Đặc điểm di truyền, hình thái và hiện trạng phân bố của ba loài hopea đang bị đe dọa ở việt nam sao hải nam (hopea hainanensis merr chun), sao hòn gai (hopea hongayensis tardieu) và sao mặt quỷ (hopea mollissima c y wu)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SI

Trang 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Tên đề tài:

Đặc điểm di truyền, hình thái và hiện trạng phân bố ba loài Hopea

đang bị đe dọa ở Việt Nam

Sao Hải Nam (Hopea hainanensis Merr & Chun),

Sao Hòn Gai (Hopea hongayensis Tardieu)

và Sao Mặt Quỷ (Hopea mollissima C.Y.Wu)

Họ tên học viên : Trần Thu Hương Người hướng dẫn : TS.Nguyễn Thị Phương Trang

Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm

Mã số : 60420114

Trang 2

2

Hà Nội, 2014

Mở đầu

Hiện nay, ở Việt Nam, họ Dầu được biết có sáu chi

(Anisoptera, Hopea, Parashorea, Vatica, Dipterocarpus, Shorea),

hầu hết là loài bản địa và đặc hữu Các loài họ Dầu hiện chỉ còn gặp trong các khu bảo tồn đã được quy hoạch vì trong những năm qua, do chiến tranh tàn phá, do giá trị thương mại và nhu cầu của người dân địa phương khai thác quá mức mà diện tích rừng nói chung và rừng hỗn giao cây họ Dầu nói riêng đã bị suy giảm nghiêm trọng

Trong các loài họ Dầu, Sao hải nam, Sao hòn gai và Sao mặt quỷ là những loài phân bố hẹp, chỉ có ở Việt Nam và Trung Quốc, Đây là loài có nhiều giá trị cả về mặt khoa học, giá trị kinh kinh tế cũng như giá trị y học Tuy nhiên hiện nay ba loài này đang đứng trước nguy cơ tuyệt chủng do mức độ suy giảm nơi sống và việc khai thác không hợp lý Mặc dù vâ ̣y , cho đến nay chưa có bất kỳ công trình nào nghiên cứu riêng về các loài này ở Việt Nam Cho đến nay, chúng ta chưa có các số liệu cụ thể, thông tin về di truyền, các yếu tố ảnh hưởng xấu đến sự tồn tại của ba loài này liên quan đến tác động của con người cũng chưa được

Trang 3

3

nghiên cứu, vì thế rất khó để nâng cao hiệu quả của công tác bảo tồn và phát triển bền vững chúng

Chính vì v ậy, chúng tôi đề xuất thực hiện nghiên cứu về

“Đặc điểm di truyền, hình thái và hiện trạng phân bố của ba

loài Hopea đang bị đe dọa ở Việt Nam: Sao hải nam (Hopea

hainanensis Merr & Chun), Sao hòn gai (Hopea hongayensis

Tardieu) và Sao mặt quỷ (Hopea mollissima C.Y.Wu)”như một bước nghiên cứu đầu tiên nhằm cung cấp thông tin cần thiết cho

về di truyền, bổ sung cơ sở dữ liệu về di truyền của ba loài này ở Việt Nam, đồng thời góp phần phục vụ công tác bảo tồn và sử dụng bền vững loài của cộng đồng dân cư địa phương

Mục tiêu nghiên cứu

Xây dựng cơ sở dữ liệu về di truyền của ba loài Hopea

quý của Việt Nam

Nội dung nghiên cứu

 Khảo sát, điều tra hiện trạng về phân bố, cấu trúc quần thể

của ba loài Sao Hòn gai (Hopea hongayensis Tardieu) tại hai đảo

Ba Mùn và đảo Cái Lim, VQG Bái Tử Long, tỉnh Quảng Ninh,

Sao Mặt Quỷ (Hopea mollissima C.Y.Wu) tại phân khu Khe Rỗ,

Trang 4

4

khu BTTN Tây Yên Tử, tỉnh Bắc Giang và Sao Hải nam (Hopea hainanensis Merr & Chun) tại VQG Bến En, tỉnh Thanh Hóa

 Xác định các đặc điểm di truyền ba vùng gen lục lạp bao

gồm matK, psbA – trnH và rbcL bằng phân tích trình tự gen

 Xác định mối quan hệ di truyền của ba loài này với một sốloài họ Dầu khác ở Việt Nam trên cơ sở trình tự ba vùng gen lục lạp nêu trên

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận văn

Kết quả nghiên cứu sẽ góp phần bổ sung cơ sở dữ liệu về di truyền cho danh lục các loài thực vật quý hiếm đang bị đe dọa tuyệt chủng ở Việt Nam, góp phần cho công tác bảo tồn nguồn gen, làm cơ sở khoa học cho công tác bảo tồn và phát triển bền vững ba loài gỗ quý này của Việt Nam

Trang 5

5

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Tổng quan về cây họ Dầu và ba loài nghiên cứu

Họ Dầu (Dipterocarpaceae) bao gồm 17 chi và khoảng 680

loài chia thành ba phân họ: Dipterocarpoideae gồm 13 chi và

khoảng 600 loài ở vùng nhiệt đới châu Á và Malesia;

Pakaraimoideae là đặc hữu vùng cao Guaianan – vùng nhiệt đới Nam Mỹ và Monotoideae với 3 chi và 30 loài ở vùng nhiệt đới Châu Phi và Nam Mỹ Các chi lớn nhất trong họ Dầu là Shorea (khoảng 250 loài), Hopea (105 loài), Dipterocarpus (70 loài) và Vatica (65 loài) Các loài cây họ Dầu đã tạo nên một họ thực vật

độc đáo và nổi tiếng nhất của vùng nhiệt đới Hiện nay gỗ của các loài cây họ Dầu đang chiếm thị phần lớn trên thị trường gỗ thế

Trang 6

6

giới nên rõ ràng chúng đang đóng một vai trò quan trọng đối với nhiều nước, nhất là các nước Châu Á mà đặc biệt là các nước Đông Nam Á Tuy nhiên, do khai thác quá mức và chuyển đổi mục đích sử dụng đất mà diện tích rừng nói chung và cây họ Dầu nói riêng đã bị suy giảm nghiệm trọng

Có khoảng 45 loài cây họ Dầu với 6 chi được tìm thấy ở Việt Nam, chúng là những cây rừng phổ biến và đóng vai trò quan trọng về giá trị sinh thái và kinh tế Phần lớn các cây họ Dầu ở Việt Nam là bản địa và đặc hữu Do giá trị thương mại và nhu cầu của người dân địa phương, các loài cây họ Dầu bị khai thác quá mức Hơn nữa, trong nhiều năm, dưới áp lực tăng trưởng kinh tế nhanh là hậu quả của sự suy giảm diện tích rừng và tăng mức độ phân cắt của các mảnh rừng còn lại Kết quả này làm ảnh hưởng đến nơi sống của cây họ Dầu

Sao hải nam(Hopea hainanensis Merr et Chun), Sao hòn

gai (Hopea hongayensis Tardieu), Sao mặt quỷ (Hopea mollissima

C.Y.Wu) đều là những loài đặc hữu, có đặc điểm hình thái gần giống nhau, phân bố rải rác trên khắp Việt Nam Ba loài đều nằm trong Sách đỏ Việt Nam và được tổ chức IUCN xếptrong các mức phân hạng khác nhau

Trang 7

và khai thác một cách hợp lý nguồn tài nguyên sinh vật trên thế giới cũng như ở Việt Nam

Tổng quan về hệ gen lục lạp sử dụng trong nghiên cứu

Trong số các gen lục lạp thì matK là 1 trong những gen tiến

hóa nhanh nhất, có kích thước khoảng 1550bp và mã hóa cho

enzyme maturase liên quan đến quá trình loại bỏ các in-tron loại

Trang 8

8

hai trong quá trình phiên mã RNA Do matK tiến hóa nhanh và có

mặt trong hầu hết các loài thực vật nên được sử dụng như một chỉ thị trong nghiên cứu mối quan hệ di truyền giữa các loài và phát

sinh loài ở thực vật CBOL (Consortium for the Barcode of Life)

đã thử nghiệm matK trên 550 loài thực vật và thấy rằng hơn 90%

mẫu thực vật hạt kín dễ dàng khuếch đại trình tự bằng cách sử

dụng 1 cặp mồi đơn và kiến nghị sử dụng matK là một trong

những chỉ thị chuẩn cho việc phân loại thực vật Ngoài ra,vùng

gen lục lạp rbcL, vùng psbA-trnH gần đây đã trở thành một công

cụ phổ biến trong các nghiên cứu phát sinh loài phân tử thực vật ở cấp độ phân loại thấp và phù hợp cho nghiên cứu DNA Vùng này

có kích thước xấp xỉ 450bp, xác suất nhân bản thành công rất cao

(100% các loài đã được nghiên cứu)

CHƯƠNG II NỘI DUNG, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

TT Tên khoa học Tên Việt Nam Địa điểm thu

mẫu Tọa độ thu mẫu

Trang 9

9

1 Hopea

hongayensis Sao Hòn gai

Đảo Ba Mùn, VQG Bái Tử Long, Quảng Ninh

107°35’E, 120m

21°02’N-2 Hopea

hongayensis Sao Hòn gai

Đảo Cái Lim, VQG Bái Tử Long, Quảng Ninh

107°33’E, 150m

21°06’N-3 Hopea

hainamensis Sao Hải nam

VQG Bến En, Thanh Hóa

105°30’E, 100m

19°35’N-4 Hopea

mollissima Sao Mặt quỷ

Phân khu Khe Rỗ, khu BTTN Tây Yên Tử, Bắc Giang

21o09’N-21 o 13’E, 130m

5 Hopea odorata Sao Đen VQG Bến En,

Thanh Hóa 19°35’N-105°30’E, 100m

6 Dipterocarpus

intricatus Dầu Lông

Khu BTTN Bình Châu-Phước Bửu,

Bà Rịa-Vũng Tàu

107°35’E, 100m

10°28’N-7 Dipterocarpus

dyeri

Dầu Song Nàng Tân Cửu, Vĩnh Cửu, Đồng Nai

107°09’E, 129m

costatus Dầu Mít

VQG Bù Gia Mập, Bình Phước

106°59’E, 130m

tuberculatus Dầu Đồng

VQG York Đôn, Buôn Đôn, Đắk Lắk

107°35’E, 150m

12°47’N-10 Parashorea Chò Chỉ VQG Cúc

Phương, Ninh

Trang 10

20°19’N-Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Độ dài sản phẩm PCR

matK CGA TCT ATT CAT TCA

ATA TTT C TCT AGC ACA CGA AAG TCG AAG T 50 900

rbcLa TCT AGC ACA CGA AAG

TCG AAG T

CTT-CGG-CAC-AAA ATA CGA AAC GAT CTC TCC

A

56 700

rbcLc TGA AAA CGT GAA TTC

CCA ACC GTT TAT GCG

GCA GCA GCT AGT TCC GGG CTC CA

56 700

trnH-psbA GTT ATG CAT GAA CGT AAT GCT C CGC GCA TGG TGG ATT CAC AAT CC 48 300

Phương pháp nghiên cứu

Khảo sát thu mẫu

Phương pháp tách chiết DNA tổng số

Phương pháp PCR với mồi nghiên cứu

Phương pháp điện di DNA trên gel agarose

Đọc trình tự

Phân tích số liệu

Phân tích mối quan hệ di truyền-xây dựng cây phát sinh chủng loại

Trang 11

11

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Hiện trạng phân bố và đặc điểm hình thái của ba loài Sao (Hopea) nghiên cứu

3.1.1 Loài Sao hải nam (Hopea hainanensis Merr et Chun) tại VQG Bến En-Thanh Hóa

Loài Sao hải nam (hay còn gọi là Sao lá to) ở đây đang bị khai thác mạnh, chỉ còn gặp rải rác Tại khu vực này, chúng tôi đã tìm thấy và thu được mẫu của 19 cá thể Sao hải nam Các cây Sao hải nam có kích thước lớn hầu như đã không còn, chỉ còn lại các cây có kích thước trung bình và nhỏ cùng cây tái sinh

3.1.2 Loài Sao hòn gai (H.hongayensis Tardieu) (synonym

H chinensis (Merr.) Hand.-Mazz.) tại đảo Ba Mùn và đảo Cái Lim-VQG Bái Tử Long-Quảng Ninh

Quần thể Sao hòn gai trên đảo Ba Mùn ngoài vùng phân

bố rất tập trung, trong một khu đất rộng khoảng hai hecta có trên hơn 100 cá thể, các cá thể Sao hòn gai ở đây tái sinh rất tốt Trong khu quần thể Sao hòn gai hầu như ngoài các cây bụi nhỏ thì không có loài cây vượt tán nào khác ngoài Sao hòn gai Chúng tôi tìm thấy hai quần thể Sao hòn gai trên đảo Ba mùn, cách nhau khoảng 5km, mỗi quần thể phân bố tập trung trong khu đất rộng khoảng 2 -3 ha với khoảng hơn 100 cá thể Ngoài ra trên đường đi vẫn bắt gặp một vài cá thể Sao hòn gai nằm rải rác

Trang 12

12

tách biệt với nhóm quần thể trung tâm

3.1.3 Loài Sao mặt quỷ (Hopea mollissima C.Y.Wu.) tại Khu BTTN Tây Yên Tử-Bắc Giang

Tổng số 16 cá thể Sao mặt quỷ đã được chúng tôi tìm thấy

và thu mẫu, tất cả các cá thể Sao mặt quỷ được tìm thấy đều là những cá thể trưởng thành,cao từ 30-40m, mọc ở nơi có độ ẩm cao (gần suối hoặc vùng có tầng đất thịt dày nhưng thoát nước), chủ yếu ở độ cao khoảng 300, không nhìn thấy có cây con xung quanh Giả thiết có thể là đã có các cây con nhưng sau đó cây con đã bị chết do thiếu ánh sáng, bởi những nơi có cây Sao mặt quỷ xuất hiện đều là những nơi đất ẩm, mật độ cây dày đặc, rất ít ánh sánh tự nhiên, hoặc cũng có thể do rễ cây con không bám được tới đất do lớp lá rụng ở đây khá dày

Bảng 1 Một số đặc điểm hình thái sai khác giữa loài Sao mặt quỷ

Mazz.)

Có nhiều lông hình sao trên cả 2 mặt lá, mặt sau nhiều hơn mặt trước

Rất ít hoặc hầu như không

có lông

Trang 13

13

2 Cuống

3 Hoa Cuống hoa màu xanh Cuống hoa màu hồng nhạt

3.2 Đặc điểm di truyền của ba loài Hopea nghiên cứu

3.2.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số

Kết quả điện di kiểm tra DNA trên gel agarose 1% cho thấy DNA tổng số thu được khá tốt, DNA không bị gãy (hình 3.7) Kết quả đo OD cho chỉ số OD260/OD280 của các mẫu luôn nằm trong khoảng 1,8 đến 2 (chỉ số cho biết dung dịch DNA có độ tinh khiết cao)

Hình 1 Kết quả điện di DNA tổng số chín loài Dầu nghiên cứu

Ghi chú: 1- Sao hải nam; 2- Sao mặt quỷ; 3- Sao hòn gai Ba

Mùn; 4- Sao hòn gai Cái Lim; 5- Sao đen; 6- Chò chỉ; 7- Dầu cát; 8-

Dầu lông; 9- Dầu mít; 10- Dầu song nàng

Trang 14

14

3.2.1 Đặc điểm vùng gen matK

Gen matK của ba loài nghiên cứu cùng sáu loài họ Dầu khác được thu thập trong quá trình thu mẫu đã được khuyếch đại

bằng cặp mồi đặc hiệu matK-F và matK-R Phản ứng PCR được

thực hiện trên máy PCR system 9700 Kết quả PCR sau đó được điện di kiểm tra trên gel Agarose 1%.Kết quả điện di kiểm tra cho thấy sản phẩm PCR là một băng đậm, sắc nét có kích thước khoảng 900bp đúng như dự kiến, chứng tỏ phản ứng PCR đã được thực hiện tốt, mồi sử dụng có độ đặc hiệu cao Để kiểm tra độ chính xác của sản phẩm PCR cũng như phân tích các đặc điểm

phân tử của gen matK, sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch và

tiến hành đọc trình tự trên máy ABI 3100, sử dụng kit Bigdye terminator.Kết quả giải trình tự sau đó được kiểm tra bằng chức năng Blast của NCBI Kết quả kiểm tra chứng tỏ các sản phẩm PCR của chúng tôi thu được chính xác là các đoạn DNA tương

ứng với các vùng gen matK

Vùng gen matK dài 900 bp của ba loài Hopea nghiên cứu

sau khi cắt bỏ hai đầu còn lại kích thước 843bp được dùng để so sánh sự sai khác bằng phần mềm Mega 5.0.Kết quả giải trình tự sau đó được kiểm tra bằng chức năng Blast của NCBI Kết quả

Trang 15

15

kiểm tra chứng tỏ các sản phẩm PCR của chúng tôi thu được

chính xác là các đoạn DNA tương ứng với các vùng gen matK

Vùng gen matK dài 900 bp của ba loài Hopea nghiên cứu

sau khi cắt bỏ hai đầu còn lại kích thước 843bp được dùng để so sánh sự sai khác bằng phần mềm Mega 5.0 Bảng sai khác di

truyền giữa ba loài Hopea nghiên cứu được đưa ra trên cơ sở so sánh trình tự Nucleotide đoạn gen matK dài 843bp, loài Dầu

ngoài nhóm (outgroup).Kết quả cho thấy không có sự sai khác nào

được tìm thấy trên đoạn gen matK dài 843 nucleotide ở hai mẫuH hongayensis thu tại đảo Cái Lim và đảo Ba Mùn Khoảng cách di truyền giữa hai loài H mollissima và H hongayensis là rất nhỏ

(0,1%).Khoảng cách di truyền giữaH hainanensis và H hongayensislà

0,2%

Trang 16

16

Hình 2 Mối quan hệ di truyền ba loài Hopea trên cơ sở so sánh

trình tự gen matK theo phương pháp NJ 3.2.2 Vùng gen psbA-trnH ba loài Hopea nghiên cứu

Một đoạn gen psbA-trnH có kích thước lý thuyết là

300bpcủa ba loài Hopea và sáu loài Dầu khác ở Việt Nam được

khuếch đại bằng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu psbA-trnH-F và psbA-trnH-R, bắt cặp mồi ở 480C, kéo dài chuỗi ở 720Ctrong 30 giây Kết quả PCR được điện di kiểm tra trên gel Agarose 1% (hình 3.12)

Hình 3 Kết quả điện di sản phẩm PCR vùng gen psbA – trnH trên

gel Agarose 1%

Ghi chú: M: DNA ladder 100bp (Fermentas)

Ghi chú: 1- Sao hải nam; 2- Sao mặt quỷ; 3- Sao hòn gai Ba

Mùn; 4- Sao hòn gai Cái Lim; 5- Sao đen; 6- Chò chỉ; 7- Dầu cát; 8-

Dầu lông; 9- Dầu mít; 10- Dầu song nàng

Định dạng
Số trang	28
Dung lượng	846,73 KB