độcao, pH acid, nồng độ muối cao, cạn kiệt dinh dưỡng… Đến khi gặp điều kiệnthuận lợi, bào tử sẽ nảy mầm thành vi khuẩn và phát triển bình thường

Bacillus subtilis lập lại vi khuẩn gram dương có kích thước 2-3x0,7-0,8(m),

nội bào tử ở trung tâm có kích thước 1,5-1,8x0,8(m) Khi nhuộm ogietka, tếbào vi khuẩn bắt màu đỏ, bào tử màu xanh

Hình 1.1: Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis quan sát dưới kính hiểu vi 1.1.3 Khả năng sinh Protease của vi khuẩn Bacillus subtilis

Bacillus subtilis là vi khuẩn có khả năng sản xuất protease có hoạt tính

cao để sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp thực phẩm, công nghiệp nhẹ,

và y học

1.1.4 Ứng dụng (Xem của Hương)

Ngày nay Bacillus subtilis được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp vì

nó sản xuất ra 2 loại protease ngoại bào là nhóm kiềm tính subtilisin vàprotease A trung tính

Trong lĩnh vực y tế:

Vi khuẩn thuộc chì Bacillus, được phân lập bằng kỹ thuật rắc đất, được

sử dụng trong sản xuất kháng sinh kháng sinh Bacitracin được xác định

là có tác dụng trên vi khuẩn Gram dương [18] Các kháng sinh khác mà

Bacillussubtilis tạora là polymyxin, difficidin, subtilin, và mycobacillin.

Polymyxin có tác dụng chống lại các vi khuẩn Gram âm, trong khi

difficidin có phổ rộng hơn [19] Bacillus subtilis tiết ra vi nhiều enzym, chẳng

hạn như amylase, protease, pullulanase, chitinase, xylanase, lipase Những enzym này được sản xuất thương mại và những enzym này đại diệncho khoảng 60% ngành thương mại sản xuất enzym công nghiệp [17] Hiện

nay được dùng nhiều trong các chế phẩm probiotic với tác dụng B subtilis có

khả năng sản sinh nhiều enzym, quan trọng nhất là amylase và protease 2 loại

enzym thuộc hệ thống men tiêu hóa B subtilis có khả năng sinh tổng hợp

một số chất kháng sinh có tác dụng ức chế sinh trưởng hoặc tiêu diệt một số

vi sinh vật khác, tác dụng lên cả vi khuẩn Gram (-), Gram (+) và nấm gây

bệnh B subtilis tồn tại trong chế phẩm ở trạng thái bào tử, nhờ vậy khi uống

vào dạ dày không bị acid cũng như các men tiêu hóa ở dịch vị phá hủy Ởruột, bào tử nẩy mầm và phát triển thành thể hoạt động giúp cân bằng hệ visinh có ích trong đường ruột, cải thiện hệ thống tiêu hóa, nhất là sau khi sử

dụng kháng sinh kéo dài Các chế phẩm chứa B subtilis ví dụ như Biosubtyl,

Biobaby được chỉ định trị tiêu chảy, viêm ruột cấp và mãn tính, rối loạn tiêuhóa, trẻ em đi ngoài phân sống, viêm đại tràng [29].

B subtilis có hoạt tính diệt nấm tự nhiên, và được sử dụng như một

tác nhân kiểm soát sinh học Nó được sử dụng để sản xuất amylase Nó được

sử dụng để sản xuất axit hyaluronic, đây là những enzym hữu ích trong lĩnhvực y tế [20]

Trong lĩnh vực thủy sản

Hầu hết những loài Bacillus không độc hại đối với động vật Enzym do

vi khuẩn Bacillus tiết ra phân hủy rất có hiệu quả các chất như carbohydrat, chất béo và đạm thành những đơn vị nhỏ hơn Bacillus cũng có khả năng phân

hủy các chất hữu cơ tích lũy trong nền đáy ao nuôi tôm Nhiều nghiên cứu đãchứng minh rằng khi bổ sung vi khuẩn này vào môi trường nuôi tôm sú thì tỉ

lệ sống của tôm được cải thiện đáng kể và hệ miễn dịch tăng lên rõ rệt Ngoài

ra, chúng còn hạn chế vi khuẩn có hại trong đường ruột và trong môi trườnggiúp chuyển hoá hiệu quả thức ăn và khống chế vi khuẩn gây bệnh Chế phẩm

vi sinh vật hữu ích có 2 loại là loại dùng để xử lý môi trường và loại trộn vàothức ăn cho tôm cá [6]

Các tác dụng khác

* Dùng làm chất kích thích tăng trưởng cho cây trồng [7]

* Chất tẩy rửa

Protease là một trong những thành phần không thể thiếu trong tất cảcác loại chất tẩy rửa, từ chất tẩy rửa dùng trong gia đình đến những chất làmsạch kính hoặc răng giả và kem đánh răng Việc ứng dụng enzym vào các chấttẩy rửa nhiều nhất là trong bột giặt Các protease thích hợp để bổ sung vàochất tẩy rửa thường có tính đặc hiệu cơ chất rộng để dễ dàng loại bỏ các vếtbẩn do thức ăn, máu và các chất do cơ thể con người tiết ra Một tiêu chuẩn

quan trọng khác của các protease dùng trong chất tẩy rửa là hoạt động tốttrong điều kiện nhiệt độ và pH cao cũng như phải thích hợp với các tác nhânoxy hóa và các chất kìm hãm có trong thành phần của chất tẩy rửa

C

⃰ C ông nghiệp thuộc da

Quá trình chế biến da bao gồm một số công đoạn như ngâm ướt, tẩylông, làm mềm da và thuộc da Thông thường các phương pháp thuộc dathường dùng các hóa chất độc hại như Natri sulfit, làm ảnh hưởng rất nghiêmtrọng đến môi trường khi nước thải của nhà máy này thải ra sông Việc sửdụng enzym để thay thế các hóa chất đã rất thành công trong việc nâng caochất lượng da và làm giảm ô nhiễm môi trường

Các vi sinh vật thuộc chi Bacillus được sử dụng làm probiotic từ ít

nhất 50 năm nay Tuy nhiên, các nhà khoa học thực sự quan tâm đến probiotic

thuộc chi Bacillus mới chỉ 15 năm lại đây và thông tin này được mô tả khá rõ

trong ba bài báo tổng quan của tác giả Hong và đồng sự, 2005; Mazza, 1994;

Sanders và đồng sự, 2003 Các loài được nghiên cứu rộng rãi nhất là Bacillus subtilis, Bacillus clausii, Bacillus cereus, Bacillus coagulans và Bacillus licheniformis Bào tử bền nhiệt có nhiều ưu điểm so với các loài không có khả năng sinh bào tử như các loài thuộc chi Lactobacillus spp… Thứ nhất là sản

phẩm probiotic dạng bào tử có thể được bảo quản ở nhiệt độ phòng ở điềukiện khô mà không bị ảnh hưởng đến độ sống Ưu điểm thứ hai là bào tử cóthể sống sót khi di chuyển qua môi trường pH acid của dịch vị dạ dày(Barbosa et al., 2005; Spinosa et al., 2000), trong khi phần lớn

các Lactobacillus ở dạng vi khuẩn sẽ bị tiêu diệt (Tuohy et al., 2007) Chính

vì vậy một liều lượng nhất định của bào tử có thể được bảo quản vô thời hạnkhông cần để trong tủ lạnh và toàn bộ bào tử trong liều dùng đó sẽ được đivào ruột để phát triển thành vi khuẩn sống và phát huy tác dụng [26]

1.1.5 Bacillus subtilis natto

Tên khác: Bacillus subtilis subsp natto, Bacillus subtilis var natto Bacillus subtilis natto là một chủng thuộc loài Bacillus subtilis, được giáo sư

Sawamura phân lập và định danh lần đầu tiên vào năm 1905

Bacillus subtilis natto phát triển rất nhiều trong đậu nành Vi khuẩn này

cũng phát triển trên loại đậu khác, trong thực phẩm có nguồn gốc thực vậtkhác như tảo biển, trong thực phẩm có nguồn gốc động vật như cá, thịt, tôm,

cua và trong sản phẩm bơ sữa Bacillus subtilis natto sử dụng nguồn carbon

là glucose, saccarose, fructose trong đó saccarose cần thiết cho vi khuẩn

phát triển và sản xuất chất nhớt Bacillus subtilis natto cũng cần biotin, trong

môi trường không có biotin các tế bào sinh dưỡng không thể phát triển và bào

tử của chúng không nảy mầm được [1]

Bacillus subtilis natto cần oxy có thể phát triển ở nồng độ oxy lớn hơn

3% Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh bào tử là 40oC, nhiệt độ tối ưu cho sự pháttriển là giữa 39 và 43 oC Ở 55 oC vi khuẩn ngừng phát triển và sự ly giải tế

bào sinh dưỡng diễn ra Bacillus subtilis natto phát triển ở pH trung tính Sự

nảy chồi và phát triển bị ức chế ở pH=4,5 hoặc thấp hơn Subtilisin là

protease của Bacillus subtilis natto và là endoprotease pH tối thích cho

enzym này là 7,0 khi cơ chất là casein và hoạt tính ở pH=10 thì tương tự ởpH=7,0 [1]

1.2 PROTEASE

1.2.1 Cấu trúc chung

Protease (Proteinases, Peptidases hoặc enzym thủy phân protein) làcác enzym phá vỡ liên kết peptit giữa các amino acid của protein Quá trìnhnày được gọi là phân cắt proteolytic, một cơ chế chung của kích hoạt hoặc bấthoạt các enzym đặc biệt là liên quan đến đông máu hoặc tiêu hóa Chúng sửdụng một phân tử của nước và do đó được phân loại như hydrolases [3]

Nhóm enzym protease (peptit – hydrolase 3.4) xúc tác quá trình thuỷphân liên kết peptit (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptit đến sảnphẩm cuối cùng là các amino acid Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năngthuỷ phân liên kết este và vận chuyển amino acid [3]

Hình 1.2 Mô hình enzym Protease thủy phân phân tử Protein

Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từmức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiềuđối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa )

và động vật (gan, dạ dày bê ) So với protease động vật và thực vật, protease

vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt Trước hết hệ protease vi sinh vật làmột hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzym rất giống nhau về cấu trúc,

khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồngnhất [3].

Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzym khác nhau nên protease vi sinhvật thường có tính đặc hiệu rộng rãi, cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đadạng

Hình 1.3 Cấu trúc trung gian enzym protease 1.2.2 Phân loại

Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3(E.C.3.4)

Hình 1.4 Sơ đồ phân loại được tóm tắt

Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và

exopeptidase

* Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia thành hai loại:

 Aminopeptidase: Xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự

do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptid hoặcmột tripeptid

 Carboxypeptidase: Xúc tác thủy phân liên kết peptid ở đầu C của

chuỗi polypeptid và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptid

* Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm:

 Serin proteinase: Là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc

serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạtđộng xúc tác của enzym Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ là chymotrypsin

và subtilisin Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzym động vật nhưchymotrypsin, trypsin, elastase Nhóm Subtilisin bao gồm hai loại enzym vi

khuẩn như Subtilisin carlsberg, Subtilisin BPN Các serine proteinase thường

hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đốirộng

 Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung

tâm hoạt động Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật nhưpapain, bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng Cáccystein proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơchất rộng

 Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm

pepsin Nhóm pepsin bao gồm các enzym tiêu hóa như: pepsin, chymosin,

cathepsin, renin Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trungtâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.

 Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được

tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn Cácmetallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảmmạnh dưới tác dụng của EDTA [3][5][6]

Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành banhóm:

- Protease acid : pH 2-4

- Protease trung tính : pH 7-8

- Protease kiềm : pH 9-11

1.2.3 Ứng dụng enzym protease

 Trong Y học: Sử dụng nhiều protease để sản xuất thuốc hỗ trợ tiêu hóa,

nấu cao động vật, chữa bệnh nghẽn mạch máu, tiêu viêm vết thương [6]

 Trong chế biến thủy sản: Trong chế biến nước mắm sử dụng enzym

protease thực vật ( bromelain, papain ) và vi sinh vật để rút ngắn thời gianlàm và cải thiện hương vị của nước mắm

 Trong công nghiệp sữa : Sản xuất phomat nhờ hoạt tính làm đông tụ

sữa của chúng

Ví dụ : Renin, Pepsin, và một số protease vi sinh vât: A candidus,

P roquerti, B mensentericus…

 Trong công nghiệp sản xuất bánh mì, bánh quy: Protease làm giảm

thời gian đảo trộn tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột, tạo độ xốp và nở tốt hơn

 Trong sản xuất bia: Chế phẩm protease làm tăng độ bền của bia và rút

ngắn thời gian lọc, protease của A oryrae dùng thủy phân protease trong hạt

ngủ cốc tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn

 Trong công nghiệp da: Protease được sử dụng để làm mềm da loại bỏ

da khỏi các chất nhớt nhờ thủy phân một phần protein chủ yếu là collagen

thành phần làm da dị ứng Protease được sử dụng tách từ vi khuẩn (B mensertericus, B subtilis), nấm mốc và xạ khuẩn…

 Trong công nghiệp dệt: Đây là Protease được sử dụng để làm sạch tơ

tằm, tẩy tơ nhân tạo (các sợi nhân tạo được bằng các dung dịch casein,gelatine) để sợi được được bóng, dể nhuộm Protease có tác dụng thủy phânlớp protein serisin đã làm dính bết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rờicác loại tơ tằm, do đó làm giảm lượng hoá chất để tẩy trắng

Sản xuất keo động vật, chất giặt tổng hợp để giặt tẩy các chất bẩnprotein, sản xuất mỹ phẩm …

Điều chế môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật để sản xuất vaccine,kháng sinh.… [2][3][6]

1.3 NATTOKINASE

Nattokinase còn được gọi là: Subtilisin NAT, Subtilisin BSP [1].Nattokinase là một enzym có hoạt động fibrinolytic rất mạnh mẽ, được chiếtxuất và tinh chế từ natto Do đó nattokinase có nghĩa là “ enzym trong natto”

1.3.1 Lịch sử

Natto là một món ăn truyền thống từ hàng ngàn năm của Nhật Bản

được làm từ những hạt đậu tương đã luộc chín lên men với B.subtilis natto.

Nó được biết đến như là bí quyết giúp người Nhật sống lâu, khỏe mạnh, kéodài tuổi thọ Người ta cho rằng natto rất hữu hiệu trong việc phòng chốngbệnh cảm cúm, ngộ độc thức ăn (kiết lỵ, tiêu chảy cấp…), làm chắc xương,tiêu diệt vi trùng gây bệnh cũng như giúp cho phụ nữ mang thai sinh con khỏekhoắn Trong suốt thời kì chiến tranh Nhật-Nga (1904-1905), quân đội NhậtBản đã phải ăn ngày 3 bữa bằng natto với cơm nhờ vậy binh lính gìn giữ đượcsức khỏe không bị đau bụng, tiêu chảy hay táo bón trên đường hành quân.Natto đã trở thành một đề tài nóng hổi khi TS Sumi Hiroyuki đưa ra nhữngkết quả bất ngờ về hiệu quả của natto trong việc làm tan các huyết khối trongđộng mạch, một trong những nguyên nhân suy tim và tử vong của bệnh nhân

bị các chứng xơ vữa động mạch vành hay đột quị vì nghẽn hay xuất huyết nãovào năm 1980

Trong bữa cơm trưa tại nhà ăn của đại học Y khoa Chicago, Sumi lấymột mẫu natto đặt vào khay thủy tinh có cục máu đông thì 18 giờ sau cục máuđông này tan rã hoàn toàn, điều đó gợi ý rằng trong natto có thể có một haynhiều hoạt chất có thể phân hủy huyết khối nhờ thủy phân sợi fibrin có khảnăng làm đông máu (tụ máu) để ngăn chứng xuất huyết nội Sumi bắt đầu lưu

ý tới vai trò của “nattokinase” và Vitamin K2 có trong natto để chứng minh

nó là hoạt chất giúp cho người Nhật Bản sống lâu, làm tăng khả năng tạo raplasmin nội sinh giúp cho cơ thể tránh được tai biến hay đột quị bởi huyếtkhối hay các chứng xơ vữa động mạch, suy tim biến chứng gây nên Theo kếtquả nghiên cứu của 3 cơ quan y tế đại học bang Oklahoma (Mỹ), JCR

Pharmaceuticals (NB) và Trường Y khoa Miyazaki phối hợp thử nghiệm trên

cơ thể người (in vivo) bằng cách cho ăn natto 200 g/ngày và đã kiểm chứngđược những hiệu ứng kể trên, đặc biệt phát hiện lượng plasmin nội sinh giảmsụt ở người cao tuổi không đủ để làm tan huyết khối, vón cục trong độngmạch thì hiệu quả càng rõ rệt

Năm 1986, TS Sumi Hiroyuki công bố toàn bộ kết quả nghiên cứu vềtác dụng của nattokinase sau khi thử nghiệm gần 200 loại thực phẩm khácnhau để so sánh, xác định nattokinase là một loại enzym mang khả năng phânhủy huyết khối một cách hữu hiệu và mạnh nhất trong các loại enzym, gấp 4lần plasmin enzym nội sinh làm tan máu đông , đồng thời tuyệt đối an toàncho cơ thể khi hấp thụ qua đường ăn uống [4]

1.3.2 Cấu trúc của nattokinase

IDSGIDSSHP DLNVRGGASF VPSETNPYQD

QAAAQ

Hình 1.5 Cấu trúc bậc 1 của nattokinase

Nattokinase thuộc họ subtilisin của protease serin, cũng có trung tâmhoạt động bao gồm nhóm hydroxyl của Ser-221, imidazol của His-64 vànhóm carboxyl của Asp-32 (hình 1.6) [1].

Hình 1.6 Cấu trúc bậc 3 của nattokinase 1.3.3 Công dụng của Nattokinase ( Tai lieu cua Mai)

Nattokinase được sử dụng rộng rãi với vai trò thực phẩm chức năng

hỗ trợ trong việc phòng và điều trị các bệnh lý tim mạch:

- Phòng ngừa và tiêu huyết khối, tăng tuần hoàn não và lưu thôngmáu

- Phòng và hỗ trợ điều trị tai biến mạch máu não, nhồi máu cơ tim,nghẽn tĩnh mạch sâu, đau thắt ngực, ổn định huyết áp

- Hạ mỡ máu, chống xơ vữa động mạch

- Cải thiện tình trạng mệt mỏi và suy giảm trí nhớ, đau đầu, hoa mắtchóng mặt, khôi phục chức năng sinh lý [32]

1.3.4 Cơ chế tiêu fibrin của nattokinase [19] [20] (cua Mai)

Nattokinase phân hủy fibrin trực tiếp hay gián tiếp thông qua 3 conđường khác nhau:

- Nattokinase trực tiếp giáng hóa fibrin trong cục máu đông, làm biếnđổi fibrin từ dạng polymer không tan thành các sản phẩm giáng hóa có trọnglượng phân tử thấp, hòa tan Như vậy, nattokinase có cơ chế tiêu fibrin giốngvới plasmin.

- Nattokinase giáng hóa fibrin gián tiếp bằng cách hoạt hóa urokinase thành urokinase Kết quả là thúc đẩy quá trình biến đổiplasminogen thành plasmin, làm tăng plasmin nội sinh

pro Nattokinase giáng hóa fibrin gián tiếp bằng cách hoạt hóa quá trìnhtổng hợp t- PA trong huyết tương Kết quả là tăng cường tạo thành plasmin.Đặc biệt, Nattokinase không ảnh hưởng đến quá trình hình thành fibrin từfibrinogen, do đó không làm suy giảm cơ chế đông máu bình thường của cơthể Vì vậy, Nattokinase không gây gây ra biến chứng chảy máu như cácthuốc chống đông máu bình thường

Hình 1.5 Hiệu ứng của nattokinase lên fibrin

Nattokinase

Sản phẩm giáng hóa của fibrin fibrin

A: Thể làm tan fibrin trực tiếp

B: Thay đổi prourokinase

sang urokinase

C: Tăng t-PA

A

B C

1.3 CÁC PROTEASE TIÊU FIBRIN

Cục máu đông có thể tan trở lại nhờ quá trình tiêu fibrin Đó là quátrình ngược với đông máu Bình thường, enzym plasmin xúc tác cho sự tiêufibrin trong máu ở thể không hoạt tính gọi là plasminogen Trong điều kiệnnhất định, các chất hoạt hóa (kinase, act ivator) được giải phóng ra khỏi tổchức, hoạt hóa plasminogen tạo thành plasmin Plasmin vừa tạo thành giúpfibrin trở thành chất phân huỷ tan được [7]

1.4.1 Streptokinase

Streptokinase ( SK, Streptase), gồm một chuỗi đapeptid, phân tửlượng 48000, được phân lập từ liên cầu tan máu nhóm A Streptokinase kếthợp với plasminogen theo tỷ lệ đồng phân tử (equimolar) tạo thành phức hợpSK-plasminogen Phức hợp này cắt liên kết arginin-valin ở vị trí 560 củaplasminogen chuyển thành SK-plasmin có hoạt tính tiêu fibrin

Ngoài tiêu fibrin, streptokinase còn xúc tác cho phản ứng thuỷ phânnucleoprotein thành các base purin tự do và pyrimidin nucleotid, do vậy làmloãng các dịch đông đặc như mủ [7]

1.4.2 Urokinase

Urokinase ( Abbokinase) là endopeptidase, gồm 2 chuỗi đa peptidchứa 411 acid amin, trọng lượng phân tử 53000, được phân lập từ nước tiểungười (URO = urine = nước tiểu) hoặc từ nuôi cấy tế bào phôi thận người.Urokinase xúc tác cho phản ứng cắt liên kết peptid của plasminogen(plasminogen có 791 acid amin) tạo thành lys-plasminogen và chuyển thànhplasmin Lysin cuối cùng của plasmin là vị trí gắn có ái lực cao với fibrin giúpcho sự thuỷ phân fibrin [7]

1.4.3 Nattokinase

Nattokinase là một enzym được chiết xuất từ đậu tương, lên men theo

phương pháp dùng vi khuẩn Bacillus natto.

Nattokinase có tác dụng phòng và phá các cục máu đông (do có khảnăng tiêu fibrin) Các cục máu đông (huyết khối) được hình thành khi các sợifibrin tích lũy trong mạch máu Các cục máu đông trong các mạch máu có thể

di chuyển lên não làm cản trở việc cung cấp oxy cho các mô não gây ra cácbệnh lý nguy hiểm như tai biến mạch máu não, suy não, giảm trí nhớ, đột quỵ.Các cục máu đông ở tim gây ra các bệnh lý như đau thắt ngực, nhồi máu cơtim [8]

1.5 LÊN MEN SẢN XUẤT ENZYM

Enzym là sản phẩm của tế bào Hầu hết các enzym được sản xuất từ visinh vật

1.5.1 Công nghệ lên men trong sản xuất enzym

Trong sản xuất chế phẩm enzym, cần chú ý đến những yếu tố:

Nguồn Enzym:

Có thể thu nhận enzym từ động vật như trypsin, chimotrypsin, từ thựcvật như papain của đu đủ, amylase của đại mạch Nhưng enzym vi sinh vật lànguồn phổ biến và giá thành có ý nghĩa kinh tế nhất

+ Các phương pháp nuôi cấy:

• Nuôi cấy bề mặt:

Phương pháp này rất thích hợp để nuôi cấy các loại nấm mốc do khảnăng phát triển nhanh, mạnh, nên ít bị tạp nhiễm Khi nuôi nấm mốc pháttriển bao phủ bề mặt hạt chất dinh dưỡng rắn, các khuẩn ty cũng phát triểnđâm sâu vào lòng môi trường đã được tiệt trùng, làm ẩm Đối với một số mụcđích đặc biệt, người ta nuôi vi sinh vật trực tiếp trên bề mặt hạt gạo (sản xuấttương), hạt đậu tương (đậu tương lên men- misô) đã được nấu chín trộn hạtcốc còn sống (làm men thuốc bắc, men dân tộc, làm tương)

Người ta thường dùng cám mì, cám gạo, ngô mảnh… có chất phụ gia làtrấu Cám, trấu, có bề mặt tiếp xúc lớn, mỏng, tạo được độ xốp nhiều, không

có những chất gây ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của nấm mốc Tỉ lệ cácchất phụ gia phải bảo đảm sao cho hàm lượng tinh bột trong khối nguyên liệukhông được thấp hơn 20%, có thể bổ sung thêm nguồn nitơ vô cơ((NH4)2SO4, (NH4)2CO), photpho, nitơ hữu cơ và các chất kích thích sinhtrưởng như malt, nước chiết ngô, nước lọc bã rượu

* Quy trình công nghệ:

Nguyên liệu  Trộn  Làm ẩm  Thanh trùng bằng nhiệt  Lamnguội, tơi  Cấy giống vi sinh vật  Chuyển vào dụng cụ nuôi cấy  Nuôicấy, theo dõi, xử lý

* Ưu nhược điểm:

Nồng độ enzym tạo thành cao hơn nhiều lần so với dịch nuôi cấy chìmsau khi đã tách tế bào vi sinh vật Trong công nghiệp rượu muốn đường hoá100kg tinh bột chỉ cần 5kg chế phẩm nấm mốc bề mặt nhưng phải cần đến100lit nấm mốc chìm để lọc bã và tế bào vi sinh vật

Chế phẩm dễ dàng sấy khô mà không làm giảm đáng kể hoạt tínhenzym, chế phẩm khô, dễ bảo quản, vận chuyển, nghiền nhỏ hoặc sử dụngtrực tiếp nếu không cần khâu tách và làm sạch enzym

Tốn ít năng lượng, thiết bị, dụng cụ nuôi cấy đơn giản, có thể thực hiệnqui mô gia đình, trang trại cũng như ở qui mô lớn đến 20 tấn/ngày

Nuôi cấy trong điều kiện vô trùng tuyệt đối và trong quá trình nuôi cấynếu có nhiễm trùng phần nào, khu vực nào thì chỉ cần loại bỏ canh trườngphần đó

Tuy nhiên phương pháp bề mặt có năng suất thấp, khó cơ khí hoá, tựđộng hoá, cần diện tích nuôi lớn, chất lượng chế phẩm ở các mẻ không đồngđều.

• Nuôi cấy chìm

Vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường lỏng với cơ chất chủ yếutrong đa số trường hợp là tinh bột Chỉ có một số ít giống vi sinh vật dùngnguồn cơ chất cacbon là đường glucose, saccharose Thực tế, trong một sốtrường hợp đường hoá sơ bộ tinh bột trước khi thanh trùng Khi đó đườngmaltose được tạo thành là chất cảm ứng tốt, môi trường thường giảm độ nhớtnên dễ dàng cho quá trình khuấy trộn và sục khí

Phương pháp nuôi cấy chìm đòi hỏi phải được vô trùng tuyệt đối ở cáckhâu vệ sinh tổng hợp, thanh trùng môi trường dinh dưỡng, thao tác nuôi cấy,không khí cung cấp cho quá trình nuôi cấy

Các giai đoạn của quá trình nuôi cấy chìm 1 bước gồm: chuẩn bị môitrường nuôi cấy, nuôi cấy nấm men giống, nuôi cấy nấm mốc sản xuất

* Ưu nhược điểm

Phương pháp nuôi cấy hiện đại dễ cơ khí hoá, tự động hoá, năng suấtcao, dễ tổ chức sản xuất

Có thể nuôi cấy dễ dàng các chủng vi sinh vật đột biến có khả năngsinh tổng hợp enzym cao và lựa chọn tối ưu thành phần môi trường, các điềukiện nuôi cấy, enzym thu được tinh khiết hơn, đảm bao điều kiện vệ sinh, vôtrùng

Tuy nhiên do thu được môi trường và nồng độ enzym thấp nên khi táchthu hồi enzym sẽ có giá thành cao Tốn điện năng cho khuấy trộn, nếu khôngbảo đảm vô trùng sẽ bị nhiễm hàng loạt, toàn bộ gây hao phí lớn [3][6]

+ Thu nhận chế phẩm enzym:

Đối với lên men bề mặt hay các đối tượng thực vật, có thể đồng hóanếu cần, sau đó dùng dung dịch đệm hay nước cất để chiết rút enzym ta códịch chiết enzym Đối với canh trường bề sâu chỉ cần lọc bỏ sinh khối là códịch chiết tương tự trên

Sau đó có thể dùng các tác nhân kết tủa thuận nghịch như aceton,ethanol, muối trung tính để có chế phẩm enzym ở dạng sạch hơn

Từ chế phẩm sạch này, bằng kỹ thuật điện di, lọc gel… ta có thể táchtừng phần để có enzym tinh khiết hơn.Tùy mục đích sử dụng để ta tạo ra chếphẩm thích hợp

Để nâng cao giá trị sử dụng, hiện nay người ta thường tạo ra chế phẩmenzym gọi là enzym không tan

1.5.2 Các chất cảm ứng trong sản xuất enzym protease

Trong tế bào vi sinh vật có rất nhiều phân tử protein khác nhau (ở vikhuẩn có tới trên 2000 loại), trong đó chủ yếu là các enzym Sự tạo thànhenzym dưới tác dụng của chất cảm ứng là quá trình tổng protein de novo.Muốn tổng hợp được enzym cảm ứng cần phải có 4 điều kiện:

1 Có gen tương ứng trong thể nhiễm sắc của tế bào

2 Có đầy đủ các nguyên liệu để xây dựng các phần tử enzym đó (cácacid amino và các hợp phần coenzym nếu enzym đó gồm hai cấutử)

3 Năng lượng cần thiết dùng cho việc tổng hợp enzym

4 Chất cảm ứng Nếu không có chất cảm ứng thì dù có đủ ba điềukiện trên cũng không thể tổng hợp được enzym

Có thể coi việc có chất cảm ứng là điều kiện cần thiết để thu đượcnhững enzym mong muốn Trong công nghiệp sản xuất enzym cần phải lựa

chọn những chất cảm ứng thích hợp và xác định nồng độ tối ưu của nó trongmôi trường để có hiệu suất sinh tổng hợp cao nhất [ quyền vàng].

Trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn, trong số các nguồn nitơ vô cơ thìNH4, H2PO4 là tốt hơn cả.Các muối amoni và nitrat khác đều làm giảm hoạtlực enzym [6]

1.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ENZYM TỪ CÁC MÔI TRƯỜNG LÊN MEN

1.6.1 Phương pháp xác định Protease

Nguyên tắc: Vi sinh vật tiết enzyme protease phân giải casein thành

polypeptide và acid amin

Cách tiến hành:

Lên men vi khuẩn Bacillus subtilis natto trên môi trường canh thang

trong 24 giờ Đục một lỗ trên môi trường thạch đĩa có bổ sung 1% casein và

10 giọt xanh methylen Nhỏ dịch lên men của Bacillus subtilis natto vào, ủ ở

37oC trong 24 giờ

Đọc kết quả:

Kiểm tra vòng phân giải casein và đo kích thước vòng phân giải casein.

1.5.2 Phương pháp xác định Amylase

Nguyên tắc: Một số vi sinh vật có enzym α-amylase thuộc nhóm hydrolase

phân giải liên kết glycozid tạo thành dextrin có phân tử bé và maltose Vì vậydưới tác dụng của α-amylase, tinh bột bị phân giải thành dextrin không chophản ứng màu xanh tím với iod

Cách tiến hành:

Lên men vi khuẩn Bacillus subtilis natto trên môi trường canh thang

trong 24 giờ Đục một lỗ trên môi trường thạch đĩa có bổ sung 1% tinh bột

Nhỏ dịch lên men của Bacillus subtilis natto vào, ủ ở 37oC trong 24 giờ