Phân tích cấu trúc, hàm lượng của thuốc điều trị tiểu đường typ II metformin hydrochloride bằng các phương pháp hóa lý hiện đại

Phân tích xác định cấu trúc, định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của các sản phẩm tổng hợp được .... Trước đây, để xác định được cấu trúc phân tử một hợp chất hữu cơ đặc biệt

Trang 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

–––––––––––––––––––

TRẦN THỊ BÍCH HẢO

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC, HÀM LƯỢNG

CỦA THUỐC ĐIỀU TRỊ TIỂU ĐƯỜNG

TYP II METFORMIN HYDROCHLORIDE BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

THÁI NGUYÊN - 2016

Trang 2

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

–––––––––––––––––––

TRẦN THỊ BÍCH HẢO

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC, HÀM LƯỢNG

CỦA THUỐC ĐIỀU TRỊ TIỂU ĐƯỜNG

TYP II METFORMIN HYDROCHLORIDE BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI

Chuyên ngành: Hoá Phân Tích

Mã số: 60 44 0118

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS PHẠM THỊ THẮM

THÁI NGUYÊN - 2016

Trang 3

a

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tới

TS Phạm Thị Thắm - nguyên giảng viên Trường ĐH Khoa học - ĐH Thái Nguyên nay là giảng viên Đại học Thủy Lợi đã tin tưởng giao đề tài, định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn và tạo những điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận văn thạc sỹ này

Tôi xin gửi lời trân trọng cảm tới TS Dương Nghĩa Bang, TS Phạm Thế Chính cùng các thầy cô khoa Hóa học, Trường ĐH Khoa học- ĐH Thái Nguyên đã ta ̣o điều kiê ̣n , giúp đỡ tôi trong quá trình tri ển khai nghiên cứu, thực hiện đề tài

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo cùng các thầy, cô, cán bộ, kĩ thuật viên Phòng Hóa dược, thuộc Viện Hóa học- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình chỉ dạy và hướng dẫn tôi trong quá trình học tập, thực nghiệm và thực hiện đề tài

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè lớp Cao học khóa 2014- 2016 đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập

và làm luận văn

Tác giả luận văn

Trần Thị Bích Hảo

Trang 4

b

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN a MỤC LỤC b DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT e DANH MỤC CÁC HÌNH g

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về các phương pháp xác định cấu trúc 2

1.1.1 Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) 2

1.1.2 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 3

1.1.3 Phương pháp phổ khối lượng (MS) 5

1.2 Phương pháp xác định hàm lượng - sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 7

1.2.1 Khái niệm 7

1.2.2 Phân loại 8

1.2.3 Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo 8

1.2.4 Pha động trong sắc ký pha đảo 9

1.2.5 Detector dad 10

1.2.6 Detector ms 11

1.3 Khái quát về bệnh tiểu đường 13

1.3.1 Phân loại bệnh tiểu đường 13

1.3.2 Các thuốc điều trị bệnh tăng đường huyết 14

1.3.3 Quan niệm của y học cổ truyền về bệnh tiểu đường 15

1.3.4 Các thuốc Đông y điều trị bệnh tiểu đường 15

1.4 Thuốc chữa bệnh tiểu đường metformine hydrochloride 16

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 16

1.4.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 17

Chương 2: THỰC NGHIỆM 20

Trang 5

c

2.1 Hóa chất và thiết bị 20

2.1.1 Hóa chất và dung môi 20

2.1.2 Thiết bị xác định và phân tích cấu trúc 20

2.1.3 Phân tích xác định cấu trúc, định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của các sản phẩm tổng hợp được 21

2.2 Tổng hợp và phân tích cấu trúc của metformine hydrochloride 21

2.2.1 Quy trình tổng hợp metformin hydrochloride 21

2.2.2 Phân tích cấu trúc của metformin hydrochoride bằng phổ IR 22

2.2.3 Phân tích cấu trúc của metformin hydrochoride bằng phổ NMR 22

2.2.4 Phân tích cấu trúc của metformin hydrochoride bằng phổ MS 22

2.3 Nghiên cứu kết tinh metformine hydrochloride 23

2.3.1 Kết tinh metformin hydrochloride trong dung môi Aceton 23

2.3.2 Kết tinh metformin hydrochloride trong dung môi MeOH 23

2.3.3 Kết tinh metformin hydrochloride trong dung môi EtOH 23

2.4 Nghiên cứu hàm lượng metformine hydrochloride theo phương pháp (HPLC) 24

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 Tổng hợp và phân tích cấu trúc metformine hydrochloride 27

3.1.1 Tổng hợp metformin hydrochloride 27

3.1.2 Phân tích cấu trúc của metformin hydrochloride bằng phương pháp IR 27

3.1.3 Phân tích cấu trúc của metformin hydrochloride bằng phương pháp NMR 28

3.1.4 Phân tích cấu trúc của metformin hydrochloride bằng phương pháp MS 30 3.2 Phân tích tìm kiếm các phương pháp kết tinh metformine hydrochloride để thu được độ sạch cao nhất 31

3.3 Hàm lượng metformine hydrochloride theo phương pháp hplc 31

KẾT LUẬN 34

TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 PHỤ LỤC

Trang 6

d

Trang 7

1

H- NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1

H Nuclear Magnetic Resonance)

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy)

MS Phổ khối lượng va chạm điện tử (Electron Impact-Mass

Spectrometry)

H, C Độ chuyển dịch hóa học của proton và cacbon

ppm Phần triệu (parts per million)

Trang 8

f

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.1: Quá trình tổng hợp calci cyanamid 16

Sơ đồ 1.2: Quá trình tổng hợp 1-cyanoguanidine 16

Sơ đồ 1.3: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride 17

Sơ đồ 1.4: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride theo Shapiro 18

Sơ đồ 1.5: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride theo Shalmashi 18

Sơ đồ1.6: Chuyển hóa các tiền chất về metformin 18

Sơ đồ 1.7: Tổng hợp các dẫn xuất của metformin 18

Sơ đồ 3.1: Tổng hợp trực tiếp metformin hydrochloride 27

Trang 9

g

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Phổ hồng ngoại của benzyl ancol 3

Hình 1.2: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của benzyl axetat 5

Hình 1.3: Phổ khối lượng của benzamit 7

Hình 1.4: Cấu trúc của cột ODS 9

Hình 1.5 Sơ đồ nguyên lý hệ điot quang 10

Hình 1.6 Các biện pháp cải tiến tăng độ nhạy của detector 11

Hình 2.2: Biểu đồ đường chuẩn 25

Hình 3.1: Phổ IR của hợp chất metformin hydrochloride 27

Hình 3.2: Phổ 1 H-NMR của chất metformin hydrochloride 29

Hình 3.3: Phổ 13 C-NMR của chất metformin hydrochloride 29

Hình 3.4: Phổ MS của metformin hydrochloride 30

Hình 3.5: Biểu đồ đường chuẩn định lượng 32

Hình 3.6: Sắc kí đồ HPLC của metformin hydrochloride 33

Trang 10

1

MỞ ĐẦU

Metformin được mô tả năm 1957 như chất có hoạt tính hạ đường huyết và năm 1979 được đưa ra thị trường ở Pháp nhưng đến tận 1994 mới được FDA cho phép lưu hành để chữa bệnh tiểu đường Typ 2 ở Mỹ Metformin là một thuốc chống đái tháo đường nhóm biguanid, có cơ chế tác dụng khác với các thuốc chống đái tháo đường nhóm sulfonylure

Trước đây, để xác định được cấu trúc phân tử một hợp chất hữu cơ đặc biệt là cấu trúc và độ sạch của các hợp chất ứng dụng trong dược phẩm không hề đơn giản; có thể mất đến hàng năm hoặc vài năm Để xây dựng được tiêu chuẩn của hợp chất chính trong dược phẩm là một công việc cực kì khó khăn và tốn kém Ngày nay, với các công cụ là các phương pháp phân tích hóa lý hiện đại, việc phân tích cấu trúc các hợp chất hữu cơ đã trở thành đơn giản, có khi chỉ tốn thời gian tính bằng giờ Việc xác định hàm lượng và độ sạch của các loại thuốc cũng nhanh hơn nhiều lần do có phương pháp HPLC

Vì vậy, việc phân tích cấu trúc, hàm lượng của thuốc điều trị tiểu đường typ II metformin hydrochloride bằng các phương pháp hóa lý hiện đại

là công việc rất quan trọng, là cơ sở để xây dựng tiêu chuẩn của sản phẩm và

là tiêu chí để đánh giá chất lượng giá thành của thuốc

Do đó đề tài nghiên cứu phân tích cấu trúc, hàm lượng của thuốc điều trị tiểu đường typ II metformin hydrochloride bằng các phương pháp hóa lý hiện đại là có ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Trang 11

2

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về các phương pháp xác định cấu trúc

1.1.1 Phương pháp phổ hồng ngoại (IR)

Trong số các phương pháp phân tích cấu trúc, phổ hồng ngoại cho nhiều thông tin quan trọng về cấu trúc của hợp chất

Bức xạ hồng ngoại bao gồm một phần của phổ điện từ, đó là vùng bước sóng khoảng 10-4

đến 10-6 m Nó nằm giữa vi sóng và ánh sáng khả kiến Phần của vùng hồng ngoại được sử dụng nhiều nhất để xác định cấu trúc nằm trong giữa 2,5x10-4 và 16x10-6 m Đại lượng được sử dụng nhiều trong phổ hồng ngoại là số sóng (cm-1), ưu điểm của việc dùng số sóng là là chúng tỷ lệ thuận với năng lượng [3]

Khi chiếu các bức xạ hồng ngoại vào phân tử các hợp chất, bức xạ hồng ngoại sẽ kích thích phân tử từ trạng thái dao động cơ bản lên trạng thái dao động cao hơn Có 2 lại dao động khi phân tử bị kích thích là dao động hóa trị

và biến dạng, dao động hóa trị (ν) là dao động làm thay đổi độ dài liên kết, dao động biến dạng (δ) là dao động làm thay đổi góc liên kết

Đường cong biểu diễn cường độ hấp thụ với số sóng của bức xạ hồng ngoại được gọi là phổ hồng ngoại, trên phổ biểu diễn các cực đại hấp thụ ứng với những dao động đặc trưng của nhóm nguyên tử hay liên kết nhất định, (Hình 1.1)

Trang 12

3

Hình 1.1: Phổ hồng ngoại của benzyl ancol

Căn cứ vào phổ hồng ngoại đo được đối chiếu với các dao động đặc trưng của các liên kết, ta có thể nhận ra sự có mặt của các liên kết trong phân

tử Một phân tử có thể có nhiều dao động khác nhau và phổ hồng ngoại của các phân tử khác nhau thì khác nhau, tương tự như sự khác nhau của các vân ngón tay Sự chồng khít lên nhau của phổ hồng ngoại thường được làm dẫn chứng cho hai hợp chất giống nhau [3]

Khi sử dụng phổ hồng ngoại để xác định cấu trúc, thông tin thu được chủ yếu là xác định các nhóm chức hữu cơ và những liên kết đặc trưng Các pic nằm trong vùng từ 4000 - 1600 cm-1 thường được quan tâm đặc biệt, vì vùng này chứa các dải hấp thụ của các nhóm chức, như OH, NH, C=O, C≡N… nên được gọi là vùng nhóm chức Vùng phổ từ 1300 - 626 cm-1

phức tạp hơn và thường được dùng để nhận dạng toàn phân tử hơn là để xác định nhóm chức Chính ở đây các dạng pic thay đổi nhiều nhất từ hợp chất này đến hợp chất khác, vì thế vùng phổ từ 1500 cm-1 được gọi là vùng vân ngón tay [3]

1.1.2 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (CHTHN) là phương pháp vật lý hiện đại nghiên cứu cấu trúc của các hợp chất hữu cơ Phương pháp phổ biến được sử dụng là phổ 1H-NMR và 13C-NMR Hạt nhân của nguyên tử 1H và 13C có momen từ Nếu đặt proton trong từ trường không đổi thì moment từ của nó có thể định hướng cùng chiều hay ngược chiều với từ trường Đó là spin hạt nhân có tính chất lượng tử với các số lượng tử +1/2 và -1/2 [2]

Độ chuyển dịch hóa học : Do hiệu ứng chắn từ khác nhau nên các hạt

nhân 1H và 13C trong phân tử có tần số cộng hưởng khác nhau Đặc trưng cho các hạt nhân 1H và 13C trong phân tử có độ chuyển dịch hóa học δ; đối với hạt nhân 1H thì:

Trang 13

4

) ( 10

o

x TMS

o

x chuan

Dựa vào độ chuyển dịch hóa học  ta biết đƣợc loại proton nào có mặt trong chất đƣợc khảo sát Giá trị độ chuyển dịch hóa học không có thứ nguyên

mà đƣợc tính bằng phần triệu (ppm) Đối với 1

H-NMR thì δ có giá trị từ 0-12 ppm, đối với 13

C-NMR thì δ có giá trị từ 0-230 ppm

Trang 14

5

Hình 1.2: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của benzyl axetat

Hằng số tương tác spin-spin J: Trên phổ NMR, mỗi nhóm hạt nhân

không tương đương sẽ thể hiện bởi một cụm tín hiệu gọi và vân phổ, mỗi vân phổ có thể bao gồm một hoặc nhiều hợp phần Nguyên nhân gây nên sự tách tín hiệu cộng hưởng thành nhiều hợp phần là do tương tác của các hạt nhân có

từ tính ở cạnh nhau Tương tác đó thể hiện qua các electron liên kết Giá trị J

phụ thuộc vào bản chất của hạt nhân tương tác, số liên kết và bản chất các liên kết ngăn giữa các tương tác [1]

Hằng số tương tác spin-spin J được xác định bằng khoảng cách giữa các

hợp phần của một vân phổ Dựa vào hằng số tương tác spin-spin J ta có thể rút ra

kết luận về vị trí trương đối của các hạt nhân có tương tác với nhau [2]

1.1.3 Phương pháp phổ khối lượng (MS)

Nguyên tắc chung của phương pháp phổ khối lượng là phá vỡ phân tử trung hòa thành ion phân tử và các mảnh ion dương có số khối z = m/e Sau

đó phân tách các ion này theo số khối và ghi nhận được phổ khối lượng Dựa vào phổ khối này có thể xác định phân tử khối và cấu tạo phân tử của chất nghiên cứu [3,4]

Trang 15

6

Để phá vỡ phân tử người ta có nhiều phương pháp: bắn phá bằng dòng electron (EI), phương pháp ion hóa hóa học (CI), phương pháp bắn phá nguyên tử nhanh (FAB)… Dùng dòng eclectron có năng lượng cao để bắn phá phân tử là phương pháp hay được sử dụng nhất Khi bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ trung hòa sẽ trở thành các ion phân tử mang điện tích dương hoặc bị phá vỡ thành các ion và các gốc theo sơ đồ:

(2)

(1) 3e

2

ABC

2e ABC e

có thể phá vỡ thành các mảnh ion dương (+), hoặc các ion gốc, các gốc, hoặc phân tử trung hòa nhỏ hơn, nên người ta thường thực hiện bắn phá các phân

tử ở mức năng lượng 70 eV [3]

B A

B AB ABC

BC A

ABC AB

Sự phá vỡ này phụ thuộc vào cấu tạo chất, phương pháp bắn phá và năng lượng bắn phá Quá trình này gọi là quá trình ion hóa

Các ion ion dương hình thành đều có khối lượng m và mang điện tích e,

tỉ số m/e được gọi là số khối z Bằng cách nào đó tách các ion có số khối khác nhau ra khỏi nhau và xác định được xác suất có mặt của chúng, rồi vẽ đồ thị biểu diễn mối liên quan giữa xác suất có mặt (hay cường độ I) và số khối z thì

đồ thị này được gọi là phổ khối lượng (Hình 1.3)

Trang 16

7

Hình 1.3: Phổ khối lượng của benzamit (C 6 H 5 CONH 2 )

Như vậy, khi phân tích phổ khối lượng người ta thu được khối lượng phân tử của chất nghiên cứu, từ các pic mảnh ion trên phổ đồ có thể xác định được cấu trúc phân tử và tìm ra qui luật phân mảnh Đây là một trong những thông số quan trọng để qui kết chính xác cấu trúc phân tử của một chất cần nghiên cứu khi kết hợp nhiều phương pháp phổ với nhau

1.2 Phương pháp xác định hàm lượng - sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

1.2.1 Khái niệm

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt

Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng , như phân tích các hợp chất thuốc trừ sâu , thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong

lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường…

Trang 17

8

1.2.2 Phân loại

Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người

ta chia HPLC thành 4 loại:

 Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography)

 Sắc ký phân bố (partition chromatography)

 Sắc ký ion (ion chromatography)

 Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography) Riêng SKPB được chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và pha động: sắc ký pha thường - SKPT (normal phase chromatography) và sắc ký pha đảo - SKPĐ (reversed phase chromatography)

Trong đó, sắc ký pha đảo được sử dụng nhiều hơn cả

1.2.3 Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo

Trong sắc ký phân bố nói chung, pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ được gắn lên chất mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu:

 Pha tĩnh được giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý → sắc ký lỏng-lỏng (liquid-liquid chromatography)

 Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền → sắc ký pha liên kết (bonded phase chromatography)

Trong quá trình sử dụng, người ta nhận thấy sắc ký pha liên kết có nhiều ưu điểm hơn sắc ký pha lỏng-lỏng vì một số nguyên nhân sau:

o Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng-lỏng dễ bị hòa tan bởi pha động nên dễ bị mất mát pha tĩnh trong thời gian sử dụng và gây nhiễm đối với hợp chất phân tích

o Do pha tĩnh của sắc ký lỏng-lỏng dễ tan trong pha động nên người ta không thể ứng dụng phương pháp rửa giải gradient dung môi

Trang 18

9

Vì vậy, người ta thường chỉ quan tâm đến loại sắc ký phân bố pha liên kết và phần lớn các loại cột sử dụng hiện nay trong sắc ký phân bố đều có cấu trúc dạng này

Trong SKPĐ, nhóm thế R trong hợp chất siloxan hầu như không phân cực hoặc ít phân cực Đó là các ankyl mạch dài như C8 (n-octyl), C18 (n-octadecyl) còn gọi là ODS (octadecylsilan) hoặc các nhóm alkyl ngắn hơn như C2; ngoài ra còn có cyclohexyl, phenyl trong đó nhóm phenyl có độ phân cực cao hơn nhóm alkyl Người ta nhận thấy các alkyl mạch dài cho kết quả tách ổn định hơn các loại khác nên đây là loại được sử dụng nhiều nhất

Hình 1.4: Cấu trúc của cột ODS

1.2.4 Pha động trong sắc ký pha đảo

Pha động trong sắc ký lỏng nói chung phải đạt những yêu cầu sau:

 Hòa tan mẫu phân tích

 Phù hợp với đầu dò

 Không hòa tan hay làm mòn pha tĩnh

 Có độ nhớt thấp để tránh áp suất dội lại cao

 Tinh khiết dùng cho sắc ký

Trong sắc ký pha đảo , dung môi pha động có độ phân cực cao Trên lý thuyết chúng ta có thể sử dụng khá nhiều dung môi nhưng kinh nghiệm thực

tế cho thấy nước, methanol, acetonitrile, tetrahydrofuran là đạt yêu cầu nhất

Trang 19

Thông thường pha động trong SKPĐ bao gồm một hỗn hợp nước hoặc dung dịch đệm với một hoặc nhiều dung môi hữu cơ phân cực tan được trong nước

Thành phần pha động có thể cố định trong suốt quá trình chạy sắc ký (chế độ isocratic) hoặc được thay đổi theo một chương trình đã định sẵn (chương trình gradien dung môi) để có hiệu quả tách tốt hơn

1.2.5 Detector dad

Trung tâm của thiết bị là một dãy diot hàng trăm chiếc (những máy hiện nay có thể lắp 1024 diot) được sắp xếp cạnh nhau liên tục thành dãy trên tấm silicon tinh khiết, kích thước 1-6 cm, độ rộng của mỗi diot riêng là 0,0015 - 0,050 mm

Hình 1.5 Sơ đồ nguyên lý hệ điot quang

Trang 20

11

Trên mỗi tấm silicon còn có một tụ điện, một công tắc cho mỗi diot Hệ thống được điều khiển bằng computer luôn ngắt mỗi công tắc làm cho tụ điện được tích - 5V Khi bức xạ chiếu vào mặt diot làm đóng mạch điện và tụ điện phóng điện Sự nạp điện lại được tiếp tục ở chu kỳ tiếp theo Kết quả là dòng điện tỷ lệ với lượng bức xạ chiếu vào, khuếch đại, số hóa và ghi lại vào bộ nhớ

a) đường quang chữ Z, b) đường quang bong bóng, c) đường quang phản xạ nhiều lần

Hình 1.6 Các biện pháp cải tiến tăng độ nhạy của detector

(cải tiến flowcell) 1.2.6 Detector ms

Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong điện trường hoặc từ trường nhất định Tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z)

có ảnh hưởng rất lớn đối với chuyển động này của ion Nếu biết được điện tích của ion thì ta dễ dàng xác định được khối lượng của ion đó

Do quá trình phân tích với đầu dò MS đòi hỏi mức đô ̣ ch ân không cao, nhiê ̣t đô ̣ cao , các chất khảo sát phải ở trạng thái khí , vâ ̣n tốc dòng chảy nhỏ ; trong khi hê ̣ thống LC la ̣i hoa ̣t đô ̣ng ở áp suất cao với mô ̣t lượng dung môi tương đối lớn , nhiê ̣t đô ̣ tương đối thấp , các chất phân tí ch ở thể lỏng Điều này gây rất nhiều khó khăn trong viê ̣c tìm cách giải quyết được sự tương thích giữa hê ̣ thống sắc ký lỏng và đầu dò khối phổ

Trang 21

12

Để khắc phu ̣c những khó khăn trên, cần phải có mô ̣t kỹ thuâ ̣t trung gian gọi là giao diện Rất nhiều kỹ thuâ ̣t giao diê ̣n (interface technology) như chùm tia ha ̣t (FB), bắn phá nguyên tử nhanh dòng liên tu ̣c (CF-FAB),… đã được nghiên cứu và ứng du ̣ng , nhưng mãi cho đến cuối thâ ̣p nhiên 80, mới có sự

đô ̣t phá t hâ ̣t sự với kỹ thuâ ̣t ion hóa ta ̣i áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Ionization - API)

Ưu điểm nổi bật của API là khả năng hình thành ion tại áp suất khí quyển ngay trong buồng ion hóa Điều này khác biệt với các kiểu ion hóa sử dụng trước đó cho LC/MS như bắn phá nguyên tử nhanh với dòng liên tục (continuous flow- fast atom bombardment CF-FAB) hay như tia nhiệt (thermospray - TS) đều đòi hỏi áp suất thấp Một thuận lợi nữa của API là sự ion hóa mềm (soft ionization), không phá vỡ cấu trúc của hợp chất cần phân tích nhờ đó thu được khối phổ của ion phân tử Ngoài ra, với kỹ thuật này, người ta có thể điều khiển được quá trình phá vỡ ion phân tử để tạo ra những ion con tùy theo yêu cầu phân tích

Có ba kiểu hình thành ion ứng dụng cho nguồn API trong LC/MS:

* Ion hóa tia điện (electrospray ionization - ESI)

* Ion hóa hóa học tại áp suất khí quyển (atmospheric pressure chemical ionization - APCI)

* Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Photoionization - APPI)

Trong đó, hai kỹ thuật APCI và ESI , đă ̣c biê ̣t là ESI được sử dụng nhiều hơn cả

***Các loại đầu dò khối phổ

Có các loại tổng quát sau:

* Sự uấn cong nhờ từ trường (Magnetic field deflection)

Trang 22

* Máy khối phổ tứ cực (quadrupole mass spectrometer)

- Máy khối phổ tứ cực (quadrupole mass filter)

- Bẫy ion (quadrupole ion storage; ion trap)

* Máy khối phổ sử dụng kỹ thuật thời gian bay (time of flight mass spectrometry)

* Máy khối phổ cộng hưởng cyclotron-ion, sử dụng phép biến đổi Fourier (Fourier transform-ion cyclotron resonance mass spectrometry: FTMS)

Trong đó, Máy khối phổ tứ cực; máy khối phổ sử dụng kỹ thuật thời gian bay; máy khối phổ cộng hưởng cyclotron-ion, sử dụng phép biến đổi Fourierđược sử dụng nhiều hơn cả

1.3 Khái quát về bệnh tiểu đường

1.3.1 Phân loại bệnh tiểu đường

Bệnh tiểu đường được chia thành hai loại như sau:

Tiểu đường tuýp 1: Tiểu đường typ 1 là một bệnh tự miễn trong đó hệ

thống miễn dịch của cơ thể phản ứng lại và phá huỷ tế bào  sản xuất insulin của đảo tuỵ Sự thiếu hụt insulin dẫn đến tăng glucose máu và thường dẫn đến các biến chứng mãn tính

Tiểu đường typ 2: Bệnh tiểu đường typ 2 được đặc trưng bởi kháng

insulin và giảm tiết chế insulin dẫn đến mất khả năng duy trì mức glucose máu bình thường

Các typ tăng đường huyết đặc hiệu khác:

- Đái tháo đường thai kỳ

- Thiếu hụt di truyền chức năng tế bào 

- Thiếu hụt di truyền về tác động của insulin

Trang 23

14

- Bệnh tuyến tụy ngoại tiết

1.3.2 Các thuốc điều trị bệnh tăng đường huyết

Dựa vào tác dụng và cơ chế tác dụng, các thuốc điều trị bệnh tiểu đường được chia thành 3 nhóm chính như sau:

- Insulin và các thuốc kích thích bài tiết insulin

- Các thuốc làm tăng nhạy cảm insulin

- Các thuốc chống tăng đường huyết sau bữa ăn

a) Insulin và các thuốc kích thích bài tiết insulin:

+ Insulin:

Insulin là hormon do tế bào  của tuyến tuỵ tiết xuất, đóng vai trò chủ yếu trong cơ chế điều hoà đường huyết của cơ thể Insulin là một trong những hormon quan trọng của cơ thể, không chỉ tác dụng trên chuyển hoá năng lượng và phát triển cơ thể, mà còn là chất cần thiết cho sự sống Tác dụng của insulin bao gồm các đáp ứng phức tạp mà ảnh hưởng cuối cùng là trên chuyển hoá glucid, lipid và protid

+ Thuốc kích thích bài tiết insulin

Các sulfonylurea

Năm 1942, Janbon đã tình cờ phát hiện tác dụng hạ đường huyết của dẫn suất sulfonamid (1154RP) ở những bệnh nhân điều trị sốt thương hàn Từ phát hiện này, nhiều nghiên cứu về tác dụng hạ đường huyết của các sulfonylurea đã được tiến hành Các nghiên cứu ngày càng làm sáng tỏ cơ chế tác dụng của thuốc Nhiều thuốc thuộc nhóm sulfonylurea đã ra đời, bao gồm các thuốc thế hệ I (tolbutamide, chlorpropamide) và các thuốc thế hệ II (Glyburide, Glypizide) Các thuốc này đang được sử dụng rộng rãi trên lâm sàng, đem lại nhiều kết quả khả quan cho người bệnh

b) Các thuốc làm tăng nhạy cảm insulin

Các biguanide:

Trang 24

ít gây tăng axit lactic trong máu hơn Các biguanide là thuốc chống tăng đường huyết, không gây hạ đường huyết Thuốc tác dụng chủ yếu ngoài tuỵ, không có tác dụng kích thích tế bào  tuyến tuỵ bài tiết insulin

c) Thuốc chống tăng đường huyết sau ăn (thuốc ức chế enzym  glucosidase)

-Acarbose:

Acarbose là thuốc ức chế enzym glucosidase của tế bào niêm mạc ruột

Do tác dụng ức chế enzym này, thuốc làm giảm hoặc chậm quá trình hấp thụ tinh bột, dextran và các disaccharide ở ruột non, tránh được tình trạng tăng đường huyết sau ăn Thuốc có tác dụng tốt cho cả 2 typ bệnh

1.3.3 Quan niệm của y học cổ truyền về bệnh tiểu đường

Theo quan niệm của Đông y, bệnh thuộc phạm vi chứng tiêu khát với ba triệu chứng chủ yếu là ăn nhiều, uống nhiều và tiểu nhiều

1.3.4 Các thuốc Đông y điều trị bệnh tiểu đường

Các thuốc Đông y điều trị bệnh tiểu đường chủ yếu là các thuốc có

nguồn gốc từ dược liệu như sinh địa (Rehmania glutinosa Libosch, Scrophulariaceae), cỏ ngọt (Stevia rebaudiana, Asteraceae), mướp đắng (Momordica charantia L.Cucurbitaceae), hoàng kỳ (Astragalus membranaceus, Fabaceae), Huyền sâm (Scrophularia ningpoensis Hemsl,

Scrophulariaceae)

Trang 25

16

1.4 Thuốc chữa bệnh tiểu đường metformine hydrochloride

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Cho đến nay, ở trong nước có duy nhất một công trình nghiên cứu tổng hợp metformin từ CaO, ure và dimethylamin Quá trình tổng hợp được được tiến hành qua 3 bước [5]:

* Bước 1: Tổng hợp calci cyanamide:

Sơ đồ 1.1: Quá trình tổng hợp calci cyanamid

Calci cyanamide được tạo thành phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ phản ứng Theo tác giả Ngô Quốc Huy, quá trình phản ứng thực hiện theo

2 giai đoạn:

- Giai đoạn 1: Nung CaO và ure ở nhiệt độ 180-300oC

- Giai đoạn 2: Tiếp tục nung hỗn hợp trên ở nhiệt độ 750oC

*Bước 2: Tổng hợp 1-cyanoguanidine:

Từ calci cyanamide đã được tổng hợp trong bước 1, đem đun nóng trong dung môi H2O nhận được 1-cyanoguanidin được mô tả trong sơ đồ sau:

1-cyanoguanidine

Sơ đồ 1.2: Quá trình tổng hợp 1-cyanoguanidine

Điều kiện phản ứng thích hợp tổng hợp 1-cyanoguanidine là ở nhiệt độ

70 oC trong khoảng thời gian 30 phút Phản ứng rất dễ bị polyme hóa nên khó

Trang 26

17

tinh chế, hiệu suất phản ứng phụ thuộc nhiều vào điều kiện phản ứng Cyanoguanidine được tổng hợp từ nguyên liệu rẻ như CaO và ure rất có ý nghĩa, tuy nhiên quá trình phản ứng phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ, đặc biệt cần phải thực hiện phản ứng ở nhiệt độ 7500C nên khó kiểm soát và ít có ý nghĩa thực tiễn

Sơ đồ 1.3: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride

Mặc dù phương pháp tổng hợp metformin từ những nguyên liệu rẻ tiền như: CaO, ure và dimethylamin nhưng do phản ứng cần tiến hành ở nhiệt độ cao nên tạo ra sản phẩm polyme và khó tinh chế dẫn đến khó áp dụng ở quy

mô lớn để tổng hợp 1-cyanoguianidine (tên khác là dicyano diamide)

1.4.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Metformin được mô tả năm 1957 như chất có hoạt tính hạ đường huyết

và năm 1979 được đưa ra thị trường ở Pháp nhưng đến tận 1994 mới được

FDA cho phép lưu hành để chữa bệnh tiểu đường tuyp 2 ở Mỹ [19]

Metformin hydrochloride (N,N-dimethylimidodicarbonimidic diamide

hydrochloride) được tổng hợp bởi Shapiro và các cộng sự [31] bằng cách cho dimethylamine hydrochloride phản ứng với dicyano diamide ở nhiệt độ

140oC (sơ đồ 1.4) Bằng con đường này Shapiro và cộng sự đã tổng hợp được hàng trăm dẫn chất biguanid Các dẫn chất này đã được nghiên cứu hoạt tính

hạ đường huyết

Trang 27

18

metformin hydrochloride

Sơ đồ 1.4: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride theo Shapiro

Năm 2008, Anvar Shalmashi [32] đã đưa ra phương pháp mới để tổng hợp metformin hydrochloride Phản ứng điều chế metformin được thực hiện trên bản mỏng điều chế và được đặt trong thiết bị microwave ở bước sóng 540W trong 5 phút đạt hiệu suất 92%

Sơ đồ 1.5: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride theo Shalmashi

Gần đây đã có một số công trình nghiên cứu tạo các dẫn xuất của metformin nhằm tăng hiệu quả sử dụng của nó trong điều trị bệnh tiểu đường Kristiina và các cộng sự [22] đã tổng hợp được một số tiền chất của metformin như mô tả trong sơ đồ 6 và sơ đồ 7 Các chất này có khả năng tan tốt trong dầu và tăng khả năng hấp phụ trong ruột

Sơ đồ1.6: Chuyển hóa các tiền chất về metformin

Sơ đồ 1.7: Tổng hợp các dẫn xuất của metformin

Trang 28

19

Nhằm làm tăng hiệu quả sử dụng của metformin, Rao và các cộng sự

đã nghiên cứu tổng hợp các phức chất của metformin với Cu và Ni Các phức này đã được nghiên cứu hoạt tính hạ đường huyết Kết quả nghiên cứu cho thấy các chất này có hoạt tính cao hơn nhiều so với metformin [30]

Kết quả nghiên cứu của Bentefrit và các cộng sự về tổng hợp phức chất của metformin với platin cho thấy phức chất tetrachloro(metformin)platin (IV) có hoạt tính kìm hãm sự tăng sinh của dòng tế bào ung thư P388 tương

Trang 29

20

Chương 2 THỰC NGHIỆM

2.1 Hóa chất và thiết bị

2.1.1 Hóa chất và dung môi

Các hoá chất dùng cho tổng hợp hữu cơ và dung môi được mua của hãng Merck, hãng Sigma Aldrich và hãng Fluka và thuộc loại phân tích dùng cho phân tích

Bột silica gel cho sắc ký cột 100 - 200 mesh (Merck), bản mỏng sắc ký silica gel đế nhôm Art 5554 DC - Alufolien Kiesel 60 F254 (Merck)

2.1.2 Thiết bị xác định và phân tích cấu trúc

Để xác định và phân tích cấu trúc các chất hữu cơ tổng hợp được, chúng tôi tiến hành các phương pháp sau:

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ 1H-NMR (500MHz) và 13C-NMR (125MHz) của các chất nghiên cứu được đo trên máy Bruker XL-500 tần số 500MHz với dung môi DMSO

và TMS là chất chuẩn, tại phòng Phổ cộng hưởng từ hạt nhân - Viện Hóa học

- Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam

- Phổ khối lượng (MS)

Trang 30

21

Phổ khối của các chất nghiên cứu được ghi trên LC - MSD - Trap - SL tại phòng Cấu trúc, Viện Hóa học - Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam

2.1.3 Phân tích xác định cấu trúc, định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của các sản phẩm tổng hợp được

Cấu trúc của các sản phẩm phản ứng được xác định nhờ các phương pháp phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1

H-NMR, 13NMR,phổ hồng ngoại ( IR)

C-Các sản phẩm phản ứng được kiểm tra độ sạch bằng các phương pháp sắc kí lớp mỏng, sắc khí lỏng ghép nối khối phổ (LC/MS)

Sắc kí lớp mỏng (SKLM) được sử dụng để định tính chất đầu và sản phẩm Thông thường chất đầu và sản phẩm có giá trị Rf khác nhau, màu sắc

và sự phát quang khác nhau Dùng sắc kí lớp mỏng để biết được phản ứng đã xảy ra hay không xảy ra, phản ứng đã kết thúc hay chưa kết thúc là dựa vào các vết trên bản mỏng, cùng các giá trị Rf tương ứng Giá trị Rf của các chất phụ thuộc vào bản chất và phụ thuộc vào dung môi làm pha động Dựa trên tính chất đó, chúng ta có thể tìm được dung môi hay hỗn hợp dung môi để tách các chất ra xa nhau (Rf khác xa nhau) hay tìm được hệ dung môi cần thiết

để tinh chế các chất

2.2 Tổng hợp và phân tích cấu trúc của metformine hydrochloride

2.2.1 Quy trình tổng hợp metformin hydrochloride

Trang 31

22

được sản phẩm thô dạng đông đặc màu trắng.Hỗn hợp phản ứng được làm lạnh bằng nước đá đưa về nhiệt độ phòng Sản phẩm thô được tinh chế trong dung môi thích hợp thu được sản phẩm sạch metformin hydrochloride

Sản phẩm là tinh thể màu trắng, nhiệt độ nóng chảy: 225-2260C

2.2.2 Phân tích cấu trúc của metformin hydrochoride bằng phổ IR

Cân 2 mg chất metformin và 100 mg KBr vào cối mã não, trộn đều và

được nghiền mịn thành hỗn hợp đồng nhất bằng chày của cối mã não Hỗn hợp này được đưa vào thiết bị ép viên thủy lực 50 tấn của hãng HP, sau đó mẫu được đo trên máy Impact 410 - Nicolet, tại phòng thí nghiệm Phổ hồng ngoại Viện Hóa học - Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam, đo ở dạng ép viên với KBr rắn

IR (KBr, cm-1): 3378; 3179; 2950; 1631; 1584; 1472; 1414

2.2.3 Phân tích cấu trúc của metformin hydrochoride bằng phổ NMR

25 mg chất metformin ở trên được cho vào trong ống NMR loại (tubes

NMR của Aldrich) dài 20,3 mm, rộng 5 mm sau đó cho 0,8 ml DMSO và lắc đều cho mẫu tan hết vào dung môi tạo thành hệ đồng nhất Mẫu được đo trên máy Bruker XL-500 tần số 500 MHz với TMS là chất chuẩn, tại Trung tâm Phân tích cấu trúc - Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam

2.2.4 Phân tích cấu trúc của metformin hydrochoride bằng phổ MS

1 mg chất metformin hydrochloride ở trên được pha trong 1 ml dung dịch DMSO, lắc đều để tạo thể thống nhất Sau đó mẫu được đưa vào máy trên LC - MSD - Trap - SL tại phòng Cấu trúc, Viện Hóa học - Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam để ghi phổ MS

EI-MS : m/z: [M-HCl]+ = 129

CTPT: C4H11N5.HCl

Trang 32

23

2.3 Nghiên cứu kết tinh metformine hydrochloride

2.3.1 Kết tinh metformin hydrochloride trong dung môi Aceton

Hòa tan sản phẩm metformin hydrochloride (50g) trong aceton (500ml), hỗn hợp được đun hồi lưu nhưng khó tan Dung dịch được lọc nóng để loại bỏ các tạp chất và sản phẩm chưa tan hết trong dung môi Dịch lọc được làm nguội tại nhiệt độ phòng, sau đó làm lạnh tại nhiệt độ âm (-10) ‚ (-20oC) trong 24h để kết tinh sản phẩm Sau 24h, thấy sản phẩm tinh thể màu trắng kết tinh xuất hiện trong dung dịch Tinh thể được lọc, rửa 3 lần bằng aceton lạnh, hút khô thu được sản phẩm metformin hydrochloride 12g Dịch lọc aceton tiếp tục được cô bớt dung môi và kết tinh lần thứ 2 lặp lại theo qui trình như trên thu thêm được 3g sản phẩm Tổng hai lần kết tinh thu được là 15g sản phẩm với hiệu suất kết tinh là 30%

2.3.2 Kết tinh metformin hydrochloride trong dung môi MeOH

Hòa tan sản phẩm metformin hydrochloride (50g) trong MeOH (500ml), hỗn hợp được đun hồi lưu đến tan, sản phẩm tan hoàn toàn trong dung môi MeOH Dung dịch được lọc nóng để lọai bỏ các tạp chất, dịch lọc được làm nguội tại nhiệt độ phòng, sau đó làm lạnh tại nhiệt độ âm (-10) ‚ (-20oC) trong 24h để kết tinh sản phẩm Sau 24h, thấy sản phẩm tinh thể màu trắng kết tinh xuất hiện trong dung dịch Tinh thể được lọc bằng phễu lọc thủy tinh, rửa 3 lần bằng MeOH lạnh, hút khô sản phẩm thu được sản phẩm metformin hydrochloride 33g Dịch lọc MeOH được cô bớt dung môi tiếp tục được kết tinh lần thứ 2 lặp lại theo qui trình như trên thu thêm được 8g sản phẩm Tổng hai lần kết tinh thu được là 41g sản phẩm với hiệu suất kết tinh là 82%

2.3.3 Kết tinh metformin hydrochloride trong dung môi EtOH

Hòa tan sản phẩm metformin hydrochloride (50g) trong EtOH (500ml), hỗn hợp được đun hồi lưu cho đến tan Dung dịch được lọc nóng để lọai bỏ các tạp chất và sản phẩm chưa tan hết trong dung môi Dịch lọc được làm nguội tại nhiệt độ phòng, sau đó làm lạnh tại nhiệt độ âm (-10) ‚ (-20oC)

Định dạng
Số trang	64
Dung lượng	3,49 MB