XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN LOÀI VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA SÁN LÁ GAN LỚN Ở VIỆT NAM

Do những hạn chế của phương pháp hình thái học, các kỹ thuật sinh học phân tử khác nhau đã được phát triển để xác định và phân biệt các loài SLGL [2], [16], [50].. Sinh học phân tử không

VIỆN SỐT RÉT – KÝ SINH TRÙNG – CÔN TRÙNG TRUNG ƢƠNG

-o0o -

ĐỖ NGỌC ÁNH

XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN LOÀI VÀ

MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA

SÁN LÁ GAN LỚN Ở VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI-2017

VIỆN SỐT RÉT – KÝ SINH TRÙNG – CÔN TRÙNG TRUNG ƢƠNG

-o0o -

ĐỖ NGỌC ÁNH

XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN LOÀI VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA

SÁN LÁ GAN LỚN Ở VIỆT NAM

LỜI CÁM ƠN

Để hoàn thành được công trình nghiên cứu này, tôi đã nhận được rất nhiều

sự giúp đỡ của các cá nhân, tổ chức Tôi xin bày tỏ lòng cám ơn tới Đảng ủy – Ban giám đốc Học viện Quân y, Ban lãnh đạo Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương, Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Quy Nhơn, Phân viện thú y Miền Trung, Bộ môn Ký sinh trùng và Côn trùng – Học viện Quân y, Phòng Khoa học và Đào tạo – Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương, Trạm thú y huyện Nghĩa Đàn – Nghệ An, Đại học Đồng Tháp, Chi cục thú y Đồng Tháp, Chi cục thú y Cần Thơ… đã tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện thu thập mẫu vật, triển khai đề tài

Đặc biệt, tôi xin tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, sự cảm ơn chân thành tới những người thầy đáng kính là PGS.TS Nguyễn Khắc Lực – Chủ nhiệm Bộ môn Ký sinh trùng và Côn trùng – Học viện Quân y, PGS.TS Trần Thanh Dương - Viện trưởng Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương đã luôn theo sát, động viên, đôn đốc, tận tình chỉ bảo và trực tiếp hướng dẫn tôi trong quá trình học tập, thu thập mẫu vật, triển khai thí nghiệm, phân tích số liệu cũng như trong quá trình hoàn thành luận án này

Tôi xin chân thành cảm ơn GS TS Lê Bách Quang, TS Phạm Văn Minh, TS Lê Trần Anh, PGS.TS Nguyễn Duy Bắc và các anh/chị em Bộ môn Ký sinh trùng và Côn trùng – Học viện Quân y; PGS TS Cao Bá Lợi, PGS.TS Nguyễn Thu Hương và các cán bộ của Phòng Khoa học và Đào tạo Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương đã tạo điều kiện thuận lợi và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài cũng như cho tôi đóng góp những ý kiến quý báu để tôi hoàn thành luận án của mình

Tôi xin cảm ơn chân thành tới Đề tài cấp Nhà nước “Đặc điểm dịch tễ học

và biện pháp phòng chống bệnh sán lá gan lớn ở Việt Nam”, mã số

KC.10.26/06-10 thuộc Chương trình Khoa học và Công nghệ trọng điểm cấp Nhà nước “Nghiên cứu phát triển và ứng dụng công nghệ phục vụ bảo vệ, chăm sóc và nâng cao sức khỏe cộng đồng”, mã số KC.10/06-10 đã tài trợ một phần kinh phí cho tôi thực hiện luận án này

Tôi xin chân thành cảm ơn người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã ủng hộ

và giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn tới Cha, Mẹ người

đã vất vả sinh thành và nuôi tôi khôn lớn để tôi có được kết quả như ngày hôm nay! Cảm ơn toàn thể gia đình đã luôn sát cánh, động viên, giúp đỡ, chia

sẻ khó khăn và truyền nhiệt huyết cho tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận án

Tác giả

Đỗ Ngọc Ánh

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu này là do chính tôi thực hiện Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn trung thực và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ công trình khoa học nào khác Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về tính trung thực, khách quan, khoa học của các kết quả trong nghiên cứu này

Tác giả

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Tên tiếng Anh đầy đủ Nghĩa/Tên tiếng Việt

CT-scan Computer tomography scan Chụp X quang cắt lớp vi tính

cox1 Cytochorome c oxydase subunit 1 Một gen thuộc hệ gen ty thể

dNTP Deoxynucleoside triphosphates Đơn vị cấu tạo nên ADN ELISA Enzyme linked immunosorbent assay Phản ứng miễn dịch gắn men GOT Glutamic oxaloacetic transaminase Enzyme trao đổi acid amin GPT Glutamic pyruvic transaminase Enzyme trao đổi acid amin ITS Internal Transcribed Spacer Đoạn giao gen

IUPAC International Union of Pure and

nad1 Nicotinamide dehydrogenase subunit 1 Một gen thuộc hệ gen ty thể NCBI National Center for Biotechnology

Information

Trung tâm tin sinh học Quốc gia - Mỹ

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi Polymerase PCR-SSCP PCR - Single –Strand Conformation

VS-P Distance between the ventral sucker

and the posterior end of the body

Khoảng cách từ giác bụng đến điểm cuối thân

WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Sán lá gan lớn Fasciola spp và bệnh do sán lá gan lớn (Fasciolosis) 3

1.1.1 Đặc điểm sinh học của Fasciola spp 3

1.1.2 Đặc điểm của bệnh do Fasciola spp 12

1.2 Một số yếu tố tác động và tỷ lệ nhiễm SLGL ở người và động vật 15

1.2.1 Một số yếu tố tác động tới nhiễm sán lá gan lớn ở người và động vật 15

1.2.2 Tình hình nhiễm sán lá gan lớn ở người và động vật 16

1.3 Các phương pháp xác định loài sán lá gan lớn 21

1.3.1 Các phương pháp xác định loài Fasciola sp 21

1.3.2 Tính đa hình di truyền và tầm quan trọng của tính đa hình di truyền ở sán lá gan lớn 29

1.3.3 Tình hình nghiên cứu xác định loài sán lá gan lớn ở Việt Nam 35

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39

2.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 39

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 39

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 39

2.1.3 Thời gian nghiên cứu 40

2.2 Phương pháp nghiên cứu 40

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 40

2.2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu 40

2.2.3 Các phương pháp và kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu hình thái 45

2.2.4 Các phương pháp và kỹ thuật sử dụng trong giám định loài, phân tích các đặc điểm phân tử 49

2.2.5 Những hạn chế của phương pháp nghiên cứu 63

2.3 Đạo đức và y đức trong nghiên cứu 64

2.4 Xử lý và phân tích kết quả nghiên cứu 64

2.4.1 Xử lý số liệu hình thái 64

2.4.2 Xử lý số liệu về sinh học phân tử 64

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 68

3.1 Xác định một số chỉ số hình thái và phân loại sán lá gan lớn dựa vào hình thái học 68

3.1.1 Xác định một số chỉ số hình thái của sán lá gan lớn 68

3.1.2 Phân loại SLGL dựa vào một số chỉ số hình thái 75

3.2 Kết quả xác định loài và phân tích một số đặc điểm phân tử sán lá gan lớn ở Việt Nam 77

3.2.1 Kết quả xác định loài và phân loại sán lá gan lớn ở Việt Nam 77

3.2.2 Kết quả xác định một số đặc điểm phân tử 96

Chương 4 BÀN LUẬN 112

4.1 Về kết quả xác định một số chỉ số hình thái và phân loài sán lá gan lớn dựa vào hình thái 112

4.1.1 Về kết quả xác định và phân tích một số chỉ số hình thái 112

4.1.2 Về kết quả phân loại sán lá gan lớn dựa vào hình thái 120

Về kết quả phân loại sán lá gan lớn 120

4.2 Kết quả xác định thành phần loài và phân tích một số đặc điểm phân tử của sán lá gan lớn ở Việt Nam 125

4.2.1 Về kết quả xác định thành phần loài sán lá gan lớn ở Việt Nam 125

4.2.2 Về một số đặc điểm sinh học phân tử của sán lá gan lớn ở Việt Nam 134

KẾT LUẬN 149

KIẾN NGHỊ 151

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 152

DANH SÁCH CÁC BÀI BÁO KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ĐÃ CÔNG BỐ 153

TÀI LIỆU THAM KHẢO 154

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Tỷ lệ nhiễm sán lá gan lớn ở trâu/bò 19Bảng 1.2 Chiều dài và sự sai khác nucleotide của các gen thuộc hệ gen ty thể

giữa Fasciola sp (Fsp), F gigantica (Fg) và F hepatica (Fh) 30

Bảng 1.3 Số lượng các acid amin mã hóa bởi các gen và tỷ lệ sai khác acid

amin giữa Fasciola sp (Fsp), F gigantica (Fg) và F hepatica (Fh) 31

Bảng 2.1 Danh sách các mẫu và gen đích giải trình tự 44Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 55Bảng 2.3 Kích thước sản phẩm PCR với mồi JB3, JB4.5 và kích thước các

mảnh cắt giới hạn với các enzyme RsaI, AluI 60

Bảng 2.4 Kích thước sản phẩm PCR với mồi ITS1-F, ITS1-R và kích thước

các mảnh cắt giới hạn với các enzyme RsaI 61

Bảng 2.5 Danh sách các trình tự của SLGL tham khảo trên ngân hàng gen 65Bảng 3.1 Một số chỉ số hình thái của SLGL tại các khu vực nghiên cứu 69Bảng 3.2 Một số chỉ số hình thái của SLGL của các vật chủ khác nhau 70Hình 3.3 Chiều dài SLGL thu từ dê, cừu tại Ninh Thuận và từ trâu tại Nghệ

An 2015 71Bảng 3.3 Kích thước một số chỉ số hình thái của SLGL thu thập từ người 71Bảng 3.4 Sự khác biệt của các chỉ số hình thái của SLGL thu từ bò tại các khu vực nghiên cứu 72Bảng 3.5 Sự khác biệt hình thái của SLGL thu từ trâu tại các khu vực nghiên cứu 73Bảng 3.6 Sự khác biệt về hình thái của SLGL thu từ bò và trâu 74

Bảng 3.7 So sánh hình thái của F gigantica và Fasciola sp ở Việt Nam 74

Bảng 3.8 Phân nhóm SLGL ở động vật theo khu vực địa lý dựa vào chiều dài

cơ thể 75

Bảng 3.9 Phân nhóm SLGL thu thập ở động vật dựa vào chiều dài cơ thể 75

Bảng 3.10 Kích thước các chỉ số hình thái của các nhóm SLGL 76

Bảng 3.11 Phân nhóm SLGL theo tỷ số Dài/Rộng 76

Bảng 3.12 Kích thước các chỉ số hình thái của các nhóm SLGL phân loại theo tỷ số chiều dài/chiều rộng 77

Bảng 3.13 Kết quả phân nhóm của 17 mẫu SLGL dựa trên trình tự đoạn gen cox1 của hệ gen ty thể 81

Bảng 3.14 Kết quả phân loại một số mẫu SLGL dựa vào gen nad1 84

Bảng 3.15 Kết quả phân loại loài SLGL bằng phương pháp PCR-RFLP dựa vào chỉ thị gen ITS1 và enzyme RsaI 87

Bảng 3.16 Phân bố loài SLGL theo khu vực địa lý 87

Bảng 3.17 Phân bố loài SLGL theo vật chủ 88

Bảng 3.18 Phân bố loài theo nhóm kích thước chiều dài SLGL 88

Bảng 3.19 Kết quả phân nhóm của 16 chủng SLGL dựa trên trình tự đoạn gen ITS1 của hệ gen nhân 89

Bảng 3.20 Kết quả phân nhóm của 16 mẫu SLGL dựa trên trình tự đoạn gen ITS-2 của hệ gen nhân 92

Bảng 3.21 Bảng liên quan giữa phân loại hình thái với kết quả phân tích loài bằng PCR-RFLP của SLGL thu từ động vật 95

Bảng 3.22 Bảng liên quan giữa phân loại hình thái với kết quả phân tích loài bằng PCR-RFLP của các mẫu được so sánh trình trình tự 95

Bảng 3.23 Tỷ lệ tương đồng đoạn nucleotide chứa 1 phần gen cox 1 của các mẫu sán lá gan lớn Việt Nam với thế giới 97

Bảng 3.24 Các vị trí có sai khác đoạn nucleotide chứa 1 phần đoạn gen cox1 giữa các chủng SLGL của Việt Nam và thế giới 98

Bảng 3.25 Tỷ lệ tương đồng nucleotide gen nad1 của SLGL trong nghiên cứu với các chủng trên ngân hàng gen 101

Bảng 3.26 Các vị trí có sai khác nucleotide và acid amin trêm đoạn gen nad1

của SLGL Việt Nam so với thế giới 103Bảng 3.27 Tỷ lệ tương đồng nucleotide đoạn giao gen ITS1 của SLGL trong nghiên cứu với các chủng trên ngân hàng gen 105Bảng 3.28 Các vị trí có sai khác về nucleotide và acid amin của SLGL Việt Nam và SLGL thế giới của đoạn giao gen ITS1 106Bảng 3.29 Tỷ lệ tương đồng nucleotide đoạn giao gen ITS-2 của SLGL ở nghiên cứu với các chủng trên ngân hàng gen 108Bảng 3.30 Các vị trí sai khác nucleotide của đoạn giao gen ITS2 giữa SLGL Việt Nam và thế giới 110Bảng 4.1 So sánh một số chỉ số hình thái SLGL Việt Nam và SLGL thu từ các động vật khác nhau trên thế giới 118Bảng 4.2 So sánh một số chỉ số hình thái của SLGL Việt Nam với các chỉ số hình thái của F hepatica và F gigantica thu từ bò trên thế giới 119

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình thể SLGL trưởng thành và trứng 4

Hình 1.2 Vòng đời sinh học của sán lá gan lớn 7

Hình 1.3 Ba loài ốc Lymnaea spp tìm thấy ở Việt Nam 10

Hình 1.4 Sơ đồ cấu trúc hệ gen ty thể sán lá gan lớn 25

Hình 1.5 Ví trí của các đoạn giao gen ITS1 và ITS2 thuộc hệ gen nhân 26

Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 40

Hình 2.2 Minh họa cách đo các chỉ số hình thái của SLGL 47

Hình 2.3 Minh họa kết quả đo kích thước bằng kính hiển vi Optika 48

Hình 2.4 Sơ đồ các bước điện di kiểm tra sản phẩm PCR và cắt giới hạn 58

Hình 3.1 Phân bố tỷ lệ SLGL ở các khu vực thu thập 68

Hình 3.2 Chiều dài SLGL thu từ Điện Biên và Bắc Giang năm 2010 68

Hình 3.3 Chiều dài SLGL thu từ dê, cừu tại Ninh Thuận và từ trâu tại Nghệ An 2015 71

Hình 3.4 Mẫu SLGL thu thập từ người 71

Hình 3.5 Ảnh điện di kết quả nhân gen bằng cặp mồi JB3, JB4.5 của các mẫu SLGL thu thập từ bò tại Vĩnh Phúc 78

Hình 3.6 Sản phẩm PCR (với các mồi JB3, JB4.5) và các mảnh cắt giới hạn bằng enzyme RsaI của một số mẫu SLGL thu từ bò tại Vĩnh Phúc 79

Hình 3.7 Kết quả cắt giới hạn sản phẩm PCR (với mồi JB3, JB4.5) bằng enzyme RsaI và AluI của 4 mẫu SLGL thu từ bò tại Tây Ninh 80

Hình 3.8 Cây phả hệ xác định mối quan hệ về loài giữa các chủng Fasciola spp dựa trên trình tự đoạn gen cox1 (447 bp), xây dựng bằng chương trình MEGA6.06, sử dụng phương pháp kết nối liền kề NJ (Neighbor-joining) với hệ số tin cậy bootstrap là 1.000 lần lặp lại 82

Hình 3.9 Ảnh điện di kết quả nhân đoạn gen nad1 một số mẫu SLGL ở Việt Nam bằng cặp mồi Ita10, Ita2 83

Hình 3.10 Cây phả hệ xác định mối quan hệ về loài giữa các chủng Fasciola spp dựa trên trình tự đoạn gen nad1 (535 bp), xây dựng bằng chương trình

MEGA6.06, sử dụng phương pháp kết nối liền kề NJ (Neighbor-joining) với

hệ số tin cậy bootstrap là 1.000 lần lặp lại 85Hình 3.11 Sản phẩm PCR với cặp mồi ITS1-F, ITS1-R các mẫu SLGL thu thập ở bò tại Quảng Nam và Đắk Lắk 86

Hình 3.12 Cây phả hệ xác định mối quan hệ về loài giữa các chủng Fasciola

spp dựa trên trình tự đoạn giao gen ITS1 (432 bp), xây dựng bằng chương trình MEGA6.06, sử dụng phương pháp kết nối liền kề NJ (Neighbor-joining) với hệ số tin cậy bootstrap là 1.000 lần lặp lại 90

Hình 3.13 Sản phẩm PCR với cặp mồi ITS2-F và ITS2-R của Fasciola spp

thu thập từ bò tại Vĩnh Phúc và Nghệ An 91

Hình 3.14 Cây phả hệ xác định mối quan hệ về loài giữa các chủng Fasciola

spp dựa trên trình tự đoạn giao gen ITS2 (360 bp), xây dựng bằng chương trình MEGA6.06, sử dụng phương pháp kết nối liền kề NJ (Neighbor-joining) với hệ số tin cậy bootstrap là 1.000 lần lặp lại 93Hình 3.15 Trình tự đoạn gen ITS-2 không hoàn thiện của mẫu SLGL 94

Hình 3.16 Minh họa 1 số vị trí có sai khác nucleotide đoạn gen cox1 của 17

mẫu SLGL ở Việt Nam so với SLGL trên thế giới 99Hình 3.17 Minh họa một số vị trí có sai khác acid amin dựa trên cơ sở đoạn

gen cox1 của SLGL Việt Nam với thế giới 100 Hình 3.18 Minh họa sự tương đồng nucleotide đoạn gen nad1 của SLGL Việt

Nam và SLGL đã được công bố 102

Hình 3.19 So sánh sự tương đồng acid amin dựa trên đoạn gen nad1 của

SLGL ở Việt Nam và thế giới 103Hình 3.20 Minh họa các vị trị có sai khác nucleotide trên đoạn giao gen ITS2 của SLGL ở Việt Nam so với SLGL thế giới 109

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh do sán lá gan lớn (SLGL) rất phổ biến ở động vật nhai lại như trâu,

bò, dê, cừu… do Fasciola hepatica (Linnaeus, 1758) và Fasciola gigantica (Cobbold, 1885) gây ra [5], [70] Fasciola hepatica và Fasciola gigantica có phân bố khác nhau, F hepatica phân bố trên khắp thế giới nhưng chủ yếu ở

các khu vực có khí hậu ôn đới như Châu Âu, Châu Mỹ và Châu Úc, trong

khi F gigantica lại phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới như ở Châu Phi và

Châu Á Cả hai loài cùng xuất hiện ở khu vực khí hậu cận nhiệt đới [102], [104] Người là vật chủ tình cờ, nhiễm SLGL do ăn rau sống hoặc uống nước lã

có nang ấu trùng còn sống Bệnh do SLGL ở người được xem là một bệnh nhiệt đới bị lãng quên Tuy nhiên gần đây bệnh có xu hướng tăng trở lại [47] Tại một

số khu vực trên thế giới, nhiễm SLGL ở người có tỷ lệ rất cao và là vấn đề y tế rất được quan tâm [108], [109] Trong 25 năm qua, toàn thế giới có khoảng 17 triệu người mắc bệnh và 180 triệu người sống trong vùng nguy cơ nhiễm SLGL [69], [104], [110] Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), ít nhất 2,4 triệu người tại hơn 70 quốc gia bị ảnh hưởng bởi bệnh do SLGL [55], [144]

Fasciola spp có cấu tạo lưỡng giới, bình thường chúng sinh sản bằng

cách tự giao phối [85], nhưng chúng cũng có thể giao phối chéo và một số trường hợp sinh sản vô tính [69], [55] Hai loài SLGL có thể được phân biệt dựa

vào hình thái ngoài, F gigantica có hình dạng thon, dài còn F hepatica ngắn và rộng [33], [141] Một số chỉ số hình thái có sự khác biệt giữa F hepatica và F

gigantica nên cũng được sử dụng để phân biệt 2 loài SLGL như khoảng cách từ

giác bụng đến cuối thân, chu vi cơ thể và tỷ số chiều dài/chiều rộng [60], [119], [120] Tuy nhiên, kích thước và hình dạng của SLGL rất thay đổi, phụ thuộc vào tuổi của sán, vật chủ ký sinh, số lượng sán nhiễm và tình trạng dinh dưỡng của vật chủ, thể nhị bội, tam bội hay hỗn hợp… [9], [68], [70], [122] Vì vậy, chỉ

dựa vào hình thái rất khó có thể phân biệt và xác định SLGL là F hepatica hay

F gigantica [9], [38], [70], [104] Dạng trung gian với hình thái và kiểu gen hỗn

hợp giữa 2 loài đã được thông báo ở nhiều quốc gia trên thế giới, trong đó có Việt Nam [55], [89], [96], [100] Dạng này bị rối loạn khả năng phân bào, chúng không có hoặc có rất ít tinh trùng trong túi tinh nên sinh sản theo kiểu vô tính Chúng có những bất thường về hình thái và phân tử theo kiểu trung gian của 2

loài nên rất khó phân loại là F hepatica hay F gigantica [63], [135]

Do những hạn chế của phương pháp hình thái học, các kỹ thuật sinh học phân tử khác nhau đã được phát triển để xác định và phân biệt các loài SLGL [2], [16], [50] Sinh học phân tử không những xác định được dạng trung gian hay hiện tượng lai mà còn cho phép xác định các đặc điểm phân tử, di truyền của SLGL, trong khi điều này khó thực hiện bởi phương pháp hình thái [50]

Một số chỉ thị phân tử thường được sử dụng là cox1, nad1 thuộc hệ gen ty thể

và các đoạn giao gen ITS1, ITS2 thuộc hệ gen nhân [3], [50], [77]…

Ở Việt Nam, trước đây một số tác giả cho rằng có cả F hepatica và F

gigantica [44], [45] Tuy nhiên, các nghiên cứu gần đây với sự hỗ trợ của

sinh học phân tử lại cho rằng SLGL ở Việt Nam là F gigantica hoặc dạng trung gian Fasciola sp [11], [38], [46], [116] Mặt khác, những năm gần đây

việc nhập khẩu gia súc trong ngành nông nghiệp rất có thể đã gián tiếp đưa SLGL từ nước ngoài vào làm phát sinh những điểm mới về thành phần loài và

di truyền trong quần thể SLGL tại Việt Nam Điều này đặt ra câu hỏi: hiện tại Việt Nam có mặt những loài SLGL nào, đặc điểm phân tử của chúng ra sao? Những câu hỏi trên đã đặt ra yêu cầu cần phải có một nghiên cứu quy mô để xác định loài và đặc điểm phân tử nhằm cung cấp các dữ liệu góp phần phòng chống hiệu quả bệnh do SLGL gây ra cho người và động vật tại Việt Nam Đề

tài “Xác định thành ph n loài và một số đ c đi m sinh h c phân tử của sán

lá gan lớn t i Việt Nam” được thực hiện nhằm các mục tiêu:

1 Xác định một số chỉ số hình thái và phân loại sán lá gan lớn tại Việt Nam bằng phương pháp hình thái học

2 Xác định thành phần loài và phân tích một số đặc điểm sinh học phân tử của sán lá gan lớn ở Việt Nam

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sán lá gan lớn Fasciola spp và bệnh do sán lá gan lớn (Fasciolosis) 1.1.1 Đặc điểm sinh học của Fasciola spp

Phân loại sinh học [70], [104], [111]

Theo một số tác giả, phân loại của sán lá gan lớn trong sinh giới như sau:

Fasciola gigantica Cobbold, 1885

Các loài sán lá gan lớn

Đến thời điểm hiện tại, giống Fasciola ghi nhận có 4 loài, gồm: F

hepatica (Linnaeus, 1758), F gigantica (Cobbold, 1855), F nyanzae (Leiper,

1910) và F jacksoni (Cobbold, 1869) [104] Trong đó F hepatica và F

gigantica là hai loài gây bệnh chủ yếu ở người và động vật [107]

F hepatica: thường được tìm thấy ở đường dẫn mật và túi mật của các

động vật nhai lại như dê, cừu, trâu, bò Tuy nhiên, loài này cũng có thể được tìm thấy ký sinh ở các vật nuôi khác như ngựa, lừa, la, lạc đà và lợn Chúng cũng có thể được phát hiện ký sinh ở các động vật hoang dã như hươu, các loài động vật có túi, thỏ, chuột [104] Loài này phân bố rộng rãi trên khắp thế giới, nhất là các khu vực có khí hậu hàn đới và cận nhiệt đới [104], [107]

F gigantica: đây là ký sinh trùng phổ biến của đường dẫn mật các

động vật nuôi và động vật hoang dã Loài này gặp chủ yếu ở khu vực có khí hậu ôn đới và nhiệt đới như Châu Á và Châu Phi [104], [107]

Đặc điểm hình thái của sán lá gan lớn

Hình 1.1 Hình thể SLGL trưởng thành và trứng [141]

(a: SLGL trưởng thành F hepatica; b: SLGL trường thành F gigantica;

c: trứng của F hepatica; d: trứng của F gigantica)

Hình thể sán trưởng thành

Con trưởng thành của F hepatica có dạng hình lá, dẹt (Hình 1.1a), hình

dạng đặc trưng cho các loài sán lá Kích thước chiều dài từ 20 đến 30 mm và

8 – 15 cm chiều rộng Cơ thể của nó kéo dài về phía trước sau, phía đầu có dạng hình nón, trên đó có giác miệng, phần giữa ngay chỗ eo giữa phần đầu

và thân có giác bụng Kích thước của giác bụng và giác miệng xấp xỉ như nhau Ruột của con trưởng thành chia nhiều nhánh với các túi thừa chạy dọc

từ trước ra sau Hai tinh hoàn cũng phân nhánh và nằm ở nửa sau cơ thể Các buồng trứng tương đối nhỏ gọn nằm ngay phía trên tinh hoàn và được đổ vào

tử cung Tử cung đổ vào lỗ sinh dục nằm ngay sau giác bụng Hình thể của F

gigantica khá giống với F hepatica, tuy nhiên kích thước có khác nhau, chiều

dài tối đa có thể lên tới 75 mm chiều rộng tối đa 12 mm (Hình 1.1b) Ở F

gigantica, tỷ lệ phần đầu hình nón nhỏ hơn ở F hepatica và phần cơ thể của

nó hình dạng giống chiếc lá hơn [104] Ngoài ra, hình thái ngoài thường thấy

F gigantica thon và dài, trong khi F hepatica thường ngắn và rộng [33],

[100] Gần đây, hình thái trứng và sán trưởng thành của dạng trung gian đã

được được mô tả có nhiều điểm giống với cả F gigantica và F hepatica [104] Vài nghiên cứu còn cho thấy, SLGL có hình thái rất thay đổi khi ký

sinh ở các vật chủ khác nhau [68], [122], [141]

Hình thể trứng

Trứng sán F hepatica thường có kích thước 150 x 90 μm và hình dạng cũng rất giống với trứng của F gigantica Có thể thấy các trứng của F gigantica với kích thước lớn hơn (200 x 100 μm) Trứng của Fasciola cần phân biệt với trứng của các sán lá khác, đặc biệt với trứng của sán Paramphistome Trứng

SLGL có vỏ màu vàng nâu với một nắp không rõ ràng và các tế bào phôi nằm

bên trong Trong khi đó Paramphistome vỏ có màu trong suốt, nắp rõ ràng và

các tế bào phôi sáng màu bên trong trứng và một gai nhỏ nằm phía sau [104]

Vòng đời sinh học

Vòng đời của sán lá gan lớn rất đặc biệt trong lớp sán lá Chúng chỉ có

1 vật chủ phụ là ốc, sau đó hình thành nang ở thực vật thủy sinh trước khi

nhiễm vào vật chủ theo con đường ăn uống Trong khi đó, hầu hết các loại sán

lá khác vòng đời qua 2 vật chủ phụ trước khi xâm nhập vào vật chủ chính [32] Vòng đời của SLGL được mô tả chi tiết như dưới đây:

Sán lá gan lớn trưởng thành đẻ trứng ở đường dẫn mật của vật chủ, trứng theo dịch mật vào đường tiêu hóa Sau đó trứng theo phân rời khỏi cơ thể vật chủ ra ngoài môi trường Ngay sau khi ra ngoài môi trường trứng vẫn chưa có phôi, trứng mất khoảng chừng 2 tuần để phát triển thành trứng chín (trứng có ấu trùng lông bên trong), sau đó ấu trùng lông (miracidium) thoát vỏ

di chuyển ngoài môi trường và bơi lội trong nước Ở điều kiện thuận lợi, ấu trùng lông có thể bơi với vận tốc 1 mm/s Đặc điểm bơi lội giúp cho ấu trùng lông có thể tìm và xâm nhập vào vật chủ phụ (vật chủ trung gian) là ốc thuộc

giống Lymnae Ấu trùng lông sau khi ra môi trường rất nhanh chóng tìm một

vật chủ thích hợp để xâm nhập, những ấu trùng lông không tìm được vật chủ

sẽ chết trong vòng 24 giờ [104] Trong khoảng pH môi trường từ 6 - 8, hiện chưa có bằng chứng nào cho thấy sự khác biệt tỷ lệ chết của ấu trùng lông Sau khi xâm nhập vào ốc, ấu trùng mất lông và trở thành bào nang (sporocyst) Bào nang phân chia và phát triển thành redia (giai đoạn này nó bắt đầu hình thành giác và ruột nguyên thủy) Redia tiếp tục phát triển thành

ấu trùng đuôi (cercaria) Các ấu trùng đuôi của sán lá gan lớn Fasciola spp có

chiều dài cơ thể vào khoảng 0,25 đến 0,35 mm với một đuôi dài, mảnh, không chia nhánh, kích thước khoảng 0,5 mm Nhìn chung, 4 - 7 tuần sau khi nhiễm,

cư trú và phát triển trong cơ thể ốc ấu trùng đuôi sẽ rời khỏi ốc ra ngoài môi trường Trong thời gian ở ngoài môi trường, ấu trùng đuôi cần có điều kiện

độ ẩm và nhiệt độ thích hợp, nhiệt độ tới hạn là 10oC Khi mới rời khỏi ốc,

ấu trùng đuôi bám vào lá cỏ hoặc là các loài rau ngập nước khác giống như cải xoong Sau đó ấu trùng rụng đuôi tạo thành nang ấu trùng (metacercaria) với 4 lớp bao bọc Các lớp bao bọc này được hình thành từ

các chất tiết của các tuyến nang nằm bên trong cơ thể ấu trùng đuôi Lớp

vỏ ngoài hoạt động như một hàng rào chống lại sự xâm nhập của vi khuẩn

và vi nấm Việc hình thành vỏ nang có thể mất đến 2 ngày Các nang ấu trùng có sức chịu đựng cao và là dạng lây nhiễm cho các vật chủ cuối cùng của sán lá gan lớn Nói chung, các nang ấu trùng được lây nhiễm cho các động vật nhai lại giống như trâu, bò và cừu; nhưng cũng có thể lây cho các động vật có vú khác bao gồm cả con người Một ấu trùng lông được tạo ra

từ trứng sán có thể tạo ra 4.000 nang ấu trùng do quá trình phân chia ở các giai đoạn bào nang và redia Nang ấu trùng chỉ tồn tại khi nhiệt độ và độ

ẩm thuận lợi, trong điều kiện khô ráo chúng không thể sống sót nhưng trong khi độ ẩm cao và nhiệt độ thích hợp nang ấu trùng có thể sống sót đến 1 năm [58]

Hình 1.2 Vòng đời sinh học của sán lá gan lớn [33]

Các nang ấu trùng (metacercaria) nằm trong thực vật thủy sinh được động vật ăn cỏ và người ăn vào Khi đến ruột chúng xuyên qua ruột non, đi vào khoang phúc mạc Từ đó, nó di chuyển trực tiếp đến gan Quá trình di chuyển từ đường tiêu hóa đến gan mất khoảng 7 ngày Trong gan, chúng chưa trưởng thành ngay mà chui vào nhu mô gan và tiếp tục di chuyển sâu vào trong gan Ở trong gan, chất dinh dưỡng chủ yếu của SLGL là máu Giai đoạn này thời gian khoảng sáu tuần Sau giai đoạn này, sán lá gan lớn xâm nhập vào ống dẫn mật và phát triển thành con trưởng thành tại đây Thời gian kể từ khi nhiễm vào cơ thể vật chủ đến khi hoàn toàn trưởng thành mất khoảng 3 tháng Sán lá gan lớn sau khi trưởng thành bắt đầu đẻ trứng và trứng lại tiếp tục thực hiện vòng đời tiếp theo Con trưởng thành có thể sống sót trong nhiều năm ở trong gan của vật chủ Bằng chứng là năm 1952 những mẫu sán 11 năm tuổi đã được tìm thấy trong cừu Trung bình một ngày một con sán trưởng thành đẻ từ 20.000 đến 50.000 trứng Cần lưu ý rằng, một lượng lớn trứng có thể thu được từ vật chủ nhiễm đơn độc một con sán trưởng thành

Các yếu tố ảnh hưởng tới vòng đời phát triển của sán lá gan lớn

Ở điều kiện thuận lợi, thời gian để SLGL hoàn thành vòng đời dao động từ 14 đến 21 tuần Thời gian hoàn thành vòng đời của SLGL phụ thuộc nhiều yếu tố, liên quan đến sự phát triển của các giai đoạn ở ngoài môi trường

và trong vật chủ trung gian là ốc Trong điều kiện khí hậu thích hợp (15 -

25oC) ấu trùng lông cần 9 - 21 ngày để phát triển và thoát vỏ Tuy nhiên, khi điều kiện không thuận lợi, thời gian này có thể lên tới vài tháng Đối với giai đoạn phát triển trong ốc, ở điều kiện 20 - 25o

C, thời gian từ khi xâm nhập vào

ốc tới khi hình thành ấu trùng đuôi là 6 - 7 tuần Nhiệt độ thấp hơn, thời gian này sẽ kéo dài ra Một ví dụ là, ở 15 °C thời gian hình thành ấu trùng đuôi từ khi ấu trùng lông xâm nhập vào ốc là 56 - 86 ngày, trong khi ở 25 °C thời gian này chỉ 38 ngày [141] Khi rời khỏi ốc, ấu trùng đuôi bơi lội tìm tới các

cây thực vật thủy sinh để tạo thành kén Nhiệt độ của nước từ 9 - 26o

C thích hợp cho ấu trùng đuôi bơi lội Quá trình chuyển động của ấu trùng đuôi còn phụ thuộc vào điều kiện ánh sáng Trung bình, ấu trùng đuôi có thể bơi lội trong thời gian 1 giờ cho tới khi tìm được thực vật thủy sinh để bám vào Khi bám vào cây thực vật thủy sinh, chúng nhanh chóng đứt đuôi và tạo thành kén trong 24 giờ [104], [141]

Vật chủ trung gian của sán lá gan lớn

Sự phát triển của các giai đoạn ấu trùng của SLGL phụ thuộc rất nhiều vàọ điều kiện môi trường khi chúng ở tự do ngoài ngoại cảnh hay trong vật chủ trung gian Một mặt, bản thân đời sống của vật chủ trung gian (ốc nước ngọt) của SLGL cũng phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện môi trường Đó chính

là lý do vì sao bệnh do SLGL bị tác động bởi các điều kiện khí hậu [141]

Trung gian truyền bệnh SLGL được xác định là các loài ốc thuộc họ

Lymnaeidae Tuy nhiên, không phải loài ốc Lymnaeidae nào cũng là vật chủ

trung gian của SLGL Có loài Lymnaeidae không phải là vật chủ trung gian của SLGL, có loài chỉ là vật chủ trung gian của F gigantica hoặc F hepatica và

một số ít loài là vật chủ trung gian của cả 2 loài SLGL [141] Tuy nhiên, những

nghiên cứu bằng công cụ sinh học phân tử gần đây trên ốc Lymnaeidae đã chỉ

ra rằng có những điểm chưa chính xác trong phân loại các loài ốc thuộc họ này Thêm vào đó, sự xuất hiện của SLGL dạng trung gian ở nhiều nơi cho thấy việc xác định loài ốc trung gian truyền SLGL cần được đánh giá lại [104]

Do phân bố địa lý của 2 loài SLGL F gigantica và F hepatica có khác

nhau nên các loài ốc trung gian truyền bệnh SLGL cũng có những điểm khác

nhau F hepatica phân bổ chủ yếu Châu Âu, Châu Mỹ và Châu Úc, nơi mà loài ốc Galba truncatula được xác định là vật chủ trung gian quan trọng F

gigantica phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, nơi các loài ốc Lymnaea spp như L natalensis và L rubiginosa là các vật chủ trung gian chủ

yếu Một số loài ốc (Radix peragra, L natalensis, Galba truncatula…) là vật chủ trung gian thích hợp của cả 2 loài F gigantica và F hepatica Sự phân bố

của các loài ốc là vật chủ trung gian hoàn toàn phù hợp với sự phân bố của SLGL [104], [140]

Hình 1.3 Ba loài ốc Lymnaea spp tìm thấy ở Việt Nam [17]

(a L viridis; b L swinhoei; c Lymnaea sp.)

Ở Việt Nam, các loài ốc nước ngọt thuộc họ Lymnaeidae như Lymaea

viridis, Lymaea swinhoei, Gyranlus sinensis, Polypilis heamisphierulae…đã

được một số tác giả thông báo là vật chủ trung gian của SLGL [37], Trong

đó 2 loài ốc nước ngọt L viridis và L swinhoei được xác định là vật chủ trung gian chủ yếu của Fasciola spp tại Việt Nam [18], [129] Mới đây, một số

nghiên cứu đã thông báo những dẫn liệu mới về vật chủ trung gian của SLGL

tại Việt Nam Theo đó, một loài ốc mới thuộc giống Lymnaea (Lymnaea sp.) khác với L viridis và L swinhoei đã được phát hiện Tuy nhiên, chưa nghi nhận ở loài ốc mới này nhiễm ấu trùng SLGL [17], [36]

Quá trình sinh sản, vấn đề lai và chuyển gen ở sán lá gan lớn

Hầu hết các loài sán trong lớp sán lá có cấu tạo lưỡng tính với khả năng

tự giao phối Tuy nhiên, hiện tượng giao phối chéo cũng gặp khá phổ biến Một số trường hợp sán lá sinh sản theo kiểu đơn giới cũng được thông báo

[141] Theo K Cwilinski và CS (2016), ở Fasciola có thể thấy cả 3 hình thức

sinh sản: tự giao phối, giao phối chéo và sinh sản vô tính [69] Said Amer và

CS (2016) và nhiều tác giả gần đây cũng có cùng ý kiến này [55] Bằng chứng

rõ nhất về sự tồn tại các kiểu sinh sản khác nhau ở Fasciola là vào năm 2011,

Itagakia T và CS đã thực nghiệm giao phối chéo thành công giữa F hepatica

và F gigantica Theo tác giả này, các cá thể thuộc các thế hệ F1 và F2 có những đặc điểm giống với cả 2 loài F hepatica và F gigantica cha mẹ Các

cả thể thế hệ F1 và F2 kết quả sau khi giáo phối chéo giữa F hepatica và F

gigantica sinh sản không giống thế hệ bố mẹ, chúng không có khả năng tự

giao phối hay giao phối chéo mà chúng sinh sản đơn giới [89] Ngoài ra, một

số tác giả đã chứng minh rằng, Fasciola với bộ gen dạng tam bội và hỗn hợp,

được ghi nhận ở nhiều quốc gia khu vực Châu Á như Trung Quốc, Nhật Bản, Việt Nam và Hàn Quốc, không có tinh trùng Chúng sinh sản đơn giới để tiếp tục vòng đời [63], [69], [86]

Ở một số quốc gia như Nhật Bản, Việt Nam, Hàn Quốc và Iran, các phân tích phân tử trên hệ gen ty thể và hệ gen nhân đã tìm ra dạng trung gian với các cá thể lai hoặc các các thể mang kiểu gen pha trộn của 2 loài (còn gọi

là các cá thể chuyển gen) [69], [146] Trên các cá thể lai, DNA nhân của một loài nhưng DNA ty thể của loài khác [55], [69], [143] Trong khi đó, các cá thể chuyển gen có gen nhân mang đặc điểm của cả 2 loài [55], [69] Các cá thể dạng trung gian (lai hoặc chuyển gen) có thể sẽ đóng vai trò trong tính đa hình di truyền của các quần thể SLGL [69], [94] Các cá thể lai cũng đã được ghi nhận gây bệnh ở cả người và động vật ở nhiều nơi [69]

1.1.2 Đặc điểm của bệnh do Fasciola spp

Bệnh do SLGL ở người là một trong số những bệnh bị lãng quên trong nhiều thập niên Nhưng trước xu hướng bệnh ngày càng gia tăng ở nhiều khu vực trên thế giới khiến bệnh được quan tâm trở lại Các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng, bệnh cảnh lâm sàng, đặc điểm dịch tễ, phương thức lây truyền

bệnh do SLGL rất khác nhau ở các khu vực địa lý khác nhau [104], [141]

1.1.2.1 Đặc điểm lâm sàng

Con người không phải là vật chủ tự nhiên mà chỉ là vật chủ tình cờ của SLGL Các triệu chứng lâm sàng thường xuất hiện sau khi bị nhiễm ấu trùng sán

2 tuần và phụ thuộc vào số lượng sán lá gan lớn ký sinh [105], [108]

Hậu quả SLGL gây ra cho người rất khác nhau Khi nang ấu trùng (metacercaria) xuyên qua thành ruột hoặc tá tràng gây xuất huyết và viêm, giai đoạn này các tổn thương có thể gây triệu chứng không rõ rệt Quá trình

ký sinh ở gan SLGL gây tiêu hủy tổ chức gan lan rộng, gây chảy máu và phản ứng viêm, phản ứng miễn dịch Sán có thể vào đường mật và ở đây chúng có thể sống vài năm gây viêm nhiễm dẫn tới xơ hoá, dầy lên và giãn rộng, có thể chảy máu đường mật [1], [5], [70], [109]

Đặc biệt sán lá gan lớn có quá trình di chuyển lạc vị trí nên có thể gây bệnh ở các cơ quan ngoài gan Ở người, vị trí tổn thương ngoài gan thường gặp nhất là đường tiêu hóa [70] Các vị trí lạc chỗ khác được thông báo là: mô dưới da, tim, mạch máu, phổi và khoang màng phổi, não, hốc mắt, thành bụng, ruột thừa, tuyến tụy, lách, u ở vùng háng; u vùng cổ, cơ xương, mào tinh hoàn [5], [6], [15], [21], [54], [70] Ở các vị trí lạc chỗ sán lá gan lớn không bao giờ phát triển thành con trưởng thành [34], [70] Các biểu hiện thông thường của tổn thương ngoài gan là do dấu vết di cư gây tổn thương mô dẫn tới viêm và xơ hóa Ở các vị trí ký sinh trùng ngoài gan, SLGL có thể bị vôi hóa hoặc tạo thành dạng u hạt [70] Nhìn chung bệnh ngoài gan do SLGL

hiếm gặp và khó chẩn đoán Bệnh thường được chẩn đoán tình cờ (trong khi phẫu thuật) hoặc khi SLGL có lối thoát để bò ra [1], [15], [70]

Bệnh gây ra bởi sán lá gan lớn được chia ra làm các thời kỳ: thời kỳ ủ bệnh (từ khi nang ấu trùng xâm nhập vào cơ thể đến khi xuất hiện triệu chứng lâm sàng đầu tiên); thời kỳ toàn phát (sán lá gan di chuyển vào đường mật); thời kỳ bệnh tiềm tàng (sán trưởng thành và bắt đầu đẻ trứng); và thời kỳ tắc nghẽn hay mạn tính [108]

Thời kỳ ủ bệnh: triệu chứng của thời kỳ ủ bệnh rất thay đổi phụ thuộc

vào số lượng ấu trùng xâm nhập và sự đáp ứng của cơ thể vật chủ Ở người, triệu chứng thời kỳ này thường không rõ ràng và thời kỳ này kéo dài khó xác định nhưng cũng đã được thông báo Thời kỳ này có thể là vài ngày, 6 tuần, 2

- 3 tháng hoặc có khi dài hơn [104], [108]

Thời kỳ toàn phát

Giai đoạn này kéo dài 2 – 4 tháng Các triệu chứng hình thành từ quá trình phá hủy tổ chức gan và phúc mạc từ sự di chuyển của ấu trùng, độc tố và hoạt động của các chất gây dị ứng Tại các vùng khu trú nhiễm sán lá gan, các triệu chứng thường trùng lặp với các bệnh mạn tính hoặc cấp tính trên nền mạn tính Vì vậy, giai đoạn cấp tính có kéo dài và gối vào giai đoạn tiềm tàng

Các triệu chứng cơ năng xuất hiện chủ yếu trong giai đoạn này là: sốt, đau bụng vùng hạ sườn phải, rối loạn tiêu hóa, nổi mề đay, gan lách to… Một

số triệu chứng hiếm gặp như các biểu hiện ở phổi như ho, ho ra máu, đau ngực, viêm phổi; cổ trướng, thiếu máu, vàng da… [5], [104], [141] Ngoài ra, các triệu chứng còn biểu hiện ở tổ chức nơi sán ký sinh lạc chỗ như khớp [15], vú [104], [108], [110], thành bụng [15], [43] hoặc các cơ quan khác [105] Trong trường hợp này, bệnh do SLGL rất khó chẩn đoán và thường được phát hiện tình cờ khi phẫu thuật hoặc các can thiệp chẩn đoán [1], [20], [41]

Thời kỳ bệnh tiềm tàng

Giai đoạn này có thể kéo dài nhiều tháng hoặc nhiều năm Tỷ lệ đối tượng không triệu chứng trong giai đoạn này là không rõ Giai đoạn này thường được phát hiện trong quá trình sàng lọc ở cộng đồng sau khi một thành viên được chẩn đoán nhiễm bệnh Tỷ lệ bạch cầu ái toan tăng cao có thể là dấu hiệu gợi ý nhiễm bệnh Những người này có thể có những than phiền về đường tiêu hóa hoặc một hay nhiều các triệu chứng cấp tính tái phát [104], [108], [110]

Thời kỳ mạn tính

Trong giai đoạn này, đau vùng thượng vị, không dung nạp thức ăn béo, buồn nôn, vàng da, ngứa, đau góc trên bên phải bụng… là những dấu hiệu lâm sàng rất khó phân biệt với viêm đường mật, viêm túi mật và bệnh sỏi mật

do các nguyên nhân khác Gan có thể to ra và làm cho lách to ra hoặc cổ trướng [104], [108], [110] Trong giai đoạn này ống mật có thể căng và dày lên; đường kính ống mật có thể tăng 1,5-3,0 lần kích thước bình thường Ống mật chủ là vị trí tổn thương gặp thường xuyên nhất [104], [108], [110], [112]

Xét nghiệm chức năng gan: các kết quả bất thường có thể được tìm ra

khi kiểm tra chức năng gan là GOT, GPT, globulin và bilirubin tăng nhẹ trong hầu hết các trường hợp [5], [6]

Chẩn đoán hình ảnh: siêu âm có hình ảnh tổn thương gan là những ổ

âm hỗn hợp hình tổ ong hoặc hình ảnh tụ dịch dưới bao gan [5], [6]

Xét nghiệm miễn dịch: bằng phương pháp ELISA cho kết quả dương

tính, đặc biệt trong giai đoạn cấp tính [5], [6]

Xét nghiệm phân tìm trứng: đây là tiêu chuẩn vàng nhưng tỷ lệ tìm

thấy trứng trong phân rất thấp [14], có khi chỉ dưới 1% [82]

1.2 Một số yếu tố tác động và tỷ lệ nhiễm SLGL ở người và động vật

Trong vài năm gần đây, số lượng các báo cáo về bệnh SLGL ở người vẫn tiếp tục gia tăng ở nhiều nước của cả 5 châu lục Nhiều khu vực nóng về bệnh SLGL ở người đã được xác định, đánh giá, và gần đây các kết quả nghiên cứu về sinh bệnh học và đáp ứng miễn dịch đã cho phép thực hiện các can thiệp ở người nhiễm bệnh dựa trên bằng chứng khoa học Năm 2013, bệnh do SLGL được Tổ chức Y tế thế giới xếp vào nhóm ưu tiêu trong số các bệnh lây truyền qua đường ăn uống [107]

1.2.1 Một số yếu tố tác động tới nhiễm sán lá gan lớn ở người và động vật

Tác động của yếu tố thời tiết, khí hậu

Yếu tố khí hậu là vấn đề ảnh hướng có tính quyết định đến sự lây truyền bệnh do sán lá gan lớn, nhất là các yếu tố nhiệt độ, độ ẩm và lượng mưa Các yếu tố này tác động trực tiếp tới ký sinh trùng ở giai đoạn phát triển

tự do ngoài môi trường hoặc gián tiếp thông qua sự phát triển của ốc - vật chủ trung gian của SLGL [107], [141] Những thay đổi khác nhau về nhiệt độ, lượng mưa theo mùa làm cho bệnh SLGL có sự khác nhau giữa các mùa hoặc giữa các khu vực Ví dụ: tại Châu Âu, bệnh SLGL ở người và động vật

thường xuất hiện vào mùa xuân hoặc mùa thu, thời điểm các ốc Lymnaea spp

phát triển thuận lợi Tuy nhiên, cũng có những nơi như Bolivia, bệnh do

SLGL diễn biến trong suốt cả năm do ốc Lymnaea spp ở quốc gia này có điều

kiện phù hợp để phát triển quanh năm [107]

Ở Việt Nam, nghiên cứu của Sam N.T và CS (2012) về tình trạng nhiễm SLGL ở trâu bò ở khu vực Miền Trung cho thấy, tỷ lệ nhiễm SLGL ở trâu bò vào mùa mưa cao hơn ở mùa khô (50,8 % so với 38,1 %) [129] Một nghiên cứu khác trên trâu bò tại Thái Nguyên cũng cho thấy tỷ lệ nhiễm SLGL phụ thuộc theo mùa Cụ thể, tỷ lệ nhiễm SLGL ở trâu bò tại Thái

Nguyên vào mùa Hè và mùa Thu cao hơn mùa Đông và mùa Xuân (Nghiên

cứu chưa được công bố)

Ốc trung gian truyền bệnh

Như trên đã trình bày, vòng đời của SLGL phụ thuộc rất nhiều vào các điều kiện môi trường Để hoàn thiện vòng đời, SLGL phải có giai đoạn phát triển ở ốc trung gian Vì vậy, bệnh do SLGL không những chỉ phụ thuộc vào điều kiện khí hậu mà còn phụ thuộc vào sự phát triển của ốc trung gian Tại

một số quốc gia Nam Mỹ, tỷ lệ nhiễm F hepatica liên quan với tình trạng xâm nhập, phát triển của ốc Galba truncatula trong suốt cả năm Ở khu vực

đảo Caribe, bệnh do SLGL ở người đã giảm nhưng có xu hướng tăng trở lại cùng với sự phát triển của các loài ốc là trung gian truyền bệnh [104], [105]

Ở Việt Nam, bệnh do SLGL ở người có nhiều điểm khác biệt và mang những đặc điểm khá đặc thù Bệnh có nhiều điểm giống ở các quốc gia láng giềng thuốc khu vực Đông Nam Á nhưng vẫn còn nhiều điểm cần làm sáng

tỏ Những thông tin ban đầu cho thấy, bệnh thường gặp ở người sống ở các

khu vực trũng, nơi phân bố của F gigantica và các loài ốc trung gian truyền

bệnh có điều kiện thuận lợi để phát triển [104]

1.2.2 Tình hình nhiễm sán lá gan lớn ở người và động vật

1.2.2.1 Trên thế giới

Nhiễm SLGL ở người

Cho tới nay, một số loài thuộc giống Fasciola đã được mô tả nhưng chỉ 2 loài F hepatica và F.gigantica được xác định là gây bệnh cho cả người

và động vật [110] Những nghiên cứu trong vài năm gần đây cho thấy bệnh

do SLGL ở người là vấn đề sức khỏe cộng đồng quan trọng ở nhiều quốc gia trên thế giới thuộc châu Âu, Mỹ, Châu Á, Châu Phi và Châu Đại Dương [72], [118] Bệnh phân bố chủ yếu ở các quốc gia có tỷ lệ chăn nuôi cừu và

gia súc (động vật nhai lại) cao Loài F hepatica phân bổ chủ yếu Châu Âu, Châu Mỹ và Châu Úc, nơi mà loài ốc Galba truncatula được xác định là vật chủ trung gian quan trọng F gigantica phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, nơi các loài ốc Lymnaea spp như L natalensis và L

rubiginosa là vật chủ trung gian chủ yếu Một số loài ốc (Radix peragra, L natalensis, Galba truncatuna…) là vật chủ trung gian thích hợp của cả F gigantica và F hepatica [105] Sự phân bố của các loài ốc là vật chủ trung

gian hoàn toàn phù hợp với sự phân bố của SLGL [104], [140]

Theo thống kê của Mas-Coma S và CS (2004), trên toàn thế giới có

khoảng 2.4 đến 17 triệu người có nguy cơ nhiễm SLGL, tập trung chủ yếu ở ở các nước Châu Á và Châu Phi [62], [104], [141] Số lượng các trường hợp mắc bệnh SLGL ở người ngày càng tăng tại 51 quốc gia của năm lục địa

[104], [108], [109] Theo một báo cáo năm 1998, số ca bệnh nhiễm SLGL ở

người là 7071, trong đó 3267 trường hợp ở Châu Mỹ, 2951 ở Châu Âu, 487

ở Châu Phi, 354 ở Châu Á và 12 trường hợp ở Châu Đại Dương [48], [109] Một phân tích toàn cầu cho thấy, bệnh do SLGL chỉ xuất hiện ở những vùng có mối liên hệ giữa bệnh ở động vật với bệnh ở người và vật chủ trung gian có các điều kiện thuận lợi để phát triển Một số nghiên cứu cho rằng, sự lưu hành bệnh do SLGL ở người không liên quan với bệnh do SLGL ở động vật Ví dụ, ở Nam Mỹ, những vùng lưu hành cao (hyperendemic) và lưu hành vừa (mesoendemic) được tìm thấy ở Bolivia

và Peru, nơi vấn đề bệnh SLGL ở động vật ít quan trọng, trong khi ở các quốc gia như Uruguay, Argentina, và Chile bệnh sán lá gan chỉ lẻ tẻ hoặc mức độ vừa [104], [108]

Ở châu Á, bệnh do SLGL ở vật nuôi tập trung ở một số nước như: Thái Lan, Iraq, Iran, Trung Quốc, Việt Nam, Ấn Độ, Nepal, Nhật Bản, Hàn Quốc

và Philippines Trong đó bệnh do SLGL ở người được thông báo nhiều nhất ở Iran, đặc biệt ở tỉnh Gilan, khu vực gần biển Caspian Theo một thống kê, ở Iran

đã có trên 10,000 trường hợp bệnh do SLGL ở người được phát hiện Tại các quốc gia Đông Á, bệnh do SLGL ở người xuất hiện rải rác Một số trường hợp bệnh do SLGL ở người thông báo tại Nhật Bản, Hàn Quốc, Việt Nam và Thái Lan [104], [108]

Nhiễm SLGL ở động vật

Nhiễm SLGL ở động vật ăn cỏ rất phổ biến trên toàn thế giới Tỷ lệ nhiễm SLGL ở động vật ăn cỏ thay đổi theo loài động vật và phụ thuộc sự tồn tại của ốc trung gian truyền bệnh, phương thức chăn nuôi của người dân khu vực nghiên cứu [49] Nhìn chung, tỷ lệ nhiễm SLGL cao ở động vật ăn cỏ [53], trung bình từ 30 % đến 50 % Có nơi tỷ lệ nhiễm SLGL ở động vật rất cao như ở trâu tại Chiang Mai - Thái Lan 52,94 - 67,27 % [121], ở bò tại Kwara - Nigeria 74,9% [73], Chile 94% [53] Tuy nhiên, cũng có nơi tỷ lệ nhiễm ở dê và cừu khá thấp, chỉ khoảng 6 - 7 % [93] Những nơi có tỷ lệ nhiễm cao hơn 70 % được xem là không bình thường [79], giống như ở bò tại khu vực phía bắc Samar, Philippines với > 95 % nhiễm SLGL [78], ở bò tại Kwara - Nigeria với 74,9% nhiễm [73] Mặc dù

cả 2 loài F hepatica và F.gigantica đều có thể nhiễm ở bò, trâu, dê, cừu, ngựa, hươu, lợn… nhưng thường thấy F hepatica nhiễm ở cừu, còn F

gigantica thường nhiễm ở trâu, bò [79] Ở một số loài động vật nhai lại

khác như hươu, nai, voi … cũng được xác định là vật chủ của SLGL [104] Tuy nhiên, cho tới nay chưa nhiều nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm ở nhóm các động vật này

1.2.2.2 Ở Việt Nam

Nhiễm sán lá gan lớn trên trâu/bò

Bảng 1.1 Tỷ lệ nhiễm sán lá gan lớn ở trâu/bò Loài gia súc Tuổi (năm) Tổng số Số nhiễm Tỷ lệ %

(Trích nghiên cứu của Nguyễn Khắc Lực và cs, 2010) [31]

Tại Quảng Nam, Nguyễn Khắc Lực và CS (2010) [31] nghiên cứu trên

245 trâu/bò bằng phương pháp tìm trứng trong phân cho thấy, tỷ lệ nhiễm chung là 40,8 % và tỷ lệ nhiễm SLGL ở trâu (43,2 %) cao hơn ở bò (38,3

%) Một nghiên cứu tương tự của Võ Thị Hải Lê (2010) tại Nghệ An cho thấy, tỷ lệ nhiễm SLGL ở trâu là 61,6 % và ở bò là 26,86 % [28] Theo các tác giả, tỷ lệ nhiễm SLGL ở trâu cao hơn ở bò là do đặc tính ưa cỏ ngập nước của trâu, trong khi đó ở bò ít hơn Tỷ lệ nhiễm SLGL ở trâu/bò trong

nghiên cứu của Nguyễn Khắc Lực (2010) [31] và Võ Thị Hải Lê (2010) [28] cao hơn của Lê Thị Tuyết và cs (2009) [42] nghiên cứu tại Nam Định (35,3

%) và cao hơn của Phạm Văn Lực và cs (2006) [29] nghiên cứu tại Đắk Lắk

(34,22 %) Trong một nghiên cứu khác về tỷ lệ nhiễm ký sinh trùng ở bò tại khu vực Hà Nội của Geurden T và CS (2008) cho thấy, nhiễm SLGL ở bò cái dưới 24 tháng tuổi thấp hơn ở bò cái trên 24 tháng tuổi (28 % so với 39

%) [76] Ở bò khu vực Miền Trung, nghiên cứu của Sam N.T và CS 2012)

cho thấy, 46,3 % bò dương tính với trứng SLGL và 87,2 % bò có huyết

thanh dương tính với Fasciola Cũng theo tác giả này, bò dưới 2 tuổi có tỷ lệ

nhiễm thấp hơn bò trên 2 tuổi (37,6 % so với 53,7 %) và mùa mưa bò nhiễm cao hơn mùa khô (50,8 % so với 38,1 %) [129] Các kết quả trên cho thấy, tỷ

lệ nhiễm SLGL ở trâu bò tại Việt Nam tương đối cao, 26,86 - 61,6 %

Về tỷ lệ nhiễm theo tuổi, theo hầu hết các nghiên cứu, ở cả trâu và bò,

tuổi càng cao thì tỷ lệ nhiễm càng cao [27], [29] Theo Nguyễn Khắc Lực (2010) [30], nhóm trâu/bò độ tuổi > 8 năm có tỷ lệ nhiễm cao nhất (50 % ở trâu

và 45,5 % ở bò) Giải thích về vấn đề này, tác giả Nguyễn Khắc Lực (2010)

[30] cho rằng tuổi trâu/bò càng cao thì sự tiếp xúc với ngoại cảnh càng dài và

cơ hội ăn phải nang ấu trùng SLGL (metacercaria) càng cao Hơn nữa, SLGL trưởng thành sống trong gan của trâu/bò tương đối dài (3 - 5 năm, thậm chí 10

năm) Võ Thị Hải Lê (2010) [28] cũng có cùng quan điểm này

Nhiễm sán lá gan lớn ở người

Theo Đặng Thị Cẩm Thạch (2008) [35], thống kê đến năm 2006 số bệnh

nhân mắc bệnh sán lá gan lớn (SLGL) là 2.428 và đến tháng 3 năm 2008 con số này đã lên trên 5.000 Năm 2008, bệnh SLGL được xác định phân bố ở 47 tình

thành từ Bắc vào Nam Nhưng đến năm 2012, theo Nguyễn Văn Đề và cs (2012)

[14], đã có ít nhất 52 tỉnh có lưu hành bệnh do SLGL và số người mắc bệnh lên tới trên 20.000 người Các ca mắc bệnh do SLGL tập trung chủ yếu ở khu vực Miền Trung Trong một nghiên cứu gần đây, tỷ lệ nhiễm SLGL trên nhóm người được chẩn đoán u gan tại Hà Nội là 32,7 % (111/339), trong đó nam giới chiếm 59,5% và nữ giới chiếm 40,5 % [14]

Về loài SLGL, trước đây một số tác giả cho rằng ở Việt Nam có lưu

hành của cả 2 loại SLGL là F hepatica và F gigantica [44], [45] Các nghiên

cứu gần đây sử dụng sinh học phân tử để xác định loài SLGL cho thấy SLGL

ở cả người và động vật ở Việt Nam là loài F gigantica [2], [25], [38] Một số

cho rằng, nhiều mẫu sán ở Việt Nam có sự lai ngoại loài giữa F hepatica và

F gigantica [19], [24] Tuy nhiên, không chỉ riêng ở Việt Nam, một số nước

thuộc khu vực Châu Á như Hàn Quốc, Trung Quốc và Nhật Bản, cũng đã ghi

nhận các cá thể dạng trung gian với 2 dạng: dạng lai giữa F gigantica và F

hepatica với gen ty thể thuộc F gigantica còn gen nhân lại thuộc F hepatica

và dạng pha trộn gen nhân của cả 2 loài [55], [69], [101]

1.3 Các phương pháp xác định loài sán lá gan lớn

1.3.1 Các phương pháp xác định loài Fasciola sp

Có nhiều phương pháp khác nhau để xác định loài ký sinh trùng nói chung và SLGL nói riêng như: phương pháp hình thái học; phương pháp dựa vào sản phẩm Protein của ký sinh trùng; phương pháp dựa vào đặc điểm dịch

tễ học và vòng đời; phương pháp dựa vào đặc tính phân bố theo vùng, khu vực địa lý, theo vật chủ; phương pháp dựa vào đặc tính sinh lý, sinh hóa; phương pháp huyết thanh học; phương pháp mô bệnh học nhuộm màu tế bào,

cá thể… và các phương pháp dựa vào các kỹ thuật sinh học phân tử [22] Tuy nhiên, đối với SLGL, 2 phương pháp xác định loài chủ yếu được sử dụng là phương pháp hình thái học và sinh học phân tử dựa trên các chỉ thị phân tử

gen ty thể và gen nhân tế bào

gigantica ngắn hơn, rộng hơn [33], [104] Nhiều tác giả còn ghi nhận hai loài

này có sự khác nhau về hình dạng và kích thước của lớp mô biểu bì [104] Một

số tác giả nghiên cứu phân biệt hai loài này dựa vào các đặc điểm khác biệt ở cơ quan sinh sản và tiêu hóa nhưng những biến đổi một cách tự nhiên của những bộ

phận này cho thấy các căn cứ này ít có giá trị thực tế [104] Trong các nghiên

cứu về hình thái SLGL trước đây, đa số tập trung vào loài F hepatica, rất ít nghiên cứu đối với F gigantica và cũng không nhiều nghiên cứu so sánh hình thái của 2 loài F gigantica và F hepatica Trong một thời gian dài, phân loại

SLGL dựa vào hình thái đã bộc lộ nhiều điểm hạn chế, nhất là ở các khu vực có

2 loài SLGL cùng tồn tại [104], [106] Điều này là do một số nguyên nhân sau:

- Các nghiên cứu trước đây về hình thái SLGL sử dụng các phương pháp tính toán chưa thực sự chuẩn xác nên các kết quả so sánh chưa rõ ràng

- Các nghiên cứu về những thay đổi hình thái thực hiện trên các chỉ tiêu không có sự tương đồng

- Các nghiên cứu về hình thái cho thấy kích thước sán trưởng thành và trứng của 2 loài có nhiều khoảng gối lên nhau Điều này là do khi đo đạc tính toán đã không tách biệt rõ ràng SLGL ở các vật chủ khác nhau

- Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh kích thước của sán trưởng thành và trứng phụ thuộc rất nhiều vào loài vật chủ mà chúng ký sinh Điều này lại ít được quan tâm trước đó

- Các nghiên cứu trước đây chưa biết có sự tồn tại của dạng trung gian do chúng mới chỉ được xác nhận trong vài thập niên trở lại đây Trong khi, dạng

này vừa có những điểm giống với F gigantica lại vừa có những điểm giống với

F hepatica Ngoài ra, tại một số quốc gia Châu Á, bộ nhiễm sắc thể của SLGL

có thể có các dạng nhị bội, tam bội và hỗn hợp Hình thái của các dạng này cũng

có nhiều điểm khác nhau…

Gần đây, một số nghiên cứu dựa trên các phương pháp đo đạc chuẩn trên

các dòng F gigantica và F hepatica thuần cho thấy, giữa 2 loài dòng thuần có

một số chỉ số có sự khác biệt rõ ràng như tỷ số chiều dài/chiều rộng (BL/BW), khoảng cách từ giác bụng đến cuối thân (VS-P), chu vi cơ thể (BR) Chính vì vậy, các chỉ số này được một số tác giả sử dụng để phân loại sơ bộ SLGL Tuy

nhiên, một vài nghiên cứu so sánh hình thái của hai loài SLGL ở những quốc gia

có hoặc có thể tồn tại của cả hai loài SLGL như ở Philippines, Iran, Thái Lan và

Ai Cập lại cho thấy việc phân biệt 2 loài SLGL dựa vào phương pháp hình thái thực sự là vấn đề khó khăn [38], [104], [109]

Nghiên cứu của Periago và CS (2006) [119] trên 251 cá thể sán thu

thập tại 3 quốc gia nơi chỉ tồn tại các loài sán thuần chủng là Tây Ban Nha

(84 cá thể F hepatica thuần chủng), Corsica - một hòn đảo thuộc nước Pháp (86 cá thể F hepatica thuần chủng) và Burkina Faso (81 cá thể F gigantica

thuần chủng) đã tiến hành xác định giá trị của hơn 20 chỉ số hình thái quan trọng như: chiều dài, chiều rộng, tỷ số chiều dài/chiều rộng, kích thước giác bụng, giác miệng, khoảng cách từ giác bụng tới cuối thân (VS-P), chu vi cơ

thể (BP)… Kết quả cho thấy, F hepatica thu thập từ Tây Ban Nha có kích

thước chiều dài dao động từ 11,64 đến 22,93 mm (trung bình 17,41 ± 0,23 mm), chiều rộng từ 6,41 đến 13,88 mm (trung bình 10,02 ± 0,17 mm) và từ Corsica chiều dài dao động từ 12,22 đến 29,00mm (trung bình 20,45 ± 0,37 mm), chiều rộng từ 4,88 đến 14,07mm (trung bình 10,71 ± 0,18 mm) Trong

khi đó, kích thước chiều dài của F gigantica thu thập từ Burkina Faso dao

động từ 28,82 - 52,30 mm (trung bình 39,72 ± 0,58 mm), chiều rộng từ 6,03 đến 11,84 mm (trung bình 8,45 ± 0,14 mm) Với các kết quả này, có thể thấy

các chỉ số BL/BW, VS-P có sự khác biệt rõ ràng giữa F hepatica và F

gigantica Cụ thể, với F hepatica, SLGL ở Tây Ban Nha chỉ số BL/BW dao

động từ 1,29 đến 2,77 (trung bình 1,74 ± 0,03), ở Corsica dao động từ 1,33

đến 2,80 (trung bình 1,91 ± 0,03) Trong khi, chỉ số BL/BW ở F gigantica ở

Burkina Faso dao động từ 3,40 đến 6,77 (trung bình 4,70 ± 0,08) Dựa vào

các kết quả này, Periago và CS (2006) phân loại SLGL thành 2 nhóm:

+ Nhóm có hình thái giống với F hepatica hay F hepatica - like (chỉ

số BL/BW dao động từ 1,29 đến 2,8; VS-P từ 8,86 đến 25,08 mm);

+ Nhóm có hình thái giống với F gigantica hay F gigantica-like (chỉ

số BL/BW dao động từ 3,40 đến 6,78; VS-P từ 26,28 đến 50,09 mm)

Một số nghiên cứu đã chứng minh cách phân loại này cũng đúng với các quần thể SLGL thuần chủng ở các khu khu vực khác [60]

Tuy nhiên, tại những nơi có tồn tại cả 3 kiểu gen F hepatica, F

gigantica và Fasciola sp xuất hiện những cá thể có kích thước các chỉ số

BL/BW và hoặc VS-P nằm ở khoảng trung gian và kích thước các chỉ số của

F hepatica, F gigantica có những khoảng gối lên nhau [60], [74] Sự xuất

hiện dạng trung gian của SLGL không những làm tăng thêm tính phức tạp trong phân loại loài SLGL mà còn gây ra những khó khăn nhất định trong chẩn đoán loài SLGL gây bệnh ở một khu vực địa lý nhất định [38], [68],

[145] Mặc dù vậy, phương pháp xác định các chỉ số hình thái của Periago và

CS (2006, 2008) là phương pháp nghiên cứu đơn giản, có thể thực hiện bởi

những người không có chuyên môn để mô tả đặc điểm hình thái của SLGL

mà không cần tới những người có trình độ chuyên môn sâu [104], [120] Chính vì thế, phương pháp này vẫn được nhiều nghiên cứu áp dụng để xác định các chỉ số hình thái, tính đa hình về hình thái và phân loại SLGL trước khi thực hiện các giám định phân tử Một số nghiên cứu tiêu biểu áp dụng phương pháp này là: Ashrafi K và CS (2006), Mufti S và CS (2014), Wannasan A và CS (2014) và Yakhchali M và CS (2015) … Các tác giả này

cũng có cùng quan điểm, ở các quần thể SLGL F hepatica và F gigantica

thuần chủng, không có các cá thể lai, các chỉ số BL/BW và VS-P được chứng minh là một công cụ hữu ích để phân biệt loài hoặc dự báo, nhận định về sự tồn tại của dạng trung gian [60], [104], [114], [143], [145]

Ở một nghiên cứu khác trên SLGL ở Thái Lan, dựa vào kích thước

chiều dài, Srimuzipo P và CS (2000) phân loại SLGL được phân ra làm 3

nhóm: nhóm nhỏ (chiều dài nhỏ hơn 25mm), nhóm trung bình (chiều dài từ

25 đến 35mm) và nhóm lớn (chiều dài lớn hơn 35mm) [136]

Phương pháp sinh học phân tử

Tất cả mọi đặc điểm sinh học của một cá thể đều được quyết định bởi

bộ gen hay hệ gen của chúng [22] Bộ gen của tế bào bao gồm hệ ty thể và hệ gen nhân tế bào thường được áp dụng trong nghiên cứu giám định loài và xác định các đặc tính di truyền của sinh vật

Đặc điểm của hệ gen ty thể sán lá

Hình 1.4 Sơ đồ cấu trúc hệ gen ty thể sán lá gan lớn [99]

Ty thể là một bào quan của tế bào, chứa một hệ gen riêng với khoảng 13-25 nghìn nucleotide Ty thể có vai trò tham gia vào quá trình oxy hóa khử

để giải phóng năng lượng cho tế bào Đối với ngành giun sán, hệ gen ty thể chứa 12 gen, trong khi đó ở động vật bậc cao ty thể chứa 13 gen Ngoài ra ty thể còn chứa 2 gen ARN ribosome, 22 gen ARN vận chuyển, một vùng không

mã hóa và một số tiểu phần khác [23], [38] Hiện nay, nhiều loài sán lá đã

được giải mã toàn bộ hệ gen ty thể như F hepatica, F gigantica, Fasciola sp., C sinensis, F magna, F buski và hàng nghìn loài đã được giải mã một

phần [23] Các gen trong hệ gen ty thể có hệ số biến đổi nhanh hơn gen trong nhân tế bào 10-15 lần nên đây là chỉ thị phân tử thuận lợi cho nghiên cứu tiến hóa và biến đổi di truyền ở sinh vật [23], [38], [102], [104] Các gen ty thể trong cùng giống, cùng loài và các loài có quan hệ gần gũi về sinh học có sự bảo tồn rất cao, do vậy, bất cứ sự thay đổi nhỏ nào cũng là dấu hiệu có giá trị trong giám định và phân loại [23]

Đặc điểm của hệ gen ty thể là [70], [139]:

- Hàng trăm/ngàn bảng sao trong nguyên sinh chất;

- Di truyền theo dòng mẹ;

- Tỷ lệ đột biến cao hơn hệ gen nhân;

- Sao chép độc lập với quá trình phân bào;

- Tác động ngƣỡng: để biểu hiện một bệnh cần đòi hỏi ADN bị đột biến phải vƣợt qua một ngƣỡng nào đó;

Các gen ty thể là cấu trúc di truyền đại diện dòng mẹ, do vậy, khi giám định các loài có khả năng lai hay trong vùng tạp lai ngoại loài (inter-specific hybridization), nhất thiết cần xem xét thêm chỉ thị hệ gen nhân (ví dụ ITS-2),

vì gen nhân đại diện di truyền dòng bố Từ đó, việc phân tích dòng lai, cá thể lai sẽ xác định đƣợc di truyền theo bố hay mẹ [139]

Đặc điểm của hệ gen nhân tế bào

Hình 1.5 Ví trí của các đoạn giao gen ITS1 và ITS2 thuộc hệ gen nhân

Trong một tế bào của cơ thể, ngoài hệ gen ty thể, hệ gen nhân tế bào với hàng chục triệu đến hàng trăm triệu nucleotide đƣợc phân bố trong các đơn vị sinh học gọi là nhiễm sắc thể (NST) Số lƣợng NST trong mỗi một loài

có khác nhau [23] Hệ gen nhân và hệ gen ty thể biểu hiện với những sản phẩm riêng, hoạt động vừa có tính độc lập, vừa tương tác, và dĩ nhiên hệ gen

ty thể - lạp thể chịu ảnh hưởng điều hòa của hệ gen nhân tế bào [23], [139]

Hệ gen nhân tế bào thường có hệ số đột biến thấp hơn hệ gen ty thể Tuy nhiên, bất kỳ sự thay đổi nào của các gen quan trọng cũng dẫn đến sự biến đổi hệ gen có tính chất đặc trưng của loài Các gen thuộc hệ gen nhân như các gen ribosome (18S, 5.8S, 28S) và vùng giao gen (ITS-1, ITS-2) thường được dùng trong phân tích phân loại Đáng lưu ý là ITS-1 và ITS-2 có mức độ biển đổi ngoại loài rất cao, khó có thể sử dụng để so sánh phân tích các loài khác giống, nhưng chúng lại là đối tượng lý tưởng trong nghiên cứu phả hệ nguồn gốc các chủng, cá thể trong cùng loài hoặc cùng giống, nhất là hiện tượng nội loài hay ngoại loài [23], [38], [139] ITS-2 đại diện phả hệ dòng bố, nếu được phân tích cùng với một số chỉ thị hệ gen ty thể đại diện cho dòng mẹ thì có thể xác định được chính xác nguồn gốc của cá thể lại ngoại loài [23]

Ứng dụng sinh học phân tử giám định loài sán lá gan lớn

Trong một thời gian dài, việc xác định loài SLGL gần như chỉ dựa vào phương pháp hình thái truyền thống [50] Khắc phục những hạn chế của phương pháp hình thái truyền thống, một số kỹ thuật sinh học phân tử đã được phát triển để ứng dụng trong giám định và phân biệt các loài SLGL Sự

ra đời của các kỹ thuật này không chỉ giúp các nhà khoa học phân biệt các loài sinh vật với nhau mà còn giúp xác định một loài sinh vật mới [50], [104] Một số công cụ sinh học phân tử đã được ứng dụng trong xác định và phân

biệt giữa F hepatica và F gigantica như: PCR cơ bản kết hợp với giải trình

tự, PCR đa mồi (multiplex-PCR), kỹ thuật xác định đa hình chiều dài đoạn giới hạn (RFLP-PCR), kỹ thuật khuếch đại gen với mồi ngẫu nhiên (RAPD-PCR), kỹ thuật xác định đa dạng cấu hình cấu trúc mạch đơn (PCR-SSCP), kỹ thuật khuếch đại gen đẳng nhiệt (LAMP) [50], [52], [65], [103] Trong đó,