Nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh lý, hóa sinh của vi tảo biển dunaliella salina phân lập từ ruộng muối giao thủy nam định

TRỊNH MINH THU NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH LÝ, HÓA SINH CỦA VI TẢO BIỂN Dunaliella salina PHÂN LẬP TỪ RUỘNG MUỐI GIAO THỦY - NAM ĐỊNH Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số:

TRỊNH MINH THU

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH LÝ, HÓA SINH

CỦA VI TẢO BIỂN Dunaliella salina PHÂN LẬP TỪ

RUỘNG MUỐI GIAO THỦY - NAM ĐỊNH

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS TRẦN ĐĂNG KHOA

Hà Nội, 2017

chỉ bảo và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

Tôi chân thành cảm ơn TS Nguyễn Thị Hoài Hà đã chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các Thầy Cô trường ĐHSP Hà N i 2 và cán

b Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học ĐHQGHN đã cung cấp những kiến thức nền tảng cơ bản hỗ trợ cho quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Cuối cùng, Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình người thân, bạn bè đã luôn đ ng viên giúp đỡ trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Học viên

T ịnh Minh Thu

trung thực và không tr ng l p với c c đề tài kh c

Tôi cũng xin cam đoan r ng c c thông tin tr ch dẫn trong luận văn đã được chỉ r ngu n gốc

Hà Nội, tháng năm 2017

Học viên

Trịnh Minh Thu

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Giới thiệu về Dunaliella 4

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu 4

1.1.2 Vị trí phân loại của Dunaliella 4

1 1 3 Đ c điểm sinh học của Dunaliella 5

1.1.4 Sinh sản 6

1.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng 7

1.2 Carotenoid 11

1.2.1 Caroten 13

1.2.2 Xanthophyll 15

1.3 Tình hình nghiên cứu Dunaliella trong và ngoài nước 16

1.3.1 Tình hình nghiên cứu Dunaliella trong nước 16

1.3.2 Tình hình nghiên cứu Dunaliella ngoài nước 16

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2 1 Đối tượng nghiên cứu 18

2 1 1 Đối tượng 18

2 1 2 Địa điểm nghiên cứu 18

2 1 3 Môi trường 18

2.1.4 Thiết bị 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 19

2.2.1 Phân lập vi tảo 19

2 2 2 X c định khả năng sinh trưởng 20

2 2 3 Phương ph p phân loại 20

2.2.4 Nghiên cứu điều kiện ảnh hưởng đến sinh trưởng và tổng hợp β-caroten của vi tảo Dunaliella 21

2 2 5 Phương ph p t ch chiết carotenoid 21

2.2.8 Các phân tích thống kê 23

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 Phân lập và sàng lọc vi tảo Dunaliella 24

3 2 Đ c điểm hình th i học và hình thức sinh sản của Dunaliella DUN23 25

3 3 Phân t ch giải trình tự 18S rDNA 27

3.4 Ảnh hưởng của c c điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng và t ch lũy  -caroten của vi tảo Dunaliella salina DUN23 31

3.4.1 Ảnh hưởng của n ng đ NaCl đến sinh trưởng và t ch lũy -caroten của vi tảo Dunaliella salina DUN23 31

3.4.2 Ảnh hưởng của cường đ chiếu s ng đến sinh trưởng và t ch lũy  -caroten của vi tảo Dunaliella salina DUN23 33

3.5 Lựa chọn phương ph p và dung môi th ch hợp cho tách chiết carotenoid 35

3.6 Phân tích carotenoid b ng sắc ký bản mỏng TLC 37

3.7 Phân tách carotenoid b ng phương ph p HPLC 39

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

ANH MỤC CÁC CH VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ

EDTA Ethylene DiamineTetraacetic Acid

Môi trường J Môi trường Johnsons

HPLC High Performance Liquid Chromatography - Sắc ký lỏng cao áp

TLC Thin Layer Chromatography - Sắc ký bản mỏng

DANH MỤC ẢNG

Bảng 2.1 Môi trường Johnsons (J) 18

Bảng 2.2 Vị trí thu mẫu của 5 chủng Dunaliella 19 Bảng 3.1 Khả năng sinh trưởng và t ch lũy carotenoid của 5 chủng Dunaliella

sau 16 ngày 24 Bảng 3.2 Các ký hiệu chi và mã GenBank 18S rDNA và ITS của các vi tảo

tham khảo 29

ANH MỤC H NH

Hình 1.1 Cấu tạo tế bào Dunaliella 5

Hình 1.2 Hợp nhất dạng đỏ và xanh của D salina và sự hình thành giao tử 7

Hình 1.3 Mô hình cấu trúc hóa học chung của m t số carotenoid 12

Hình 1.4 Mô hình cấu trúc hai đ ng phân của -caroten 14

Hình 3.1 Hình dạng tế bào sinh dưỡng Dunaliella DUN23 (thanh k ch thước 5µm) 25

Hình 3.2 Thể giao tử Dunaliella DUN23 (thanh k ch thước 5µm) 25

Hình 3.3 Sinh sản hữu tính của Dunaliella DUN23 26

Hình 3.4 Sinh sản vô tính của Dunaliella DUN23 27

Hình 3.5 Cây phả hệ dựa trên phân tích giải trình tự18S rDNA của Dunaliella DUN23 và các chủng có quan hệ họ hàng gần 28

Hình 3.6 Cây phân phả hệ dựa trên phân tích giải trình tự ITS của Dunaliella DUN23 và các chủng có quan hệ họ hàng gần 29

Hình 3.7 Ảnh hưởng của n ng đ NaCl đến sinh trưởng và hàm lượng  -caroten của vi tảo Dunaliella salina DUN23 32

Hình 3.8 Ảnh hưởng của cường đ chiếu s ng đến sinh trưởng và t ch lũy -caroten của vi tảo Dunaliella salina DUN23 34

Hình 3 9 Hàm lượng carotenoid tách chiết b ng phương ph p (a) vortex (b) sonic, (c) hỗn hợp dung môi 36

Hình 3.10 Sắc ký đ TLC carotenoid của vi tảo Dunaliella salina DUN23 38

Hình 3.11 Sắc ký đ chuẩn của Lutein 9.814; Astaxanthin 12.985; -caroten 14.299 39

Hình 3.12 Sắc ký đ HPLC của Dunaliella salina DUN23 (Thời gian lưu: Lutein 9.784; Astaxanthin 12.986; -caroten 14.298) 40

nhiên liệu sinh học, các dạng dược phẩm…

Vi tảo lục-cam Dunaliella (ngành tảo lục) là các loài có hình dạng khác nhau

từ hình que tới dạng trứng đơn bào di đ ng (9 tới 11 µm), xuất hiện trong nhiều

v ng nước m n như đại dương c c h nước m n c c đầm lầy, b n chứa và các mương ngập m n gần biển, chiếm ưu thế trong các thủy vực có chứa hàm lượng muối n ng đ 2M M t vài loài vi tảo có thể t n tại trong c c điều kiện đ muối cao như c c ao bay hơi muối Để t n tại, những vi tảo này t ch lũy c c β-carotene và glycerol với n ng đ cao để bảo vệ chúng trước các yếu tố cường đ ánh sáng và áp

suất khí quyển Loài Dunaliella cũng được nghiên cứu nhiều do chúng có hoạt tính

chống oxy hóa cao, chúng có khả năng t ch lũy lượng lớn các carotenoid Chi

Dunaliella có 22 loài và m t số dạng biến thể, các dạng sinh sống ở biển và các loài

ưa m n, những vi tảo này được nuôi cấy tương đối đơn giản và không kết thành

đ m hay c c dạng chuỗi Loài được biết tới nhiều nhất là Dunaliella salina ưa m n

Dunaliella là ngu n ch nh t ch lũy m t lượng carotenoid lớn trong tự nhiên[34] Trong môi trường nước m n, Dunaliella salina có màu lam Tuy nhiên,

trong c c điều kiện đ muối và cường đ ánh sáng cao, vi tảo này lại biến thành màu đỏ do sự sinh t ch lũy các carotenoid có chức năng bảo vệ tế bào

Công nghệ sinh học tảo có những ưu điểm lớn trong hàng thập kỷ qua và những kết quả nghiên cứu đã mang lại những giá trị to lớn cho con người Hiện nay, carotenoid đang được quan tâm nhiều trên thị trường, chúng sử dụng như c c chất tạo màu trong các loại thực phẩm dinh dưỡng dược phẩm, mỹ phẩm Những hợp chất này có c c đ c tính chống oxy hóa và thu hút được nhiều sự chú ý bởi c c đ c tính tiềm ẩn của chúng trong qu trình ngăn ngừa ung thư[28] Trong số khoảng

1000 c c carotenoid được tìm thấy trong tự nhiên, chỉ m t vài trong số chúng có chứa β-carotene (cà rốt), lycopene (cà chua) và lutein (sau bina) M c dù m t số loại carotenoid, ví dụ β-carotene và zeaxanthin có thể được tổng hợp nhân tạo, ngu n carotenoid từ vi tảo tự nhiên cũng như từ vi khuẩn và nấm men được sử dụng như các chất bổ sung vẫn tạo được sự chú ý lớn của c ng đ ng thế giới Ngày nay, vi tảo

Dunaliella đang thu hút được nhiều sự chú ý do khả năng t ch lũy β-carotene của

nó M t phân tử β-carotene có thể trung hòa tới hơn 1000 phân tử oxy gốc tự do

Nam Định là vựa muối lớn nhất của miền Bắc với 870 ha có thể sử dụng cho sản xuất muối Giao Thuỷ là huyện ven biển, ở cực nam đ ng b ng châu thổ sông

H ng ph a Nam và Đông Nam tiếp giáp với biển Đông Việt Nam, tiếp giáp các huyện Xuân Trường, Hải Hậu (Nam Định) và Kiến Xương Tiền Hải (Thái Bình) Hai xã Giao Phong và Bạch Long thu c huyện Giao Thủy là hai trong những

xã có sản lượng muối cao của tỉnh Ru ng muối thu c xã Giao Phong n m sát phía trong đê trung ương gi p thị trấn Quất Lâm Từ 250 ha ru ng muối, mỗi năm xã Bạch Long đóng góp khoảng 40000 tấn muối Gần đây do sự gia tăng nhiệt đ , quá

trình bay hơi nước trực tiếp đ muối tăng lên; quần thể Artemia (loài giáp xác) giảm và do đó sự đa dạng về mật đ Dunaliella ở ru ng muối của hai xã tăng lên

màu đỏ của ru ng muối cũng từ đó mà hình thành

Vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh lý, hóa

sinh của vi tảo biển Dunaliella salina phân lập từ ruộng muối Giao Thủy-Nam Định” nh m tạo cơ sở cho việc đưa chủng vi tảo Dunaliella salina vào nhân nuôi

trên quy mô công nghiệp, nh m đạt hiệu quả cao trong việc khai thác giá trị kinh tế

to lớn của chủng vi tảo này

2 Mục đ ch nghiên cứu

X c định m t số chỉ tiêu sinh lý hóa sinh của vi tảo biển Dunaliella salina

Tuyển chọn được vi tảo biển Dunaliella tiềm năng sinh tổng hợp carotenoid

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

Phân lập x c định chỉ tiêu sinh lý hóa sinh vi tảo biển Dunaliella salina

Nghiên cứu c c yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và t ch lũy β-caroten

của vi tảo Dunaliella salina

T ch chiết carotenoid từ vi tảo Dunaliella salina

4 Điểm mới của luận văn

Cung cấp m t số dẫn liệu cập nhật về ngu n gen vi tảo biển Dunaliella ở các

đ ng muối tại khu vực nghiên cứu

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

5.1 Ý nghĩa khoa học

Góp phần bổ sung vốn kiến thức cho chuyên ngành sinh học thực nghiệm sinh thái học và là cơ sở khoa học cho những nghiên cứu về ngu n gen vi tảo biển đa dạng sinh học và nuôi tr ng thủy sản

5.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả của đề tài phục vụ trực tiếp việc bảo t n ngu n gen vi tảo trong c c

đ ng muối Nam Định, tuyển chọn được vi tảo biển Dunaliella đưa vào khai th c

nhân nuôi trên quy mô công nghiệp

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU

1.1 Giới thiệu v Dunaliella

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu

Năm 1838, Dunal mô tả đầu tiên về loài vi tảo đỏ đơn bào hai roi, sống trong nước biển cô đ c Ông đã công bố sự có m t của m t nhóm sinh vật trong các ru ng muối ở Montpellier thu c bờ biển Mediterranean nước Ph p mà ngày nay được biết

đến là Dunaliella salina [26]

Trong suốt thế kỷ 19, các nhà sinh học cũng quan sát thấy vi tảo đỏ có roi của Dunal trong các h nước m n và tại các khu vực có đ m n cao ở Crimea, Algeria, Lorraine, Pháp và Romania [7]

Năm 1905, Teodoresco (Bucharest) và Clara Hamburger (Heidelberg) công

bố hai bài báo mô tả chi tiết thêm về Dunaliella như là m t chi mới Teodoresco đã

nghiên cứu mẫu thu thập từ ru ng muối ở Romani, trong khi Hamburger nghiên cứu trên các mẫu vật được gửi tới từ các ru ng muối ở Cagliari, Sardinia Cả hai tác giả đều trình bày bản vẽ chi tiết của sinh vật về hình thái, cấu trúc, sinh sản, tập tính và

sinh thái học Trong phân loại, chi Dunaliella được đ t tên Dunal vì sự kính trọng

đối với ông người đầu tiên quan sát thấy sinh vật này trong các ru ng muối ở Pháp

c ch đây gần 70 năm với hai loài đầu tiên trong chi này đã được công bố năm 1906

là Dunaliella salina và Dunaliella viridis [26]

1.1.2 Vị trí phân loại của Dunaliella

Theo Avron và Ben-Amotz, phân loại khoa học của Dunaliella như sau [6]:

1.1.3 Đặc điểm sinh học của Dunaliella

Dunaliella là vi tảo đơn bào sống đơn lẻ có hai roi Tế bào không có lớp

màng polysaccharide cứng, được bao bọc bởi màng đàn h i mỏng và phủ m t lớp

áo là màng nhầy nguyên sinh chất Việc thiếu m t polysaccharide cứng giúp tế bào nhanh thay đổi về khối lượng để đ p ứng áp lực thẩm thấu trong tế bào b ng c ch loại bỏ glycerol qu trình chấm dứt khi thể t ch trở về với gi trị ban đầu [10] Tế

bào Dunaliella có hình dạng khác nhau: hình trứng, hình cầu, hình quả lê ho c hình

elip với c c k ch thước: chiều dài 5-25µm, chiều r ng 3-13µm [20] Tế bào của m t loài nhất định có thể thay đổi hình dạng khi c c điều kiện sống thay đổi trong điều kiện không thuận lợi tế bào thường có dạng hình cầu K ch thước tế bào cũng có thể thay đổi khi điều kiện sinh trưởng và cường đ nh s ng thay đổi [33]

Hình 1.1 Cấu tạo tế bào Dunaliella [10]

Hạt nhân thường bị che khuất bởi m t số hạt nhỏ, nó chiếm hầu hết diện tích phần trước của tế bào

và thường được bao quanh bởi th y trước lục lạp [33] Những tế bào di đ ng này chuyển đ ng nhờ hai roi, trong đó m t roi n m ở điểm cuối ph a trước của

tế bào, chiều dài của roi phụ thu c vào loài

Tế bào chứa duy nhất m t lục lạp đơn hình chén lục lạp này bao g m m t hạt tinh b t ở trung tâm được bao quanh bởi tinh b t Lục lạp chiếm hầu hết diện

t ch cơ thể Thể lục lạp khắc thành nhiều thùy, các màng thylakoid trong lục lạp xếp

ch ng lên nhau dày đ c Lục lạp có thể t ch lũy m t lượng lớn β-caroten làm cho các tế bào có màu cam ho c đỏ thay vì màu xanh lá cây Khi nuôi cấy ở n ng đ

muối thấp tế bào có thể bị mất màu cam Nghiên cứu siêu cấu trúc cho thấy tế bào

có m t màng xốp được bao quanh bởi chất dị nhiễm sắc kết tụ Ty thể có thể n m trong các b phận khác nhau của tế bào ở phần mỏng Số lượng và k ch thước của

ty thể khác nhau giữa các tế bào và ở giai đoạn phát triển khác nhau Số lượng b máy golgi trong tế bào có thể có từ 2 đến 4, g m 10-15 túi màng dẹt xếp ch ng nhau Điểm mắt n m ở ngoại vi của lục lạp

Các loài trong chi Dunaliella được phân lập từ môi trường nước m n như

biển và các h muối với m t dải r ng các thành phần hóa học và n ng đ muối dao

đ ng từ 0,5% đến bão hòa khoảng 35% Cơ chế thích nghi với dải n ng đ muối

r ng ở Dunaliella dựa trên khả năng thay đổi n ng đ glycerol trong tế bào Khi Dunaliella được nuôi cấy ở đ m n cao thì n ng đ glycerol n i bào vượt quá 50%

Trong điều kiện này glycerol đóng vai trò như m t “chất tan tương th ch” bảo vệ chống lại cả hai enzyme bất hoạt và ức chế Cũng thấy r ng dưới ánh sáng ho c trong tối tổng hợp glycerol trong điều kiện ưu trương và loại bỏ trong điều kiện nhược trương đ c lập với tổng hợp protein [10] M t khác, những nghiên cứu gần

đây cho r ng Dunaliella có m t khả năng đ c biệt trong việc loại bỏ các ion Na+

trong môi trường m n cao b ng cách sử dụng m t kênh bơm natri theo hướng oxy hóa khử mới [22] Các kết quả nghiên cứu proteomic cũng chỉ thêm r ng ngoài các

phương ph p trên, Dunaliella đ p ứng với thay đổi đ m n cao b ng cách tăng

cường quang tổng hợp để đ ng hóa CO2 [26] Ngoài sự thích nghi với điều kiện môi

trường n ng đ muối cao của hầu hết các loài Dunaliella thì Dunaliella acidophila

có thể phát triển trong môi trường axit (pH 0-1), Dunaliella antarctica phát triển mạnh ở nhiệt đ thấp và m t số chủng D salina có thể chịu được cường đ ánh sáng cao Dunaliella là sinh vật có khả năng th ch nghi được với nhiều điều kiện

môi trường sống khắc nghiệt nhất

1.1.4 Sinh sản

Dunaliella có m t chu trình sinh trưởng phức tạp bao g m cả sinh sản hữu

tính và vô tính Sự hợp nhất của hai đ ng giao tử thành m t hợp tử đã được chứng minh trong nhiều nghiên cứu trước đây Các nghiên cứu của Lerche đã chỉ ra

phương thức sinh sản hữu tính của Dunaliella, sự hình thành hợp tử hữu tính của 5 trong số 6 loài được nghiên cứu bao g m D salina, D parva, D peircei, D euchlora, D minuta Sự hình thành hợp tử ở D salina được hoạt hoá bởi sự giảm

n ng đ muối từ 10 đến 3% Bắt đầu quá trình, các roi tiếp xúc với nhau, tiếp sau đó các giao tử tạo nên m t cầu sinh chất và hợp nhất Hợp tử có lớp phía ngoài dày, chúng có thể chịu được môi trường nước ngọt và cũng có thể kéo dài được sự sống trong điều kiện khô hạn Những hợp tử này nảy mầm b ng cách phóng thích lên tới

32 tế bào con khi phá vỡ bào nang Tuy nhiên trong trường hợp này, tế bào hình thành vỏ dày và tròn đã diễn ra vào thời điểm đ m n của nước tăng lên Sinh sản

hữu tính ở Dunaliella là phổ biến hơn sinh sản vô tính [26]

Sinh sản vô tính b ng cách phân chia theo chiều dọc tế bào thành nhiều đ ng

bào tử G p điều kiến bất lợi Dunaliella hình thành bào tử nghỉ (dạng cyst) có vách

dày chống chịu được với điều kiện khắc nghiệt Khi g p điều kiện thuận lợi chúng phát triển thành cơ thể mới

Hình 1.2 Hợp nhất dạng đỏ và xanh của D salina và

sự hình thành giao tử [26]

1.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng

Dunaliella có thể sinh trưởng trong môi trường có n ng đ NaCl cao N ng

đ NaCl có ảnh hưởng cao đến sinh trưởng và phát triển của Dunaliella Ngoài ra

các yếu tố kh c như dinh dưỡng, nhiệt đ , pH, ánh sáng cũng ảnh hưởng đến sinh

trưởng của Dunaliella

B, UV-A bức xạ tạo ra sự t ch lũy lớn carotenoid của D bardawil mà không làm

chậm quá trình sinh trưởng [21]

1.1.5.2 Nhiệt độ

Dunaliella có khả năng sinh trưởng trong m t dải nhiệt đ từ dưới 0 đến

450C.Trong phòng thí nghiệm, nhiệt đ tối ưu cho sự sinh trưởng của Dunaliella là

320C và thích hợp ở dải nhiệt đ 25 - 350C Nhiệt đ thấp làm giảm tốc đ sinh trưởng dẫn đến giảm số lượng tế bào M t khác, nhiệt đ ở 40o

C sẽ thúc đẩy cảm ứng carotenoid nhưng đ ng thời cũng làm chậm tỷ lệ sinh trưởng [12] Ngoài ra, nhiệt đ cao hơn 40oC vi tảo Dunaliella sinh glycerol nhiều vào môi trường, đây là

m t ngu n cacbon hữu cơ là điều kiện tốt cho vi khuẩn và nấm sợi phát triển dẫn đến cạnh tranh với vi tảo [20]

1.1.5.3 pH

Dunaliella có khả năng chịu pH từ 0 11 nhưng pH tối ưu cho D.salina n m

trong khoảng 9  11 Trong nuôi cấy vi tảo tự dưỡng, pH tăng lên do vi khuẩn quang hợp cố định CO2 với NO3- góp phần làm tăng n ng đ OH- [9] Khi pH môi trường cao sẽ có nguy cơ kết tủa m t số các muối canxi và keo tụ sinh khối vi tảo Điều này dẫn đến giảm sinh trưởng của vi tảo bởi vậy trong nuôi cấy cần tr nh tăng

pH lên trên 8 [9] Trong hệ thống ao mở được vận hành pH thường được duy trì ở mức 7,5 ± 0,2 b ng điều khiển kép (CO2 và HCl) tại đầu vào của hệ thống nuôi cấy

Đ ng thời trong quá trình nuôi cấy, bổ sung CO2 và HCl Trong m t số ao mở và các bể phản ứng quang sinh, ngu n cung cấp chính cacbon vô cơ là ion HCO3-, pH được điều khiển b ng cách cho thêm HCl

1.1.5.4 Nhu cầu dinh dưỡng

Dunaliella là sinh vật quang tự dưỡng, sử dụng CO2 và HCO3- như ngu n cacbon vô cơ Việc thiếu m t ngu n cacbon vô cơ th ch hợp là yếu tố hạn chế sinh

trưởng dưới c c điều kiện trong nuôi cấy D salina như đ m n cao, pH cao và nhiệt

đ cao [12] Các thiết bị sục khí, bơm CO2 được sử dụng trong hệ thống nuôi cấy

nh m cung cấp đủ lượng CO2 cần cho sinh trưởng Ngoài ra, bổ sung vào môi trường nuôi cấy 10 mmol/l NaHCO3 là cần thiết cho sinh trưởng tối ưu

Ngu n nitơ tốt nhất cho D salina là nitrate Trong thực tế, bổ sung vào môi

trường 5 mmol/lNaNO3 ho c KNO3 sẽ cho vi tảo sinh trưởng tốt M t khác, thiếu hụt nitrate là m t trong những cách phổ biến nhất để giảm tốc đ sinh trưởng đ ng thời sẽ kích hoạt cảm ứng sản xuất carotenoid Tuy nhiên, kéo dài thiếu hụt nitơ trong nuôi cấy, có thể dẫn đến tỷ lệ tử vong cao của các tế bào cũng như gây giảm nghiêm trọng hàm lượng carotenoid trong mỗi thể tích nuôi cấy Ngu n nitơ kh c như muối amoni và urê là không thích hợp vì chúng có thể gây chết vi tảo dưới điều kiện nhất định Nghiên cứu cũng chỉ ra r ng việc sử dụng NH4NO3 hay (NH4)2CO3

như ngu n nitơ sẽ gây đ c hại đối với sự phát triển của D salina [13] Phốt pho

trong KH2PO4 ho c NaH2PO4 cho kết quả tốt nhất Yêu cầu hàm lượng photphat tối

ưu cho sự phát triển là khoảng 0,2 mg/l KH2PO4 Trong ao mở, n ng đ cao hơn có thể ức chế sự sinh trưởng vì sự có m t đ ng thời của photphat và canxi đ c biệt là ở

pH cao hơn 8 có thể dẫn đến kết tủa Ca3PO4 và keo tụ vi tảo [18]

Dunaliella cũng cần n ng đ sunphat cao (khoảng 2 mmol/l) để phát triển tối

ưu nhưng sunphat rất ít khi phải thêm vào trong môi trường ao thương mại vì ngu n nước tự nhiên như nước biển ho c nước máy chứa hàm lượng sunphat cao (khoảng 30 mmol/l) [9]

Các yếu tố khác cũng cần cho sinh trưởng của D.salina bao g m: K+, Ca2+,

Mg2+, Cl-, Na+, sắt chelated và m t số yếu tố khác Các chỉ số của Mg2+/Ca2+ và Cl

-/SO42- trong môi trường cũng ảnh hưởng đến tốc đ sinh trưởng và tổng hợp

caroten Dunaliella có thể chịu được phạm vi r ng của tỷ lệ Mg2+/Ca2+ từ 0,8 – 2,0

Tỷ lệ Cl-/SO42- tốt nhất cho sinh trưởng tối ưu của D salina được nghiên cứu là 3,2,

trong khi đó tỷ lệ tối ưu cho t ch lũy carotenoid là khoảng 8,6 Fe3+ thường được thêm vào nuôi cấy dưới hình thức bổ sung FeCl3-EDTA ho c bổ sung sắt dạng phức-EDTA Nghiên cứu của Borowitzka và Borowitzka cho thấy, so với bổ sung sắt dạng phức thì bổ sung FeCl3 dẫn đến tốc đ sinh trưởng tăng nhanh hơn so với

sinh trưởng ban đầu của D Salina[13] Tuy nhiên, khi bổ sung sắt dạng phức thì

cho số lượng tế bào cao hơn so với FeCl3 Bốn nguyên tố vi lượng, bao g m cả mangan, kẽm coban và đ ng cũng cần thiết cho sự sinh trưởng tối ưu của

Dunaliella Tuy nhiên, không cần phải thêm các yếu tố đó vào môi trường nếu môi

trường đó bao g m các muối công nghiệp ho c nước biển [9]

1.1.5.5 Hệ thống nuôi cấy

Nuôi cấy đại trà vi tảo đã được phát triển trong các hệ thống nuôi cấy bao g m

ao mở ao tròn ao mương túi lớn, bể chứa, thùng lên men dị dưỡng và m t số loại bể phản ứng quang sinh k n C c đ c điểm sinh học của vi tảo là m t trong những yếu tố quan trọng nhất để xem xét cho lựa chọn m t hệ thống nuôi cấy thực tế

 Hệ thống ao mở

Ngày nay, các hệ thống thương mại phổ biến nhất cho nuôi sinh khối của

Dunaliella là ao mở ngoài trời Nhà máy sản xuất Dunaliella n m trong khu vực có

khí hậu nóng và khô với đ che phủ thấp và thường n m ở ngu n nước muối ho c gần ngu n nước muối Để kiểm so t đ m n thì nước biển với n ng đ muối thấp được bơm từ c c đầm phá vào các h nước sau đó bổ sung các chất dinh dưỡng thích hợp Sau khi các tế bào vi tảo trong ao đạt n ng đ -caroten thích hợp, sẽ được chuyển sang các nhà máy thu hoạch trên bờ và môi trường còn lại được bơm lại vào các ao [33]

Ngoài ra, ở m t số nơi sử dụng cánh khuấy nhỏ để tr n đều chất dinh dưỡng,

CO2 và tế bào vi tảo Cung cấp khí CO2 với vai trò là ngu n cacbon vô cơ đ ng thời

nh m kiểm soát pH Nuôi cấy ngoài trời có thể được vận hành theo mẻ ho c bán

liên tục Sự pha tr n của các hình thức nuôi cấy có nhiều ưu điểm: có hiệu quả ngăn

ch n các tế bào sa lắng, phân tầng nhiệt, hỗ trợ chất dinh dưỡng, phân phối khí và loại bỏ oxy dư thừa [33]

Các thông số ảnh hưởng đến năng suất của vi tảo trong ao như: tỷ lệ tr n đ sâu của hệ thống nuôi cấy k ch thước của các chủng… cần được tối ưu hóa trong bất kỳ trường hợp nghiên cứu nào vì kết quả có thể thay đổi từ m t điều kiện thử nghiệm khác

 Hệ thống khép kín

Bể phản ứng quang sinh công nghiệp là hệ thống tuyệt vời cho việc kiểm soát nhiều thông số nuôi cấy và do đó được sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật quang hợp như vi tảo và tế bào thực vật Sinh khối vi tảo thu được xử lý để sản xuất các sản phẩm dinh dưỡng, tổng hợp các thành phần có giá trị như axit béo bão hòa và carotenoid, làm thức ăn trong c c ngành công nghiệp nuôi tr ng thủy sản Bể phản ứng được thiết kế để phân phối ánh sáng và chất dinh dưỡng đều và tăng cường trao

đổi khí Trong sản xuất Dunaliella thì các thông số như: nhiệt đ , pH, chất dinh

dưỡng luôn được theo dõi và kiểm soát ch t chẽ

Tuy hệ thống khép kín đạt n ng đ sinh khối cao và kiểm soát các thông số môi trường và các thông số kỹ thuật khác là tốt hơn như giảm nguy cơ ô nhiễm, giảm thiếu hụt CO2 và có điều kiện tái canh tác sản xuất Nhưng gần đây c c số liệu

đã chỉ ra r ng: năng suất trên m t đơn vị thể tích và chi phí sản xuất trong hệ thống này không tốt hơn so với ao mở [24] So với ao mở, thiết kế của bể phản ứng quang sinh là phức tạp hơn tốn kém và khó áp dụng với quy mô r ng Tuy nhiên đối với các ứng dụng trong tương lai sử dụng bể phản ứng quang sinh có tiềm năng trong sản xuất hơn sử dụng hệ thống ao mở

1.2 Carotenoid

Carotenoid là m t họ của các hợp chất có sắc tố được tổng hợp từ thực vật,

vi sinh vật và đ ng vật Trong thực vật, chúng tham gia vào b máy quang hợp và bảo vệ thực vật chống lại bức xạ m t trời Trái cây và rau quả tạo thành các ngu n chính của carotenoid trong chế đ ăn uống của người Carotenoid có tác dụng ngăn

ngừa các bệnh như bệnh tim mạch ung thư và c c bệnh mãn tính khác Chúng cũng

là tiền chất của vitamin A

Hình 1.3 Mô hình cấu trúc hóa học chung của một số carotenoid [23]

Trong những năm gần đây c c đ c tính chống oxy hóa của carotenoid đã được quan tâm nghiên cứu [25] Cho đến nay có đến hơn 600 carotenoid được xác định trong tự nhiên Tuy nhiên, chỉ có khoảng 40 có m t trong m t chế đ ăn uống phổ biến của con người Trong số 40 carotenoid này thì có khoảng 20 carotenoid được tìm thấy trong máu và các mô của người Gần 90% carotenoid trong chế đ ăn uống và cơ thể người được đại diện bởi -caroten, -caroten, lycopen, lutein và cryptoxanthin [17]

Carotenoid có cấu trúc polyisoprenoid g m 40 nguyên tử cacbon, là m t chuỗi dài liên hợp của liên kết đôi Được cấu tạo bởi 8 đơn vị isoprence liên tiếp nhau ở trung tâm phân tử tạo nên cấu trúc đối xứng Có vài carotenoid mạch thẳng, nhưng đa số là những hợp chất có vòng 6 cạnh (ho c vòng 5 cạnh) ở m t đầu hay cả hai đầu của phân tử Những carotenoid khác nhau bởi tận cùng chứa các nhóm chức

kh c nhau nhưng đều có cấu trúc phân tử trung tâm giống nhau

Theo cấu trúc hóa học carotenoid được chia thành 2 loại là: caroten và xanthophyll

1.2.1 Caroten

Caroten - m t loại hydratcacbon chưa bão hòa có CTHH là C40H56, không tan trong nước, chỉ tan trong lipid và các dung môi hữu cơ Phần trung tâm phân tử

g m 18 nguyên tử cacbon hình thành m t hệ thống các liên kết đơn đôi xen kẽ, có

4 nhóm CH3 mạch nhánh Có 4 loại caroten quan trọng là α-caroten β-caroten, caroten và lycopen

-Trong số c c đ ng phân của carotenoid thì α-caroten và β-caroten là 2 loại phổ biến nhất của caroten.-caroten g m 2 dạng -caroten tự nhiên và -caroten tổng hợp nhân tạo -caroten từ thiên nhiên t n tại 2 dạng cis và trans, còn -caroten tổng hợp chủ yếu chỉ t n tại m t dạng trans

Hai dạng cis và trans là hai hợp chất khác nhau về tính chất vật lý và hóa học Ngoài ra, có sự khác biệt cả trong việc được cơ thể hấp thu trong ru t trong quá trình tiêu hóa M t nghiên cứu thực tế trên gà và chu t cho thấy -caroten tự nhiên được hấp thu tốt hơn 10 lần so với -caroten tổng hợp, sử dụng carotenoid tự nhiên khiến nguy cơ mắc ung thư thấp hơn -caroten tự nhiên không chứa thành phần nhân tạo hay chất bảo quản, còn -caroten tổng hợp có chứa các chất bảo quản

và t n đọng hóa chất d ng để tổng hợp trong quá trình tinh chế Đây là lý do tại sao

c c cơ quan ch nh phủ như Viện Y tế Quốc tế và Viện Ung thư Quốc tế khuyến cáo nên sử dụng -caroten từ thực phẩm thiên nhiên [25] -caroten tự nhiên thường thấy trong các loại trái cây và rau quả như cải xoăn c c rau có màu xanh đậm, bông cải xanh b đỏ, cà rốt b đu đủ dưa đỏ, các loại trái cây màu vàng, màu da cam

Bên cạnh đó vi tảo Dunaliella cũng là m t ngu n cung cấp -caroten d i dào Theo

nghiên cứu của Ben-Amotz, ở đ m n trên 27% NaCl D.salina có thể t ch lũy được lượng carotenoid lên tới trên 14% khối lượng khô[11] Vì vậy Dunaliella là ngu n

khai thác -caroten tiềm năng

Hình 1.4 Mô hình cấu trúc hai đồng phân của -caroten [23]

-caroten có hàng loạt tác dụng có lợi cho sức khỏe Lợi ch đ ng kể nhất là tăng cường khả năng miễn dịch và đ c biệt ở những người dương t nh với HIV Có nghiên cứu chỉ ra r ng m t số carotenoid thực sự ảnh hưởng đến con đường truyền tín hiệu giữa các tế bào của chúng ta Ví dụ, các dòng tế bào ung thư thường không thể nhận được các tín hiệu hóa học kiểm so t sinh trưởng từ các tế bào khác -caroten giúp mở các kênh truyền tín hiệu trên màng các tế bào ung thư và tiền ung thư cho phép cơ thể truyền tín hiệu ngừng phân chia ở dòng tế bào ung thư Do đó các loại thực phẩm giàu carotenoid, cụ thể trong trường hợp này là -caroten có thể không chỉ ngăn cản mà còn đảo ngược bệnh ung thư [25]

-caroten được chứng minh là tiền vitamin A Cơ thể chuyển hóa -caroten thành vitamin A nhưng sẽ không gây ra đ c tố của vitamin A vì cơ thể chỉ chuyển đổi vừa đủ lượng -caroten sang vitamin A mà cơ thể cần Khi sử dụng vitamin A trong thời gian dài sẽ gây phát ban, rụng tóc đau đầu, tổn thương gan không thể h i phục Nhưng khi d ng với liều lượng lớn -caroten cũng không gây đ c tố hay tác dụng phụ cho cơ thể Lượng -caroten dư thừa sẽ di chuyển trong máu và tích trữ trong các mô mỡ, nếu tích trữ với lượng lớn dưới da thì da sẽ có màu vàng cam đ c biệt là trong lòng bàn tay [25]

Tuy nhiên, m t số nhà khoa học học đưa ra giả thuyết r ng -caroten kết hợp với vitamin C có thể làm giảm năng lượng của các gốc tự do Khi không có m t vitamin C, -caroten có thể tạo thành dạng pro-oxy hóa (ức chế chống oxy hóa) dẫn đến làm gia tăng tổn thương c c tế bào, mô Những người hút thuốc, có hàm lượng cao các gốc tự do trong phổi nên dẫn tới thiếu vitamin C điều này cho thấy với những người bị nghiện thuốc lá nếu bổ sung -caroten có thể gây tăng nhẹ nguy cơ ung thư [25] Vì vậy để phát huy tốt nhất lợi ích của -caroten đối với sức khỏe, cần

bổ sung m t cách hợp lý để tránh những tác dụng không mong muốn

1.2.2 Xanthophyll

Xanthophyll là những dẫn xuất oxy hóa của caroten, có CTHH là C40H56O2, chứa nhóm hydroxyl Xanthophyll được tìm thấy chủ yếu g m: lutein, zeaxanthin và cryptoxanthin Lutein là m t loại xanthophyll tìm thấy trong lá cây và rau quả Ngoài

ra cũng ph t hiện thấy lutein trong lòng đỏ trứng Lutein là hợp chất tan tốt trong chất béo và rất ổn định trong nhũ tương Đ ng vật không thể tự tổng hợp xanthophyll, nên bổ sung vào cơ thể b ng c ch ăn c c thực phẩm giàu xanthophyll [23]

Xanthophyll là m t chất chống oxy hóa quan trọng vì 2 lý do: Thứ nhất đây là

m t trong số ít các chất chống oxy hóa có thể vượt qua hàng rào máu não mang lại sự bảo vệ chống oxy hóa cho đôi mắt, não và hệ thần kinh trung ương Thứ hai nó cũng

là m t trong số ít các chất chống oxy hóa không bao giờ trở thành pro-oxy hóa

Lutein và zeaxanthin là những carotenoid duy nhất được tìm thấy trong điểm vàng và thủy tinh thể của mắt người, có chức năng kép giúp chống oxy hóa mạnh và

nâng cao khả năng lọc ánh sáng màu xanh Ngoài vai trò quan trọng trong việc bảo

vệ mắt lutein và zeaxanthin còn đóng vai trò quan trọng giúp ngăn ngừa bệnh tim mạch đ t quỵ và ung thư phổi Bên cạnh đó chúng cũng giúp bảo vệ da khỏi sự tác

đ ng của tia cực tím (UV) khi tiếp xúc quá nhiều với ánh nắng M t số quan sát từ các nghiên cứu kh c cũng cho thấy các xanthophyll có thể giảm nguy cơ mắc m t

số bệnh ung thư đ c biệt là ung thư vú và ung thư phổi [30]

1.3 Tình hình nghiên cứu Dunaliella t ong và ngoài nước

1.3.1 Tình hình nghiên cứu Dunaliella trong nước

Dunaliella là m t ngu n cung carotenoid tự nhiên tiềm năng với nhiều ứng dụng khác nhau M c dù vậy, Việt Nam vẫn chưa sản xuất được carotenoid tự nhiên

từ Dunaliella ở quy mô công nghiệp Các nghiên cứu chỉ dừng ở quy mô phòng thí nghiệm Đã có c c đề tài nghiên cứu về Dunaliella như nghiên cứu của Huỳnh Hiệp

Hùng và c ng sự, tìm ra được n ng đ NaCl và n ng đ KNO3 tối ưu cho sinh trưởng và tối ưu cho t ch lũy -caroten đối với chủng Dunaliella sp phân lập được

từ ru ng muối ở Khánh Hòa [1] Cũng có nghiên cứu khác của Hoàng Thị Kim

Thoa về ứng dụng Dunaliella trong nuôi tr ng thủy sản[2] Các nghiên cứu vẫn

dừng ở việc tìm hiểu sơ b chưa đào sâu tìm hiểu c c cơ chế điều hòa áp suất thẩm thấu, tìm ra các gen chịu m n… Đ ng thời cũng nghiên cứu theo phương ph p truyền thống chưa ứng dụng được công nghệ gen vào trong nghiên cứu

1.3.2 Tình hình nghiên cứu Dunaliella ngoài nước

Carotenoid tự nhiên có nhu cầu cao trên thị trường toàn cầu nhờ vào ứng dụng của chúng trong c c lĩnh vực: y học, mỹ phẩm, thực phẩm M t số chủng

Dunaliella có khả năng t ch lũy lượng lớn -caroten Thấy được tầm quan trọng đó nhiều quốc gia trên thế giới đã đi sâu vào nghiên cứu c c đ c điểm sinh học điều kiện cho sinh trưởng tối ưu và c c yếu tố ảnh hưởng đến qu trình t ch lũy -caroten

của vi tảo Dunaliella Các thí nghiệm đầu tiên nh m đ nh gi ảnh hưởng của đ

m n đến tốc đ sinh trưởng của các loài Dunaliella kh c nhau đã được công bố vào những năm 1930 Baas-Becking đã quan s t thấy r ng D viridis phát triển mạnh

như nhau trong khoảng 1–4 M NaCl (6–23%) và pH trong khoảng 6–9 Ông đã ph t hiện ra r ng n ng đ cao của ion Ca và Mangan sẽ trở thành nhân tố ức chế Nhiều thí nghiệm sâu và r ng, sử dụng nhiều chủng loài đã được công bố bởi Lerche Bà nhận thấy r ng hầu hết các chủng sinh trưởng tối ưu ở n ng đ muối từ 2-8%, và rất chậm nếu trên 15% Tốc đ sinh trưởng hàng ngày 0,47-1,22 đã ghi nhận được dưới

c c điều kiện tối ưu Song song với nghiên cứu về sinh trưởng, thì nghiên cứu về khả năng t ch lũy -caroten cũng được đ c biệt quan tâm Các nghiên cứu đã chứng

minh được khả năng t ch lũy -caroten của vi tảo Dunaliella phụ thu c vào nhiều

yếu tố như: n ng đ NaCl dinh dưỡng cường đ chiếu s ng pH… Các nghiên cứu của Lerch chứng minh được r ng hàm lượng carotenid cao có thể được kích thích bởi việc giới hạn dinh dưỡng cũng như b ng cường đ ánh sáng mạnh Cùng với khoa học hiện đại, ngoài những phương ph p nghiên cứu truyền thống thì các phương ph p ứng dụng công nghệ gen trong việc kích hoạt t ch lũy carotenoid trong

Dunaliella và đã đạt hiệu quả Tiềm năng công nghệ sinh học của Dunaliella làm

ngu n cung cấp ß-caroten đã được nghiên cứu từ khá sớm Tổ chức tiên phong

trong việc nuôi tr ng Dunaliella để sản xuất ß-caroten đã được thành lập ở Liên bang Xô Viết năm 1966 Hiện nay trên thế giới, việc sản xuất Dunaliella quy mô

lớn để thu ß-caroten là m t trong những thành công về công nghệ sinh học ở thực vật ưa m n Các công nghệ kh c nhau được sử dụng, từ nuôi quảng canh tự nhiên đến hình thức nuôi tr ng tập trung mật đ cao với c c điều kiện giám sát ng t nghèo Các nghiên cứu đã đạt được những kết quả to lớn, nhờ đó có thể ứng dụng

vào sản xuất Dunaliella đại trà Và hứa hẹn m t hướng đi đầy tiềm năng về sản xuất ß-caroten tự nhiên từ vi tảo Dunaliella

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng

Vi tảo Dunaliella được phân lập từ ru ng muối Nam Định

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu

Phòng thí nghiệm Công nghệ Micro và Nano Trường Đại học Công nghệ và phòng thí nghiệm thu c Phòng Sinh học Tảo, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học Đại học Quốc Gia Hà N i

10

Môi trường được khử trùng 1210C/15 phút

2.1.4 Thiết bị

Các thiết bị và máy móc của phòng thí nghiệm Công nghệ Micro và Nano, Trường Đại học Công nghệ và phòng sinh học Tảo, Viện vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà N i

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phân lập vi tảo

C c mẫu nước tự nhiên được thu thập từ 5 ru ng muối thời điểm giữa m a

hè (c c th ng khô hạn) thu c hai xã Giao Phong và Bạch Long huyện Giao Thủy

Nam Định (bảng 2.2) Mẫu đựng trong c c bình nhựa (100ml) và được chuyển tới phòng th nghiệm trong 24 giờ Sau đó c c chủng Dunaliella tự nhiên được quan

s t dưới k nh hiển vi Olympus CKX41 b ng vật k nh đ phóng đại 100 lần và dựa trên mô tả hình th i theo phân loại của Borowitzka và Siva (2007)

Bảng 2.2 Vị trí thu mẫu của 5 chủng Dunaliella

Vị tr thu mẫu /ký hiệu chủng

Định vị GPS Bắc (N) Đông (E) DUN11 20°12'25" 106°23'51"

DUN12 20°12'09" 106°24'59"

DUN21 20°13'02" 106°25'15"

DUN22 20°12'43" 106°24'47"

DUN23 20°12'33" 106°24'16"

Sau đó 10ml c c mẫu được làm giàu trong bình tam gi c 250 ml chứa 100

ml môi trường Johnson cải tiến với NaCl 1 5M Mẫu đ t trong phòng nuôi cấy nhân tạo ở trạng th i tĩnh từ 7 đến 14 ngày Dưới điều kiện chiếu s ng 6000 lux và nhiệt

đ 25±2°C Trong qu trình làm giàu mẫu được cấy chuyển liên tục 5 lần trong khoảng 14 ngày nh m loại sự nhiễm bẩn thứ cấp Qu trình lựa chọn c c chủng thuần được thực hiện dựa trên phương ph p mô tả bởi Shaish và c ng sự (1991)

b ng micropipete và đĩa thạch