Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng kháng ung thư của viên nén nổi chứa curcumin (FULL TEXT)

ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư dạ dày là loại ung thư phổ biến và là nguyên nhân tử vong do ung thư cao thứ tư trên thế giới; Việt Nam thuộc khu vực có trung bình nguy cơ ung thư dạ dày cao, với tỷ lệ mắc mới cả nam và nữ là 16,3/ 100.000 dân [119]. Mặc dù đã có nhiều tiến bộ trong chẩn đoán, điều trị nhưng tiên lượng ung thư dạ dày hiện nay vẫn còn xấu với tỷ lệ sống thêm 5 năm chỉ khoảng 28%. Các liệu pháp hóa trị là cần thiết ở đa số bệnh nhân nhưng với độc tính cao do những hoá chất tổng hợp tấn công không đặc hiệu cả tế bào ung thư và tế bào bình thường làm ảnh hưởng đến sức khỏe bệnh nhân. Vì vậy, việc hướng tới tìm các hợp chất có nguồn gốc dược liệu để hỗ trợ điều trị vừa hiệu quả và vừa an toàn đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu. Curcumin là thành phần chính của thân rễ Nghệ vàng (Curcuma longa L. Zingiberaceae) đã được nghiên cứu với nhiều công dụng như kháng ung thư (ung thư dạ dày, ung thư gan, ung thư phổi, ung thư kết tràng, ung thư vú, ung thư da), kháng viêm, chống oxy hóa, kháng khuẩn (Helicobacter pylori), kháng virus, kháng nấm [37], [49], [59], [68], [71], [87]… Các thử nghiệm sinh học đã chứng minh, curcumin thật sự hiệu quả trong việc phối hợp điều trị ung thư đặc biệt là ung thư dạ dày [8], [37], [81] và an toàn ngay cả khi dùng liều cao. Với sự an toàn và hiệu quả, curcumin là hợp chất thiên nhiên có nhiều tiềm năng ứng dụng trong phòng ngừa và hỗ trợ điều trị bệnh ung thư dạ dày. Tuy nhiên, cho đến nay curcumin vẫn chưa được ứng dụng nhiều trong các dạng thuốc đường uống do curcumin có độ tan thấp, tốc độ hòa tan kém, không bền trong môi trường kiềm, chuyển hóa nhanh [11], [49], [75], [87], [91]… Sinh dược học đã chứng minh rằng độ tan và tốc độ hòa tan của dược chất là một trong những yếu tố quyết định mức độ và tốc độ giải phóng, hấp thu dược chất từ đường uống [11]. Vì thế, để góp phần nâng cao sinh khả dụng của curcumin, việc áp dụng các kỹ thuật bào chế thích hợp nhằm cải thiện đặc tính ít tan của curcumin như giảm kích thước tiểu phân, tạo phức hệ phân tán rắn, sử dụng tá dược mới… trước khi đưa vào bào chế các dạng thuốc là vấn đề cần phải thực hiện. Ngoài ra, để tránh tác động bị phân hủy bởi pH kiềm của môi trường ruột non lên curcumin thì việc nghiên cứu các dạng bào chế mới là điều rất cần thiết. Có nhiều dạng bào chế mới ra đời trong đó có thuốc nổi, là một trong những dạng thuốc có nhiều tiềm năng ứng dụng, hứa hẹn mang đến phương pháp trị liệu mới có hiệu quả nhờ thuốc có tỉ trọng thấp hơn dịch dạ dày (≈1,004g/cm3) nên có khả năng nổi và lưu ở dạ dày mà không bị tác động bởi tốc độ làm rỗng dạ dày trong một thời gian dài [110] từ đó giúp thuốc không bị phân hủy bởi pH kiềm của ruột non, giúp giảm liều, giảm tần số dùng thuốc, giảm sự dao động của nồng độ thuốc trong máu, tăng sự hấp thu… khắc phục được những hạn chế vốn có của những dạng thuốc truyền thống, nâng cao hiệu quả điều trị lâm sàng [101], [110]. Cho đến nay, trên thị trường Việt Nam chưa có dạng thuốc nổi chứa curcumin và chưa có bất kỳ nghiên cứu nào về tác dụng ức chế sự phát triển tế bào ung thư dạ dày của curcumin được thực hiện. Vì vậy, với mong muốn tìm ra một dạng thuốc mới, có thể khai thác hết tiềm năng chữa bệnh của một hoạt chất có nguồn gốc từ thiên nhiên, ít tác dụng phụ cũng như góp phần nghiên cứu đánh giá hiệu quả kháng ung thư của curcumin trên chuột nhắt trắng, đề tài “Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng kháng ung thư của viên nén nổi chứa curcumin” được thực hiện với mục tiêu như sau: 1) Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng curcumin trong hệ phân tán rắn bằng phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-Vis) và trong viên nén nổi bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). 2) Nghiên cứu bào chế hệ phân tán rắn (HPTR) chứa curcumin có độ hòa tan cao bằng các phương pháp và chất mang khác nhau. 3) Nghiên cứu bào chế viên nén nổi chứa HPTR curcumin 100 mg. 4) Đánh giá tác dụng kháng ung thư dạ dày của thành phần công thức viên nén nổi chứa HPTR curcumin 100 mg trên dòng tế bào ung thư ở người (in vitro) và trên chuột nhắt trắng (in vivo).

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư dạ dày là loại ung thư phổ biến và là nguyên nhân tử vong do ung thưcao thứ tư trên thế giới; Việt Nam thuộc khu vực có trung bình nguy cơ ung thư dạdày cao, với tỷ lệ mắc mới cả nam và nữ là 16,3/ 100.000 dân [119] Mặc dù đã cónhiều tiến bộ trong chẩn đoán, điều trị nhưng tiên lượng ung thư dạ dày hiện nayvẫn còn xấu với tỷ lệ sống thêm 5 năm chỉ khoảng 28% Các liệu pháp hóa trị là cầnthiết ở đa số bệnh nhân nhưng với độc tính cao do những hoá chất tổng hợp tấncông không đặc hiệu cả tế bào ung thư và tế bào bình thường làm ảnh hưởng đếnsức khỏe bệnh nhân Vì vậy, việc hướng tới tìm các hợp chất có nguồn gốc dượcliệu để hỗ trợ điều trị vừa hiệu quả và vừa an toàn đang thu hút sự quan tâm củanhiều nhà nghiên cứu

Curcumin là thành phần chính của thân rễ Nghệ vàng (Curcuma longa L.

Zingiberaceae) đã được nghiên cứu với nhiều công dụng như kháng ung thư (ung

thư dạ dày, ung thư gan, ung thư phổi, ung thư kết tràng, ung thư vú, ung thư da),

kháng viêm, chống oxy hóa, kháng khuẩn (Helicobacter pylori), kháng virus,

kháng nấm [37], [49], [59], [68], [71], [87]… Các thử nghiệm sinh học đã chứng minh,curcumin thật sự hiệu quả trong việc phối hợp điều trị ung thư đặc biệt là ung thư dạdày [8], [37], [81] và an toàn ngay cả khi dùng liều cao Với sự an toàn và hiệu quả,curcumin là hợp chất thiên nhiên có nhiều tiềm năng ứng dụng trong phòng ngừa và

hỗ trợ điều trị bệnh ung thư dạ dày Tuy nhiên, cho đến nay curcumin vẫn chưađược ứng dụng nhiều trong các dạng thuốc đường uống do curcumin có độ tan thấp,tốc độ hòa tan kém, không bền trong môi trường kiềm, chuyển hóa nhanh [11], [49], [75],[87], [91]

…

Sinh dược học đã chứng minh rằng độ tan và tốc độ hòa tan của dược chất làmột trong những yếu tố quyết định mức độ và tốc độ giải phóng, hấp thu dượcchất từ đường uống [11] Vì thế, để góp phần nâng cao sinh khả dụng của curcumin,việc áp dụng các kỹ thuật bào chế thích hợp nhằm cải thiện đặc tính ít tan củacurcumin như giảm kích thước tiểu phân, tạo phức hệ phân tán rắn, sử dụng tá dượcmới… trước khi đưa vào bào chế các dạng thuốc là vấn đề cần phải thực hiện.Ngoài ra, để tránh tác động bị phân hủy bởi pH kiềm của môi trường ruột non lên

curcumin thì việc nghiên cứu các dạng bào chế mới là điều rất cần thiết Có nhiềudạng bào chế mới ra đời trong đó có thuốc nổi, là một trong những dạng thuốc cónhiều tiềm năng ứng dụng, hứa hẹn mang đến phương pháp trị liệu mới có hiệu quảnhờ thuốc có tỉ trọng thấp hơn dịch dạ dày (≈1,004g/cm3) nên có khả năng nổi vàlưu ở dạ dày mà không bị tác động bởi tốc độ làm rỗng dạ dày trong một thời giandài [110] từ đó giúp thuốc không bị phân hủy bởi pH kiềm của ruột non, giúp giảmliều, giảm tần số dùng thuốc, giảm sự dao động của nồng độ thuốc trong máu, tăng

sự hấp thu… khắc phục được những hạn chế vốn có của những dạng thuốc truyềnthống, nâng cao hiệu quả điều trị lâm sàng [101], [110]

Cho đến nay, trên thị trường Việt Nam chưa có dạng thuốc nổi chứa curcumin

và chưa có bất kỳ nghiên cứu nào về tác dụng ức chế sự phát triển tế bào ung thư dạdày của curcumin được thực hiện Vì vậy, với mong muốn tìm ra một dạng thuốcmới, có thể khai thác hết tiềm năng chữa bệnh của một hoạt chất có nguồn gốc từthiên nhiên, ít tác dụng phụ cũng như góp phần nghiên cứu đánh giá hiệu quả kháng

ung thư của curcumin trên chuột nhắt trắng, đề tài “Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng kháng ung thư của viên nén nổi chứa curcumin” được thực hiện với

mục tiêu như sau:

1) Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng curcumin trong hệ phân tán rắnbằng phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-Vis) và trong viên nénnổi bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

2) Nghiên cứu bào chế hệ phân tán rắn (HPTR) chứa curcumin có độ hòa tancao bằng các phương pháp và chất mang khác nhau

3) Nghiên cứu bào chế viên nén nổi chứa HPTR curcumin 100 mg

4) Đánh giá tác dụng kháng ung thư dạ dày của thành phần công thức viên nén

nổi chứa HPTR curcumin 100 mg trên dòng tế bào ung thư ở người (in vitro)

và trên chuột nhắt trắng (in vivo).

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ CURCUMIN

Curcumin là tên gọi của curcuminoid-một nhóm hợp chất có nguồn gốc từ Nghệ

vàng (Curcuma longa L Zingiberaceae) Bao gồm curcumin I-chiếm khoảng 77%;

curcumin II (demethoxycurcumin)-chiếm tỷ lệ khoảng 17%; curcumin III(bisdemethoxycurcumin)-chiếm tỷ lệ khoảng 3% Trong đó, thành phần chính cóhoạt tính sinh học là curcumin I [11], [91], [100]

Hình 1 1 Cấu trúc của curcumin

Curcumin là bột tinh thể có màu vàng cam, không tan trong nước ở pH acid vàtrung tính, không tan trong ether, tan trong methanol, ethanol, dimethyl sulfoxid vàaceton Cực đại hấp thu (max) của curcumin trong methanol là 430 nm Điểm chảy

là 183 oC Hệ số phân bố và độ tan trong nước của curcumin tương ứng là 3,2 và 0,6

- Nhóm parahydroxyl: hoạt tính chống oxi hoá

- Nhóm ceton: kháng viêm, kháng ung thư

- Nhóm liên kết đôi: kháng viêm, kháng ung thư, chống đột biến tế bào

Nhiều công trình đã nghiên cứu hoạt tính và tác dụng dược lý của curcumin Kếtquả cho thấy, curcumin có hoạt tính sinh học mạnh và đa dạng, bao gồm: hoạt tínhchống viêm, chống ung thư, chống đông máu, chống vi khuẩn, chống nấm, chốngvirus, làm lành vết thương, giảm cholesterol; chữa một số bệnh như: đái tháođường, , tim mạch [8], [37], [75], [81], [91]…

Curcumin có khả năng ngăn chặn các loại ung thư dạ dày, da, tuyến vú, miệng,phổi, gan, thực quản, ruột non, ruột già… Curcumin tác động đến hầu hết các giaiđoạn hình thành và phát triển khối u Cơ chế kháng ung thư của curcumin rất đadạng như: ức chế sự sinh sản và tăng sinh mạch máu của tế bào ung thư, ức chế cácisoenzym cytochrom P450, ức chế sự chuyển hóa sinh học của các chất gây ungthư, ức chế các protein liên quan đến chu trình tế bào như NF-kB, cảm ứng enzymeglutathion S-transferase (GST), thúc đẩy tế bào ung thư đi vào chu trình chết tựnhiên [8], [37], [49], [71], [81], [91], [116]…

Hình 1 2 Quá trình hình thành và di căn khối u và tác động của curcumin

Các nghiên cứu khác nhau về quá trình chuyển hóa của curcumin đã được thựchiện Khi dùng đường uống, curcumin được chuyển hóa chủ yếu theo con đườngglucuronid hóa Quá trình chuyển hóa curcumin xảy ra chủ yếu ở gan, ít hơn ở thận

và ống tiêu hóa [41],[ 100] Curcumin bị chuyển hóa lần đầu cho dihydrocurcumin vàtetrahydrocurcumin, những hợp chất này sau đó được chuyển sang dạng liên hợpmonoglucuronid Vì vậy, chất chuyển hóa chính của curcumin là curcumin-glucuronid, dihydrocurcumin-glucuronid, tetrahydrocurcumin-glucuronid vàtetrahydrocurcumin Những chất chuyển hóa của curcumin có hoạt tính tương tựnhư curcumin nhưng không rõ ràng Trong khi hầu hết các nghiên cứu cho thấy cáccurcumin-glucuronid và tetrahydrocurcumin có hoạt tính kém hơn curcumin thì một

số nghiên cứu khác cho rằng những hợp chất này có thể có hoạt tính mạnh hơncurcumin

= 0,9991[115].Goindi Shishu và cộng sự (2011) đã định lượng curcumin trong methanol vàđệm pH 1,2 với hệ thống quang phổ Shimadzu Kết quả, khoảng tuyến tính 1-10µg/mL với hệ số tương quan r2 = 0,9999; phương trình hồi quy là ŷ = 0,145x tại

Kadam Prasad Vijay và cộng sự (2013) sử dụng máy quang phổ DoublebeamShimadzu 1800 định lượng curcumin trong công thức cream Kết quả, tại max 422

nm có khoảng tuyến tính 1-7 g/mL với hệ số tương quan bình phương r2

= 0,999;phương trình hồi quy là ŷ = 0,166x – 0,01 [50]

Hazra Kalyan và cộng sự (2015) sử dụng máy quang phổ DoublebeamShimadzu định lượng curcumin trong công thức nanocurcumin Kết quả, tại max

421 nm có khoảng tuyến tính 5-25 g/mL với hệ số tương quan bình phương r2

=0,9997 [39]

Holkar Vishal Vasant và cộng sự (2015) sử dụng máy quang phổ DoublebeamShimadzu 1800 định lượng curcumin (10 g/mL) trong methanol Kết quả, tại

max421 nm có khoảng tuyến tính 1-6 g/mL với hệ số tương quan bình phương r2

=0,999; phương trình hồi qui ŷ = 0,150x + 0,005 [40]

Tất cả các nghiên cứu cho thấy qui trình đều đạt độ đặc hiệu, độ đúng và độchính xác

1.2.1.2 Các nghiên cứu định lượng curcumin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Jadhav B-K và cộng sự (2007) sử dụng HPLC đầu dò UV-Vis tại bước sóng 420

nm với chương trình rửa giải isocratic để định lượng các curcumin, cột RP-C18Vydac® (250 x 4,6mm, 5 µm) với pha động acetonitril:0,1% acid trifluro-acetic(50:50); tốc độ dòng 1,5 mL/phút; thể tích tiêm mẫu 20 µL Kết quả khoảng tuyếntính của curcumin 100-200 ng/mL với hệ số tương quan bình phương r2 = 0,9996;thời gian lưu khoảng 7,2 phút [43]

Ramshankar Yadav Vivek và Suresh Sarasija (2009) sử dụng HPLC đầu dò Vis tại bước sóng 425 nm để xác định curcumin, cột Merck C15 (250 x 4,6 mm, 5µm) với pha động acetonitril:tetrahydrofuran: 2% acid acetic (50:30:20); tốc độdòng 0,7 mL/phút; thể tích tiêm mẫu 50 µL Kết quả khoảng tuyến tính củacurcumin 50-100000 ng/mL với hệ số tương quan bình phương r2 = 0,9997; thờigian lưu 4,587 phút [93]

UV-Ramshankar Yadav Vivek và các cộng sự (2009) sử dụng HPLC đầu dò UV-Vistại bước sóng 425 nm để định lượng curcumin, demethoxy và bismethoxycurcumin, cột pha đảo Merck C15 (4,6 x 250 mm, 5 m) và pha động làtetrahydrofuran:1% acid citric (35:65); tốc độ dòng 1,2 mL/phút; thể tích tiêm mẫu

50 µL Kết quả khoảng tuyến tính của curcumin 50-5000 ng/mL với hệ số tươngquan bình phương r2 = 0,9997; thời gian lưu 15,892 phút [94]

Li Rui và cộng sự (2011) sử dụng HPLC đầu dò LC/MS/MS để định lượngcurcumin, demethoxycurcumin (DMC) và bis demethoxycurcumin (BDMC) ở khối

u chuột, Zorbax SB-C18 (4,6 x 12,5 mm; 5 m) và pha động là acetonitril:nước(chứa 0,1% acid formic) (50:50); tốc độ dòng 0,2 mL/phút Kết quả khoảng tuyếntính 2-6000 ng/mL với hệ số tương quan bình phương r2 = 0,997-0,99; thời gian lưu12,59; 11,28 và 10,11 phút [61]

Sonavaran C và cộng sự (2011), sử dụng HPLC pha đảo đầu dò UV-Vis tại bướcsóng 250 nm với chương trình rửa giải gradient để định lượng curcumin trong chếphẩm thuốc viên nén, cột Lichrocart Lichrosphere (250 x 4,0 mm; 5 µm) với phađộng acetonitril:đệm natri acetat pH 4,5 (10:90); tốc độ dòng 1 mL/phút; thể tích

hệ số tương quan bình phương r2 = 0,999; thời gian lưu 9 phút [32].

Jangle RD và Thorat BN (2013), sử dụng HPLC đầu dò UV-Vis tại bước sóng

425 nm để xác định liposome curcuminoid, cột Zorbax Eclipse XDB-C18 (150 × 4

mm, 5 µm) và pha động là acid orthophosphoric 0,1% :acetonitril (50:50); tốc độdòng 1 mL/phút; thể tích tiêm mẫu 5 µL Kết quả khoảng tuyến tính của curcumin50-300 ng/mL với hệ số tương quan bình phương r2 = 0,997; thời gian lưu củacurcumin 6,36 phút [45]

Ang Lee Fung và cộng sự (2014) sử dụng HPLC đầu dò UV-Vis tại bước sóng

370 nm với chương trình rửa giải isocratic để định lượng các curcumin vàquercetin, cột Thermo Hypersil (250 x 4,6mm, 5 µm) với pha động acetonitril:acidacetic pH 2,6 (40:60); tốc độ dòng 1,3 mL/phút; thể tích tiêm mẫu 20 µL Kết quảkhoảng tuyến tính của curcumin 1,25-200 µg/mL với hệ số tương quan bình phương

r2 = 0,99993; thời gian lưu khoảng 16,72 phút [13]

Long Yuling và cộng sự (2014) sử dụng HPLC đầu dò UV-Vis tại bước sóng

425 nm để xác định đồng thời curcumin, demethoxycurcumin vàbisdemethoxycurcumin, cột Wondasil C18 (250 cm X 4,6 mm, 5 µm) với pha độngacetonitril: đệm phosphat 10 mM pH 5,0 (50:50); tốc độ dòng 1 mL/phút; thể tíchtiêm mẫu 20 µL Kết quả khoảng tuyến tính của curcumin 0,208-41,6 µg/mL với hệ

số tương quan bình phương r2 = 0,9985; thời gian lưu khoảng 14 phút [66]

Tất cả các nghiên cứu cho thấy qui trình đều đạt tính tương thích hệ thống, độ đặc hiệu, độ đúng và độ chính xác

1.2.2 Độ ổn định và tuổi thọ của thuốc

Thực hiện theo hướng dẫn thử độ ổn định và xác định tuổi thọ của thuốc theoWHO, ASEAN và quy định về đăng ký thuốc-BYT [1], [6], [7], [33], [131]

Các nghiên cứu khảo sát độ ổn định của curcumin

Wang YingJan và cộng sự (1997) nghiên cứu về độ ổn định của curcumintrong dung dịch đệm và đặc tính của sản phẩm thoái hóa Một loạt các điều kiện pHkhác nhau từ 3-10 đã được thử nghiệm và kết quả cho thấy tốc độ phân hủy phụthuộc vào pH và xảy ra nhanh hơn ở điều kiện trung tính Kết quả cho thấycurcumin ổn định hơn trong môi trường nuôi cấy có chứa 10% huyết thanh bê vàtrong máu người, ít hơn 20% curcumin phân hủy trong vòng 1 giờ và sau 8 giờkhoảng 50% curcumin vẫn còn tồn tại Trans-6-(4ʼ-hydroxy-3ʼ-methoxyphenyl)-2,4-dioxo-5-hexenal được dự đoán là sản phẩm thoái hóa chính; vanillin, acidferulic, feruloylmethan được xác định là sản phẩm thoái hóa nhỏ và lượng vanillintăng theo thời gian ủ [130]

Gugulothu Dalapathi B và Vandana B Patravale (2012) nghiên cứu sự ổn địnhcủa chế phầm chứa đồng thời curcumin và celecoxib Tác giả tiến hành phân hủy

sáng, môi trường acid, kiềm và nhiệt độ cao Kết quả, các mẫu phân hủy được tiêmvào hệ thống HPLC, thu được các sắc ký đồ cho thấy pic curcumin giảm nhanh nhấtkhi tiếp xúc với tác nhân oxy hóa, tiếp theo là môi trường kiềm, acid, ánh sáng và ởnhiệt độ cao hầu như curcumin không thay đổi đáng kể [31]

Korany Mohamed A và cộng sự (2013) nghiên cứu sự ổn định của curcumin vàsilymarin trong chế phẩm chứa 2 thành phần này Tác giả tiến hành phân tích và

nhân oxy hóa và nhiệt độ cao Kết quả cho thấy, trong môi trường acid, trung tính,ánh sáng và tác nhân oxi hóa, pic curcumin trên sắc ký đồ giảm lần lượt 43%, 26%,37%, và 41%, xuất hiện những pic lạ nhưng nằm xa các pic chính Trong môitrường kiềm, curcumin gần như phân hủy hoàn toàn, diện tích pic giảm 92% với sựxuất hiện của 5 pic lạ nằm cách xa pic chính trên sắc ký đồ Ở mẫu chế phẩm bị sấy

ở nhiệt độ cao, pic curcumin hầu như không có gì thay đổi, nhưng độ tinh khiết picgiảm [54]

1.3.2 Một số phương pháp điều chế HPTR thường sử dụng

Phương pháp nghiền ướt (Kneading method): dược chất và chất mang được

nghiền trộn với lượng tối thiểu chất lỏng thích hợp (có thể là nước) trong một thờigian dài bằng cối, chày hoặc máy nghiền để thu được một khối nhão, sau đó làmkhô và nghiền tán thành hạt có kích thước thích hợp Phương pháp này kinh tế, thânthiện với môi trường, tránh được sự phân huỷ dược chất, hạn chế sử dụng dung môihữu cơ [16], [25], [83], [123]

Phương pháp đun chảy (Melting method): dược chất được phối hợp với các chất

mang thân nước theo các tỷ lệ thích hợp bằng cách đun chảy Làm nguội nhanh hỗnhợp trong nước đá Để ổn định trong thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng, sấy khô.Nghiền nhỏ, rây lấy hạt có kích thước thích hợp Phương pháp này được áp dụngcho dược chất rắn không bị phân hủy bởi nhiệt và chất mang trơ thân nước dạng rắn

có nhiệt độ nóng chảy thấp, độ linh động của chất mang khi ở trạng thái nóng chảy

đủ để thay đổi sự kết hợp các phân tử dược chất Ngoài ra, để hạn chế ảnh hưởngcủa nhiệt độ lê sự bền vững của hoạt chất, phương pháp này có thể thực hiện trongbình kín dưới chân không hoặc có sự hiện diện của nitơ lỏng [16], [25], [83], [123]

Phương pháp dung môi (Solvent evaporation method): dược chất và chất mang

được hòa tan trong một lượng dung môi tối thiểu Sau đó loại dung môi để thu đượcđồng kết tủa của dược chất và chất mang Nếu dược chất và chất mang không đồngtan trong dung môi thì có thể phối hợp hai hoặc nhiều dung môi khác nhau để hòatan dược chất và chất mang Dung môi, dược chất và chất mang được khuấy trộn,sau đó bốc hơi hoặc thu hồi dung môi HPTR được nghiền, rây chọn hạt có kíchthước thích hợp Phương pháp dung môi thường áp dụng đối với các dược chất vàchất mang không bền với nhiệt và cùng tan trong một hay hai dung môi khác nhau.Phương pháp này thích hợp với các polyme có điểm chảy cao tuy nhiên phươngpháp này là đắt tiền, khó loại bỏ dung môi hoàn toàn, khó lựa chọn dung môichung [16], [25], [83], [123]

Phương pháp dung môi kết hợp với phương pháp đun chảy (Melting solvent method): dược chất được hòa tan vào một dung môi thích hợp, rồi phối hợp dung

dịch này vào chất mang đun chảy ở nhiệt độ thích hợp, sau đó làm bay hơi dungmôi, sấy đến khối lượng không đổi Phương pháp này chỉ áp dụng với dược chất cóliều điều trị thấp (nhỏ hơn 50 mg) [16], [25], [83], [123]

Phương pháp chất lỏng siêu tới hạn (Supercritical fluid methods): CO2 quá tớihạn được sử dụng làm dung môi để hòa tan dược chất và chất mang Dung dịchđược đưa qua một vòi phun với các điều kiện nhiệt độ và áp suất thay đổi, dung môitách ra và hạt của HPTR được hình thành Phương pháp này không sử dụng cácdung môi hữu cơ, dùng CO2 là dung môi thân thiện với môi trường và được xem làdung môi rẻ tiền Phương pháp này áp dụng với các dược chất không bền vớinhiệt Tuy nhiên, bị hạn chế do dung dịch có nồng độ dược chất thấp, CO2 quá tớihạn chỉ hòa tan những dược chất có độ phân cực kém [16], [25], [83], [123]

Phương pháp đùn nóng chảy (Hot melt extrusion method): dược chất và chất

mang được trộn đều ở nhiệt độ nóng chảy trong một thời gian ngắn, sau đó hỗn hợpđược đùn nhanh qua máy ép Sản phẩm thu được đem làm nguội ở nhiệt độ phòng

và nghiền nhỏ Phương pháp này áp dụng với các dược chất không bền với nhiệt[16], [25], [83], [123]

.Trong các phương pháp trên thì phương pháp đun chảy và phương pháp dungmôi hay được sử dụng để điều chế HPTR

1.3.3 Phương pháp đánh giá đặc tính của HPTR

Phương pháp quang phổ hồng ngoại-IR (Infra Red): nếu có sự tương tác tạo

phức giữa hoạt chất và chất mang thì trên phổ IR biến đổi của các phức sẽ thấy

sự biến mất hoặc thay đổi một số sóng đỉnh đặc trưng của hoạt chất [73], [123]

Phương pháp phân tích nhiệt vi sai-DSC (Differential Thermal Analysis): dựa

vào sự xuất hiện của đỉnh nội nhiệt tương ứng của từng chất Nếu có s ự trộn lẫn giữa hoạt chất và chất mang hay có sự hình thành dạng vô định hình thì trên nhiệt

đồ sẽ thấy giảm cường độ đỉnh nội nhiệt của hoạt chất [73], [123]

Phương pháp soi kính hiển vi điện tử quét-SEM (Scanning Electron Microscopy): SEM cung cấp hình ảnh bề mặt hạt trong không gian ba chiều Để

khảo sát bằng SEM thì tiểu phân phải được làm khô và bề mặt được bao phủ bằngchất dẫn như vàng SEM cho hình ảnh bề mặt của vật mẫu bằng cách quét nó bằngmột chùm tia điện tử hẹp có năng lượng cao [73], [123]

Ngoài ra, đo độ hòa tan và tốc độ hòa tan, nhiệt động lực học, quang phổ, phântích khối phổ (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), nhiễu xạ tia X(XRD)… cũng được sử dụng

1.3.4 Các nghiên cứu cải thiện độ tan của curcumin

Yadav Vivek R và cộng sự (2009) nghiên cứu bào chế phức hợp c á ccyclodextrin (-CD, -CD, HP-β-CD và methyl-β-CD) với curcumin với tỷ lệ 1:1

và 1:2, điều chế bằng phương pháp nghiền và phương pháp dung môi Kết quảcho thấy, bằng phương pháp nghiền ướt, độ tan của curcumin tăng lên đáng kể đặc

biệt tăng nhiều nhất đối với phức hợp curcumin với methyl-β-CD và HP-β-CD lần

lượt gấp 190 và 220 lần so với curcumin nguyên chất [133]

Tomren MA và cộng sự (2007) đã đánh giá độ tan của các curcumin trong phứchợp với các cyclodextrin, kết quả cho thấy độ tan cao nhất được tìm thấy ở phức

hợp với hydroxypropyl-β-cyclodextrin cho tất cả các curcumin do khả năng hình

thành liên kết hydro [118]

Marcolino Vanessa Aparecida và cộng sự (2011) đã nghiên cứu đánh giá độ ổn

định của phức hợp curcumin với β-CD v ớ i c á c t ỷ l ệ 1 : 1 v à 1 : 2 ( t ỷ

l ệ m o l ) bào chế bằng các phương pháp khác nhau: phương pháp nghiền,phương pháp dung môi và hỗn hợp vật lý Kết quả cho thấy phức hợp curcumin-

β-CD tỷ lệ 1:2 ổn định hơn cả do trong mỗi phức, mỗi vòng benzen của

curcumin nằm trong khoang của β-CD nhờ lực Vander Waals, tương tác kỵ nước, liên kết hydro giữa các nhóm giàu điện tử của phân tử curcumin trong khoang β-CD

[70]

Paradkar Anant và cộng sự (2004) nghiên cứu đặc tính của HPTR curcumin:PVP

ở các tỷ lệ khác nhau (1:1, 1:3, 1:5, 1:7 và 1:10) bào chế bằng kỹ thuật phun sấy.Phân tích tính chất vật lý của curcumin thông qua kính hiển vi quét điện tử, phổhồng ngoại, phân tích nhiệt vi sai, nhiễu xạ tia X cho thấy so với hỗn hợp vật lý,

hệ có những thay đổi trạng thái trong suốt quá trình hình thành HPTR, trong đó hệhình thành chủ yếu ở trạng thái vô định hình HPTR tạo thành có dạng các hạt hìnhcầu, ở tỷ lệ thấp hơn của PVP (1:1-1:3) các hạt có bề mặt xù xì, ở tỷ lệ cao hơn(1:5-1:10), các hạt có bề mặt trơn láng hơn Nghiên cứu cũng cho thấy độ hòa tancủa HPTR được cải thiện rõ rệt, curcumin tan hoàn toàn trong 30 phút trong khicurcumin nguyên liệu cũng như hỗn hợp vật lý độ hòa tan hầu như không đáng kểngay cả sau 90 phút [80].

Dong-Hui Xu và cộng sự (2006) nghiên cứu độ hòa tan và độ hấp thu curcumintrong HPTR với PVP chế tạo bằng phương pháp dung môi ở các tỷ lệ (1:2, 1:4,1:6, 1:8, 1:10) Kết quả cho thấy độ hòa tan của curcumin tốt nhất với tỷ lệcurcumin:PVP là 1:8 So với nguyên liệu độ tan và độ hòa tan của curcumin trong

HPTR tăng lên đáng kể trong đó độ tan tăng ít nhất 880 lần Thử nghiệm in vivo trên

chuột cũng cho thấy HPTR curcumin:PVP hấp thu tốt hơn và có sinh khả dụng caohơn đáng kể so với curcumin nguyên liệu và hỗn hợp vật lý [132]

Sattha Kaewnopparat và cộng sự (2009) nghiên cứu biện pháp tăng độ tan củacurcumin bằng cách chế tạo HPTR của curcumin với PVP K30 bằng phương phápdung môi với các tỷ lệ khác nhau (1:2, 1:4, 1:5, 1:6, 1:8) Kết quả cho thấy độ tancủa curcumin trong các HPTR đều cao hơn hẳn so với curcumin nguyên liệu.HPTR với tỷ lệ curcumin-PVP là 1:6, 1:8 có độ tan của curcumin tăng 16-26 lầntrong môi trường dịch ruột nhân tạo không có pepsin, tăng 4-5 lần trong môitrường dịch ruột nhân tạo không có pancreatin so với HPTR bào chế với tỷ lệcurcumin:PVP (1:2) [108]

Kumavat Suresh D và cộng sự (2013) nghiên cứu điều chế HPTR PVP K30, K90 ở các tỷ lệ 1:3, 1:5, 1:10 bằng phương pháp dung môi, nghiên cứu

curcumin-so sánh kết quả độ tan của HPTR curcumin-so với curcumin nguyên liệu và hỗn hợp trộn vật

lý đồng thời phân tích phổ IR và DSC để chứng minh cơ chế cải thiện độ tan củacác chất Kết quả cho thấy, trong môi trường đệm pH 1,2 độ tan của curcuminnguyên chất là rất thấp 0,45 ± 0,01 µg/mL, hỗn hợp trộn vật lý có cải thiện độ hòatan nhưng không đáng kể trong khi HPTR thì khả năng hòa tan cao hơn rõ rệt so với

curcumin nguyên chất và hỗn hợp vật lý nguyên nhân là do curcumin tăng khả năngthấm ướt do liên kết với các phân tử PVP Khả năng hòa tan tăng dần theo tỷ lệcurcumin và polyme, với tỷ lệ 1:10 cho khả năng hòa tan cao nhất, với cùng tỷ lệ thìHPTR của curcumin-PVP K30 cao hơn curcumin-PVP K90 xấp xỉ 4 lần, nguyênnhân là do PVP K90 trọng lượng phân tử cao hơn, độ nhớt cao hơn nên cản trở quátrình hòa tan [58]

Joshi Vedamurthy và cộng sự (2010) nghiên cứu độ tan và độ ổn định củacurcumin trong các HPTR với các polyme PEG 4000, PEG 6000, PVP K30 vàCMC (micro crystalline cellulose) với các tỷ lệ curcumin: PEG 4000/ PEG 6000/PVP K30 (1:1, 1:4, 1:8) bằng phương pháp trộn vật lý và phương pháp đun chảy;curcumin:PEG 4000 (PEG 6000/PVP K30):CMC (1:1:2) Kết quả trong môi trườngnước, các công thức HPTR đều có độ tan lớn hơn độ tan của curcumin nguyên chất(2,68 µg/mL) trong đó công thức curcumin:PEG 6000 (1:8) điều chế bằng phươngpháp đun chảy có độ hòa tan cao nhất là 10344,77 µg/mL; nghĩa là độ tan cải thiệnkhoảng 3800 lần so với curcumin nguyên chất [48]

Suresh Kumavat và cộng sự (2014) nghiên cứu điều chế HPTR củacurcumin:PEG 4000:PVP K30 với các tỷ lệ 1:3:7, 1:5:5 và 1:7:3 bằng phương phápdung môi Kết quả cho thấy, trong môi trường đệm pH 1,2 độ tan của curcuminnguyên chất là rất thấp 0,45 ± 0,01 µg/mL, HPTR thì khả năng hòa tan cao hơn rõrệt so với curcumin nguyên chất và hỗn hợp vật lý đồng thời ở tỷ lệ 1:7:3 thì tỷ lệhòa tan cao hơn các tỷ lệ khác nguyên nhân là do PEG có nhiều nhóm -OH hơnPVP nên tỷ lệ PEG nhiều hơn sẽ giúp tăng khả năng hòa tan cao hơn [112]

Phaechamud T và U Sotanaphun (2010) nghiên cứu độ hòa tan của các curcumin(curcumin, desmethoxy-curcumin, bis desmethoxy-curcumin) từ hệ phân tán rắn sửdụng những chất mang khác nhau (PEG 4000, PEG 6000, PEG 20000, HPMC,

xylitol, xhitin, ac-di-sol, acid citric, sucrose và β-cyclodextrin) với tỷ lệ 1:10 được

bào chế bằng phương pháp trộn vật lý Độ hòa tan của các curcumin từ các hệ phântán rắn được thực hiện trong môi trường chứa 0,02% Tween 80 Kết quả, độ hòa tanlớn nhất của curcumin được quan sát trong hệ phân tán rắn sử dụng xylitol Nghiên

cứu tiếp tục thực hiện bằng cách sử dụng xylitol với các tỷ lệ curcuminoid:xylitol(1:5, 1:10, 1:15, 1:20) bằng phương pháp trộn vật lý, phương pháp dung môi (dungmôi acetonitril) và phương pháp đun chảy điều chế HPTR, kết quả với tỷ lệ 1:10điều chế bằng phương pháp trộn vật lý có độ hòa tan cao nhất (đạt 100% sau 120phút) [85].

Modasiya MK và Patel VM (2012),nghiên cứu điều chế HPTR của curcuminvới PEG 4000, PEG 6000 và PVP K30 với các tỷ lệ curcumin:PEG 4000/PEG6000/PVP K30 (1:1, 1:4, 1:8) bằng phương pháp trộn vật lý và phương pháp đunchảy Trong môi trường thử độ hòa tan chứa 1% Tween 80, tất cả các công thứcHPTR để cải thiện độ tan so với curcumin nguyên chất trong đó công thức tối ưuHPTR có độ hòa tan cao nhất là tỷ lệ curcumin:PEG 6000 (1:8) điều chế bằngphương pháp đun chảy cho độ tan tăng 1000 lần so với curcumin nguyên chất [74].Waghmare Pranali và Kadu Pramod (2014) sử dụng HPMC K4M và HPMCK15M để cải thiện độ hòa tan của curcumin với các tỷ lệ curcumin:HPMCK4M/HPMC K15M (1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5) điều chế bằng phương pháp dung môi.Kết quả, trong môi trường acid HCl 0,1N thì curcumin tinh khiết chỉ hòa tan đượctối đa 1,7 µg/mL, các HPTR đều cải thiện được độ tan so với curcumin nguyênchất, công thức HPTR có độ tan thấp nhất cũng được khoảng 8,5 µg/mL Trong cáccông thức HPTR thì công thức curcumin:HPMC K4M (1:4) cải thiện độ hòa tan làcao nhất (17,25 µg/mL), nghĩa là gấp khoảng 10 lần so với curcumin nguyên chất.Nghiên cứu cũng cho thấy, trong các môi trường thử độ tan khác như nước hoặc pHđệm 7,4 cũng cho kết quả tương tự là HPTR curcumin:HPMC K4M (1:4) có độ tancao nhất [125]

Waghmare Pranali và Kadu Pramod (2014) nghiên cứu điều chế HPTR củacurcumin:HPMC K15M với các tỷ lệ 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 bằng phương pháp dung môi.Kết quả cho thấy, các HPTR đều có độ tan cao hơn so với curcumin nguyên chấttrong đó HPTR tỷ lệ 1:4 cho độ hòa tan cao nhất trong môi trường thử là nước, acidHCl 0,1N và đệm pH 7,4 lần lượt là 8,857; 7,5578; 2,0377 µg/mL trong khicurcumin nguyên chất chỉ có 1,128; 0,1052; 0,141 µg/mL [126]

1.4 TỔNG QUAN VỀ DẠNG THUỐC NỔI TRONG DẠ DÀY

1.4.1 Khái niệm

Thuốc nổi hay còn gọi là hệ thống trị liệu kiểm soát thủy động lực là dạng thuốc

có tỉ trọng thấp hơn dịch dạ dày (≈ 1,004 g/cm3) nên có khả năng nổi trong dạ dày

mà không bị tác động bởi tốc độ làm rỗng dạ dày trong thời gian dài Khi thuốc nổitrong dạ dày thì dược chất được phóng thích từ từ với tốc độ mong muốn và sau đóphần còn lại của thuốc sẽ được đẩy ra khỏi dạ dày, nhờ vậy thuốc lưu lại dạ dàytrong thời gian lâu hơn và duy trì nồng độ thuốc ổn định hơn trong cơ thể [110]

1.4.2 Ưu, nhược điểm

Ưu điểm [101], [110]

- Có lợi cho những hoạt chất hấp thu tốt ở dạ dày, có tác động tại chỗ ở dạdày, giảm sự kích ứng đường tiêu hóa của những thuốc có tính acid

- Tăng sự hấp thu của những hoạt chất kém hấp thu ở pH kiềm của ruột

- Tăng độ hấp thu của hoạt chất do thuốc đã hòa tan trong dịch dạ dày nên khixuống ruột ở dạng dung dịch thì sự hấp thu sẽ tăng lên

- Thuốc có tác dụng theo mong muốn

- Dễ dàng được bệnh nhân tuân thủ điều trị

Nhược điểm [101], [110]

- Không nên bào chế dưới dạng thuốc nổi những hoạt chất gây kích ứng dạdày, kém ổn định trong môi trường dịch vị, hấp thu đồng đều trên toàn bộống tiêu hóa, chịu hiệu ứng vượt qua lần đầu

- Không thích hợp cho những thuốc có độ tan rất thấp trong môi trường acid,những thuốc nhằm mục đích phóng thích hoạt chất chọn lọc ở kết tràng

- Đòi hỏi phải có lượng dịch đủ nhiều trong dạ dày để thuốc nổi, phải uốngthuốc với lượng nước nhiều khoảng 200-250 mL

1.4.3 Phân loại

Hệ thống có sủi bọt khí: thuốc nổi trong dạ dày nhờ vào quá trình sinh khí và quá

trình bắt giữ khí được sinh ra làm giảm khối lượng riêng của dạng thuốc Bao gồm:viên nén nổi một lớp, hai lớp, ba lớp, dạng nhiều vi hạt đóng trong một đơn vị phânliều, dạng thuốc nổi với nhựa trao đổi ion, dạng thuốc nổi có cấu trúc buồng nổi,dạng thuốc nổi có cấu trúc buồng trương phồng, dạng thuốc nổi phóng thích cókiểm soát nhờ áp suất thẩm thấu [26], [57], [102]

Hệ thống không có sủi bọt khí: thuốc nổi trong dạ dày nhờ vào sự trương nở của

polyme làm giảm khối lượng riêng của dạng thuốc Bao gồm: viên nén nổi một lớp,viên nén nổi hai lớp, dạng thuốc nổi có cấu trúc xốp, hạt alginat, viên nang có kiểmsoát thủy động lực học, vi cầu rỗng [26], [57], [102]

Keo thân nước: thường được sử dụng với tỷ lệ 20-75% Chúng có thể là keotổng hợp, anion hoặc không ion hóa bao gồm các gôm thân nước, dẫn xuất cellulosenhư pectin, agar, alginat, gelatin, casein, bentonit, chitosan, veegum, gôm gellan,HPMC (K4M, K15M, K100M)…

Những chất béo no: thường được sử dụng với tỷ lệ 5-75% Những chất béo no,tiêu hóa được có khối lượng riêng nhỏ hơn 1 được sử dụng để làm giảm tính thânnước của công thức và do đó làm tăng khả năng nổi như sáp ong, acid béo, alcolbéo mạch dài, glycerid, dầu khoáng…

Tác nhân tạo khí: natri bicarbonat, acid citric, acid tartaric, dinatri glycinecarbonate…

Những chất làm tăng độ nổi: có thể chiếm tỷ lệ đến 80% Những chất có khốilượng riêng nhỏ hơn 1 như ethylcellulose có thể được sử dụng để làm tăng độ nổicho công thức Những chất có khối lượng riêng thấp: bột bọt polypropylen (Accurel

MP 1000®)

Những chất làm tăng tốc độ phóng thích hoạt chất: thường được sử dụng với tỷ

lệ 5-60% như lactose, mannitol… Những chất làm giảm tốc độ phóng thích hoạtchất: thường được sử dụng với tỷ lệ 5-60% như dicalci phosphat, talc, magnesiumstearat…

Những chất phụ: chất bảo quản, chất ổn định, tá dược trơn có thể được thêm vàocông thức với tỷ lệ thích hợp

1.4.5 Kỹ thuật điều chế

Sử dụng các keo có khả năng tạo gel như các gôm thân nước, gelatin, alginat,dẫn xuất cellulose… kết hợp với tác nhân tạo khí carbonic tiến hành dập viên nénmột lớp, hai lớp, ba lớp theo kỹ thuật chung của sản xuất thuốc viên nén [76]

Giảm kích thước tiểu phân, sau đó bao bằng lớp sinh khí và ngoài cùng là lớppolyme hoặc tạo các vi cầu rỗng của thuốc rồi đóng vào nang [76], [110]

Gắn kết hoạt chất tích điện âm với các hạt nhựa trao đổi ion và tác nhân sinh khícarbonic, sau đó bao bằng một màng bán thấm rồi đóng nang hoặc dập viên [76], [110].Tạo buồng nổi với bể chứa thuốc được nang hóa hoặc phương pháp kết hợp vớibuồng trương phồng chứa chất lỏng, dung môi hóa khí ở nhiệt độ cơ thể Điều chếdạng thuốc nổi phóng thích có kiểm soát nhờ áp suất thẩm thấu [110]

Sử dụng các nguyên liệu có khối lượng riêng thấp như polyme methacrylic,cellulose acetat phthalat [76], [110]

1.4.6 Kiểm soát chất lượng

Tiềm thời: là thời gian để viên nổi lên hoàn toàn sau khi tiếp xúc với môi trường

hòa tan [77]

Thời gian nổi: là thời gian tính từ khi viên nổi lên bề mặt môi trường cho đến khi

viên bắt đầu chìm xuống đáy cốc [77]

Tính nguyên vẹn của viên, hạt: yêu cầu viên phải duy trì tính nguyên vẹn trong

suốt quá trình nổi [77]

Chụp X-quang dạ dày: là thử nghiệm in vivo giúp đánh giá khả năng nổi của viên

trên sinh vật thử nghiệm hoặc trên người tình nguyện đồng thời thử nghiệm cũnggiúp cho việc xác định liều sử dụng Thử nghiệm thực hiện bằng cách cho động vậthoặc người tình nguyện uống thuốc, sau từng khoảng thời gian (tùy từng hoạt chất)chụp X-quang đến khi nào không nhìn thấy viên trong dạ dày nữa thì kết thúc thửnghiệm, ghi nhận lại kết quả [77]

1.4.7 Các nghiên cứu bào chế dạng thuốc nổi curcumin

Gupta Neeta và Aggarwal Nidhi (2008) nghiên cứu viên nén nổi chứa curcumin

(CI) và viên nén nổi chứa phức curcumin-β-cyclodextrin (CII) theo cơ chế sủi bọt

khí với thành phần tá dược là HPMC K15 (200 mg), dicalci phosphat (20 mg), natricarbonat (40 mg), acid citric (20 mg), carbopol 934P (25 mg) và magnesium stearat(10 mg) bằng phương pháp xát hạt ướt Kết quả cho thấy, thời gian nổi của cả 2công thức CI và CII có tiềm thời 10-12 phút, thời gian nổi 16 giờ; CI trong 24 giờ

chỉ có 2,25% curcumin được phóng thích trong khi với CII thì có đến 98%curcumin được phóng thích [36].

Rahman MH và cộng sự (2010) đánh giá ảnh hưởng của HPMC và Poloxame

188 đến động học phóng thích của curcumin trong vi cầu nổi Vi cầu nổi là một cấutrúc rỗng bên trong được điều chế bởi nhũ tương dầu trong nước bằng phương phápkhuếch tán dung môi, HPMC và Poloxame 188 hòa tan trong dung môi hữu cơ,curcumin hòa tan hoặc phân tán vào polyme Kết quả, HPMC và Poloxame 188 sửdụng với nồng độ 10-40%, kích thước hạt vi cầu tăng khi nồng độ polyme tăng 101

± 2,8-220 ± 3,6 µm; các công thức có khả năng nổi từ 74-90%; thử độ hòa tan củacác vi cầu trong môi trường pH = 1,2 cho thấy khi nồng độ polyme tăng thì tỷ lệcurcumin được giải phóng ra khỏi vi cầu giảm, trong đó công thức có độ giải phóngcao curcumin cao nhất là công thức sử dụng Poloxame 188 với nồng độ 10%, trong

12 giờ giải phóng được khoảng 40% curcumin [89]

Goindi Shishu và cộng sự (2011), nghiên cứu hạt nổi lưu lại dạ dày của phức

curcumin β-cyclodextrin để điều trị các khối u dạ dày Hạt nổi được tạo ra bằng

cách cho từ từ hỗn hợp 200 mg phức curcumin vào 5 mL nước cất, dung dịch nàyđược phân tán vào dung dịch natri alginat (3% w/v) có chứa HPMC K15M(alginat:HPMC = 9:1 w/w), tiếp tục thêm tá dược tạo khí calci carbonat(alginat:CaCO3 = 1:0,5 w/w) và bơm vào dung dịch calci clorid 1% (w/v) đã đượcacid hóa bằng acid acetic (10% v/v) Kết quả, 100% các hạt đều có khả năng nổi và

duy trì trạng thái nổi trong 24 giờ; thử nghiệm in vitro cho thấy sau 3 giờ curcumin được phóng thích lần lượt là 380,18 µg/h và 185,43 µg/h với phức curcumin-β-

cyclodextrin và hạt nổi chứa phức này Ngoài ra, kết quả nghiên cứu cũng cho thấy50% curcumin được phóng thích từ hạt nổi sau 5 giờ và sau 12 giờ là 90% Việc tạohạt nổi chứa phức curcumin không chỉ cải thiện độ hòa tan so với curcumin tinhkhiết mà còn giúp kéo dài thời gian giải phóng hoạt chất [29]

Upmanyu Neeraj và cộng sự (2011) nghiên cứu bào chế vi cầu nổi chứacurcumin bằng phương pháp bốc hơi dung môi Curcumin, HPMC K15M vàcellulose ethyl (EC) với các tỷ lệ (1;2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6) được hòa tan trong mộthỗn hợp ethanol và dichloromethan (1:1) ở nhiệt độ phòng, sau đó thêm 250 mL

nước chứa 0,01% Tween 80, khuấy trong 20 phút với tốc độ dòng 300 rpm ở nhiệt

độ 30-40 oC Kết quả cho thấy hiệu suất tạo vi hạt 63,81-64,36%; kích thước hạtphân bố từ 14,6-20,76 µm; tỷ lệ % nổi 48,3-68,3%; công thức có tỷ lệ HPMC:EC(1:6) sau 12 giờ thử độ hòa tan trong môi trường pH 1,2 có tỷ lệ % giải phóng hoạtchất là cao nhất [109]

Kumar Kapil và AK Rai (2012) nghiên cứu bào chế vi cầu nổi chứa curcuminbằng phương pháp bốc hơi dung môi Curcumin, HPMC, cellulose ethyl (EC),Eudragit S100 (F1:Eudragit S100 = 250 mg; F2:Eudragit S100 = 500 mg;F3:Eudragit S100 = 750 mg + EC = 250 mg + HPMC = 250 mg; F4:EC = 500 mg +

EC = 250 mg) Các công thức được hòa tan trong hỗn hợp ethanol và dicloromethan(1:1) sau đó thêm 200 mL nước chứa 0,2% natri lauryl sulfat, khuấy trong 1 giờ vớitốc độ dòng 750 rpm ở nhiệt độ phòng Kết quả các vi cầu nổi có kích thước hạt, tỷ

lệ % nổi, hiệu suất tạo vi hạt là: 251-387 µm, 74,6-90,6% và 45,5-82,0% Tỷ lệ hòatan trong môi trường thử pH 1,2 tối đa sau 20 h là 47,1; 55,7; 69,4 và 81,3% đối vớicác công thức F1, F2, F3 và F4 [56]

Ridhima D, Shweta P và Upendra KJ (2012) nghiên cứu bào chế vi cầu nổi chứacurcumin bằng phương pháp bốc hơi dung môi Curcumin, HPMC E5LV, celluloseethyl (EC), Eudragit L100, Eudragit S100 với 9 công thức là sự kết hợp của cácpolyme với các tỷ lệ khác nhau Các công thức được hòa tan trong hỗn hợp ethanol

và dicloromethan (1:1) sau đó trộn với nước chứa 0,2% natri lauryl sulfat ở 40 oC.Kết quả, hiệu suất tạo vi hạt 73,2-86,9%; kích thước hạt phân bố từ 10-60 µm; tỷ lệ

% nổi 53,85-70,1%; công thức có tỷ lệ Eudragit L100:Eudragit S100 (1:1) sau 12giờ thử độ hòa tan trong môi trường pH 1,2 có tỷ lệ % giải phóng hoạt chất là caonhất 90,73% [97]

Rani Sobhita (2014) nghiên cứu bào chế viên nén nổi chứa curcumin theo cơ chếsủi bọt khí-sinh khí CO2, sử dụng Psyllium kết hợp với HPMC K15M Kết quả cáccông thức nghiên cứu, viên có tiêm thời nổi từ 1-12 phút; thời gian nối > 8 giờ;công thức tối ưu có sự phóng thích hoạt chất theo động học Higuchi [95]

Treesinchai Sakonjan và cộng sự (2015) nghiên cứu bào chế viên nén nổi chứacurcumin Hệ thống bao gồm viên nhân chứa curcumin được bao bởi một lớp bao

tạo khí (acid tartaric + natri bicarbonat + HPMC) và một màng bảo vệ (Eudragit®

RL 30D) Kết quả cho thấy, trong môi trường thử pH 1,2 viên có tiềm thời và thờigian nổi là khoảng 6,5 phút và > 480 phút; kết quả cũng cho thấy độ hòa tan củacurcumin là rất thấp vì vậy cần phải thêm vào 1% (w/v) natri lauryl sulfat vào dungdịch thử độ hòa tan [121]

Bảng 1 1 Một số chế phẩm thuôc nổi trên thị trường [10]

4 Topalkan Dung dịch alginat nổi Aluminum-magnesium antacid

5 Liquid Gavison Dung dịch alginat nổi

sủi bọt khí Aluminium hydroxid

6 Conviron Gel nổi Ferrous sulfat

7 Cytotech Viên nén nổi Misoprostal

1.5 TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ DẠ DÀY-CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH TẾ BÀO VÀ MÔ HÌNH GÂY UNG THƯ DẠ DÀY TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG

1.5.1 Tổng quan về ung thư dạ dày

Ung thư là một nhóm các bệnh liên quan đến việc phân chia tế bào một cách vô

tổ chức và những b àotế đó có khả năng xâm lấn những m ô k hác bằng cách pháttriển trực tiếp vào mô lân cận hoặc di chuyển đến nơi xa (di că n ) Hiện có khoảng

200 loại ung thư [4]

Ung thư dạ dày là một căn bệnh đi kèm với sự xuất hiện của một khối u ác tínhđược hình thành trên cơ sở của biểu mô của niêm mạc dạ dày [4]

1.5.1.1 Các yếu tố bệnh sinh

Chế độ ăn nhiều muối có liên quan chặt chẽ với hiện tượng gia tăng nguy cơmắc ung thư dạ dày (UTDD) Nghiên cứu trên động vật phát hiện thấy chế độ ăn

nhiều muối sẽ tạo hiện tượng viêm teo niêm mạc dạ dày và do đó tạo điều kiện

thuận lợi phát sinh UTDD khi kết hợp với nhiễm Helicobacter pylori Các nitric

cũng được coi là vai trò trong bệnh sinh UTDD thông qua các nghiên cứu dịch tễhọc [4]

Hút thuốc lá làm tăng nguy cơ UTDD lên 1,56 lần Theo Gonzalez (2003) xấp xỉ18% trường hợp UTDD được quy cho hút thuốc lá [30] Nguy cơ UTDD tăng theothời gian hút thuốc và giảm đi sau 10 năm cai thuốc

H pylori là xoắn khuẩn gram âm, ký sinh trong lớp chất nhày của niêm mạc Tổ

chức Y tế thế giới đã xếp H pylori vào nhóm tác nhân chính gây UTDD H pylori

có khả năng gây tổn thương niêm mạc từ đó viêm niêm mạc dạ dày kết hợp cùngcác yếu tố khác dẫn tới dị sản, loạn sản và ung thư [27]

Do di truyền, ước tính UTDD có tính chất gia đình chiếm tỷ lệ 1% đến 15%trong tổng số bệnh nhân mắc UTDD [4]

Tiền sử bệnh lý ở dạ dày như: viêm teo dạ dày, vô toan, thiếu máu ác tính, dị sảnruột, u tuyến dạ dày (polyp có kích thước > 2 cm) là một số bệnh lý được coi lànguy cơ cao gây UTDD [38]

Bảng 1 2 Phân loại mô bệnh học ung thư dạ dày theo Tổ chức Y tế Thế giới năm

2010 [20]

Loại mô học

n ống nhỏ UT

BM tuyế

n nhà

y UT

BM

tế bào nhẫ

n UT

BM tuyế

n vảy UT

BM

tế bào vảy UT

BM

tế bào nhỏ UT

BM khô

ng biệt hoá

Các loại khácC

arcinoi

d (unộiti

ết bi

ệt hoácao)Un

g th

ư khôn

g phả

i biểum

ô Sacomcơtr

ơnUng thư mô đệm đường tiêu hoáSacom Kaposi

U lympho ác tính

U lympho tế bào B vùng ria của MALT U lympho tế bào Mantle

U lympho tế bào

B lan tỏa

Hầu hết các triệu chứng cơ năng và toàn thân của UTDD là không đặc hiệu và

có thể gặp trong nhiều bệnh lý ống tiêu hóa khác Trên thực tế lâm sàng, đa số bệnhnhân khi có các triệu chứng này thì UTDD đã ở giai đoạn tiến triển

Cận lâm sàng: Chụp dạ dày hàng loạt có thuốc cản quang; nội soi dạ dày ốngmềm và sinh thiết; phương pháp tế bào học; phương pháp mô bệnh học; chụp cắtlớp vi tính; chụp cộng hưởng từ; siêu âm nội soi

1.5.2 Các phương pháp nghiên cứu độc tính trên tế bào và mô hình gây ung thư dạ dày trên chuột nhắt trắng bằng 7,12-dimetyl benz(a)anthracen (DMBA)

1.5.2.1 Các phương pháp nghiên cứu độc tính trên tế bào

Khái niệm độc tính tế bào

Độc tính tế bào là kết quả của những tác động lên cấu trúc và/hoặc hoạt độngcần thiết cho sự sống, tăng sinh và/hoặc chức năng của tế bào dẫn đến tác dụng lênchức năng của các cơ quan cụ thể và/hoặc gây tử vong

Các chất có hoạt tính độc tính tế bào có thể tác động lên sự toàn vẹn của màng tếbào và/hoặc màng bào quan, khung tế bào, quá trình phân chia, chuyển hóa của tếbào, điều hòa ion, sinh tổng hợp hoặc phân giải, phóng thích chất nội bào hoặc cácthành phần của tế bào dẫn đến ức chế sự tăng trưởng của tế bào và/hoặc gây chết tếbào [62], [127]

Phương pháp nghiên cứu độc tính tế bào

- Phương pháp dùng thuốc nhuộm đỏ trung tính [19]

- Đếm tế bào sống bằng dung dịch trypan blue [120]

- Phương pháp nhuộm sulforhodamin B (SRB) [124]

- Xác định tỷ lệ tế bào sống bằng phương pháp MTT

Trong đó, phương pháp MTT là phương pháp hay được sử dụng vì có một số ưuđiểm như độ chính xác, độ tin cậy cao, phép đo phổ có thể phát hiện những thay đổirất nhỏ trong sự chuyển hóa của tế bào, thuốc thử an toàn…

Phương pháp MTT [28], [62], [98]: là phương pháp xác định và đánh giá khả nănggây độc và tăng sinh tế bào Hoạt tính độc tế bào đánh giá qua tỷ lệ sống của tế bào được xác định nhờ hoạt tính enzym succinat dehydrogenase (SDH) của ty thể chỉ cótrong tế bào sống SDH chuyển MTT [3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid)] thành tinh thể formazan tan trong dung môi hữu cơ như isopropanol tạo dung dịch màu tím được đo mật độ quang OD ở bước sóng 570 nm,

sẽ phản ánh số lượng tế bào sống trong mẫu nuôi cấy Xác định được số lượng tế bào sống của mẫu nuôi cấy từ đó sẽ kết luận được khả năng gây độc của mẫu thử

Dòng tế bào N87: được phân lập từ ung thư biểu mô dạ dày của người N87 là một

dòng tế bào ung thư biểu mô dạ dày có nguồn gốc từ năm 1976 được phân lập bởi

A Gazdar và cộng sự tại Viện ung thư quốc gia từ một di căn của ung thư gan Khối u được cấy truyền như một sự cấy ghép mô ở chuột không có tuyến giáp qua

ba đoạn trước khi dòng tế bào đã được thành lập

Một số nghiên cứu tác dụng của curcumin trên mô hình độc tính tế bào

Zhao Jing và cộng sự (2007) nghiên cứu hiệu quả kháng khối u của curcumintrên dòng tế bào HeLa-gây ung thư cổ tử cung ở người Kết quả cho thấy, khả năng

ức chế sự tăng sinh của tế bào phụ thuộc vào nồng độ và thời gian Sau 72 giờ, tỷ lệ

ức chế 11% -45,8%, sự khác biệt giữa các mẫu với thời gian điều trị khác nhau rất

có ý nghĩa (p <0,01) So với nhóm chứng, sự khác biệt của các nhóm 5 µmol/L và

10 µmol/L là có ý nghĩa (p<0,05) và giữa các nhóm của 25 µmol/L và 50 µmol/Lrất có ý nghĩa (p<0,01) [134]

Wang Dorothy và cộng sự (2008) nghiên cứu khả năng ức chế dòng tế bàoCAL27 và UM-SCC1 (2 dòng tế bào gây ung thư vòm họng ác tính) của liposomecurcumin (10%) Kết quả, có một sự ức chế đáng kể sự tăng trưởng tế bào củaliposomal curcumin so với liposome (p<0,0001) Khả năng ức chế tế bào phụ thuộcvào nồng độ khảo sát; với dòng tế bào CAL27 bị ức chế tăng trưởng tối ưu ở 200Amol/L; UM-SCC1 là ở mức 50 Amol/L [128].

Tian Fang và cộng sự (2012) nghiên cứu khả năng của curcumin trong việc nângcao hiệu quả điều trị ung thư đường tiêu hóa trên dòng tế bào BGC-823 của 5-Fluorouracil và Oxaliplatin (FOLFOX) Kết quả cho thấy, giá trị IC50 của curcumin,Fluorouracil và Oxaliplatin lần lượt là 10 µM; 0,1 mM và 5 µM [117]

Lu Wei-Dong và cộng sự (2013) nghiên cứu hiệu quả của curcumin trên dòng tếbào HCT8/VCR-gây ung thư đại tràng đa kháng thuốc, thử nghiệm ở các nồng độ(6,25; 12,5; 25 µM) kết quả cho thấy khi nồng độ tăng thì khả năng ức chế tế bàocũng tăng theo Đồng thời ở nồng độ curcumin 25 µM ức chế tế bào ung thư caohơn mẫu sử dụng 0,5 µg/mL vincristin (p<0,05) [67]

Rahman Mohamed Habibur và cộng sự (2014) nghiên cứu khả năng ức chế tếbào ung thư thần kinh IMR32 của tiểu phân nano lipid rắn curcumin Kết quả, độc tính tế bào phụ thuộc vào liều nồng độ ức chế tối thiểu IC50 của curcumin và nanolipid rắn curcumin là 129,33 µg/mL và 60,08 µg/mL [90]

Liu Xiaohong và cộng sự (2014) nghiên cứu khả năng ức chế sự tăng sinh tế bàoung thư dạ dày SGC-7901 của curcumin Kết quả cho thấy, độc tính tế bào phụthuộc vào liều LCur (9,5% ± 2,10%), MCur (23,2% ± 7,21%), và HCur (39,4% ±0,43%) so với curcumin (1,20% ± 0,25) (tất cả p <0,05) Kết quả phối hợp vớidiazoxid, tỷ lệ ức chế đã giảm trong LCur + DZ (6.72% ± 1,80%), MCur + DZ(16,55% ± 6,11%), và HCur + DZ (31,43 ± 8,15%) so tương ứng với LCur, MCur,

và HCur (tất cả p<0,05) (LCur, Mcur, Hcur nồng độ curcumin lần lượt là 15µmol/mL; 30 µmol/mL; 60 µmol/mL) [65]

Li Xingyi và cộng sự (2014) nghiên cứu khả năng ức chế sự tăng sinh của 4dòng tế bào ung thư HeLa, BGC-823, S-65, C-26 của micell curcumin Kết quả tất

cả các dòng tế bào ung thư đều bị ức chế bởi curcumin và micell curcumin, với IC50

từ 10-20 µg/mL [64]

1.5.2.2 Mô hình ung thư dạ dày trên chuột nhắt trằng bằng 7,12-dimetyl benz(a)anthracen (DMBA)

DMBA là hydrocarbon thơm đa vòng có tác dụng gây ung thư và ức chế miễndịch ở các loài khác nhau, được ứng dụng rộng rãi để gây khối u ở vú, da và các cơquan khác DMBA gây điều khiển ngược của các thụ thể aryl hydrocarbon (arylhydrocarbon receptor-AhR), làm biến đổi các tiền gen sinh ung thư (proto-oncogen) thành gen sinh ung thư (oncogen) dẫn đến hình thành tế bào ung thưnguyên phát Ngoài ra, enzym CYP1B1 và epoxid hydrolase trong microsomchuyển hóa DMBA tạo ra DMBA-3,4-dihydrodiol-1,2-epoxid (DMBA-DE), chấtchuyển hóa này sẽ liên kết với ADN gây đột biến và khởi đầu ung thư[51],[ 63]

Một số nghiên cứu tác dụng của curcumin trên mô hình gây ung thư dạ dày trên chuột nhắt trắng

Azuine Magnus A và Sumati V Bhide (1992) gây khối u dạ dày trên chuột Swiss

cái (6-8 tuần tuổi) bằng benzo(a)pyrene (B(a)P) với liều 1 mg trong 1 mL dầuphộng, 2 lần/tuần/4 tuần Chuột được chia làm 6 nhóm: nhóm 1 là nhóm chứngdương, dùng thuốc điều trị; nhóm 2 uống B(a)P + curcumin 2% (100g bột Nghệ) 2tuần trước khi khi cho uống B(a)P trong và sau 2 tuần khi kết thúc uống B(a)P;nhóm 3 tương tự nhóm 2 nhưng thay bằng curcumin 5% (250g bột Nghệ); nhóm 4tương tự nhóm 3 nhưng kéo dài quá trình cho uống thuốc đến cuối thí nghiệm;nhóm 5 uống curcumin trong 8 tuần và kéo dài cho đến cuối thí nghiệm; nhóm 6nhóm chứng âm, uống dầu phộng 2 lần/ tuần cho đến hết tiến trình thí nghiệm,chuột bị giết ở 180 ngày tuổi Kết quả, B(a)P gây ra 100% khối u dạ dày chuột thửnghiệm; nhóm 2 không làm giảm khối u ở chuột; nhóm 3 giảm 40% và nhóm 4giảm 90% số khối u; nhóm 5 và nhóm 6 không xuất hiện bất kỳ khối u nào (nghĩa làcurcumin và dầu phộng không gây ra khối u) đồng thời nghiên cứu cũng cho thấybột Nghệ không có bất kỳ ảnh hưởng nào lên khối lượng trung bình của chuột [15].Huang Mou-Tuan và cộng sự (1994) dùng chất gây ung thư dạ dày là B(a)P với

liều 1 mg, 2 lần/tuần/4tuần trên dòng chuột cái A/J (6 tuần tuổi) chia làm 6 nhóm:

nhóm 1 (20 con) là nhóm sinh lý uống 100 µL dầu bắp; nhóm 2 (41 con), nhóm

3-6 (30 con/nhóm) uống 1,5 mg B(a)P + 100 µL một 1 lần/tuần/4 tuần Nhóm 3 vànhóm 4 uống 0,5% và 2% curcumin 2 tuần trước, trong và 1 tuần sau khi uống liềuB(a)P cuối cùng; nhóm 5-6 uống 0,5% và 2% curcumin 1 tuần sau khi uống liềuB(a)P cuối cùng và kéo dài đến cuối tiến trình thử nghiệm Các con chuột bị giếtsau 24 tuần (tính từ lúc uống liều B(a)P cuối cùng) Kết quả, nhóm 1 không thấyxuất hiện khối u nhóm chỉ dùng B(a)P và không được điều trị (nhóm 2) thì số khối

u trung bình trên chuột là 4,9 ± 0,4; tỉ lệ xuất hiện khối u là 100%, trong khi nhóm

3 và nhóm 4 có tỷ lệ khối u bị ức chế 51% và 53%, % u nhú bị ức chế là 52% và50%, ung thư tế bào vảy bị ức chế 60% và 80%, về thể tích khối ung thư tế bàovảy giảm 79% và 86% Nhóm 5 và nhóm 6 có tỷ lệ khối u bị ức chế là 47% và67% % u nhú bị ức chế 50% và 66%, ung thư tế bào vảy bị ức chế là 20% và 80%,

về thể tích khối u thì giảm 22% và 66% một cách có ý nghĩa [42]

Singh Shivendra V và cộng sự (1998) nghiên cứu sử dụng benzo(a)pyrene

(B(a)P) gây ung thư dạ dày trên chuột nhắt cái A/J (8 tuần tuổi) trong 14 ngày với

liều 1,5 mg trong 100 µL dầu bắp 1 lần/1 tuần Sau khi uống B(a)P chuột được cho

ăn uống trong 5 ngày Sau đó chuột được chia làm 2 nhóm: nhóm 1 uống curcumin2% cùng với chế độ ăn uống; nhóm 2 là nhóm đối chứng chỉ ăn uống không dùngcurcumin hay bất cứ thuốc nào, sau 2 tuần thì giết chuột và phân tích kết quả.Curcumin có thể ức chế ung thư đoạn trên dạ dày (forestomach) bằng cách ức chếhoạt hóa của emzym EROD (ethoxyresorufin O-deethylase) và tăng cường chấtgiải độc khử (+)-anti-BaPDE thông qua cảm ứng của các GST gan [103]

Gupta Neeta và Nidhi Aggarwal (2008) thử nghiệm tác dụng kháng khối u của

viên nén nổi chứa phức chất curcumin với β-cyclodextrin trên dòng chuột cái

Balb/C 8-9 tuần tuổi nặng từ 20-30g được gây ung thư bằng 2 liều B(a)P 3

mg/0,25 mL dầu bắp, cách khoảng thời gian 2 tuần Các nhóm chuột được chiathành 4 nhóm: nhóm không được điều trị, 3 nhóm còn lại điều trị bằng 3 loại thuốckhác nhau là viên nén nổi chỉ chứa curcumin, viên nén nổi chứa phức chất

curcumin với β-cyclodextrin và viên chỉ có curcumin với β-cyclodextrin nghiền

trộn vào dầu bắp cho uống liều 100 mg/kg sau liều B(a)P và kéo dài đến hết tiến

trình, thời gian là 20 tuần Kết quả, nhóm không được điều trị xuất hiện 100% cókhối u với số khối u là 2, còn các nhóm được điều trị bằng viên nén nổi chỉ chứa

curcumin, viên nén nổi chứa phức curcumin và β-cyclodextrin và viên chỉ có curcumin tinh khiết và β-cyclodextrin tỉ lệ xuất hiện khối u giảm lần lượt là 25%,

50% và 35%, số khối u trung bình trên chuột là 1,5; 1 và 1,32 Điều này chứng tỏ

hệ thống phân phối thuốc qua viên nén nổi chứa phức chất curcumin và

β-cyclodextrin giảm số lượng khối u có ý nghĩa thông kê [36]

Goindi Shishu và cộng sự (2011) nghiên cứu hạt nổi lưu tại dạ dày của phức

curcumin β-cyclodextrin để điều trị các khối u dạ dày trên mô hình gây ung thư chuột cái Balb/C 8-9 tuần tuổi, nặng từ 20-30 g được gây ung thư bằng 2 liều B(a)P

3 mg/0,25 mL dầu bắp, cách khoảng thời gian 2 tuần Các chuột được chia thành 4nhóm: nhóm không điều trị, nhóm chuột uống hạt nổi placebo, nhóm uống cur tinh

khiết, nhóm uống hạt nổi chứa phức cur với β-cyclodextrin (liều 75 mg/kg trong 5

ngày liên tiếp cách khoảng 2 ngày đến hết tiến trình 10 tuần) và nhóm không đượcđiều trị Kết quả, tỷ lệ xuất hiện khối u ở nhóm dùng curcumin tinh khiết và hạt nổi

chứa phức curcumin β-cyclodextrin giảm tương ứng là 25% và 50% và số khối u

trên mỗi con chuột mang khối u cũng đã giảm 38,29% và 71,42% [29]

Sintara Kawiya và cộng sự (2012) nghiên cứu tác dụng giảm ung thư dạ dày gây

ra bởi N-metyl-N-nitroureas (MNU) và natri clorua (NaCl) bão hoà của curcumin

trên chuột cống đực Wistar (6 tuần tuổi) Chuột được chia thành các nhóm: nhóm

đối chứng và đối chứng curcumin: được cho uống đệm citrat pH=4,5 vào ngày đầutiên và ngày thứ 14, dung dịch NaCl 30% 2 lần/tuần trong 3 tuần (1 mL/con) sau đónhóm đối chứng được cho uống dầu hàng ngày trong suốt tiến trình (2,5 mL/kg) cònđối chứng curcumin (CC) uống dầu trộn curcumin hàng ngày trong suốt tiến trình(200 mg/kg); nhóm thử (MNU+NaCl 30%); nhóm 1 (MNU + NaCl 30% +curcumin 3 tuần); nhóm 2 (MNU + NaCl 30% + curcumin 20 tuần) cho uống MNUhoà tan trong đệm citrat pH=4,5 vào ngày đầu tiên và thứ 14 (100 mg/kg) + NaCl30% 2 lần/tuần trong 3 tuần (1 mL/con) tiếp tục do nhóm thử uống dầu hàng ngày,

nhóm 1 uống curcumin trộn với dầu hàng ngày trong 3 tuần (200 mg/kg) còn nhóm

2 thì uống trong 20 tuần Kết quả, tỉ lệ ung thư ở các nhóm 1, 2 giảm lần lượt 40%,50% so với không được điều trị là 100% [104]

Tian Fang và cộng sự (2012) nghiên cứu khả năng của curcumin trong việc nângcao hiệu quả điều trị ung thư đường tiêu hóa của 5-Fluorouracil và Oxaliplatin

(FOLFOX) trong trên chuột cái Balb/C (5 tuần tuổi) bị gây ung thư bằng cách tiêm

dưới da (vùng sườn trước của chuột) 1x107 tế bào BGC-823, khi khối u xuất hiện vàđạt thể tích trung bình đạt khoảng 20 mm3 thì tiến hành cho điều trị Chuột đượcchia làm 4 nhóm: nhóm 1 chỉ dùng curcumin (10 mg/kg, tiêm phúc mô màng bụngmỗi ngày); nhóm 2 chỉ dùng FOLFOX (5-FU 33 mg/kg, tiêm phúc mô 2 lần mỗituần + Oxaliplatin 10 mg/kg, tiêm phúc mô một lần duy nhất trong suốt quá trìnhđiều trị) ; nhóm 3 kết hợp curcumin + FOLFOX; nhóm 4 nhóm (uống nước muốisinh lý) Sau 14 ngày điều trị thì đem giết chuột, đo thể tích khối u Kết quả chothấy, curcumin không có tác dụng phụ khi sử dụng và không có hiện tượng giảmtrọng lượng so với chuột nhóm 4; chuột nhóm 2 và nhóm 3 có sự giảm trọng lượng

có ý nghĩa thống kê so với nhóm 4, sự giảm trọng lượng của nhóm 2 và nhóm 4 làtương tự nhau; sự kết hợp của chất curcumin và FOLFOX ức chế đáng kể sự pháttriển của khối u so với những con chuột chỉ sử dụng FOLFOX, curcumin riêng lẻhay nhóm chỉ sử dụng nước muối sinh lý [117]

Liu Xiaohong và cộng sự (2014) nghiên cứu khả năng ức chế sự tăng sinh của tếbào ung thư dạ dày bằng cách làm suy yếu kênh kali nhạy cảm với ATP (KATP)của curcumin Nghiên cứu sử dụng dòng tế bào ung thư SCG-7901 cấy dưới da,

nách phải của 18 con chuột cái Balb/C có khối lượng trung bình (17,64 ± 5,19 g),

sau khi thể tích khối u > 100 mm3 chia ngẫu nhiên chuột ra làm 3 nhóm: nhóm 1tiêm phúc mô nước muối sinh lý 2 lần/ngày/2 tuần; nhóm 2 chuột được tiêm phúc

mô curcumin (50 mg/kg) 2 lần/ngày/2 tuần; nhóm 3 chuột được tiêm phúc mô đồngthời curcumin (50 mg/kg) + diazoxid (10 mg/kg) 2 lần/ngày/2 tuần Khối u củachuột được đo 2 lần/tuần, đồng thời khối u cũng được cân nặng sau khi chuột bị giết

(3 tuần sau khi uống thuốc) Kết quả, so với nhóm 1 thể tích khối u đã giảm đáng kểtrong nhóm 2 bắt đầu từ ngày 7 (p<0,05) tuy nhiên, nhóm 3 lại có thể tích khối ucao hơn đáng kể so với nhóm 2 (p<0,05) Kết quả tương tự với khối lượng khối ucũng cho thấy nhóm 2 giảm đáng kể so với nhóm 1 (p<0,05) ; nhóm 3 có giảm sovới nhóm 1 (p<0,05) nhưng vẫn cao hơn nhóm 2 [65].

Uehara Yoshihiko và cộng sự (2015) nghiên cứu khả năng ức chế -caenin vàSTAT 3 (2 yếu tố gây ung thư dạ dày) của hợp chất GY-031 có cấu trúc tương tự

curcumin trên mô hình chuột K19-Wnt1/C2mE Gan (chuột biến đổi gen) 10 tuần

tuổi Chuột được chia làm 2 nhóm: nhóm 1 hàng ngày ăn 5 g HFD (loại thức ănchứa hàm lượng chất béo cao); nhóm 2 hàng ngày ăn 5 g HFD và 0,5% (w/w) GY-

031, sau 10 tuần đem giết và phân tích khối u Kết quả, chuột ở nhóm 1: tỷ lệ chuột

có khối u tại thời điểm 13-15, 16-18, và 20 tuần tuổi là 25,0; 83,3 và 91,7% trongkhi ở nhóm 2 tại 13-15 tuần tuổi không thấy xuất hiện khối u, tuần 16-18 chỉ có30%; tuần 20 là 50% Thể tích trung bình khối u của nhóm 1 là 3,1 ± 1,5 mm, trongkhi đó ở nhóm 2 chỉ có 1,6 ± 1,5 mm; ức chế 22,6% -catenin và 44,8% STAT 3.Ngoài ra, GY-031 còn ức chế sự xâm nhập của đại thực bào [122]

Da Wei và cộng sự (2015) nghiên cứu khả năng ức chế mật độ dày đặc củamạch bạch huyết của curcumin trên mô hình gây ung thư bằng cách cấy vào nách

chân trước của chuột Balb/C 6 tuần tuổi (khoảng 20 g) bằng tế bào SGC-7901 (tế

bào ung thư dạ dày ở người) Mô hình có 40 con chuột với tỷ lệ chuột cái:chuột đực(1:1) Một tuần sau khi tiêm tế bào ung thư, chuột được chia ngẫu nhiên thành 4nhóm (10 con/nhóm): nhóm 1 nước muối sinh lý; nhóm 2 curcumin 40 mg/kg/ngày;nhóm 3 curcumin 80 mg/kg/ngày; nhóm 4 curcumin 160 mg/kg/ngày Các conchuột được tiêm phúc mạc curcumin 2 lần/tuần và được cân 2 lần/tuần; 8 tuần saukhi cấy chuột bị giết và đem phân tích Kết quả cho thấy, khối lượng chuột không

có sự khác biệt giữa các nhóm; về thể tích và số khối u thấp hơn đáng kể ở nhữngcon chuột được điều trị bằng curcumin 80 và 160 mg/kg/ngày so với nhóm 1(p<0,001) Ngoài ra, cả hai liều curcumin 80 và 160 mg/kg/ngày giảm đáng kể mật

độ hạch bạch huyết (p<0,01) [23]

Bảng 1 3 Một số nghiên cứu tác dụng của curcumin trên mô hình gây ung thư

khác trên chuột

Stt Tác giả Năm Nghiên cứu TL

TK

4

Manoharan

S và

cộng sự

5 Lu

Wei-Dong

và cộng sự

6

Bimonte

Sabri

na và cộng sự

7 N g h i ê n

c ứ u

h i ệ u

q u ả

n g ă n

n g ừ a

u n g

t h ư

v ú

c ủ a

d ị c h c

hiết Nghệ trên mô hình gây ung thư

ở chuột cái

Dawley

Sprague-(4-5 tuần tuổi) bởi 7,12- Dimethyl benz[a]a nthracen

e (DMBA)

2002 Nghiên cứu hiệu quả của trà và curcumin trên mô hình gây ung thư vòm họng bằng DMBA

2007 Nghiên cứu hiệu quả kháng khối u của curcum

in trên

mô hình gây ung thư ở

30 chuột cái

Balb/C

bị gây ung thư bằng 1

x 107 (trong

100 µL đệm phosph at) hỗn dịch tế bào HeLa

2009 Nghiên cứu hiệu

quả của curcumin và piperin trên mô hình gây ung thư vòm họng bằng DMBA (0,5% trong parafin lỏng; 0,1 mL) bôi cục bộ vào

túi má trái của chuột đực hamster Syrian

vàng

2013 Nghiên cứu hiệu quả của curcumin trên mô

hình chuột cái Balb/C (5 tuần tuổi) bị gây

ung thư bởi 4 x 106 (trong 0,1 mL đệm phosphat) hỗn dịch tế bào HCT8/VCR-gây ung thư đại tràng đa kháng thuốc

2015 phân tích vai trò của curcumin trong việc ức chế sự tăng trưởng và hình thành mạch trên

mô hình gây ung thư vú ở chuột bằng cách cấy vào bên dưới sườn phải của 16 chuột cái

Fonx1 nu/nu 6-8 tuần tuổi hỗn dịch 2,5 x

106 tế bào MBA.MB 231

[ 2 4 ]

[6 0] [1 34 ]

[ 6 9 ] [ 6 7 ] [ 1 7 ]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU

- HPTR của curcumin với PEG, PVP K30, HPMC 606, -cyclodextrin và tween 80

- Thành phần công thức viên nén nổi chứa HPTR curcumin 100 mg dùng bào

chế viên, các thử nghiệm trên in vitro và in vivo.

- 03 lô viên nén nổi chứa HPTR curcumin 100 mg được nghiên cứu và bào chế

để khảo sát độ ổn định thuốc (mỗi lô 2000 viên)

Bảng 2 1 Các n guyên l iệu sử dụ n g tro n g bào chế

Bảng 2 2 Các n guyên liệu=sử dụn g tron g phâ n tích

1 Acetonitril Đức Dùng cho HPLC

2 Acid acetic băng Đức Dùng cho HPLC

3 Acid hydroclodric Trung Quốc TCCS

4 Acid phosphoric Đức Dùng cho HPLC

5 Acid formic Đức Dùng cho HPLC

7 Kali dihydrophosphat Trung Quốc TCCS

10 Natri hydroxyd Trung Quốc TCCS

12 Nước cất hai lần Việt Nam DĐVN IV

13 Chất chuẩn đối chiếu curcumin I do Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Tp Hồ

Chí Minh cung cấp số lô QT 209020313, với độ tinh khiết là 98,90% tínhtrên chế phẩm nguyên trạng

Bảng 2 3 Các n guyên liệu và độ n g vật sử dụng trong thử in= vi t ro và in vivo

Tinh khiếtNhà bào chế

3 Tá dược trong viên nén nổi Mỹ, Trung Quốc,

Ấn Độ

TCCS

11 Dòng tế bào ung thư dạ dày N87 Hoa Kỳ Dùng thí nghiệm

12 Chuột nhắt trắng, chủng Swiss Viện pasteur Việt Dùng thí nghiệm13

albino, giống cái

Các nguyên liệu thử độc tế bào

Nam

Tinh khiết

tích vi thể dạ dày chuột

Bảng 2 4 Các t r ang t hiết bị đư ợ c sử dụng t r ong đề tài

1 Hệ thống máy HPLC Dionex UltiMate 3000 Mỹ

19 Các thiết bị xử lí mẫu và đo IR

20 Các thiết bị xử lí mẫu và đo DSC

21 Các thiết bị xử lí mẫu và đo SEM

22 Các thiết bị xử lí mẫu thử độc tính tế bào

23 Các thiết bị xử lí mẫu phân tích vi thể dạ dày chuột

Địa điểm nghiên cứu

1 Khoa Dược, Khoa Y-Trường Đại học Y Dược Cần Thơ

2 Phòng nghiên cứu và phát triển-Cty Cổ phần Dược Hậu Giang

3 Khoa khoa học tự nhiên, Khoa công nghệ, Phòng thí nghiệm chuyên sâu, Trạm xá thú y-Đại Học Cần Thơ

4 Trung tâm kiểm nghiệm Thuốc-Mỹ phẩm-Thực phẩm TP Cần Thơ

5 Bộ môn Dược lý-Khoa Dược, Đại Học Y Dược TP HCM

6 Phòng sinh học nano và ứng dụng-Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên, ĐạiHọc Quốc Gia Hà Nội

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng curcumin trong hệ phân tán rắn bằng phương pháp quang phổ UV-Vis và trong viên nén nổi bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

2.2.1.1 Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng curcumin trong HPTR bằng phương pháp quang phổ UV-Vis

a Chuẩn bị mẫu

Dung dịch chuẩn đối chiếu: cân chính xác khoảng 10 mg curcumin chuẩn chovào bình định mức 50 mL, thêm methanol, siêu âm trong 10 phút; bổ sung thể tíchđến vạch, lắc kỹ Lọc qua giấy lọc, bỏ khoảng 10 mL dịch lọc đầu Hút chính xác 1

mL dung dịch cho vào bình định mức 50 mL, bổ sung vừa đủ đến vạch bằng dungdịch đệm pH 1,2; lắc đều Dung dịch thu được có nồng độ đối chiếu là 4 μg/mL.Dung dịch mẫu giả định: cân chính xác khoảng 10 mg curcumin và một lượng tádược tương ứng tỷ lệ trong công thức cho vào bình định mức 50 mL, thêmmethanol, siêu âm trong 10 phút; bổ sung thể tích đến vạch, lắc kỹ Lọc qua giấylọc, bỏ khoảng 10 mL dịch lọc đầu Hút chính xác 1 mL dịch lọc cho vào bình địnhmức 50 mL, bổ sung vừa đủ đến vạch đệm pH 1,2; lắc đều Dung dịch thu được cónồng độ curcumin là 4 μg/mL

b Tính đặc hiệu

Chuẩn bị mẫu chuẩn và mẫu giả định: chuẩn bị như 2.2.1.1-mục a.

Dung dịch mẫu trắng: cân chính xác khoảng 80 mg tá dược cho vào bình địnhmức 50 mL, thêm methanol, siêu âm trong 10 phút; bổ sung thể tích đến vạch, lắc

kỹ Lọc qua giấy lọc, bỏ khoảng 10 mL dịch lọc đầu Hút chính xác 1 mL dịch lọccho vào bình định mức 50 mL Bổ sung đệm pH 1,2 vừa đủ đến vạch, lắc đều

Dung môi pha mẫu: MeOH

Dung dịch thử độ hòa tan: đệm pH 1,2

Tiến hành: quét phổ trong vùng từ 300-600 nm và đo độ hấp thu UV-Vis tạibước sóng 428 nm

Yêu cầu: phổ UV-Vis của mẫu chuẩn, mẫu giả định phải chồng khít lên nhau,mẫu trắng, dung môi pha mẫu, dung dịch đệm thử độ hòa tan pH 1,2 không có đỉnhhấp thu tại bước sóng định lượng Xác định hiệu hay độ sai lệch các kết quả thuđược theo công thức:

� 0

� × 100 ≤ 2% (2.1)

A: độ hấp thu mẫu giả định tại bước sóng định lượng

A0: độ hấp thu mẫu trắng tại bước sóng định lượng

c Tính tuyến tính

Dung dịch chuẩn đối chiếu gốc (400 g/mL): cân chính xác 10 mg curcuminchuẩn cho vào bình định mức 25 mL, thêm methanol, siêu âm trong 10 phút; bổsung thể tích đến vạch, lắc kỹ

Pha giai mẫu có nồng độ trong khoảng 1-10 g/mL Đo độ hấp thu các dungdịch tại bước sóng 428 nm

Lập đường tuyến tính ŷ = ax + b bằng cách sử dụng phần mềm Microsoft Excel

2003 thể hiện mối tương quan giữa nồng độ và độ hấp thu, biểu thị bằng hệ số tương quan bình phương r2; với r2  0,9980

Dùng trắc nghiệm F kiểm tra tính tương thích của phương trình hồi quy và dùngtrắc nghiệm t kiểm tra ý nghĩa của các hệ số a và b:

- Giả thuyết H0: phương trình/ hệ số hồi quy; không tương thích/ không có ýnghĩa

- Giả thuyết H1: phương trình/ hệ số hồi quy; tương thích/ có ý nghĩa