Nghiên cứu đặc điểm của gen mã hóa chalcone isomerase phân lập từ cây đậu tương

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn hợp về điều kiện khí hậu và đất đai nên việc trồng trọt đậu tương tại Mỹ phát triển mạnh mẽ do đó đã cho sản lượng đậu tươn

Trang 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

TRẦN THỊ THANH VÂN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CỦA GEN MÃ HÓA CHALCONE

ISOMERASE PHÂN LẬP TỪ CÂY ĐẬU TƯƠNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2016

Trang 2

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

TRẦN THỊ THANH VÂN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CỦA GEN MÃ HÓA CHALCONE

ISOMERASE PHÂN LẬP TỪ CÂY ĐẬU TƯƠNG

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Ngườ i hướng dẫn khoa ho ̣c: GS TS Chu Hoàng Mâ ̣u

Thái Nguyên - 2016

Trang 3

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) thuộc cây họ đậu (Fabaceae), là cây

trồng quan trọng không chỉ ở Việt Nam và còn xuất hiện ở gần 200 quốc gia trên thế giới Đậu tương là cây trồng cạn ngắn ngày , có giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế cao Đối với nông nghiệp, đậu tương là cây trồng thân thiện với môi trường và thúc đẩy phát triển kinh tế nông nghiệp Đậu tương được ví như nhà máy sản xuất đạm tự nhiên nhờ các nốt sần trong rễ cây giúp cải thiện chất lượng đất thông qua khả năng hấp thụ nitơ tự nhiên

Các sản phẩm từ đậu tương đã và đang được sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới Nhiều nghiên cứu cho thấy đậu tương tốt cho sức khỏe con người nhờ có chứa thành phần isoflavone Isoflavone là dươ ̣c chất có nguồn gốc thảo mộc , có thể làm giảm sự xuất hiện của một số loại ung thư, giảm các triệu chứng mãn kinh, ngăn ngừa các bệnh về tim mạch, béo phì, loãng xương, ngăn chặn sự gia tăng cholesterol trong máu Bên cạnh đó isoflavone giúp phụ nữ tăng cường chất lượng của da, giảm được các nếp nhăn, giảm độ sâu của nếp nhăn mắt, làm cho

da săn chắc hơn nhờ tăng cường kết nối collagen, đồng thời cải thiện màu sắc và giữ ẩm cho da

Con đường sinh tổng hợp isoflavone ở đâ ̣u tương được biết là một nhánh của con đường phenylpropanoid với hai enzyme chìa khóa là chalcone synthase (CHI) và isoflavone synthase (IFS) để tổng hợp isoflavone genistein và daidzein

có khả năng chống oxi hóa mạnh nhất Chúng được tìm thấy chủ yếu ở đậu tương và các loại cây họ đậu khác Tuy nhiên, hàm lượng isoflavone trong đậu tương rất thấp, khoảng từ 50 – 3000 µg/g và tồn tại ở hai dạng chính là glycoside

và aglucone Dạng glycoside có trọng lượng phân tử lớn, chiếm tới trên 90% isoflavone tổng số được cho là hấp thụ hạn chế trong hệ tiêu hóa người, trong

Trang 4

khi đó, dạng aglucone được hấp thụ nhanh hơn , nhưng hàm lượng la ̣i rất thấp , chỉ chiếm từ 1% – 5% isoflavone tổng số Chính vì vậy nghiên cứu ứng dụng công nghệ gen vào việc cải thiện theo hướng nâng cao hàm lượng isoflavone trong hạt đậu tương là rất cần thiết Kỹ thuật biểu hiện gen ở thực vâ ̣t cho phép tạo ra các dòng cây có khả năng tổng hợp isoflavone với hàm lượng cao , tạo nguyên liê ̣u phu ̣c vụ sản xuất các chế phẩm sinh ho ̣c đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của công tác chăm sóc và bảo vê ̣ sức khỏe con người ở nước ta

Xuất phát từ những lý do trên , đề tài luận văn thạc sĩ đã được chúng tôi lựa

chọn và thực hiện là: “Nghiên cứu đặc điểm của gen mã hóa chalcone isomerase phân lập từ cây đậu tương”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Phân tích được đặc điểm của gen mã hóa chalcone synthase trong con đường sinh tổng hợp isoflavone phân lâ ̣p từ hai giống đâ ̣u tương khác nhau về hàm lượng isoflavone

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Phân tích hàm lượng isoflavone trong hạt nảy mầm của ba giống đậu tương Viê ̣t Nam là ĐT51, DT90 và DT84

3.2 Nghiên cứu thông tin về gen mã hóa chalcone isomerase (CHI), thiết kế că ̣p

mồi PCR nhân gen CHI, tách dòng và xác định trình tự gen CHI

3.3 Phân tích sự đa da ̣ng về trình t ự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn

của gen CHI

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đậu tương

Kết quả phân tích đă ̣c điểm của gen CHI và xác định những điểm sai khác về trình tự nucleotide của gen CHI và trình tự amino acid suy diễ n giữa c ác

giống đâ ̣u tương khác nhau về hàm lượng daidzein và genistein là cơ sở để giải thích mối liên quan giữa gen CHI vớ i hoa ̣t đô ̣ng tổng hơ ̣p isoflavone ở đâ ̣u

Trang 5

tương Đồng thời cũng là cơ sở sử dụng đoạn mã hó a của gen CHI trong viê ̣c

thiết kế vector chuyển gen trong mu ̣c đích nâng cao hàm lượng isoflavone trong

đâ ̣u tương bằng kỹ thuâ ̣t chuyển gen

Kết quả xác đi ̣nh hàm lượng daidzein và genistein của các giống đâ ̣u tương nghiên cứu cung c ấp dữ liệu cho chọn giống đậu tương theo định hướng nâng cao hàm lượng isoflavone của đâ ̣u tương

Kết quả nghiên cứu của luận văn là tư liệu khoa học phục vụ cho mục đích nghiên cứu và giảng dạy công nghê ̣ sinh ho ̣c

Trang 6

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 CÂY ĐẬU TƯƠNG

1.1.1 Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm thực vật học của cây đậu tương

Cây đậu tương hay còn được gọi là cây đậu nành có tên khoa học là Glycine

max (L.) Merrill, là loại cây ăn hạt, thân thảo thuộc họ đậu (Fabaceae), đậu

tương mang bộ nhiễm sắc thể 2n=40 Cây đâ ̣u tương đươ ̣c xếp trong hê ̣ thống như sau:

Đến thế kỷ XVII, cây đậu tương được giới thiệu vào Châu Âu bởi các nhà

thực vật học và được đặt tên là Glycine max Sau đó đến thế kỷ XVIII cây đậu

tương mới được du nhập vào Mỹ, nhưng có nhiều kết quả cho thấy do có sự phù

Trang 7

hợp về điều kiện khí hậu và đất đai nên việc trồng trọt đậu tương tại Mỹ phát triển mạnh mẽ do đó đã cho sản lượng đậu tương tăng lên nhanh chóng, đến nay đậu tương vẫn được coi là cây trồng chính đem lại giá trị kinh tế cao tại Mỹ và nhiều quốc gia khác trên thế giới: Trung Quốc, Brazil [3], [5]

Hiện nay, cây đậu tương vẫn đang là cây được trồng phổ biến ở nhiều quốc gia trên thế giới bởi đậu tương là cây công nghiê ̣p, cây thực phẩm đem lại giá trị kinh tế cao nhờ sự vượt trội hơn hẳn so với các cây trồng khác bởi hàm lượng các chất dinh dưỡng như protein, lipid cao, chứa nhiều vitamin, các khoáng chất

và nhiều hoạt chất thảo mộc có lợi cho sức khoẻ con người

Tại Việt Nam đậu tương được ví như “vàng mọc từ đất” bởi đậu tương cho sản lượng cao, cải tạo đất và là cây trồng xen canh gối vụ với nhiều loại cây trồng, chứa nhiều hàm lượng protein đem lại nhiều giá trị kinh tế

Cây đậu tương là loại cây thân thảo, bụi nhỏ và là cây hằng năm Thân cây mảnh, cao khoảng từ 0,8m đến 0,9 m, có lông, cành hướng lên phía trên Một cây đậu tương hoàn chỉnh bao gồm rễ, thân, lá, hoa, quả và hạt

Rễ đậu tương

Rễ đậu tương là cây rễ cọc, bộ rễ bao gồm rễ cái (rễ chính) và nhiều rễ bên hay còn gọi là rễ phụ, trên rễ cái mọc ra nhiều rễ phụ là các rễ phụ cấp 2 và rễ phụ cấp 3 Trong điều kiện bình thường rễ cái ăn sâu vào đất khoảng 20-30 cm hoặc có khi ăn sâu đến 15oCm; thông thường các rễ con tập trung nhiều nhất ở

độ sâu 6-2oCm Bộ rễ phát triển và được chia thành 2 thời kỳ chính: (i) Thời kỳ thứ nhất: rễ cái và rễ phụ đầu tiên phát triển mạnh và sinh ra nhiều rễ con, thời

kỳ này kéo dài từ 30-40 ngày sau mọc (ii) Thời kỳ thứ hai: lớp rễ đầu tiên phát triển chậm dần, rễ con không phát triển chỉ có các rễ phụ nhỏ kéo dài ra và phát triển cho tới gần thu hoạch

Trên rễ chính và rễ phụ có nhiều nốt sần chứa các vi khuẩn Rhizobium

japonicum sinh sống, loại vi khuẩn này có dạng hình gậy hoặc hình cầu quan sát

Trang 8

được dưới kính hiển vi điện tử, vi khuẩn Rhizobium japonicum sống trong lòng

đất, có khả năng cố định đạm từ khí trời, mỗi một cây họ đậu có vài trăm nốt sần phân bố đồng đều trên các rễ, ban đầu khi mới hình thành các nốt sần có màu sữa sau đó phát triển có màu hồng Quá trình hình thành nốt sần kéo dài 16-21 ngày, phát triển nhiều mạnh nhất vào lúc đậu tương ra hoa và làm quả

Giữa vi sinh vật nốt sần với cây đậu tương chúng có mối quan hệ cộng sinh, cây cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn hoạt động và ngược lại vi khuẩn lại tích hợp nitơ tự do của không khí chuyển sang đạm hữu cơ để cây có thể sử dụng được Cây đậu tương càng nhiều chất dinh dưỡng cho vi sinh vật hoạt động thì vi sinh vật càng phát triển và tích lũy đạm được càng nhiều cho cây sinh trưởng và phát triển tốt

Thân, cành đậu tương

Thân cây đậu tương thuộc thân thảo có hình tròn, chia đốt, ít phân cành, trên thân có nhiều lông nhỏ Thân đậu tương thường đứng hoặc có khi thân bò hay nửa bò, khi còn non thân có màu xanh hoặc tím, khi về già chuyển sang màu nâu nhạt, màu sắc của thân khi còn non có liên quan chặt chẽ với màu sắc của hoa sau này Nếu thân lúc còn non có màu xanh thì hoa màu trắng và nếu khi cây còn non thân có màu tím thì hoa màu tím đỏ Thân cao trung bình 0,5- 1,2 m hoặc cũng có khi cao nhất đến 1,5m, trên thân mang 14-15 lóng, các lóng ở phía dưới thường ngắn, các lóng ở phía trên thường dài Tùy theo giống và thời vụ gieo mà chiều dài lóng có sự khác nhau thường biến động từ 3-10 cm Cây đậu tương trong vụ hè có lóng dài hơn vụ xuân và vụ đông Chiều dài của lóng góp phần quyết định chiều cao của thân Thân cây đậu tương thường cao từ 0,3-1,0m Giống đậu tương dại cao từ 2-3m Thực tế cũng có những giống không có lông

tơ Những giống có mật độ lông tơ dày, màu sẫm có sức kháng bệnh, chịu hạn và chịu rét khỏe những giống không có lông tơ thường sinh trưởng không bình thường, sức chống chịu kém Thân có lông tơ nhiều hay ít, dài hay ngắn, dày hay

Trang 9

thưa là một đặc điểm phân biệt các giống với nhau Đốt đầu tiên của thân chính mang hai lá mầm, đốt thứ hai lại mang hai lá đơn mọc đối diện nhau, sau đó kể

từ đốt thứ ba trở đi mỗi đốt mang một lá kép có các lá chét, các lá kép mọc đối diện nhau Dựa vào sự sinh trưởng và đặc điểm mà thân có các loại như sau: Loại mọc thẳng: thân cứng, đường kính thân lớn, thân cao trung bình, đốt ngắn, nhiều quả

Loại bò: thân chính phân cành rất nhỏ, mềm, phủ trên bề mặt đất thành đám dây, thân dài, đốt dài, quả nhỏ

Loại nửa bò: là loại trung gian giữa hai loại mọc thẳng và mọc bò

Loại mọc leo: thân nhỏ rất dài, mọc bò dưới đất hay leo lên giá thể khác Thân đậu tương có khả năng phân cành ngay từ nách lá đơn hoặc kép Dựa vào đặc tính sinh trưởng của thân cành và đặc điểm ra hoa nên có thể chia giống đậu tương ra làm hai loại:

Sinh trưởng hữu hạn: Khi ngọn thân hoặc ngọn cành đã ra hoa thì không tiếp tục sinh trưởng nữa hay cành không cao lên nữa, loại này chủ yếu được trồng lấy để lấy hạt

Sinh trưởng vô hạn: Khi đậu tương ra hoa kết quả và cả khi sắp chín thân cành vẫn tiếp tục sinh trưởng, thường là loại mọc bò

Từ lúc mọc đến khi cây có 5 lá thật (3 lá kép) khoảng 25 – 30 ngày sau khi gieo, thân sinh trưởng với tốc độ bình thường

Khi cây đã có 6-7 lá thật thân bắt đầu phát triển mạnh Điểm khác biệt của cây đậu tương với cây trồng khác là cây ra hoa rộ lại là lúc thân cành phát triển mạnh nhất Đây là giai đoạn hai quá trình sinh trưởng, sinh dưỡng cho nên cần cung cấp đầy đủ dinh dưỡng tạo điều kiện cho bộ rễ phát triển thuận lợi Cành mọc ra từ đốt trên thân, hướng lên trên, số cành trên thân nhiều hay ít phụ thuộc vào loại giống đậu tương, đất đai, kỹ thuật canh tác, điều kiện gieo

Trang 10

trồng, có những giống đậu tương chỉ có 1-2 cành hoặc có những giống không có cành, cành và thân chính kết hợp với nhau tạo thành tán cây đậu tương [7], [15]

Lá đậu tương

Cây đậu tương có lá mọc cách và có 3 loại lá chính: lá mầm, lá đơn và lá kép có nhiều hình dạng khác nhau như hình trái xoan, trứng, tròn, dài, ô van, mũi

lá gần nhọn, không đều ở gốc Mặt lá thường có nhiều lông trắng

Lá mầm (lá tứ diệp): lá mầm mới mọc có màu vàng hay xanh lục khi tiếp xúc với ánh sáng thì chuyển sang màu xanh Hạt giống to thì lá mầm chứa nhiều dinh dưỡng nuôi cây mầm, khi hết chất dinh dưỡng lá mầm khô héo

Lá nguyên (lá đơn): xuất hiện sau khi mọc từ 2-3 ngày và mọc phía trên lá mầm Lá đơn mọc đối xứng nhau, lá đơn to xanh bóng là lá biểu hiện cây sinh trưởng tốt, lá đơn to xanh đậm biểu hiện của một giống có khả năng chịu rét, lá đơn nhọn gợn sóng là biểu hiện cây sinh trưởng không bình thường

Lá kép: Mỗi lá kép có 3 lá chét, cũng có thể có 4-5 lá chét Lá kép mọc so

le, có màu xanh tươi, khi già biến thành màu vàng nâu Cũng có giống khi quả chín lá vẫn giữ được màu xanh Phần lớn lá có nhiều lông tơ Lá có nhiều hình dạng khác nhau tùy theo giống Những giống lá nhỏ và dài chịu hạn khỏe nhưng thường cho năng suất thấp, những giống lá to chịu hạn kém nhưng thường cho năng suất cao hơn Nếu hai lá kép đầu to và dày thường biểu hiện giống có khả năng chống chịu rét Số lượng lá kép nhiều hay ít, diện tích lá to hay nhỏ chi phối rất nhiều đến năng suất và phụ thuộc vào thời vụ gieo trồng Các lá nằm cạnh chùm hoa nào giữ vai trò chủ yếu cung cấp dinh dưỡng cho chùm hoa ấy Nếu vì điều kiện nào đó làm cho lá bị úa vàng thì quả ở vị trí đó thường bị rụng hoặc lép Số lá nhiều to khoẻ nhất vào thời kỳ đang ra hoa rộ Khi phiến lá phát triển to, rộng, mỏng, phẳng, có màu xanh tươi là biểu hiện cây sinh trưởng khoẻ

có khả năng cho năng suất cao

Trang 11

Hoa đậu tương

Đậu tương là cây tự thụ phấn, có hoa mọc từ nách lá, hoa nhỏ, không có mùi thơm, hoa màu trắng, tím hoặc tím nhạt xếp thành chùm hoa, mỗi chùm hoa

có từ 1-10 hoa hoặc cũng có từ 7-8 hoa, hoa dạng cánh bướm, ống đài năm cánh không bằng nhau Tràng hoa gồm cánh hoa cờ phía sau, hai cánh bên và hai cánh thìa phía trước tiếp xúc nhau nhưng không dính vào nhau Đài hoa có màu xanh, nhiều lông Bộ nhị gồm 10 nhị chia làm hai nhóm: nhóm 1 gồm 9 nhị và cuống dính với nhau thành một khối; nhóm 2 chỉ có một nhụy hoa, nhụy hoa có một lá noãn Vòi nhụy cong về phía nhị Đậu tương là cây có hoa lưỡng tính, hoàn toàn

tự thụ phấn Cây ra hoa sớm hay muộn, thời gian ra hoa tuỳ thuộc vào giống và thời vụ gieo do chịu ảnh hưởng phối hợp của ánh sáng và nhiệt độ Giống chín sớm sau mọc trên dưới 30 ngày đã ra hoa và giống chín muộn 45- 50 ngày mới

ra hoa Thời gian ra hoa dài hay ngắn theo giống và theo thời vụ Có những giống thời gian ra hoa chỉ kéo dài 10-15 ngày Thời kỳ hoa nở rộ thường từ ngày thứ 5 đến ngày thứ 10 sau khi hoa bắt đầu nở Hoa trong đợt rộ mới tạo quả nhiều, còn trước và sau đợt hoa rộ thì tỷ lệ đậu quả thấp Điều kiện thích hợp cho

sự nở hoa là ở nhiệt độ 25-28oC, ẩm độ không khí 75- 80%, ẩm độ đất 70- 80% Cây đậu nành cho nhiều hoa nhưng tỷ lệ hoa không thành quả chiếm 20- 80%

Quả và hạt đậu tương

Hình dáng quả đậu tương là loại quả thẳng hoặc hơi cong, bề ngoài vỏ quả ráp có nhiều lông, khi chín đa số màu vàng hoặc xám Hạt có hình tròn, dẹt, bầu dục bề mặt ngoài chỉ có một lớp vỏ mỏng bao quanh một phôi lớn Vỏ hạt nhẵn [2] Quả thõng, hình lưỡi liềm, gân bị ép, trên quả có nhiều lông mềm màu vàng, thắt lại giữa các hạt Quả đậu tương thuộc loại quả giáp Mỗi quả có từ 1- 4 hạt

Vỏ quả đậu tương có 3 lớp: biểu bì, hạ bì và lớp nhu mô bên trong Do vỏ của lớp

tế bào mô dậu có lớp cutin che phủ nên sự trao đổi khí không xảy ra, sự trao đổi khí giữa phôi và môi trường qua rốn hạt Những mảnh của nội nhũ bị ép chặt vào

Trang 12

vỏ hạt Lớp ngoài nội nhũ gọi là lớp aleuron gồm những tế bào hình lập phương nhỏ chứa đầy đạm Quả đậu tương gồm 2 nửa của lá noãn, nối với nhau ở phần bụng và lưng Trên cả 2 đường nối biểu bì của quả cong vào phía trong tạo nên một lớp nhu mô thẳng đứng, lớp nhu mô này tách mô dẫn thành 2 vùng giúp quả tách ra khi quả chín

Hạt đậu tương cũng như hạt của nhiều loại họ đậu khác là không có nội nhũ

mà chỉ có một lớp vỏ bao quanh một phôi lớn Trong hạt, phôi thường chiếm 2%, 2 lá tử diệp chiếm 90% và vỏ hạt 8% tổng khối lượng hạt Hạt có nhiều hình dạng khác nhau như hình cầu, dẹt, dài và oval Ở hạt trưởng thành, đầu của rốn

là lỗ noãn, lỗ này được bao phủ bởi một lớp màng Ở đầu kia của rốn là rãnh nhỏ Màu sắc, kích thước, khối lượng, rốn hạt khác nhau đặc trưng cho từng giống, khối lượng hạt trung bình khoảng 200-400mg/hạt [3], [4], [7]

Về sinh thái học , nhiệt độ thích hợp ở giai đoạn nẩy mầm và giai đoạn cây con từ 24 - 30oC, độ ẩm ở giai đoạn nẩy mầm 80% nhưng đến giai đoạn cây non

độ ẩm lại giảm xuống 50 - 60% Nhiệt độ 24 - 34oC

là nhiệt độ thích hợp cho giai đoạn ra hoa kết trái, ở giai đoạn này nhu cầu độ ẩm tăng gần như giai đoạn nẩy mầm từ 70 - 80%, sang đến giai đoạn quả chín nhiệt độ thích hợp giảm còn 20 -

25oC và độ ẩm cũng giảm mạnh xuống mức 35 - 45% Ở cây đậu tương lượng mưa cần phải đạt từ 700 mm là tốt nhất Đa số các giống đậu tương có thể trồng trên nhiều loại đất khác nhau như: đất phù sa, đất xám, đất giồng cát, những loại đất này thường có thành phần cơ giới nhẹ, độ PH từ 5-8

1.1.2 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và ơ ̉ Việt Nam

Hiện nay trên thế giới đậu tương là cây trồng đứng thứ tư sau cây lúa mỳ, cây lúa nước và cây ngô Thống kê diện tích, năng suất, sản lượng đậu tương từ 2011-2014 theo FAO được thể hiện bảng 1.1

Trang 13

Bảng 1.1 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới

Chỉ tiêu

Năm

Diện tích (triệu ha)

Năng suất (tạ/ha)

Sản lƣợng (triệu tấn)

Nguồn: FAOSTAT database

Bảng 1.1 cho thấy về diện tích, năng suất đậu tương trên thế giới trong 4 năm gần đây hầu như không biến động hoặc biến động rất ít Sản lượng tăng ở năm 2013 và năm 2014 Đặc biệt so với năm 2011, năm 2014 tăng 17,7%, so với năm 2012 tăng 21,8%

Đậu tương được coi là cây trồng mang tính chiến lược của nhiều Quốc gia: Trung Quốc, Thái Lan, Mỹ, bên cạnh đó đậu tương có khả năng thích nghi rộng nên được trồng ở nhiều vùng khác nhau tập trung nhiều nhất ở Châu Mỹ và Châu

Á Sản phẩm của đậu tương chủ yếu là hạt, trong các loại cây lấy dầu hạt đậu tương chứa một lượng dầu khá lớn do đó cây đậu tương được trồng khá phổ biến Một trong những nước có nền kinh tế phát triển trên thế giới như Mỹ, Brazin cũng tập trung vào việc trồng các giống đậu tương, cùng với Brazin, Argentina và Trung Quốc đã chiếm 90 - 95% tổng sản lượng đậu tương trên toàn thế giới Riêng tại Mỹ chiếm 50% tổng sản lượng đậu tương trên toàn thế giới Theo Tổ chức Nông lương Liên hiệp quốc FAO toàn thế giới đến năm 2011 sản lượng đậu tương đạt 262,04 sau đó do mở rộng diện tích trồng cây đậu tương vào năm 2014 toàn thế giới cho sản lượng đạt 308,43 triệu tấn tăng 46,39 triệu tấn so với năm 2011 Bên cạnh đó cây đậu tương có thể trồng được trên nhiều vùng đất khác nhau như ven nhà, sườn đồi, ven suối, trong vườn… có thể nói rằng đậu tương có khả năng thích nghi rộng ở Châu Mỹ, Châu Á, Braxin, Achentina, cùng với sự phát triển của nền nông nghiệp sản lượng đậu tương ngày càng tăng lên

Trang 14

nhanh chóng và phát triển mạnh ở khu vực Châu Á, theo kết quả nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới nhận thấy cây đậu tương đã có những đóng góp nhất định vào nền kinh tế quốc dân nên đã có rất nhiều nước đã tập trung vào đầu tư mở rộng diện tích để trồng cây đậu tương nhằm làm tăng năng suất

Bảng 1.2 Tình hình sản xuất đậu tương của bốn nước đứng đầu về năng suất

Sản lượng (triệu tấn)

Diện tích (triệu ha)

Năng suất (tạ/ha)

Mỹ 29,85 28,19 84,19 30,79 26,64 82,05 30,70 29,14 89,48 33,61 32,13 108,01 Brazil 23,96 31,21 74,81 24,97 26,36 65,84 27,86 29,32 81,69 30,27 28,65 86,76 Trung

Quốc 78,89 18,36 14,48 67,50 19,33 13,05 66,00 18,93 12,50 6,73 18,12 12,20 Achentina 18,74 26,07 48,87 17,57 22,81 40,10 19,41 25,39 49,30 19,25 27,73 53,39

Nguồn: FAOSTAT database

Đậu tương là cây trồng không những mang lại hiệu quả kinh tế, cải tạo đất

mà đậu tương còn có khả năng thích ứng rộng nên đã được trồng phổ biến ở hầu khắp mọi nơi trên thế giới, nhưng tập trung nhiều nhất ở châu Mỹ và châu Á Từ sau năm 1997 đến những năm gần đây, sản xuất đậu tương trên thế giới liên tục tăng lên cả về diện tích sản xuất và sản lượng

Áp dụng những tiến bộ khoa học vào việc cải tạo và nâng cao chất lượng cây trồng, các cây trồng biến đổi gen đã được trồng ở rất nhiều nước trên thế giới bởi đậu tương biến đổi gen cho năng suất, hàm lượng cao, đồng thời chống chịu được với các điều kiện bất lợi của môi trường: nóng, lạnh, chịu hạn và chịu được thuốc diệt cỏ.…

Tại Việt Nam hiện nay đậu tương đã có những đóng góp to lớn trong ngành công nghiệp: là nguyên liệu của ngành công nghiệp chế biến cao su nhân

Trang 15

tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo, chất đốt nóng, dầu bôi trơn, chế tạo làm nến, xà phòng Đối với nông nghiệp: đậu tương được dùng để làm thức ăn gia súc theo ước tính cứ 1kg hạt đậu tương tương đương với 1,38 đơn vị thức ăn chăn nuôi, để làm thức ăn tươi bên cạnh đó còn sử dụng toàn bộ các bộ phận thân, lá, quả, hạt vì nó có thành phần dinh dưỡng khá cao như N: 6,2%,

P2O5: 0,7%, K2O: 2,4% Trồng cây đậu tương còn có tác dụng cải tạo đất: đậu

tương là cây luân canh cải tạo đất tốt, 1ha trồng đậu tương nếu sinh trưởng tốt để lại trong đất từ 30-60kg N, góp phần tăng năng suất cả hệ thống cây trồng và giảm chi phí cho việc bón N Thân lá đậu tương dùng bón ruộng hay phân hữu cơ rất tốt bởi hàm lượng N trong thân chiếm 0,05 %, trong lá chiếm 0,19% [1], [8] Do đó đậu tương được sử dụng nhiều làm thức ăn cho người và gia súc

Nước ta cây đậu tương được trồng ở nhiều vùng sinh thái với nhiều điều kiện khí hậu khác nhau, đậu tương được trồng ở miền Bắc chiếm khoảng 70%, miền Nam chiếm khoảng 30%, với đặc điểm cây đậu tương được trồng ở những vùng đất không cần màu mỡ trong đó vùng đồng bằng sông Hồng có diện tích trồng đậu tương lớn nhất cả nước với 73.400 ha chiếm 38% diện tích cả nước, các vùng Đông Bắc (24,9%), Tây Nguyên (12,7%), Tây Bắc (10,7%), đồng bằng sông Cửu Long (8,4%) Các vùng Bắc Trung Bộ, duyên hải Nam Trung Bộ và Đông Nam Bộ diện tích chỉ có vài nghìn ha Cây đậu tương được trồng như cây trồng chính hoặc cây trồng xen vào nhiều thời điểm khác nhau trong năm nên có

cả vụ xuân, vụ hè và vụ đông [1]

Hiện nay diện tích sản xuất đậu tương của cả nước đang có xu hướng tăng lên tuy nhiên sản lượng đậu tương tăng không đáng kể và không ổn định Đến năm 2011 tại Việt Nam bắt đầu sản xuất đậu tương trên quy mô công nghiệp tuy nhiên sản lượng vẫn còn có phần hạn chế, nhằm giải quyết tình trạng thiếu hụt về các sản phẩm đậu tương nước ta cũng đã phải nhập khẩu một lượng khá lớn các sản phẩm về đậu tương nhằm cung cấp cho các ngành công nghiệp, ngành chế biến thức ăn gia súc, nuôi trồng thủy hải sản, riêng năm 2013 trong tổng số 13,4

Trang 16

triệu tấn thức ăn chăn nuôi cho gia súc thì đậu tương chiếm gần 3,5 triệu tấn và cũng năm 2013 Việt Nam phải nhập khẩu 556 nghìn tấn đậu tương từ Mỹ Trong khu vực ASEAN Việt Nam là nước đứng thứ 3 về diện tích trồng đậu tương sau một số nước như Lào, Campuchia, Thái Lan, tuy nhiên năng suất vẫn còn rất thấp

Bảng 1.3 Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam Chỉ tiêu

Năm

Diện tích (nghìn ha)

Năng suất (tấn/ha)

Sản lƣợng (nghìn tấn)

2012 và từ đó cho đến nay cây ngô được canh tác thương mại tại Việt Nam do đó sản lượng các giống ngô luôn cao hơn so với giống đậu tương

Trang 17

1.1.3 Thành phần dinh dưỡng trong hạt đậu tương

Trong hạt đậu tương có chứa đầy đủ các thành phần dinh dưỡng: protein, lipid, các loại muối khoáng , trong đó hàm lượng protein chiếm từ 38- 40%, lipid chiếm từ 15- 20%, hydrat cacbon từ 15- 16% và nhiều muối khoáng, nước chiếm khoảng 8%, các chất vô cơ khoảng 5%, các muối khoáng Na, K, Ca, S,

P, Mg, Fe

Đậu tương có chứa thành phần dinh dưỡng cao, là thức ăn bổ dưỡng có thể thay thế các loại thịt, cá, trứng Hàm lượng protein có trong đậu tương trung bình khoảng 35- 45% và cao gấp đôi so với các loại đậu khác So với thịt động vật, đậu tương có nhiều chất dinh dưỡng hơn: 100 gr đậu tương có 411 calo; 34

gr đạm; 18 gr béo; 165mg calcium; 11mg sắt; trong khi đó thịt bò có 165 calo, 21gr đạm; 9gr béo; 10mg calcium và 2,7 mg sắt [6], [8], [15]

Hạt đậu tương có 3 bộ phận: vỏ hạt chiếm 8% trọng lượng hạt; phôi chiếm 2% và tử diệp chiếm 90% Tùy thuộc vào điều kiện đất đai, thời tiết, mùa vụ mà thành phần dinh dưỡng trong hạt đậu tương có thể thay đổi[1], [2], [5]

Protein và các amino acid

Protein có trong đậu tương chiếm khoảng 38-40% hoặc có loài hàm lượng protein trong đậu tương chiếm đến 50%, có những sản phẩm được chế biến từ đậu tương cho hàm lượng protein lên đến 90-95%, đây là nguồn cung cấp protein có giá trị cao cho con người Các nhóm Protein đơn giản như albumin: 6-8%; globulin: 25-34%; glutelin: 13-14% Protein của đậu tương không có Cholesteron, dễ tiêu hóa, dễ tan trong nước và chứa nhiều loại acid amin không thay thế cần thiết cho cơ thể sống như: leucine chiếm 8,4%, isoleucine: 5,8%, methionine chiếm 1,4%; valine: 5,8%, tryptophan: 1,1%, phenylalanine: 3,8%, threonine: 4,8%, lysine: 6,0% Hàm lượng của các chất amino acid này tương đương với hàm lượng của các chất amino acid có trong trứng gà, đặc biệt hàm lượng Trytophan gần gấp đôi so với hàm lượng chứa trong trứng gà [8]

Trang 18

Lipid

Hàm lượng lipid trong đậu tương khoảng 15-20% hoặc có thể đạt tới 23% Trong hạt đậu tương hàm lượng các chất béo cao hơn nhiều lần so với các loại thực vật cung cấp dầu Lipid của đậu tương chứa một tỷ lệ các acid béo chưa no cao như: acid oleic chiếm 25- 36%, acid linoleic: 52 -65% và acid linolenoic: 2 -3% đây là những loại không thể thiếu đối với cơ thể [15] Ngoài ra còn chứa các acid béo no chứa nhiều giá trị dinh dưỡng cao: acid panmitic: 6- 8%; acid stearic: 3-5%; acid arachidoic: 0,1-1,0%

Đặc biệt trong dầu đậu tương còn chứa lecinthin có tác dụng làm cho cơ thể trẻ lâu, tăng cường trí nhớ, có khả năng tái sinh các mô cơ, xương và tăng cường sức đề kháng cho cơ thể

Glucid trong đậu tương chiếm khoảng 22-35,5%, gồm hai loại tan và không tan trong nước Hạt đậu tương có P 2O5 chiếm 0,6-2,18%; K2O: 1,91-2,64%; CaO: 0,23- 0,63%; MgO: 0,22- 0,55%; SO3: 0,41- 0,44; Na2O: 0,38%; Cl:0,025

và các chất khác : 1,17% Về vitamin, hạt đậu tương chứa các vitamin tan trong nước: vitamin B1, vitamin B2, vitamin B3, vitamin B6, vitamin PP và các vitamin tan trong dầu: vitamin A, vitamin D, vitamin E, vitamin K

Ngoài ra trong hạt đậu tương khô chứa khoảng 5% khoáng, với các nguyên

tố khoáng đa lượng như muối của K chứa 2%, P: 0,65%, Mg: 0,24%, S: 0,45%, Ca: 0,23%, Na: 0,38%; Cl và những nguyên tố khoáng vi lượng gồm có: Cu, Zn,

Fe, Co, Pb, I, Se, Mn, Cd,… Hàm lượng trung bình của các nguyên tố khoáng đa lượng chiếm từ 0,2-2,1% còn hàm lượng của những nguyên tố khoáng vi lượng chiếm 0,01-140 ppm [15]

Ngoài ra trong hạt đậu tương còn có các chất có hoạt tính sinh học , như isoflavone, saponin, lecithin, trypsin inhibitor, lectins, phytosterol

Isoflavone có rất nhiều các tác dụng sinh học đã và đang được nghiên cứu

để đưa vào ứng dụng trong thực tiễn Theo các kết quả nghiên cứu trong 100 g

Trang 19

đậu tương có đến 33 -38 gam chất đạm Khi cơ thể người đặc biệt nam giới khi

sử dụng lượng đạm có trong đậu tương giúp tăng cường cơ bắp Trong quá trình tiêu hóa các sản phẩm của đậu tương, đường ruột tiết ra chất kìm hãm hoạt động của hoocmon gây ung thư tuyến tiền liệt và hói đầu Isoflavone giúp ngăn ngừa ung thư tuyến tiền liệt ở nam giới, giúp nâng cao và cải thiện chất lượng tinh trùng ở nam giới Isoflavone có tác dụng chống oxy hóa, làm bền vững màng tế bào nơi dễ bị peroxyd hóa gây ra các rối loạn làm hủy hoại tế bào [5], [29] Tác dụng trên mạch máu, làm tăng tính thấm của mao mạch Do đó được dùng trong các trường hợp rối loạn chức năng tĩnh mạch, tĩnh mạch bị suy yếu, giãn tĩnh mạch, trĩ, chảy máu do đặt vòng trong phụ khoa, các bệnh trong nhãn khoa như sung huyết kết mạc, rối loạn tuần hoàn võng mạc [5]; tác dụng chống độc, giảm tổn thương và bảo vệ, giải độc gan [7] Một số nghiên cứu cho thấy đã có tác dụng để điều trị viêm gan, xơ gan, bảo vệ tế bào gan như cây Actiso, cây Bụt dấm…[5] Tác dụng chống viêm, có thể sử dụng để điều trị ban đỏ, viêm da, tổn thương da và màng nhầy trong trường hợp điều trị xạ trị [5] Isoflavone có tác dụng làm tăng biên độ co bóp và tăng thể tích phút của tim, làm hồi phục tim khi

bị gây ngộ độc bởi chloroform, quinin, methanol [5] Ngoài ra còn có tác dụng chống kết tập tiểu cầu [7], [29] Đặc biệt, các dẫn chất thuộc nhóm isoflavonoid

có tác dụng như estrogen, điều này được giải thích là do sự gần nhau về mặt cấu trúc với diethylstilbestrol [5] Ngoài ra còn có các tác dụng chống co thắt các tổ chức cơ nhẵn như túi mật, ống dẫn mật, phế quản, tác dụng thông tiểu, chống loét dạ dày [5] Các nghiên cứu còn chỉ ra tác dụng chống ung thư, ức chế sự phát triển tế bào ung thư của genistein [29], tăng tuần hoàn não và điều trị trĩ Một số isoflavone như daidzein được dùng để tăng cường tuần hoàn, chống nấm,

kháng khuẩn, chống virus [7]

Saponin: chiếm một lượng 0,1-0,3% saponins Có 3 nhóm saponins đậu

tương được phát hiện là: Saponins A,Saponins B, Saponins E Saponins có tác

Trang 20

dụng giảm lượng cholesterol trong máu, ngăn ngừa sự phát triển của các tế bào ung thư, tăng cường khả năng miễn dịch của cơ thể

Lecithin (phosphatidyl choline): chiếm khoảng 0,5- 1,5% Lecithin là một

nguồn quan trọng của choline Lecithin tham gia sự trao đổi chất, xây dựng cấu trúc tế bào có tác dụng giảm nguy cơ mắc các bệnh về tim mạch, ngăn ngừa sự phát triển bất thường của bào thai, giúp tăng cường trí nhớ, ngăn ngừa hoặc làm giảm tác dụng phụ của một số loại thuốc

Trypsin inhibitor: Có 2 loại chất ức chế trypsin được phân lập ra từ đậu

tương là: Kunitz trypsin inhibitor và Bowman-Birk (BB) inhibitor, có khả năng

ức chế enzyme trypsin trong cơ thể người, riêng BB inhibitor còn có khả năng ức chế chymotrypsin Các trypsin inhibitors này dễ bị phá hủy bởi nhiệt Nhiều nghiên cứu mới đây cho thấy rằng, các trypsin inhibitors có thể là nguyên nhân gây ra chứng phình to tuyến tụy ở trẻ nhỏ Bên cạnh đó, người ta cũng thấy được

rằng BB inhibitor cũng có khả năng ngăn ngừa các tác nhân gây ra ung thư

Lectin ( hoặc gọi hemagglutinins), lectins rất tốt cho sức khỏe như: làm

giảm lượng insulin trong máu, giảm suy thoái của gan và thận

Phenolic acid: có tác dụng phòng ngừa sự tấn công của các tế bào ung thư Omega - 3 fatty acid: là chất béo không bão hoà có khả năng làm giảm

luợng cholesterol xấu LDL và làm gia tăng lượng cholesterol tốt HDL trong máu

Phytosterol: Hạt đậu tương chứa khoảng 0,3-0,6 mg/g là phytosterols, trong

đó stanol chiếm khoảng 2% Có 3 nhóm phytosterols chính đó là Campesterol,

-sitosterol và stigmasterol Các phytosterol có khả năng làm giảm hàm lượng cholesterol trong máu, giảm nguy cơ về các bệnh tim mạch, làm giảm sự phát

triển của các bướu ung thư kết tràng, chống lại ung thư da

Trang 21

1.2 ISOFLAVONE VÀ CHU TRÌNH CHUYỂN HÓA ISOFLAVONE TRONG ĐẬU TƯƠNG

1.2.1 Hợp chất isoflavone trong đậu tương

Isoflavone có nguồn gốc từ các loài thực vật khác nhau nhưng tập trung chủ yếu ở các giống đậu tương Có thể nói hợp chất isoflavone được ví như phytoestrogen do nó có tác dụng như estrogen Đây chính là tác dụng nổi bật của nhóm isoflavone Trong tự nhiên, daidzein và genistein là hai chất quan trọng nhất, chiếm phần lớn trong tổng số các isoflavone nên chúng được coi là đối tượng chính trong nghiên cứu hiện nay Isoflavone không chỉ có trong các dược liệu mà có trong các loại thực phẩm cung cấp trong các bữa ăn hàng ngày của con người Đậu tương là loại thực phẩm tập trung chứa nhiều hàm lượng isoflavone nhất và đã được người dân thường xuyên sử dụng, chế biến dưới

nhiều dạng khác nhau

Do sự tương đồng về cấu trúc hóa học nên isoflavone có thể can thiệp vào hoạt động của estrogen trong cơ thể người Tùy thuộc vào thụ quan estrogen trên các tế bào mà isoflavone có thể làm giảm hoặc kích hoạt các hoạt động của

estrogen Isoflavone dạng tự do có 3 loại genistein, daidzein và glycitein (isoflavone aglucone) Genistein và daidzein là hai hợp chất isoflavone tự nhiên đang được nghiên cứu vì lợi ích sức khỏe đáng kể mà nó đem lại, hai hợp chất này chiếm phần lớn trong tổng số các isoflavone Ngoài dạng isoflavone tự do trong hạt đậu tương còn có isoflavone dạng liên hợp glucoside, glucoside acetyl

và dạng malonyl Theo FDA thì tổng hàm lượng daizdein và genistein chiếm khoảng từ 93% đến 98% isoflavone tổng số Khi ha ̣t đậu nảy mầm lượng isoflavone đạt tới đỉnh điểm Isoflavone có thể làm giảm sự xuất hiện của một số loại ung thư, chống viêm nhiễm, giảm các triệu chứng mãn kinh, ngăn ngừa các bệnh về tim mạch và có thể tác động tích cực đến quá trình sinh lý khác

Khi so sánh thành phần isoflavone trong phôi , lá mầm, vỏ hạt và hạt đậu tương nhóm các nhà khoa ho ̣c Hàn Quốc đã thông báo kết quả tổng tỉ lệ trung

Trang 22

bình của isoflavone là 2887 μg/g trong phôi, 575 μg/g trong hạt, 325 μg/g trong

lá mầm và 33 μg/g trong vỏ hạt Họ cũng đã phân tách được 12 đồng phân isoflavone trong 90 phút/mẫu thí nghiệm [7] Trong hạt đậu tương các aglucone chiếm một lượng nhỏ , bao gồm sissotrin , ononin; các dẫn xuất acetyl của β-glucozit: 6’-acetylsissotrin, 6’-acetylononin; các dẫn xuất malonyl của β-glucozit: 6’-malonylsissotrin, 6’-malonylononin [10]

Theo các kết quả nghiên cứu trong năm 2005, các nhà khoa học Brazil đã tiến hành phân tích 18 mẫu đậu tương Kết quả cho biết isoflavone trong đậu tương là một hợp chất phenolic gồm có: aglucone (daidzein, genistein và glycitein), ß - glucoside (genistin, daidzin, glycitin), ß - glucoside kết hợp với nhóm malonyl ( 6’ - O - malonyldaidzin, 6’ - O - malonylgenistin và 6’ - O - malonylglycitin), ß - glucoside kết hợp với nhóm acetyl (6’

- O - acetyldaidzin, 6’

- O - acetylgenistin và 6’ - O - acetylglycitin)

Tiếp sau đó các nhà khoa học Bồ Đào Nha cũng đã sử dụng các phương pháp sắc kí lỏng cao áp HPLC/DAD và phổ UV để xác định thành phần của isoflavone trong 40 mẫu hạt đậu tương, kết quả nghiên cứu cho thấy trong hạt đậu tương các aglucone chiếm một lượng nhỏ, hợp chất chính trong hạt đậu tương là các dẫn xuất malonyl và dẫn xuất axetyl của ß - glucoside

Đến năm 2006 các nhà khoa học Hàn Quốc đã thực hiện một nghiên cứu so sánh thành phần isoflavone trong phôi, lá mầm, hạt và vỏ hạt đậu tương Kết quả nhận được, tổng tỉ lệ trung bình của isoflavone là 2887μg/g trong phôi, 575μg/g trong hạt, 325μg/g trong lá mầm, 33μg/g trong vỏ hạt Các nhà khoa học cũng

đã phân tách được 12 đồng phân isoflavone bằng phương pháp sắc kí HPLC - PDA [19] Cấu trúc cơ bản của isoflavone gồm 2 vòng bezen: A và B nối với một dị vòng pyron [32]

Trang 23

Hình 1.1 Cấu trúc hoá học của các aglucone

HO HO

Daidzin

HO HO

Hình 1.2 Cấu trúc hoá học của các ß-Glucoside

Phần lớn các isoflavone trong đậu tương là ở dạng glucoside như genistin, daidzin, glycitin Tuy nhiên, dạng isoflavone này có hoạt tính sinh học thấp hơn

so với dạng aglucone (genistein, daidzein, glycitein)

Ribeiro và cs đã xác định được trong đậu tương nảy mầm, isoflavone dạng aglucone tăng lên rất nhiều do hoạt tính của β-glucosidase nội bào của đậu tương được kích hoạt bởi quá trình nảy mầm Enzyme này cắt liên kết β-glucoside trong phân tử genistin, loại đi phân tử glucose để chuyển thành genistein [24]

1.2.2 Chu trình chuyển hóa isoflavone

Isoflavone được tổng hợp từ một nhánh của con đường trao đổi chất phenylpropanoid (Hình 1.4) Tiền thân của con đường là một amino axit L-phenylalanine, mà bước khởi đầu là loại bỏ đi nhóm amin để tạo ra axít cinnamic qua các enzym lyase phenylalaninen ammonia (PAL) Trong phản ứng thứ hai và

Trang 24

thứ ba, cinnamate 4-hydroxylase (C4H) và 4 coumarate CoA ligase (4CL)

chuyển đổi thành axit cinnamic p-coumaryol CoA Các enzym quan trọng đầu

tiên để tổng hợp flavonoid là chalcone synthase (CHS) và chalcone isomerase

(CHI), trong đó chuyển đổi chalcone thành flavone và chalcone reductase (CHR)

là cần thiết cho sự hình thành daidzein và glyceollins Sau đó, enzym isoflavone

synthase (IFS) tham gia xúc tác cho con đường sinh tổng hợp isoflavone Đây là

enzym đầu tiên chuyển đổi isoflavone và các sản phẩm isoflavone trong con

đường sinh tổng hợp isoflavone [15] Như vâ ̣y , trong con đường chu yển hóa

tổng hơ ̣p isoflavone, có hai enzyme quan trọng nhất và được coi như enzym chìa

khóa trong con đường sinh tổng hợp isoflavone ở cây đậu tương là chalcone

isomerase (CHI) và isoflavone synthase (IFS) [14]

Hình 1.3 Sơ đồ một phần của con đường phenylpropanoid [21]

Các chất trung gian và các enzym tham gia vào quá trình tổng hợp isoflavone Mũi

tên nét đứt đại diện cho nhiều bước; mũi tên liền đại diện cho các bước kế tiếp

Trang 25

1.2.3 Isomerase chalcone (CHI) và gen CHI

Isomerase chalcone (CHI) là enzyme thứ hai trong con đường sản sinh flavonoid và xúc tác chuyển đổi 1 chalcone  1 flavanone – là nguyên liệu để tạo ra flavonoid và isoflavonoid [8] Enzym CHI phân lập từ thực vật không thuộc cây họ đậu không thể sử dụng isoliquiritigenin như một chất nền vì vậy CHI được phân thành hai loại chính là loại I và loại II [16] Loại I, CHI có thể xúc tác cho 6-hydrox-chalcone tạo thành (2S)–flavonoid hoặc (2S)–5- desoxidation flavonoid Loại I, CHI đã được tìm thấy trong hầu hết các loại thực vật cả thực vật họ đậu cũng như không thuộc họ đậu có thể kể đến như lúa mạch,

Arabidopsis và lúa [6] Loại II, CHI chủ yếu tìm thấy trong cây họ đậu có thể

xúc tác cho cả 6-hydrox-chalcone và 6-deoxidation-chalcone vào (2S)-flavonoid hoặc (2S)-5-desoxidation flavonoid [9]

Kết quả nghiên cứu năm 1994, Heather và Ann H đã phân lập được hai gen

CHI ký hiệu là CHI1, CHI2 với kích thước lần lượt là 666 bp và 845 bp từ

cDNA của cỏ linh lăng (Medicago sativa L.) [13] Sau đó Grotewold và Peterson

đã phân lập được gen CHI từ cây ngô và thấy rằng các gen mã hóa một sản phẩm ZmCHI1 có trọng lượng phân tử là 24,3 kDa Gen CHI1 ngô này có cấu trúc

phân đoa ̣n và gồm 4 exon [11] Năm 2003, Norimoto và cs đã phân lập được 3

gen: CHI1, CHI2 và CHI3 từ cDNA của cây Lotus japonicus và công bố trên GenBank; gen CHI1 mang mã số AB054801, chiều dài 681 bp, mã hóa cho chuỗi polypeptide 226 amino acid (24,4 kDa); gen CHI2 mang mã số

AB054802, chiều dài 666 bp, mã hóa cho chuỗi polypeptide 221 amino acid

(23,9 kDa) và CHI3 với mã số AB073787, chiều dài 678 bp, mã hóa cho 225 amino acid (24,2 kDa) [20] Năm 2005, Ralston đã phân lập gen CHI1A từ

mRNA cây đậu tương và thấy gen có chiều dài 1157 bp, mã hóa cho 128 amino

acid [22] Đến năm 2010, Soderlund cũng đã phân lập được 1 gen CHI1 từ

mRNA của cây ngô với chiều dài 1080 bp [27] Terai và cs đã nghiên cứu phân

lập được gen CHI từ cDNA của cây sắn dây Pueraria lobata với kích thước gen

Trang 26

là 675 bp mã hóa một polypeptide 225 amino acid, trọng lượng phân tử 23,8kDa

Gen CHI (cDNA) đã được gắn vào vector biểu hiện pET-3d và biểu thành công trong Escherichia coli [28] Gen CHI cũng được phân lập từ mRNA lá cây nho (Vitis vinifera L.) bởi tác giả Gutha và cs, kích thước củ a gen là 979 bp, mã hóa cho 234 amino acid [12] Năm 2015, Dastmalchi và cs đã chỉ ra rằng CHI

được xếp vào 4 phân họ dựa trên các trình tự tương đồng và các cơ chất đặc hiệu với enzyme CHI thuô ̣c họ CHI [8]

Trang 27

2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT,THIẾT BỊ, VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu

Sử du ̣ng ba giống đâ ̣u tương Viê ̣t Nam ĐT 51, DT90, DT84, làm vật liệu nghiên cứu Trong đó giống DT84 và DT90 do Viện Di truyền nông nghiệp cung cấp; giống ĐT51 do Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm thuộc Bộ Nông nghiệp cung cấp Hình ảnh hạt của

ba giống đâ ̣u tương đươ ̣c thể hiê ̣n ở Hình 2.1

Hình 2.1 Hình ảnh hạt của ba giống đâ ̣u tương nghiên cứu

A: ĐT51; B: DT90; C: DT84 Giống đậu tương ĐT51 do Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ- Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm chọn lọc từ tổ hợp lai giữa hai giống LS17 và giống DT2001 Giống đậu tương ĐT 51 có đặc điểm: hoa màu tím , hạt vàng, rốn nâu đậm, quả chín có màu vàng Chiều cao cây trung bình 45-55cm, phân cành khá, hơn 2 cành/cây, số quả chắc cao, tỷ lệ quả 3 hạt đạt 25-30% Khối lượng 100 hạt khoảng từ 17,5-20,0 g Thời gian sinh trưởng trung bình 90-

95 ngày, năng suất 20-29 tạ/ha, tuỳ thuộc vào mùa vụ và điều kiện thâm canh Giống thích hợp trong vụ hè, xuân và vụ đông Đây là một trong nhiều giống đậu tương được trồng rộng rãi ở miền Bắc

Trang 28

Giống đâ ̣u tương DT 90 do Viê ̣n Di truyền nông nghiê ̣p cho ̣n ta ̣o bằng phương pháp lai hữ u tính kết hợp với đô ̣t biến thực nghiê ̣m sử du ̣ng tia gamma

Co60, 18 Krad ở dòng lai F 2 (K7002 x Co ̣c chùm ) đươ ̣c công nhâ ̣n và khu vực hóa năm 1994 Giống DT90 có hoa trắng, lá hình tim nhọn, màu xanh sáng, lông nâu, cây cao 45-50 cm, thân có 10-11 đốt, phân cành vừa phải, cây go ̣n phù hợp với trồng thuần và trồng xen Quả chín màu xanh xám, số quả chắc là 22-35, tỷ

lê ̣ quả 3 hạt từ 15%-20% Giống DT90 có khả năng chống đổ, chống các bê ̣nh gỉ sắt, sương mai, đốm nâu vi khuẩn , lở cổ rễ Chịu nhiệt và lạnh khá Hạt vàng sáng, rốn ha ̣t trắng , hạt to , khối lươ ̣ng 1000 hạt từ 180-270g Tỷ lệ protein từ 41,6-47,5%, lipid khoảng 18,4%

Giống đậu tương DT84 do Viện di truyền nông nghiệp tạo ra từ tổ hợp lai DT-80/ĐH4 (DT96) bằng phương pháp lai hữu tính kết hợp gây đột biến thực nghiệm bằng tia gamma Co60

trên dòng lai F3-D333 Cây cứng, bộ lá gọn có màu xanh đậm Hoa tím, lông trên quả và thân màu vàng, vỏ quả khi chín màu vàng Hạt to tròn, màu vàng tươi, to, ít nứt, khối lượng 1000 hạt 160-180 gam, hiện nay giống đậu tương DT84 được trồng phổ biến ở nhiều nơi vì sản phẩm luôn đạt chất lượng tốt, năng suất cao, khả năng chống chịu với nhiều điều kiện bất lợi của môi trường

Trang 29

Vector tách dòng pBT do Viện Công nghệ Sinh học cung cấp

Các hóa chất dùng trong xác định hàm lượng isoflavone trong các giống đậu tương: các chất chuẩn: genistein, daidzein Các chất: acetonitril, methanol,

natri format acid formic (HPLC); tetrahydrofuran (HPLC); HCl (HPLC); nước

cất (HPLC) và các hoá chất khác được mua của hãng Invitrogen, Fermatas, Merck

Các loại hóa chất khác như cồn tuyệt đối, sorbitol, chloroform của Việt Nam, Trung Quốc sản xuất

2.1.3 Thiết bị

Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: Máy sắc ký lỏng cao áp, máy lắc ổn nhiệt, máy li tâm lạnh , máy khuấy trộn Vortex, máy đo pH, máy PCR, thiết bị giải trình tự nucleotide , máy quang phổ, bể ổn nhiệt, bộ điện di DNA, máy chụp ảnh gel, tủ an toàn sinh học, cân phân tích 10-4g, pipetman các loại, tủ lạnh -30 o

C, -84 oC, tủ ấm và một số thiết bị khác

2.1.4 Địa điểm nghiên cứu

Các thí nghiệm phân lâ ̣p gen được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghê ̣ gen, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên Giải trình tự nucleotide được thực hiện tại Phòng thí nghiệ m Tro ̣ng điểm công nghê ̣ gen, Viện Công nghê ̣ sinh ho ̣c Thí nghiệm phân tích hàm lượng isoflavone thực hiê ̣n ta ̣i Khoa Nghiên cứu Thực phẩm - Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia Hà Nội, Bộ y tế

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp phân tích hàm lượng isoflavone trong các mẫu đậu tương (ĐT51, DT90, DT84)

Mầm hạt đậu tương nảy mầm 3 ngày tuổi được sử du ̣ng làm nguyên liê ̣u

để chiết rút daidzein và genistein Đi ̣nh lươ ̣ng daidzein và genistein theo phương pháp sắc ký HPLC

Trang 30

Nguyên lý: Dịch chiết chứa daidzein và genistein được chiết từ mầm đậu

tương sử dụng dung môi thích hợp Dịch chiết thu được sau đó được loại tạp, làm sạch mẫu qua hệ thống SPE Dịch thu được sau đó được phân tích trên hệ thống HPLC

Phương pháp phân tích đi ̣nh lượng daidzein và genistein được thực hiê ̣n

theo phương pháp AOAC Official 2006.07 và theo Hao Chen và cs (2001)

Cân chính xác 2g mẫu đã được ủ cho nảy mầm 3 ngày tuổi cho vào ống

ly tâm 50ml có nắp kín, thêm 35 ml dung dịch chiết mẫu, đậy kín nắp, lắc đều Thủy phân trong 2 giờ tại nhiệt độ 80o

C, sau đó để nguội và ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút, gạn lấy phần dịch trong phía trên Thêm 10 ml dịch chiết vào phần cặn, lắc đều trong 1 phút rồi đem ly tâm, gộp phần dịch trong cho vào bình định mức 50ml, định mức bằng acetonitril Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm, phân tích trên HPLC

HPLC là kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích hòa tan trong pha động

là chất lỏng và di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh Tùy thuộc vào ái lực của chất phân tích với pha động và pha tĩnh mà các chất di chuyển với tốc độ khác nhau, do đó thứ tự khác nhau Thành phần pha động đưa chất phân tích ra khỏi

cột được thay đổi để rửa giải các chất với thời gian hợp lý [21]

Điều kiện sắc ký:

Pha tĩnh: Cột C18 Symmetry Waters (250mm x 4,6mm; 5µm)

Nhiệt độ cột: 40 oC, tốc độ dòng: 1,0 ml/phút, thể tích tiêm mẫu: 50µl

Detector PDA quét phổ từ 200-400nm, định lượng ở bước sóng 260nm

Pha động: gradient giữa methanol và dung dịch đệm format

Định dạng
Số trang	60
Dung lượng	1,3 MB