Nghiên cứu thiết kế và chuyển gen AGPopt tổng hợp nhân tạo vào cây sắn (Manihot esculenta Crantz)

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Đỗ Hải Lan NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VÀ CHUYỂN GEN AGPopt TỔNG HỢP NHÂN TẠO VÀO CÂY SẮN Manihot esculenta Crantz Chuyên

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐỖ HẢI LAN

ẾT KẾ VÀ CHUYỂN GEN

AGPopt TỔNG HỢP NHÂN TẠO

VÀO CÂY SẮN (Manihot esculenta Crantz)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI, 2017

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Đỗ Hải Lan

NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VÀ CHUYỂN GEN

AGPopt TỔNG HỢP NHÂN TẠO

VÀO CÂY SẮN (Manihot esculenta Crantz)

Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

Mã số: 62 42 01 12

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1 GS.TS Lê Trần Bình

Viện Công nghệ sinh học

2 PGS.TS Lê Văn Sơn

Viện Công nghệ sinh học

Hà Nội, 2017

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Lê Trần Bình và PGS TS Lê Văn Sơn, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam là người thầy tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu thực hiện và hoàn thành luận án này

Tôi xin cảm ơn lãnh đạo và tập thể cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Phòng Thí nghiệm trọng diểm công nghệ gen, Ban Lãnh đạo, Phòng Quản lý tổng hợp, bộ phận Quản lý đào tạo sau đại học, Viện Công nghệ sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi về mọi mặt, hỗ trợ tôi thực hiện các thủ tục cần thiết để tôi có thể hoàn thành chương trình học tập và nghiên cứu của Nghiên cứu sinh

Tôi xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ quý báu của TS Hoàng Văn An và NCS Võ Thị Xuân Kiều, College of Life Science, Kyung Hee University, Hàn Quốc trong quá trình tôi thực hiện luận án

Tôi nhận được sự tạo điều kiện giúp đỡ về mọi mặt từ Ban Giám hiệu, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh - Hóa, Phòng Tổ chức cán bộ, Phòng Đào tạo sau đại học, Trường Đại học Tây Bắc trong suốt quá trình thực hiện luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, đồng nghiệp

đã luôn động viên và khích lệ tôi trong thời gian qua

Hà Nội, tháng 11 năm 2017

Tác giả luận án

Đỗ Hải Lan

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của GS.TS Lê Trần Bình và PGS TS Lê Văn Sơn

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả khác Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Hà Nội, ngày tháng 11 năm 2017

Tác giả luận án

Đỗ Hải Lan

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 5

1.1 Giới thiệu chung về cây sắn 5

1.1.1 Đặc điểm thực vật học 5

1.1.2 Vai trò và giá trị kinh tế 6

1.1.3 Tình hình phát triển cây sắn 8

1.2 Nghiên cứu nuôi cấy in vitro và hệ thống chuyển gen ở cây sắn 10

1.2.1 Nghiên cứu chọn tạo giống sắn theo phương pháp truyền thống 10

1.2.2 Nghiên cứu nuôi cấy in vitro và tái sinh cây 11

1.2.3 Các nghiên cứu quy trình chuyển gen ở cây sắn 15

1.2.4 Tạo cây sắn chuyển gen tăng cường hàm lượng tinh bột 18

1.3 Tinh bột và quá trình tạo tinh bột ở cây có củ 23

1.3.1 Giới thiệu về tinh bột 23

1.3.2 Cơ chế tổng hợp tinh bột 24

1.3.3 Các enzim và gen liên quan tích lũy tinh bột 26

1.4 Gen tổng hợp biểu hiện trong thực vật 31

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

2.1 Vật liệu nghiên cứu 35

2.2 Phương pháp nghiên cứu 36

2.2.1 Các phương pháp liên quan đến nuôi cấy mô, tái sinh cây sắn và chuyển gen 37

2.2.2 Các phương pháp liên quan đến tổng hợp gen và thiết kế vector mang gen nhân tạo mã hóa enzyme AGPase phục vụ cho chuyển gen 42 2.2.3 Các phương pháp liên quan đến phân tích các dòng cây chuyển 49

gen

2.2.4 Phương pháp tính toán và xử lý số liệu 52

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 53

3.1 Kết quả xây dựng quy trình nuôi cấy và tái sinh cây sắn 53

3.1.1 Kết quả đánh giá khả năng tạo phôi soma 54

3.1.2 Kết quả đánh giá khả năng tái sinh của phôi soma 58

3.2 Kết quả tối ưu hóa quy trình chuyển gen chỉ thị gus vào cây sắn 62 3.2.1 Tối ưu chủng vi khuẩn A tumefaciens và vector chuyển gen vào cây sắn 62

3.2.2 Tối ưu vật liệu và phương pháp lây nhiễm vi khuẩn A tumefaciens vào cây sắn 64

3.2.3 Tối ưu thời điểm lây nhiễm và mật độ vi khuẩn A tumefaciens cho chuyển gen vào mảnh lá mầm cây sắn KM94 66

3.2.4 Tối ưu nồng độ (AS) và thời gian lây nhiễm vi khuẩn A tumefaciens 66

3.2.5 Tối ưu thời gian đồng nuôi cấy 68

3.2.6 Tối ưu loại kháng sinh và ngưỡng chọn lọc 69

3.2.7 Phân tích cây sắn KM94/pCB-gus 72

3.3 Kết quả thiết kế vector mang gen mã hóa AGPase 73

3.3.1 Tổng hợp gen nhân tạo mã hóa AGPase 73

3.3.2 Thiết kế vector tái tổ hợp chứa cấu trúc gen AGPopt 77

3.3.3.Tạo chủng vi khuẩn A tumefaciens tái tổ hợp chứa vector

pBI121/AGPopt đã thiết kế 79

3.3.4 Đánh giá sự biểu hiện của gen AGPopt trong cây thuốc lá 80

3.4 Chuyển gen AGPopt vào cây sắn 88

3.4.1 Biến nạp gen AGPopt vào cây sắn KM94 nhờ A tumefaciens CV58/pGV2260 88

3.4.2 Phân tích cây sắn chuyển gen KM94/AGPopt 90

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 93

4.1 Nuôi cấy mô và tái sinh cây sắn phục vụ chuyển gen 93

4.2 Chuyển gen chỉ thị chọn lọc gus vào cây sắn 99

4.3 Tổng hợp gen nhân tạo AGPopt mã hóa enzyme AGPase và thiết kế vector pBI121/AGPopt 103

4.4 Chuyển gen AGPopt vào cây sắn KM94 108

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 111

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN 112

SUMMARY 113

TÀI LIỆU THAM KHẢO 117

PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Danh mục 5 loại cây chiếm kim ngạch xuất khẩu cao trong

ngành nông nghiệp 2015 7

Bảng 1.2 Diện tích, năng suất, sản lượng sắn năm 2016 9

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của 2,4D, picloram và NAA lên tỉ lệ tạo phôi

soma từ 6 loại vật liệu của 2 giống sắn KM140 và KM94 56

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ picloram tới sự hình thành phôi

soma từ đỉnh chồi và lá non của hai giống sắn KM94 và

KM140 nuôi cấy in vitro 58

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của BAP và IBA lên khả năng tạo chồi của phôi

soma từ lá non và đỉnh chồi của 2 giống sắn KM140 và KM94 59

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến quá trình tạo chồi từ

phôi soma sau 4 tuần nuôi cấy 60

Bảng 3.5 Khả năng tạo rễ của chồi 61

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn A tumefaciens, vector

và loại vật liệu lây nhiễm đến hiệu quả hiệu quả chuyển gen

gus vào cây sắn KM94 và KM140 63

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của phương pháp và các loại vật liệu lây nhiễm

đến hiệu quả chuyển gen gus vào của cây sắn KM94 và

KM140 65

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn và thời điểm lây nhiễm đến

hiệu quả chuyển gen gus vào lá mầm cây sắn KM94 66

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của nồng độ AS và thời gian lây nhiễm đến hiệu

quả chuyển gen gus vào lá mầm cây sắn KM94 67

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy và nồng độ AS đến

hiệu quả chuyển gen gus vào lá mầm cây sắn KM94 68

Bảng 3.11 Ảnh hưởng ngưỡng chọn lọc của kanamycin, neomycin và 70

paromomycin lên hiệu quả chuyển gen gus vào lá mầm cây

sắn KM94

Bảng 3.12 Hiệu quả chuyển gen AGPopt vào cây thuốc lá K326 81

Bảng 3.13 Hàm lượng tinh bột trong lá của cây thuốc lá

K326/pBI121/AGPopt 87

Bảng 3.14 Khả năng tạo tạo chồi và ra rễ của các mẫu sắn KM94

/AGPopt 90

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Diện tích trồng sắn phân theo vùng kinh tế 8

Hình 1.2 Cơ cấu sử dụng sắn ở Việt Nam 10

Hình 1.3 Sơ đồ các bước tái sinh ở cây sắn 12

Hình 1.4 Sơ đồ bốn hệ thống chuyển gen vào cây sắn 16

Hình 1.5 Các phản ứng sinh tổng hợp tinh bột 26

Hình 1.6 Các enzim tham gia sinh tổng hợp tinh bột 19

Hình 1.7 Cấu trúc của enzim AGPase 24

Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm 36

Hình 2.2 Sơ đồ các bước thiết kế vector pBI121/AGPopt 42

Hình 2.3 Sơ đồ tổng hợp vector pBI121/AGPopt 47

Hình 2.4 Sơ đồ các bước tách chiết enzim AGPase 51

Hình 3.1 Hình ảnh minh họa các bước chuẩn bị, tạo vật liệu khởi đầu phục vụ tái sinh cây sắn 53

Hình 3.2 Các loại vật liệu cho nuôi cấy mô và tái sinh cây sắn 54

Hình 3.3 Hình ảnh mẫu qua các giai đoạn tái sinh cây sắn khác nhau 62 Hình 3.4 Kết quả nhuộm X-gluc với các loại vật liệu lây nhiễm 64

Hình 3.5 Số lượng cây KM94/pCB-gus được tạo thành trên môi trường chọn lọc với các kháng sinh có nồng độ khác nhau 72

Hình 3.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen nptII từ các dòng sắn chuyển gen 73

Hình 3.7 Kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen AGPopt và glgC ở E coli K12 75

Hình 3.8 Hình 3.8 Kết quả so sánh trình tự protein suy diễn từ gen AGPopt với glgC (E coli K12) 76

Hình 3.9 Sơ đồ cấu trúc gen AGPopt tổng hợp nhân tạo 77

Hình 3.10 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng cắt vector pBI121 và pUCIDT/AGPopt bằng XbaI và SacI 78

Hình 3.11 Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch vector pBI121 và

AGPopt (A); điện di sản phẩm colony-PCR gen AGPopt

với cặp mồi đặc hiệu G336 F/G336KDEL R từ vector

pBI121/AGPopt (B) 79

Hình 3.12 Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR gen AGPopt với cặp

mồi đặc hiệu G336F G336KDEL R 79

Hình 3.13 Kết quả sau khi biến nạp vector pBI121/AGPopt vào A

tumefaciens và điện di sản phẩm colony-PCR gen AGPopt

từ các dòng khuẩn lạc A tumefaciens CV58/

pGV2260 80

Hình 3.14 Hình ảnh minh họa một số bước chuyển gen AGPopt bằng

A tumefaciens CV58/PGV2260 vào cây thuốc lá 81

Hình 3.15 Kết quả điện di sản phẩm PCR gen AGPopt các dòng thuốc lá

chuyển gen 82

Hình 3.16 Kết quả lai Southern các mẫu thuốc lá chuyển gen

AGPopt 83

Hình 3.17 Kết quả lai Western kiểm tra sự biểu hiện của gen AGPopt

trong các dòng thuốc lá mang gen AGPopt 85

Hình 3.18 Hoạt tính enzim AGPase trong lá các dòng thuốc lá mang

gen AGPopt và dòng cây không chuyển gen 86

Hình 3.19 Hình ảnh minh họa kết quả tái sinh cây từ phôi soma

chuyển gen AGPopt của giống sắn KM94 89

Hình 3.20 Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen mã hóa nptII từ các

dòng cây sắn KM94 chuyển gen 91

Hình 3.21 Kết quả điện di sản phẩm PCR gen AGPopt ở các dòng cây

sắn KM94 chuyển gen AGPopt bằng cặp mồi đặc hiệu G336F/G336KDEL R 92

CaMV Cauliflower mosaic virus

CMML Cassava maturation medium by Li et al (1996)

dNTP deoxyribonucleotide triphosphate

EDTA Ethylene diaminne tetra acetic acid

FEC Friable embryogenic callus

NAA 1-naphthaleneacetic acid

nptII neomycin phosphotransferase II

OD Optical density - Mật độ quang

PCR Polymerase chain reaction

TPT Triose phosphate/phosphate translocator

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Cây sắn (Manihot esculenta Crantz) là cây có củ được trồng ở vùng cận nhiệt

đới của Châu Phi, Châu Á và Châu Mỹ, đáp ứng nhu cầu lương thực cho 800 triệu người (Paul et al., 2016) Củ sắn có hàm lượng chất khô chiếm 30 - 60% (FAO, 2013) trong đó 80% là tinh bột, được sử dụng chủ yếu làm lương thực, thức ăn chăn nuôi, công nghiệp tinh bột, đường, nhiên liệu sinh học (Abraham, 1996) Sản phẩm

từ sắn đã trở thành mặt hàng xuất khẩu có giá trị ở nước ta, đạt kim ngạch xuất khẩu 1,32 tỷ USD trong năm 2015 Trong tầm nhìn chiến lược đến năm 2020, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (Bộ NN và PTNT) đã xếp cây sắn cùng với lúa và ngô được ưu tiên phát triển, do vậy, diện tích trồng sắn đến nay đã đạt hơn 570 nghìn ha, tuy nhiên, năng suất sắn của Việt Nam chỉ đạt 19,15 tấn ha ở mức trung bình của thế giới (Bộ NN và PTNT, 2016)

Để phát triển cây sắn bền vững, cần thiết phải cải tạo giống sắn nhằm không chỉ thu được lợi nhuận cao mà còn duy trì được độ phì nhiêu của đất Hiện nay, trong công tác chọn tạo giống cây trồng, công nghệ gen có ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô, tế bào đã trở thành công cụ hiệu quả để cải biến di truyền của những cây có hạn chế trong sinh sản hữu tính và được nhân giống vô tính là chủ yếu như cây sắn Trên thế giới, nghiên cứu tạo cây sắn chuyển gen đã được bắt đầu từ thập

kỷ 90 của thế kỷ trước và đến nay đã có nhiều thành tựu (Beeching, 2013), đặc biệt trong hướng cải tiến chất lượng củ như giảm hàm lượng cyanogen (Fregene, 2002; Taylor et al., 2004), giảm tỷ lệ amylose trong tinh bột (Fregene, 2002), tăng hàm lượng protein, β-caroten (Morillo et al., 2012; Ovalle et al., 2016), sắt, vitamin (Fregene, 2002; Taylor et al., 2004; Sayre et al., 2011; Li et al., 2015; Narayanan et al., 2016), tăng tinh bột (Ihemere et al., 2006)… Việc ứng dụng công nghệ chuyển gen nhằm tác động vào các gen tham gia quá trình tổng hợp thủy phân tinh bột để tăng khả năng tích lũy tinh bột ở cơ quan dự trữ hướng đến nâng cao năng suất cây

có củ nói chung và cây sắn nói riêng là hướng nghiên cứu đúng đắn và đang thu hút

được sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu

Trong sinh tổng hợp tinh bột, ADP-glucose pyrophosphorylase (AGPase) là enzim điều hoà quá trình tổng hợp tinh bột ở bước chuyển glucose-1-phosphate thành ADP-glucose, nguyên liệu để tạo thành tinh bột (Buchanan et al., 2002) Trong quá trình nghiên cứu, người ta đã phát hiện ra AGPase là sản phẩm đơn gen

của gen glgC của vi khuẩn E.coli, có hoạt tính cao hơn hàng trăm lần so với ở thực

vật (Iglesias et al., 1993) KhiAGPase E coli mang đột biến điểm G336D thay thế

glycin ở vị trí 336 bằng axit aspartic có thể hoạt động hiệu quả mà không cần chất hoạt hóa fructose-1,6-bis phosphate, có ái lực cao hơn với cơ chất (ATP và Glucose-1-phosphate) và giảm ái lực với chất ức chế AMP (Ihemere et al., 2006)

Vì vậy, nuôi cấy mô tái sinh cây sắn, tổng hợp gen nhân tạo AGPopt mã hóa

AGPase với mã di truyền phù hợp với thực vật nhưng có ưu điểm của AGPase ở vi khuẩn và mang đột biến mong muốn, đánh giá sự biểu hiện của gen tổng hợp trên cây mô hình đóng vai trò vô cùng quan trọng trong chuyển gen tổng hợp nhân tạo vào cây sắn góp phần tạo tiền đề cho cải biến năng suất và chất lượng một số giống sắn đang được trồng phổ biến ở nước ta

Với những lí do trên, chúng tôi lựa chọn đề tài: ―Nghiên cứu thiết ế v

chuyển gen AGPopt tổng hợp nhân tạo v o cây sắn (Manihot esculenta

Crantz)‖

2 Mục tiêu nghiên cứu

Thiết kế và đánh giá hoạt động trên cây mô hình của vector mang gen mã hóa

AGPase đã được tối ưu khả năng biểu hiện trong thực vật (AGPopt) và triển khai chuyển gen AGPopt vào cây sắn thông qua qui trình tái sinh và chuyển gen vào

giống sắn đang được canh tác tại Việt Nam

3 Phạm vi nghiên cứu

Về sinh lý học thực vật nghiên cứu hoàn thiện các điều kiện nuôi cấy mô tế bào, điều kiện tạo phôi soma và tái sinh cây từ phôi soma phục việc chuyển gen ở cây sắn

Về sinh học phân tử tập trung khai thác nguồn dữ liệu gen liên quan đến AGPase, đề xuất tối ưu hóa mã di truyền cho phù hợp với thực vật và bổ sung đột biến vào trình tự gen nhân tạo để gia tăng hiệu quả sinh tổng hợp tinh bột

Về kỹ thuật di truyền tập trung thiết kế vector chuyển gen mang gen tổng hợp nhân tạo, tiến hành kiểm tra hoạt động của vector và gen chuyển trên đối tượng thuốc lá mô hình, đồng thời hoàn thiện qui trình chuyển gen và tiến hành chuyển gen ở cây sắn

4 Nội dung nghiên cứu

(1) Nghiên cứu xây dựng quy trình tái sinh cây sắn thông qua phương pháp tạo phôi soma

(2) Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình chuyển gen gus vào cây sắn thông qua vi khuẩn A tumerfaciens

(3) Nghiên cứu thiết kế cấu trúc, vector mang gen AGPopt và đánh giá sự biểu hiện của gen AGPopt trên cây thuốc lá

(4) Nghiên cứu chuyển gen AGPopt vào cây sắn

5 Đóng góp mới của luận án

Lần đầu tiên quy trình nuôi cấy mô, tái sinh qua phôi soma trên cây sắn ở Việt Nam được nghiên cứu hoàn thiện

Gen mã hóa AGPase ở vi khuẩn E coli có hoạt tính xúc tác tạo nguyên liệu

cho tổng hợp tinh bột được cải biến phù hợp biểu hiện trong hệ thống thực vật, tạo

đột biến (AGPopt) nâng cao hoạt tính enzim và được chuyển vào vector biểu hiện

thực vật thích hợp phục vụ công tác chuyển gen

Quy trình chuyển gen chỉ thị gus đã được xây dựng thành công trên cây sắn KM94 thông qua vi khuẩn A tumefaciens

Bước đầu xác định sự có mặt của gen nhân tạo AGPopt mã hóa AGPase trong

cây sắn KM94

Ý nghĩa hoa học v thực tiễn

Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam công bố quy trình tái sinh in vitro

thông qua phôi soma của một số giống sắn hiện đang được canh tác ở Việt Nam

Các kết quả đạt được trong nghiên cứu này là cơ sở cho các ứng dụng nhân nhanh các giống sắn mới chất lượng, bảo tồn nguồn gen có giá trị cũng như phục vụ công tác chuyển gen

Quy trình chuyển gen chỉ thị gus vào cây sắn thông qua A tumefaciens là cơ

sở khoa học để cải tiến giống sắn; đồng thời đây là mô hình để nghiên cứu chức năng gen ở cây trồng

Kết quả biến đổi, tổng hợp nhân tạo gen mã hóa AGPase (AGPopt), thiết kế

vector biểu hiện thực vật và chuyển gen này vào cây thuốc lá là cơ sở khoa học cho việc tạo ra các giống sắn cao sản

Bước đầu xác định được sự có mặt của gen AGPopt trong cây sắn chuyển gen,

là cơ sở cho các xác định tiếp theo về biểu hiện của gen AGPopt trong cây sắn

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 Giới thiệu chung về cây sắn

1.1.1 Đặc điểm thực vật học

Cây sắn (Manihot esculenta Crantz) (ITIS, 2012), thuộc loài Manihot

esculenta, chi Manihot, tông Manihoteae, phân họ Crotonoideae, họ

Euphorbiaceae, bộ Malpighiales (tên khác: khoai mì, cassava, tapioca ) Trong

chi Manihot có khoảng 98 loài nhưng chỉ có Manihot esculenta Crantz là loài

đóng vai trò quan trọng trong nông nghiệp (OECD, 2014)

Cây sắn có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới của châu Mỹ La tinh và được trồng cách đây khoảng 5.000 năm Trung tâm phát sinh cây sắn được giả thiết tại vùng Đông Bắc của Brazil thuộc lưu vực sông Amazon (OECD, 2014) Theo Hoàng Kim

và Phạm Văn Biên (1995), cây sắn được du nhập vào Việt Nam khoảng giữa thế kỷ XVIII, hiện chưa có tài liệu chắc chắn về nơi trồng và năm trồng đầu tiên Hiện tại, sắn được trồng trên 100 nước của vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới, tập trung nhiều ở châu Phi, châu Á và Nam Mỹ (OECD, 2014)

Sắn có 98 loài hoang dại nhưng được chia thành hai nhóm chính: sắn ngọt và sắn đắng (OECD, 2014) Sắn là cây đa bội thể phức tạp, dị hợp, bộ nhiễm sắc thể 2n

= 36, thể tam bội và tứ bội có số nhiễm sắc thể tương ứng 54 và 72 (OECD, 2014) Sắn có khả năng chịu đựng trong điều kiện sống bất lợi như khí hậu khô hạn, đất giàu hay nghèo dinh dưỡng, đòi hỏi tối thiểu lượng phân bón, thuốc trừ sâu và nước Cây sắn là thực vật trung gian giữa C3 và C4 (Saithong et al., 2013; Zhang et al., 2016) Nhiệt độ tối ưu cho quang hợp của các cây trồng trên đồng ruộng là 35oC nhưng phạm vi quang hợp tối ưu từ 25 đến 45oC (El-Sharkawy et al., 2012) Vì vậy, cây sắn thích nghi với điều kiện khí hậu nhiệt đới

Thân cây sắn có tính chất thân gỗ, có thể mọc cao từ 2 - 4 m, là bộ phận chính

để làm giống trong sản xuất Tại mỗi mắt là một điểm sinh trưởng của chồi nách, tại đây sẽ phát triển thành cành bên hoặc thân cây mới sau khi trồng Số lượng thùy của

lá trưởng thành tương đối ổn định đối với một giống sắn Sắn có hoa đơn tính, cả hoa cái và hoa đực cùng nằm trên một chùm hoa, sau khi hoa cái được thụ phấn, bầu nhụy cái phát triển thành quả (OECD, 2014)

Rễ củ được hình thành do sự phân hóa hình thành của rễ con và sự phình to của rễ (phần rễ mọc ngang) Củ có thể dài tới 1m (trung bình từ 30 - 60cm), đường kính củ có thể lên đến 14cm (trung bình từ 3 - 7cm) 3 tuần sau khi trồng đã thấy xuất hiện tầng thứ cấp thể hiện sự phân hóa hình thành củ sắn Tốc độ lớn của củ chia thành 3 giai đoạn:

Giai đoạn 1: 2 - 3 tháng đầu sau khi hình thành củ, tốc độ lớn của củ chậm Giai đoạn 2: Từ tháng thứ 6 - 8 tốc độ lớn của củ rất nhanh

Giai đoạn 3: Sau giai đoạn 2 đến thu hoạch, tốc độ lớn của củ giảm dần (OECD, 2014)

Dinh dưỡng, độc tố: Củ sắn tươi có tỷ lệ chất khô 20%; trong đó tinh bột

chiếm 80%; chất protein, béo, xơ, tro trong 100 g được tương ứng là 0,8 - 2,5 g, 0,2

- 0,3 g, 1,1 - 1,7 g, 0,6 - 0,9 g; chất muối khoáng và vitamin trong 100 g củ sắn là 18,8 - 22,5 mg Ca, 22,5 - 25,4 mg P, 0,02 mg B1, 0,02 mg B2, 0,5 mg PP Trong củ sắn, hàm lượng các acid amin không đươc cân đối, thừa arginin nhưng lại thiếu các acid amin chứa lưu huỳnh Thành phần dinh dưỡng khác biệt tùy từng giống, vụ trồng, số tháng thu hoạch sau khi trồng và kỹ thuật phân tích (Wheatley và Chuzel, 1993) Giá trị dinh dưỡng của sắn còn được đánh giá qua hàm lượng carotenoid tích lũy trong củ (Carvalho et al., 2016)

Trong lá và củ sắn ngoài các chất dinh dưỡng cũng chứa một lượng độc tố (HCN) đáng kể Các giống sắn ngọt có 80 - 110 mg HCN kg lá tươi và 20 - 30

mg kg củ tươi Các giống sắn đắng chứa 160 - 240 mg HCN kg lá tươi và 60 - 150

mg kg củ tươi Tuỳ theo giống, vỏ củ, lõi củ, thịt củ, điều kiện đất đai, chế độ canh tác, thời gian thu hoạch mà hàm lượng HCN có khác nhau (Wheatley and Chuzel, 1993)

1.1.2 Vai trò và giá trị kinh tế của cây sắn

Sắn có nhiều công dụng trong chế biến công nghiệp, thức ăn gia súc và lương

thực, thực phẩm

Củ sắn dùng để làm thực phẩm như ăn tươi, chế biến sắn lát khô, tinh bột sắn, làm thức ăn gia súc, bánh kẹo, đường glucose tinh thể, mạch nha giàu maltose, mì

ăn liền, bún, miến, hạt trân châu (tapioca), phụ gia thực phẩm, bột ngọt (Salvador

et al., 2014) Lá sắn ngọt là loại rau xanh giàu đạm rất bổ dưỡng và để nuôi cá, nuôi tằm Lá sắn đắng ủ chua hoặc phơi khô để làm bột lá sắn dùng chăn nuôi lợn, gà, trâu, bò, dê v.v

Sắn là một mặt hàng quan trọng trong ngành công nghiệp chủ yếu là do tinh bột của nó được sử dụng trong việc sản xuất các mặt hàng khác nhau Tinh bột sắn

có nhiệt độ hồ hóa thấp nên dễ dàng chuyển hóa thành các đường đơn giản như sorbitol, mannitol và maltol, là nguyên liệu để sản xuất kem đánh răng, mỹ phẩm, dầu sơn, ascorbic acid, polyester, polyethylene nhựa (Ren, 1996), maltodextrin, lysine, acid citric, siro glucose, hồ vải, hồ giấy, colender, phủ giấy, bìa các tông, phụ gia dược phẩm, sản xuất màng phủ sinh học, chất giữ ẩm (Abraham, 1996) Đặc biệt, tinh bột sắn là nguồn nguyên liệu chủ yếu cho quá trình lên men để sản xuất etanol, nhiên liệu sinh học

Cây sắn đã mang lại hàng tỷ USD giá trị xuất nhập khẩu và thương mại cũng như tạo ra hàng triệu việc làm và thu nhập cho người nông dân, doanh nghiệp ở nhiều quốc gia

Năm 2015, cây sắn vẫn chiếm kim ngạch xuất khẩu cao trong ngành nông nghiệp, cụ thể: đứng thứ 4 sau cây lúa, cà phê và cây điều về sản lượng và kim ngạch xuất khẩu (bảng 1.1)

Bảng 1.1 Danh mục 5 loại cây chiếm im ngạch xuất hẩu cao trong ng nh nông

nghiệp 2015 (Nguồn: Hiệp hội sắn Việt Nam, 2016)

1.1.3 Tình hình phát triển cây sắn

Theo báo cáo của Tổ chức lương thực nông nghiệp Liên Hiệp quốc FAO, cây sắn được đánh giá là loại cây lương thực có tiềm năng phát triển to lớn, được dự đoán là cây trồng của thế kỷ XXI Cây sắn hiện nay đã chuyển đổi vai trò từ cây lương thực, thực phẩm thành cây công nghiệp hàng hóa có lợi thế cạnh tranh cao

Toàn thế giới có trên 100 nước trồng sắn với tổng diện tích đạt 20,82 triệu ha, tổng sản lượng đạt 269,12 triệu tấn và năng suất củ tươi bình quân đạt 12,92 tấn ha Khu vực Châu Phi có diện tích trồng và sản lượng sắn lớn nhất, tuy nhiên, khu vực Châu Á lại là nơi tạo ra sản lượng cao nhất (FAOSTART, 2015) Các giống sắn được trồng tại Việt Nam chủ yếu là: KM94, KM140, KM98-5 Hiện nay, ở Việt Nam, giống sắn KM94 được trồng nhiều nhất chiếm 75,5% tổng diện tích trồng sắn

cả nước, tiếp đó là giống KM140 chiếm 5,4% còn lại là giống khác (Hiệp hội sắn Việt Nam, 2016)

Tại Việt Nam, sắn được canh tác phổ biến ở hầu hết các tỉnh của các vùng sinh thái nông nghiệp Các vùng trồng sắn chính của Việt Nam được tập trung chủ yếu là Bắc Trung bộ, duyên hải miền Trung, Tây Nguyên, Đông Nam bộ và Trung du miền núi phía Bắc Tổng diện tích sắn của 5 vùng sinh thái này chiếm khoảng 97% diện tích sắn cả nước Bắc Trung bộ và Duyên hải miền Trung là vùng sản xuất sắn nhiều nhất cả nước, Tây Nguyên là vùng thứ 2, tập trung chủ yếu ở bốn tỉnh Kon Tum, Gia Lai, Đắk Lắk và Đắk Nông

Hình 1.1 Diện tích (ha) trồng sắn phân theo vùng inh tế (Nguồn: Bộ NN và

DH Nam Trung Bộ Bắc Trung Bộ

TD và MN phía Bắc

ĐB Sông Hồng

ha

Diện tích trồng sắn có xu hướng tăng dần theo các năm, trong năm 2016, diện tích trồng sắn trên cả nước đạt 570,4 nghìn ha, trong đó khu vực miền Nam có sự

mở rộng khá mạnh về diện tích trồng sắn, còn miền Bắc có sự thu hẹp (Bảng 1.2)

Bảng 1.2 Diện tích, năng suất, sản lƣợng sắn năm 2016 (Nguồn: Bộ NN và PTNT)

và cây ăn quả có xu hướng mở rộng, (ii) đầu ra cho sản xuất tinh bột sắn và sắn lát

từ đầu năm 2016 trở lại đây gặp khó khăn khiến cho giá sắn củ nguyên liệu duy trì ở mức thấp (AgroMonitor, 2016)

Năng suất sắn của Việt Nam hiện nay đứng khoảng thứ 10 trong số các quốc gia năng suất cao Tuy nhiên, năng suất bình quân tăng từ 17 tấn ha lên 19,1 tấn ha nhưng vẫn chỉ tương đương 50% so với năng suất sắn tại Ấn Độ, thấp hơn so với một số nước Đông Nam Á như Lào (25,17 tấn ha), Indonesia (22,86 tấn ha), Thái Lan (21,82 tấn ha) (AgroMonitor, 2016)

Cơ cấu sử dụng sắn Việt Nam hàng năm được chia thành 03 nhóm chính gồm: 37% cho sản xuất tinh bột, 33% cho xuất khẩu và 30% cho sản xuất thức ăn chăn nuôi (Nguyễn Hữu Hỷ, 2016)

Viện Nghiên cứu Chính sách lương thực thế giới (IFPRI) đã tính toán nhiều mặt và dự báo tình hình sản xuất và tiêu thụ sắn toàn cầu với tầm nhìn đến năm

2020 Năm 2020, sản lượng sắn toàn cầu ước đạt 275,1 triệu tấn, trong đó sản xuất sắn chủ yếu ở các nước đang phát triển là 274,7 triệu tấn, các nước đã phát triển khoảng 0,4 triệu tấn Mức tiêu thụ sắn ở các nước đang phát triển dự báo đạt 254,6 triệu tấn so với các nước đã phát triển là 20,5 triệu tấn Khối lượng sản phẩm sắn toàn cầu sử dụng làm lương thực thực phẩm dự báo nhu cầu là 176,3 triệu tấn và thức ăn gia súc 53,4 triệu tấn Tốc độ tăng hàng năm của nhu cầu sử dụng sản phẩmsắn làm lương thực, thực phẩm và thức ăn gia súc đạt tương ứng là 1,98% và 0,95% Châu Phi vẫn là khu vực dẫn đầu sản lượng sắn toàn cầu với dự báo sản lượng năm 2020 sẽ đạt 168,6 triệu tấn Trong đó, khối lượng sản phẩm sử dụng làm lương thực thực phẩm là 77,2%, làm thức ăn gia súc là 4,4% Châu Mỹ La tinh giai đoạn 1993 - 2020, ước tốc độ tiêu thụ sản phẩm sắn tăng hàng năm là 1,3%, so với châu Phi là 2,44% và châu Á là 0,84 - 0,96% Cây sắn tiếp tục giữ vai trò quan trọng trong nhiều nước châu Á, đặc biệt là các nước vùng Đông Nam Á nơi cây sắn

có tổng diện tích đứng thứ ba sau lúa và ngô và tổng sản lượng đứng thứ ba sau lúa

và mía (FAO, 2013)

1.2 Nghiên cứu nuôi cấy in vitro v hệ thống chuyển gen ở cây sắn

1.2.1 Nghiên cứu chọn tạo giống sắn theo phương pháp truyền thống

Các chương trình nhân giống truyền thống tại Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), Colombia và Viện Nông nghiệp Nhiệt đới Quốc tế (IITA), Nigeria, hai Trung tâm CGIAR đã thành công trong việc phát triển và tạo các giống sắn tăng khả năng kháng bệnh và côn trùng, hàm lượng chất khô và cải

33%

37%

30%

Xuất khẩu Tinh bột Thức ăn chăn nuôi

Hình 1.2 Cơ cấu sử dụng sắn ở Việt Nam (Nguồn: Nguyễn Hữu Hỷ, 2016)

thiện chất lượng sắn ở châu Phi (Manyong et al., 2000; Nweke et al., 2002), châu Á

và châu Mỹ (Jennings vàIglesias, 2002)

Tại Việt Nam, nghiên cứu chọn tạo giống sắn hơn 20 năm qua, Trung tâm Nghiên cứu thực nghiệm nông nghiệp Hưng Lộc, ĐH Nông lâm Thái Nguyên, Trung tâm Nghiên cứu và phát triển cây có củ (Viện CLT-CTP) đã thông qua các chương trình quốc gia, quốc tế để thu thập, bảo quản, đánh giá và sử dụng nguồn gen giống sắn; lai tạo, chọn lọc và chuyển giao giống sắn triển vọng ở Việt Nam đã đạt được những thành tựu có ý nghĩa, tạo các giống mới HL20, HL23 và HL24 (Trung tâm Nghiên cứu Thực nghiệm nông nghiệp Hưng Lộc, giai đoạn 1986-1993), KM60, KM94, SM937-26, KM95 và KM98-1 (mạng lưới nghiên cứu và chuyển giao tiến bộ kỹ thuật về sắn của Việt Nam (VNCP), Trung tâm Nông nghiệp nhiệt đới Quốc tế (CIAT), Công ty VEDAN (Đài Loan), giai đoạn 1989-2007), KM98-7, NA1, SA06, KM21-12 (ĐH Nông lâm Thái Nguyên, Trung tâm Nghiên cứu và phát triển Cây có củ, Viện Di truyền nông nghiệp, giai đoạn 2007- 2015), KM98-5, KM140, HL-S10 và HL-S11 (Trung tâm Nghiên cứu Thực nghiệm nông nghiệp Hưng Lộc) Bộ giống sắn đang trồng đại trà tại các địa phương chưa thật sự đáp ứng cho việc thâm canh tăng năng suất và rải vụ Nhiều tỉnh hiện đang trồng chủ yếu là giống KM94, KM60 Các phương pháp tạo giống sắn mới được thực hiện chủ yếu là lai tạo kết hợp với chọn lọc và gần đây có sử dụng phương pháp chiếu xạ gây đột biến (Phạm Thị Nhạn và Nguyễn Hữu Hỷ, 2015) Mặc dù với thành tựu như trên, phương pháp lai hữu tính truyền thống có hạn chế là cần từ 7-8 năm mới có thể tạo ra giống mới Do vậy, ngoài phương pháp chiếu xạ rút ngắn thời gian chọn tạo giống, ứng dụng công nghệ sinh học trong tạo giống phân tử giúp tăng cường khả năng biến đổi những tính trạng mục tiêu, đó là một phương pháp tốt

để cải tiến hàm lượng tinh bột ở thực vật

1.2.2 Nghiên cứu nuôi cấy in vitro và tái sinh cây

Công nghệ chuyển gen ở sắn cũng như các loại cây trồng khác, hệ thống biến đổi gen trong sắn phụ thuộc vào khả năng tạo các tế bào toàn năng của hệ thống

nuôi cấy mô Đây là mục tiêu cho chuyển gen, sau khi chọn lọc thành công tái sinh

cây chuyển gen hoàn chỉnh (Su, 2002)

Vật liệu nuôi cấy thường được dùng là chồi, hoặc thùy lá non của các giống sắn có nguồn gốc khác nhau từ các bộ sưu tập của IITA (Hankoua et al., 2006), Ấn

Độ (Konan et al., 1997), CIAT (Zhang et al., 2001)

Quá trình tái sinh cây trải qua các bước cơ bản như sơ đồ dưới đây (hình 1.3):

Vật liệu khởi đầu (lá, đỉnh sinh trưởng) được sử dụng để cảm ứng tạo phôi soma qua tiền phôi sơ cấp Phôi soma có thể chuyển hóa theo nhiều hướng:

- Phôi soma có thể cho nảy mầm trực tiếp tạo thành cây con

- Phôi soma chuyển hóa tiếp thành phôi soma thứ cấp

- Phôi soma được chọn lọc, nuôi cấy tạo thành mô sẹo tơi tiền phôi, được làm trưởng thành để trở lại phôi soma

- Từ mô sẹo tơi tiền phôi có thể tạo thành tế bào trần và ngược lại

Bước 1 Cảm ứng tạo phôi soma

Vật liệu ban đầu là mô phân sinh đỉnh (AM) 2 - 6 mm hoặc thùy lá non (ILL) được đặt trên môi trường muối và vitamin MS (1962) bổ sung 20% sucrose và các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin (2,4-D hoặc picloram) với các nồng

độ khác nhau 1 - 8mg/l 2,4-D (Stamp et al., 1987), 12 mg/l picloram (Li et al., 1996; Zhang et al., 2001) đặt trong tối ở 26◦C trong 1 - 2 tuần để cảm ứng tạo phôi soma

Hình 1.3 Sơ đồ các bước tái sinh ở cây sắn (Nguồn: Raemakers et al., 1997)

Bước 2 Phát sinh phôi soma sơ cấp v thứ cấp, tạo mô sẹo tơi tiền phôi

Sau 15 - 20 ngày nuôi cấy bước 1, các mảnh mẫu được chuyển sang môi trường có bổ sung 0,01 mg l 2,4-D (Raemakers et al., 1997) (bước 2) ở ngoài sáng

để làm trưởng thành phôi Dicamba (1 - 66 mg/l) và picloram (1 - 12 mg/l) có thể thay thế 2,4-D để cảm ứng phát sinh phôi sơ cấp (Taylor et al., 1995) Các cụm phôi soma sơ cấp gồm các phôi hình cầu, hình chùy, hình tim (được tạo ra trong môi trường cảm ứng phôi) được phân chia thành những cụm nhỏ gồm từ 5 - 10 phôi/cụm và được chuyển lên môi trường MS bổ sung 2% sucrose, 0,1 mg/1 BAP (Li et al.,1996) để tạo khả năng phát triển thành các phôi ở giai đoạn lá mầm xanh (phôi soma trưởng thành) Tuy nhiên, phôi trưởng thành được tạo ra nhiều hơn trong môi trường bổ sung NAA so với môi trường có bổ sung 2,4-D Hơn nữa, sự phát triển của phôi được cảm ứng bởi NAA nhanh hơn bởi 2,4-D, dicamba hoặc picloram (Sofiari, 1996)

Trong hệ thống này, phôi trưởng thành có các lá mầm màu xanh lớn được sử dụng để bắt đầu chu kì phát sinh phôi mới Hệ thống nhân phôi trưởng thành đã sử dụng thành công đối với 13 14 mẫu kiểm tra (Raemakers, 1993) Không chỉ 2,4-D, picloram và dicamba, mà cả NAA cũng có khả năng cảm ứng phát sinh phôi thứ cấp Các mảnh lá mầm màu xanh (5mm2) được tách từ phôi giai đoạn lá mầm 14 -

15 ngày tuổi được đặt lên môi trường P-CIM để cảm ứng phôi soma thứ cấp Các cụm phôi soma thứ cấp (được cảm ứng trên môi trường P-CIM) được phân chia thành các cụm nhỏ khoảng 5 - 10 phôi và được chuyển lên môi trường CMML để trưởng thành Quá trình này được lặp lại có tính chu kì (Hankoua et al., 2005)

Mô sẹo tiền phôi tơi (FEC) hay còn được gọi là mô sẹo phôi hóa được cảm

ứng bằng cách chuyển các cấu trúc phôi soma lên môi trường Gresshoff & Doy bổ sung 2% w/v sucrose và 50 μM picloram (GD2 50P) (Taylor et al., 1995), 1/10 MS

bổ sung 12 mg/l picloram (Nguyễn Văn Đồng và cs, 2014) Sau khi tạo thành, FEC được nuôi cấy duy trì trên môi trường GD bổ sung 6% sucrose và 50 μM picloram,

4 tuần cấy chuyển một lần Huyền phù tế bào tiền phôi được bắt đầu bằng cách chuyển 0,5g FEC vào 50ml môi trường huyền phù tiền phôi (embryogenesis

suspension medium - EMS) Schenck & Hildebrandt, bổ sung 50 μM picloram và 6%w/v sucrose (SH6 50P) trong bình nón 250 ml và duy trì 4 tuần cấy chuyển 1 lần như mô tả của Taylor et al (1995) Tất cả được đặt trong phòng sinh trưởng ở nhiệt

độ biến động từ 25 - 28oC trong tối 1 tuần để cảm ứng phôi từ thùy lá và đỉnh sinh trưởng hoặc với chu kì quang 16h (40-100 μm photon s-1

m-2 PAR) để nhân và duy trì các mô Tất cả môi trường nuôi cấy cần cung cấp 0,6% agar Tăng trưởng của huyền phù tế bào được xác định bằng cách đo thể tích tế bào ổn định (SCV), khối lượng tươi và khô SCV được đánh giá bằng hút 15ml huyền phù tế bào vào mỗi ống và để mô ổn định trong 30 phút (Taylor et al., 2001)

Các dòng FEC không pha trộn có thể duy trì trong 3 tuần nuôi cấy lặp lại trên môi trường GD2 trong hơn 2 năm FEC phát triển thành phôi trưởng thành sau khi nuôi cấy trên môi trường trưởng thành (Sofiari, 1996) Phôi trưởng thành được nhân lên bởi phát sinh phôi soma thứ cấp với tần suất cao và sau khi làm khô phôi trưởng

thành nảy mầm thành cây Các cây in vitro có hình thái giống cây ban đầu và hầu

hết tất cả các cây trồng trong nhà kính (Raemakers et al., 1997)

Bước 3 Tái sinh cây (ra chồi, ra rễ)

Các lá mầm màu xanh còn non từ phôi soma 14 - 15 ngày tuổi ở các chu kì lặp lại của được cắt thành mảnh nhỏ khoảng 5mm2 và nuôi cấy trong môi trường biệt hóa (COM) gồm MS bổ sung 2% sucrose, 1 mg/l BAP, 0,5 mg/1 IBA và 2µM CuSO4 để cảm ứng sự tạo thành chồi đỉnh trực tiếp Một tháng sau khi nuôi cấy, chồi đỉnh được tạo ra được chuyển sang môi trường kéo dài chồi gồm MS bổ sung 2% sucrose, 0,4 mg/1 BAP (Nguyễn Văn Đồng và cs, 2014) và 2µM CuSO4 để tạo cây con Tất cả môi trường đều được làm đặc với 0,6% agar, pH 5,7 và khử trùng ở

121oC trong 15 phút, rồi đặt ở 25 - 28oC với quang chu kì là 16h Các cây con được tạo ra làm quen với khí hậu dần bằng cách trồng trong bầu cát hoặc giá thể đặt trong nhà kính (Hankoua et al., 2005; Zhang et al., 2001)

Môi trường COM bổ sung AgNO3 được sử dụng để đánh giá hiệu quả của AgNO3 Sự phát triển của chồi ban đầu và chồi tái sinh được tách ra từ mảnh mẫu

và chuyển lên môi trường kéo dài chồi Trong thí nghiệm này, ảnh hưởng của

AgNO3 lên chồi ban đầu để tạo ra sự kéo dài chồi được đánh giá sau 4 tuần Các chồi được chuyển lên CBM để tạo rễ và sinh trưởng tiếp (Zhang et al., 2001)

Để cảm ứng rễ, các mô sẹo này được chuyển lên môi trường MS có chứa 1

μM naphthalenacetic acid (NAA) và đặt ở quang chu kì 16h (Tessy et al., 2001) hoặc các chồi dài 1 - 2cm được tái sinh từ chồi bên hoặc từ mô phân sinh được tách

ra từ chồi bên được chuyển lên môi trường MS không hormone bổ sung 3% sucrose Cây con được duy trì trên môi trường MS2 Khi chồi đạt 5 - 6cm và có hệ thống rễ phát triển tốt, cây được chuyển ra đất bằng cách rửa thạch ở rễ và đặt dưới nước máy trong một hộp Magenta mở để trong 3 - 4 ngày Chúng trồng trong chậu hỗn hợp 50% mùn và 50% cát và được chuyển tới nhà kính Trong 2 tuần đầu, chúng được phủ nylon để tăng độ ẩm (Konan et al., 1997), hoặc duy trì độ ẩm tương đối 90 - 100% trong buồng sinh trưởng ở 26 - 28◦C 7 - 10 ngày sau, cây được chuyển ra nhà kính (Taylor et al., 2001)

Ở Việt Nam, tái sinh cây sắn được sử dụng bằng phương pháp giâm hom truyền thống với nguồn nguyên liệu là các đoạn thân sắn 15 - 20 cm, mang từ 6 - 8 đốt

1.2.3 Các nghiên cứu quy trình chuyển gen ở cây sắn

Công nghệ biến đổi gen cho phép những tính trạng có lợi được chuyển từ một giống sắn này tới giống sắn khác và từ họ hàng hoang dại, vượt qua ranh giới loài

và các vấn đề về thụ phấn chéo và giao phối cận huyết Ngoài ra, chuyển vật chất di truyền từ các nguồn ngoại lai như virus cho chiến lược kháng tác nhân gây sâu, bệnh, cải thiện năng suất có thể được phát triển và triển khai mang lại lợi nhuận cho nông dân trồng sắn Chuyển gen vào cây sắn đã được nghiên cứu cách đây khoảng

30 năm bằng cách sử dụng A tumefaciens hoặc súng bắn gen, theo hai xu hướng là

chuyển các gen chỉ thị chọn lọc và chuyển các gen có giá trị trong nông nghiệp (Paul et al., 2016;Chavarriaga-Aguirre et al., 2016)

Những cấu trúc phôi đa bào và phôi thứ cấp có thể được tạo ra từ các tế bào mầm (Raemakers et al., 1993), đã được sử dụng làm mục tiêu cho chuyển gen khi chương trình kỹ thuật di truyền của sắn được bắt đầu vào đầu những năm 1990 Sau một thời gian thất bại, đã có bằng chứng cho việc tạo phôi và thực vật chuyển gen

lần đầu tiên được đưa ra vào năm 1994 (Sarria et al., 1995) Tiếp theo là bước đột

phá trong tái sinh cây từ hệ thống phôi, tạo cây sắn biến đổi gen biểu hiện uidA (Li

et al., 1996) và gen chỉ thị luciferine (LUC) (Raemakers et al., 1996)

Tại thời điểm 2004, bốn hệ thống chuyển gen được sử dụng để tạo thực vật chuyển gen (hình 1.4)

Hình 1.4 Sơ đồ bốn hệ thống chuyển gen vào cây sắn (Nguồn: Taylor et al., 2004)

Tất cả bốn hệ thống chuyển gen đều phụ thuộc vào tạo mô phôi từ mẫu thùy lá

in vitro, nhưng khác nhau về kĩ thuật và cách phối hợp với các hệ thống chuyển gen

Vật liệu chuyển gen cũng có thể là lá mầm màu xanh từ phôi soma trưởng

thành 30 - 60 ngày tuổi (Li et al., 1996; Arias-Garzon, 1997), hoặc chồi phụ (Li et al., 1996) hoặc tế bào trần (Raemakers et al., 1997)

Trong trường hợp đầu tiên, mô sẹo tơi (FEC) được tạo ra từ cấu trúc phôi soma, tương tự như các tế bào toàn năng được tạo ra từ phôi hữu tính ở ngũ cốc như đậu tương (Taylor et al., 1995; Nguyễn Văn Đồng và cs, 2014) Phôi soma trưởng thành được tạo ra từ các đơn vị phôi có kích thước dưới mm và cây tái sinh trên môi trường có chứa cytokinin FEC và huyền phù tiền phôi được tạo ra từ đó, đã được

sử dụng thành công làm mô mục tiêu chuyển gen nhờ súng gen (Raemakers et al.,

1996; Taylor et al., 2001) và Agrobacterium tumefaciens (Zhang et al., 2000)

Mô phôi chưa biệt hóa được sử dụng cho chuyển gen và tái sinh cây biến đổi gen ở sắn Sự tạo thành callus tơi tiền phôi ở 14 giống sắn khác nhau về địa lý, 11 giống đã tạo huyền phù tế bào tiền phôi Tái sinh 8 giống có hiệu quả khác biệt đáng

kể trong đó cv TMS 60.444 và Line 2 từ Zimbabwe đáp ứng tốt nhất Mô ở các giống còn lại tồn tại ở các giai đoạn hình cầu và chùy cho thấy cần phải nghiên cứu thêm để tái sinh cây hoàn thiện (Taylor et al., 2001) Chetty et al.( 2013) và Nyaboga et al (2013) khắc phục một số hạn chế như FEC chất lượng thấp, thời gian sinh trưởng trên môi trường chọn lọc, sự sàng lọc tạo FEC mới từ mô sẹo không phôi Các nghiên cứu của Ma và Xu (2015) cho thấy hiệu quả chuyển gen vào FEC không cao, do đó, SEDC được sử dụng thay thế FEC (Ntui et al 2015) Trong phương pháp thứ hai, phôi soma (được tạo ra từ thùy lá) trưởng thành

và tạo lá mầm xanh Sau khi được tách khỏi phôi, cây con được tái sinh qua sự phát sinh cơ quan chồi từ bề mặt cắt của các cơ quan lá

Các báo cáo ban đầu về cây biến đổi gen xác nhận rằng cây chuyển gen có thể

được tạo ra bởi gây nhiễm A tumefaciens vào mảnh lá mầm (Li et al., 1996) hoặc

súng bắn gen vào các mô sẹo đã hình thành lá mầm (Zhang et al., 2000; Taylor et al., 2004)

Các lá mầm được tiền nuôi cấy trên môi trường MS8 trong 2 - 3 ngày dưới điều kiện 300 µE m–2s–1 ở 25 - 28oC trước khi biến nạp với Agrobacterium (Sarria

et al., 2000) Rồi các mô này được chuyển tới môi trường MS chứa 8mg/l 2,4-D, 75

mg l paromomycin và 500 mg l carbenicillin để ức chế Agrobacterium và để chọn

lọc Phôi soma được sinh trưởng trong chu kì quang 12h/ngày, 50µmol photons/m2/s ở 28oC Các cụm phôi soma được tạo thành sau 4 tuần nuôi cấy và được chuyển lên môi trường tái sinh sắn chứa kháng sinh chọn lọc trong 4 tuần Sau khi nảy mầm, các cây con được chuyển lên môi trường vi nhân giống (MS bổ sung 2% (w/v) sucrose, 0,04 mg/l BAP, 0,05 mg/l GA, 0,02 mg/l naphthaleneacetic acid (NAA), 1 mg/L thiamine-HCl, 100 mg/l myo-inositol, pH 5,7) không có kháng sinh

để cảm ứng rễ (Ihemere et al., 2006)

Gần đây, thêm hai quy trình tạo cây sắn chuyển gen được công bố Trong hai

trường hợp này, A tumefaciens được sử dụng để đưa trực tiếp gen vào cấu trúc của

phôi được tạo ra bởi các thùy lá Điều này có thể xảy ra bằng cách chuyển trực tiếp vào mẫu thùy lá để tạo ra phôi chuyển gen sơ cấp (Arias-Garzon et al., 1997) hoặc bằng cách đồng nuôi cấy với phôi thứ cấp vốn được nhân lên nhanh chóng từ tái sinh phôi đầu tiên (Sarria et al., 2000; Siritunga và Sayer, 2003) Nuôi cấy tiếp theo trên môi trường chọn lọc đảm bảo chỉ tăng sinh mô chuyển gen, sau đó phục hồi phôi trưởng thành và nảy mầm để tạo cây hoàn chỉnh Sau khi phân tích 75 dòng

cây chuyển gen, hiệu quả của chuyển gen bởi Agrobacterium chiếm 50% trong khi

sử dụng súng bắn gen chỉ đạt hiệu quả 10%

Với vật liệu là tế bào trần tách từ phôi soma, sau chuyển gen không tái sinh thành cây Các thí nghiệm với tế bào trần của FEC đã được tiến hành (Ma và Xu, 2015) Tuy nhiên, hoạt tính chuyển LUC của các tế bào trần này cao hơn tế bào trần được tách từ phôi soma thứ cấp 6 tuần sau khi sốc điện, xuất hiện các chấm LUC (Raemakers et al., 1997)

1.2.4 Tạo cây sắn chuyển gen tăng cường hàm lượng tinh bột

Có 2 hướng chính để cải thiện hàm lượng tinh bột là (1) tăng tích lũy tinh bột đồng thời với (2) giảm phân giải tinh bột Các nghiên cứu của Huang et al (2013) trên cây sắn đã chỉ ra hoạt tính enzim SPS ở lá sắn và sự tổng hợp Susy cao nhất vào tháng 8, tuy nhiên sự phân giải của Susy theo đường cong parabol; hoạt tính enzim AGPase ở củ sắn tăng rồi giảm theo đường cong có 1 đỉnh, hoạt tính của enzim SSS trong củ giảm trong khi hoạt tính enzim SBE ổn định; amylose, amylopectin và tinh bột tổng số của củ sắn tươi tăng đều đặn trong suốt thời gian

sinh trưởng

1.2.4.1 Tạo cây sắn chuyển gen tăng cường tích lũy tinh bột

Nâng cao hàm lượng tinh bột của cây trồng cho phép tinh bột được sản xuất với giá rẻ hơn trong công nghiệp, cho phép cạnh tranh hiệu quả hơn với các sản phẩm thay thế phi sinh học

Có ba chiến lược chính để tăng hàm lượng tinh bột lưu trữ bằng cách biến đổi quá trình tổng hợp tinh bột: tăng chuyển hóa sucrose, tăng hoạt tính enzim SS, BE, DBE, AGPase và tăng vận chuyển cơ chất (Andrew, 2003) Giảm phân giải tinh bột bằng ức chế các enzim phân giải tinh bột (Derde et al., 2012; Zeeman, 2010)

* Tăng hoạt tính enzim AGPase

Nghiên cứu đầu tiên về tăng hoạt tính AGPase ở thực vật được thực hiện ở cây

khoai tây qua biểu hiện của glgC16 dưới sự kiểm soát của promoter 35S Stark et al (1992) đã công bố sản phẩm của glgC16 trong lạp thể và củ của các dòng chuyển

gen tích lũy tinh bột nhiều hơn củ của cây không chuyển gen mặc dù không có sự liên hệ giữa mức tinh bột và hoạt tính AGPase ở các dòng khác nhau Tăng sản

lượng tinh bột trong củ chỉ xảy ra khi gen glgC16 được biểu hiện trong rễ củ được điều khiển bởi promoter patatin Khi gen glgC16 biểu hiện ở tất cả các mô thì sẽ

không tăng sản lượng tinh bột (Stark et al., 1992) Sự cần thiết phải biến đổi gen

glgC của vi khuẩn để tăng sản lượng tinh bột xuất phát từ thực tế là AGPase được

điều hòa bởi các chất trao đổi khác với AGPase thực vật Trong khi đó vị trí đột biến đặc hiệu Gly336 thành Asp loại bỏ điều hòa ngược bởi FBP, nó làm giảm hoạt tính AGPase so với không đột biến (Kumar et al., 1989) Vị trí đột biến đặc hiệu thứ

2 Lys296 thành Glu cần thiết để tăng cường hoạt tính của AGPase Đột biến kép K296E/G336D (Lys296Glu/Gly336Asp) của AGPase vi khuẩn làm giảm điều hòa

dị lập thể và có hoạt tính tương tự enzim vi khuẩn ban đầu (Kumar et al., 1989) Giả

thiết rằng sự tạo ADP-glucose được tăng cường do đột biến kép gen glgC tạo ra sự

thiếu hụt chất điều hòa dị lập thể và hướng tới đích là rễ và amyloplast sẽ làm tăng sản lượng tinh bột trong củ sắn (Stark et al., 1992)

Sự biểu hiện của AGPase ngoại lai (của E coli) được sử dụng ở các cây lúa

(Nagai et al., 2009), ngô (Wang et al., 2007) hoặc sắn (Ihemere et al., 2006) Trong các trường hợp này, hoạt tính AGPase trong hạt được tăng cường dẫn đến tăng sinh khối, nhưng không tăng hàm lượng tinh bột đơn vị khối lượng tươi

Ở củ sắn chuyển gen, hoạt tính AGPase khi có mặt phosphate vô cơ cao hơn

so với đối chứng 7 - 8 lần Mặc dù không có sự tăng hàm lượng tinh bột củ (khối

lượng tươi), nhưng năng suất rễ tổng số cao gấp hai đến ba lần so với các dòng biến đổi gen trong điều kiện tăng trưởng được kiểm soát (Ihemere et al., 2006) Nhóm

nhà nghiên cứu này đã tạo ra cây chuyển gen biểu hiện gen glgC E.coli đã bị biến

đổi (G336D) Các cây này có hoạt tính AGPase gần như cao gấp đôi, sinh khối rễ và

bộ phận trên mặt đất (thân, lá) lớn gấp 2 lần so với cây ban đầu Các nhà nghiên cứu này cho rằng sự tạo thành sinh khối phía trên mặt đất được tăng cường thể hiện sự giải phóng ức chế ngược ở quang hợp (sự tích luỹ chất khô), tương tự như khi biểu

hiện gen glgC ở củ khoai tây (Stark et al., 1992) và nội nhũ lúa mì (Smidansky et

al., 2002) và nội nhũ lúa (Smidansky et al., 2002)

Qua điều hòa tăng sinh tổng hợp tinh bột bằng cách biểu hiện một phiên bản

sửa đổi của gen glgC E coli dưới sự kiểm soát của promoter patatin đặc hiệu từ khoai tây (Lloyd et al., 1999; Ihemere et al., 2003) nhận thấy glgC mã hóa AGPase

- bước giới hạn tốc độ trong sinh tổng hợp tinh bột sắn Bảy cây sắn chuyển gen đều tăng hoạt tính AGPase hơn 65% so với cây đối chứng Quan trọng nhất, khi trồng trong nhà kính, sinh khối thân và rễ tăng đáng kể dẫn đến tích lũy gần như gấp đôi khối lượng tinh bột khô so với cây không chuyển gen (Taylor et al., 2004)

Việc biến đổi một mình AGPase có thể không có đạt được kết quả mong muốn

tăng tinh bột trong các cơ quan dự trữ (Zeeman, 2010)

* Tăng nguồn tiền chất tinh bột cho amyloplast

Như đã đề cập đến, tổng hợp tinh bột dự trữ cần ATP và bộ khung carbon từ tế bào chất Geigenberger et al (2001) đã cung cấp bằng chứng là sự tăng nguồn cung cấp ATP cho lạp thể trong củ khoai tây có thể là chiến lược để tăng hàm lượng tinh bột trong củ, vì vậy, sự biểu hiện gen ngoại lai ATP/ADP transporter của

Arabidopsis ở củ khoai tây chuyển gen dưới sự kiểm soát của 35S promoter CMV

đã tích lũy ADPG nhiều gấp 2 lần và hàm lượng tinh bột / gram khối lượng tươi nhiều hơn so với đối chứng từ 16 đến 36% Cây chuyển gen kép biểu hiện đồng thời

GPT cây đậu và ATP/ADP transporter Arabidopsis đã tăng cường năng suất củ và

hàm lượng tinh bột, tóm lại, các dữ liệu đã chỉ ra rằng cả ATP/ADP và GPT cùng kiểm soát hàm lượng tinh bột và năng suất củ có thể là do cơ chất đồng giới hạn

(ATP và hexose-P) cung cấp AGP Các bằng chứng đã chỉ ra rằng sự tăng cung cấp ATP cho lục lạp là chiến lược tăng hàm lượng tinh bột (Regierer et al., 2002) Điều hòa sự biểu hiện adenylate kinase lục lạp, enzim xúc tác chuyển hóa giữa ATP với AMP và ADP, làm tăng ADPG và hàm lượng tinh bột trong củ khoai tây Cho đến nay, hàm lượng tinh bột tăng gấp 2 lần là công bố có giá trị cao nhất

* Tăng cung cấp sucrose cho tế bào dị dưỡng

Scofield et al (2002) công bố sự ức chế chất vận chuyển sucrose cây lúa OsSUT1 dẫn tới làm suy yếu quá trình vào chắc của hạt, khối lượng cuối cùng của hạt bị giảm Hướng tới đánh giá tiềm năng cải thiện sức chứa sucrose được hấp thu dựa vào năng suất và chất lượng hạt lúa mỳ, Weichert et al (2010) tạo ra cây lúa

mỳ chuyển gen biểu hiện gen ngoại lai vận chuyển sucrose từ lúa mạch HvSUT1 dưới sự kiểm soát của promoter nội nhũ đặc hiệu Để đánh giá liệu có thể cải thiện hiệu suất ở cây khoai tây bởi sự biểu hiện chất vận chuyển sucrose ngoại lai, Leggewie et al (2003) đã tạo ra cây khoai tây chuyển gen biểu hiện gen ngoại lai chất vận chuyển sucrose của spinach dưới sự kiểm soát của promoter 35S Các cây này tạo củ với mức hàm lượng tinh bột và năng suất giống cây WT Vì vậy, các dữ liệu thu được ở cả cây một và hai lá mầm cho thấy điều hòa tăng vận chuyển sucrose không phải là chiến lược thỏa đáng để tăng hàm lượng tinh bột ở các mô dị dưỡng

* Tăng cường phân giải sucrose bên trong tế bào dị dưỡng

Có nhiều nghiên cứu thành công về chuyển hóa sucrose – tinh bột đã tập trung vào tăng cường hoạt tính của SuSy (sucrose synthase) Thí nghiệm đầu tiên tăng hoạt tính SuSy được thực hiện ở khoai tây qua biểu hiện của StSUS4 dưới sự kiểm soát của promoter 35S Baroja-Fernández et al (2009) công bố UDPG, ADPG và hàm lượng tinh bột ở củ biểu hiện gen ngoại lai SuSy cao hơn của cây WT Hơn nữa, năng suất tinh bột ở cây chuyển gen SuSy cao hơn cây WT ở trong điều kiện nhà kính và đồng ruộng (Baroja-Fernández et al., 2009) Hơn nữa, chúng làm giảm hoạt tính của invertase, phù hợp với các nghiên cứu trước đây làm giảm hoạt tính SuSy sẽ làm giảm mức tinh bột và tăng hoạt tính invertase (Zrenner et al., 1995)

cho thấy sự cân bằng giữa con đường chuyển hóa trung gian qua sucrose và qua invertase là yếu tố quyết định tới sự tích lũy tinh bột ở củ khoai tây Nghiên cứu gần

nhất của Li et al (2013) đã tạo ra cây chuyển gen biểu hiện gen StSUS4 của ngô dưới sự kiểm soát của promoter UBI 5 dòng cây chuyển gen có hoạt tính SuSy và

hàm lượng ADPG cao, hàm lương tinh bột tăng 10% so với hạt WT ở giai đoạn

chín Hơn nữa, hạt có biểu hiện StSUS4 chứa cân bằng amylose/amylopectin cao

hơn ở hạt WT Nhìn chung, các dữ liệu này đã chỉ ra rằng sự tăng hoạt tính SuSy là chiến lược hữu ích cho tăng tích lũy tinh bột và tăng năng suất ở các cơ quan dự trữ của cả cây một và hai lá mầm

* Tăng cường sự biểu hiện của starch synthase

Dựa trên các nghiên cứu về nhiệt độ bất hoạt SS ở nội nhũ lúa mì, Keeling et

al (1993) cho thấy hoạt tính xúc tác cực đại của SS liên quan chặt chẽ với dòng trao đổi thông qua tổng hợp tinh bột ở nhiều cơ quan dự trữ đã chỉ ra rằng SS đóng vai trò chính trong điều hòa tổng hợp tinh bột, đó cũng là mục tiêu có giá trị để tạo cây chuyển gen có hàm lượng tinh bột cao Tuy nhiên, sự biểu hiện gen SS ngoại lai làm tăng tích lũy tinh bột rất khó khăn Điều này là do sự có mặt của các SS trong cây tương tác với nhau trong phức hệ protein và thể hiện vai trò đặc hiệu trong cấu trúc cuối cùng của hạt tinh bột (Hennen-Bierwagen et al., 2008) Hơn nữa, tinh bột ở củ chuyển gen đã bị thay đổi đặc tính cấu trúc (Shewmaker et al., 1994) Đột biến

SSIV T-DNA tích lũy chỉ 1 hạt tinh bột lớn ở lục lạp Arabidopsis (Roldán et al., 2007) Đột biến kép TDNA SSIII/SSIV ở Arabidopsis tích lũy rất ít tinh bột, tất cả

các dữ liệu này đã chỉ ra rằng SSIV đóng vai trò then chốt trong quá trình khởi đầu hạt tinh bột và trong tích lũy tinh bột, là yếu tố bắt buộc kiểm soát số lượng hạt tinh bột (Szydlowski et al (2009)) Sự loại bỏ SSIV dẫn đến làm giảm cả số lượng hạt

tinh bột và hàm lượng tinh bột ở lá Arabidopsis cho thấy số lượng hạt tinh bột có

thể là bước điều hòa trong kiểm soát tích lũy tinh bột (D'Hulst và Mérida, 2010) Đáng chú ý là mức tích lũy tinh bột cao trong ngày được huy động hoàn toàn trong đêm ở cây biểu hiện SSIV ngoại lai, cho phép chúng sinh trưởng với tốc độ cao hơn cây WT Sự biểu hiện SSIV ngoại lai đi cùng với sự tăng hoạt tính AGPase và

SuSy, giảm hoạt tính invertase và tăng hàm lượng ADPG Gámez-Arjona et al (2011) giả thiết rằng sự tích lũy tinh bột được tăng cường trong củ biểu hiện SSIV ngoại lai có thể dẫn đến tăng hoạt tính SSIV, AGPase và SuSy, giảm invertase

Hartzenberg (2016) đã gây đột biến SSI ở Solanum tuberosum nhằm thay thế

ADP-glucose (nguyên liệu tổng hợp tinh bột trong lục lạp) bởi UDP-ADP-glucose (được sử dụng để tổng hợp tinh bột và dự trữ tinh bột trong tế bào chất), góp phần thúc đẩy vận chuyển sản phẩm quang hợp được thuận lợi

1.2.4.2 Tạo cây chuyển gen ức chế sự phân hủy tinh bột

Bằng chứng quan trọng đã chỉ ra tổng hợp và phân hủy tinh bột đồng thời xảy

ra ở các tế bào dị dưỡng tích lũy tinh bột Như vậy, sự tích lũy tinh bột ở các mô dị dưỡng với sự quay vòng tinh bột là kết quả của sự cân bằng giữa phân giải và tổng hợp tinh bột (Baroja-Fernández et al., 2003) Kết quả, điều hòa giảm chức năng phân hủy tinh bột sẽ là phương tiện hữu hiệu trong việc làm tăng hàm lượng tinh bột ở cơ quan dị dưỡng α-amylase đóng vai trò trung tâm trong phân hủy tinh bột nội nhũ Nói cách khác, gen mã hóa glucan water dikinases (GWD) - tham gia quá trình phosphoryl hóa tinh bột cần thiết cho amylase phân hủy trung gian - được biểu hiện ở các cơ quan dự trữ tinh bột Gần đây, Ral et al (2012) cho biết điều hòa giảm RNAi trung gian của GWD trong nội nhũ lúa mì dưới sự kiểm soát của promoter nội nhũ đặc hiệu dẫn đến sự tăng năng suất hạt đáng kể nhờ sự tăng khối lượng hạt,

số nhánh /khóm, số nhánh/bông, số hạt/nhánh Những thay đổi này không đồng thời

do sự thay đổi tỉ lệ % tinh bột/khối lượng khô tổng số, có thể so sánh với cây chuyển gen mã AGPase Nghiên cứu của Ral et al (2012) cho thấy cơ chế tăng sinh khối ở lúa mỳ là ứng dụng tiềm năng đối với các cây trồng khác Sự ức chế hoạt động của gen α-amylase đã cải thiện chất lượng hạt gạo khi trồng cây trong điều kiện nhiệt độ cao (Hakata et al., 2012)

1.3 Tinh bột v quá trình tạo tinh bột ở cây có củ

1.3.1 Giới thiệu về tinh bột

Tinh bột là dạng dự trữ carbon quan trọng nhất ở thực vật (Martin và Smith, 1995) Ước tính có khoảng 2.500 tấn tinh bột được thu hoạch hàng năm từ hạt ngũ

cốc, thân củ và rễ củ (FAO, 2013) Ở thực vật bậc cao, tinh bột được tổng hợp trong plastid của cả tế bào quang hợp và không quang hợp, ở dạng tạm thời hoặc dạng dự trữ lâu dài của cơ thể Tinh bột gồm 2 loại polyme khác nhau của glucose là amylose và amylopectin (Martin và Smith, 1995), được sắp xếp trong các hạt tinh bột có không gian ba chiều và cấu trúc bán tinh thể Amylose được tạo thành bởi các mạch thẳng, mỗi mạch gồm 1.000 gốc glucose liên kết với nhau bởi liên kết α (1,4) Amylose (chiếm 30% tinh bột) bị phân nhánh ở mức độ thấp (xấp xỉ 1 nhánh 1000 gốc) bởi liên kết 1,6 (Martin và Smith, 1995) Amylopectin (chiếm 70% tinh bột) gồm các glucan phân nhánh có khối lượng phân tử ước tính 107 và

109 Daltons (Buléon et al., 1998)

Tinh bột sắn được tích lũy trong amyloplast của rễ củ Hàm lượng tinh bột của

củ sắn chiếm 74 - 85% khối lượng khô (Munyikwa et al., 1997) Các hạt tinh bột sắn có hình tròn, phẳng ở một bên, có kích thước 5 - 40 μm (Munyikwa et al.,

1997, Kim et al., 2011) Nghiên cứu hạt tinh bột trong 18 tháng liên tục cho thấy hạt tinh bột sắn chỉ sinh trưởng trong 6 tháng, sau đó dừng sinh trưởng (Moorthy,

Ramanujan, 1986) Tinh bột sắn chứa khoảng 14 - 24% amylose (Kawabata et al.,

1984) Tinh bột sắn chủ yếu là loại A, có đặc tính điển hình của tinh bột ngũ cốc,

có đặc trưng bởi xoắn kép đóng gói chặt chẽ hơn so với sắp xếp mở trong kiểu B Tinh bột sắn cũng chứa 0,08% - 1,54% chất béo thô, 0,03% - 0,6% protein thô và

0,75% - 4% phospho (Munyikwa et al., 1997)

1.3.2 Cơ chế tổng hợp tinh bột

Tinh bột được tổng hợp trong lục lạp để lưu trữ tạm thời như một trong những sản phẩm ổn định cuối cùng của quang hợp, được tổng hợp trong các amyloplast của các phần không quang hợp của cây - hạt, rễ củ (thân ngầm) để lưu trữ lâu dài (Martin và Smith, 1995)

Bước 1 Sự tạo thành ADP-glucose - nguyên liệu của sinh tổng hợp tinh bột

Dù ở vị trí lá hay cơ quan dự trữ, amylose và amylopectin đều sử dụng nguyên liệu là ADP-glucose (ADPG), vốn được tổng hợp từ glucose-1-phosphate và ATP

trong phản ứng, được xúc tác không thuận nghịch bởi AGPase (ADP-glucose pyrophosphorylase) và giải phóng pyrophosphate (Schünemann et al., 1993) Đây là bước quyết định cho tổng hợp tinh bột

Thực tế cho thấy chỉ AGPase xúc tác cho quá trình tổng hợp ADPG liên quan đến sinh tổng hợp tinh bột trong cây Tuy nhiên, sucrose synthase (Susy) cũng có thể tạo ra ADPG (Baroja-Fernández et al., 2003)

Bước 2-1 Sự tạo thành liên kết α (1-4) glucoside (tạo mạch thẳng) trong amylose và amylopectin

Trong bước tiếp theo của sinh tổng hợp tinh bột, starch synthase (SS) xúc tác tổng hợp liên kết 1-4 tại đầu không khử của chuỗi glucan có sẵn phần glucosyl của ADP-glucose, làm giải phóng ADP Một báo cáo cho thấy UDP-glucose được sử dụng làm tiền chất để chuyển nhóm glucose (Moreno et al., 1986) Các phân tử glucose trong tinh bột được kết nối sơ cấp bởi liên kết α (1-4)-glycosid Theo cách này chuỗi glucose dài được tổng hợp, thậm chí được phân nhánh bởi liên kết α (1-6) glycosid Phân tử tinh bột phân nhánh chứa nhiều gốc glucose cuối cùng ở chỗ phân

tử tinh bột có thể được kéo dài (Erwin et al., 2011) (Hình 1.5)

Bước 2-2 Sự tạo thành liên kết α (1-6) glucoside (tạo mạch nhánh) trong amylopectin

Sự phân nhánh 1-6 trong polymer tinh bột được tạo bởi SBE (starch branching enzyme), thủy phân liên kết l-4 trong một mạch rồi xúc tác sự tạo thành liên kết 1-6 giữa đầu khử của chuỗi glucan bị cắt và gốc glucose khác, có thể là một gốc từ chuỗi bị thủy phân Việc phân nhánh của amylopectin xảy ra đồng thời với quá trình kéo dài chuỗi Ở độ dài chuỗi nhất định (khoảng 20 gốc glucan), chuỗi polysaccharide được phân cắt ở liên kết α (1,4) glycosid và đoạn ngắn polysaccharide tách ra được nối nhờ một liên kết α (1,6) mới được tạo thành với chuỗi bên cạnh Các chuỗi này được kéo dài hơn bởi SS (starch synthase) đến tận khi nhánh mới phát triển (Erwin et al., 2011) Glucose-1-phosphate và ATP là cơ chất của AGPase Sản phẩm ADP-glucose được sử dụng bởi SS để kéo dài chuỗi

amylose có sẵn nhờ liên kết α (1,4) ở đầu không khử SBE tái sắp xếp chuỗi amylose qua liên kết α (1,6)

Hình 1.5 Các phản ứng sinh tổng hợp tinh bột ( Nguồn: Erwin et al., 2011)

PPi - inorganic pyrophosphate; residue – gốc

1.3.3 Các enzim và gen liên quan tích luỹ tinh bột

Tinh bột thực vật gồm hai loại polymer là amylose và amylopectine, được tổng hợp từ nguyên liệu là ADP-glucose với sự tham gia của 4 loại enzim: ADP glucose pyrophosphorylase (AGPase; EC 2.7.7.23), starch synthase (SS; EC

2.4.1.21), starch branching enzyme (SBE; EC 2.4.1.28) và starch debranching enzyme (SDBE) (Zeeman et al., 2010)

Hình 1.6 Các enzim tham gia sinh tổng hợp tinh bột (Nguồn: Barbara et al., 2016)

1.3.3.1 Enzim ADP glucose pyrophosphorylase (AGPase) và gen mã hóa AGPase

ADP glucose pyrophosphorylase (AGPase) là enzim kiểm soát quá trình tổng hợp glycogen ở vi khuẩn và tổng hợp tinh bột ở thực vật

AGPase ở E.coli có hoạt tính cao hơn hàng trăm lần so với ở thực vật Các

AGPase ở nhiều loài khác nhau về cấu trúc, tốc độ xúc tác và điều hoà dị lập thể AGPase vi khuẩn là homodimer (Kleczkowski et al., 1993) Còn AGPase thực vật

là một heterotetramer α2β2 khoảng 210 kD, gồm 2 chuỗi polypeptide cấu trúc nên

2 phần dưới đơn vị lớn (large subunit - LS) 60 kDa và 2 phần dưới đơn vị nhỏ (small subunit – SS) 51 - 54 kDa (Lin et al., 1988; Martin và Smith, 1995) Nhiều dạng đồng phân của của các phần dưới đơn vị này được tìm thấy ở thực vật (Martin

và Smith, 1995)

AGPase vi khuẩn là sản phẩm đơn gen (glgC) AGPase vi khuẩn được điều

hoà bởi các yếu tố khác nhau và khác so với ở thực vật AGPase vi khuẩn được hoạt hoá bởi fructose-1,6 biphosphate (FBP) và bị ức chế bởi adenosin monophosphate