NGHIÊN CỨU TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH TÁCH VÀ DUNG HỢP PROTOPLAST GIỮA CÁC DÒNG KHOAI TÂY DẠI VỚI GIỐNG KHOAI TÂY TRỒNG ATLANTIC PHỤC VỤ CHƯƠNG TRÌNH CHỌN TẠO GIỐNG KHOAI TÂY KHÁNG BỆNH VIRUS VÀ BỆNH MỐC SƯƠNG

Các dòng khoai tây dại có khả năng kháng cao với hầu hết các chủng gây bệnh virus và mốc sương. Do đó, các loài khoai tây dại này như một nguồn cung cấp gen giàu có cho quá trình cải tiến giống khoai tây của các nhà chọn tạo giống và các nhà di truyền học. Tuy nhiên rất khó để lai tạo hữu tính giữa các loài dại (2n = 2x = 24) với khoai tây trồng (2n = 4x = 48) do sự không tương hợp về genom, sự bất thụ trong lai xa… Chính vì thế lai soma bằng dung hợp protoplast là một giải pháp rất hữu hiệu để khắc phục những nhược điểm trên Đối với Việt Nam, công tác chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh vẫn còn nhiều hạn chế, chủ yếu vẫn áp dụng các phương pháp truyền thống, chưa áp dụng các phương pháp CNSH hiện đại, chưa có bộ vật liệu phong phú mang các tính trạng quý như mang gen kháng virus, mốc sương, chống chịu với các stressmôi trường. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình tách và dung hợp protoplast giữa các dòng khoai tây dại với giống khoai tây trồng Atlantic phục vụ chương trình chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh virus và bệnh mốc sương”

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BỆNH MỐC SƯƠNG

Giáo viên hướng dẫn : GS.TS Nguyễn Quang Thạch

KS Hoàng Thị Giang Sinh viên thực hiện : Phạm Thị Ngân

HÀ NỘI - 2011

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực tập cuối khoá tại Phòng thí nghiệm Côngnghệ sinh học khoai tây - Viện sinh học nông nghiệp - Trường đại học nôngnghiệp Hà Nội, tôi đã nhận đước giúp đỡ nhiệt tình, chu đáo của thầy giáo,GS.TS Nguyễn Quang Thạch Thầy đã giúp tôi nâng cao kiến thức, hiểu biếtsâu và rộng hơn về công nghệ sinh học trong nông nghiệp nói riêng và línhvực khác của công nghệ sinh học nói chung Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòngbiết ơn sâu sắc và kính trọng tới thầy

Tôi xin gửi lời biết ơn chân thành tới các cán bộ công tác tại Viện sinhhọc nông nghiệp, đặc biệt là KS Hoàng Thị Giang đã chỉ bảo và tạo điềukiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt thời gian thực tập tại đây

đặc biệt là các thầy cô khoa Công nghệ sinh học đã truyền đạt những kiếnthức vô cùng quý báu cho tôi có nền tảng cơ sở để tôi có thể hoàn thành tốtluận văn này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè tôi, những người luônchia sẻ, động viên, giúp đỡ và góp ý cho tôi trong suốt quá trình thực tập vàhoàn thành bào cáo tốt nghiệp

Hà nội, ngày 25 tháng 5 năm 2011

Sinh viên

Phạm Thị Ngân

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

I Đặt vấn đề 1

II Mục đích và yêu cầu 2

1 Mục đích 2

2 Yêu cầu 2

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu chung về khoai tây 3

1.1.1 Nguồn gốc 3

1.1.2 Phân loại 3

1.1.3 Đặc điểm thực vật học của cây khoai tây 4

1.1.4 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới và trong nước 6

1.2 Tình hình nhiễm bệnh virus ở khoai tây 9

1.2.1 Tình hình nhiễm bệnh vius 9

1.2.2 Tác hại của bệnh virus 11

1.2.3 Tình hình nhiễm bệnh mốc sương ở khoai tây 13

1.3 Các hướng nghiên cứu tạo giống khoai tây 15

1.3.1 Nghiên cứu chuyển gen 15

1.3.2 Nghiên cứu dung hợp tế bào trần 16

1.3 Tạo giống khoai tây bằng dung hợp tế bào trần 21

1.3.1 Khái niệm tế bào trần (protoplast) và con lai soma (somatic hybrid) 23

1.3.2 Quá trình tách, dung hợp, nuôi cấy và tái sinh protoplast 23

1.3.3 Xác định con lai soma 25

PHẦN II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.1 Vật liệu 29

2.1.1 Giống khoai tây Atlantic (Solanum tuberosum cv.Atlantic) 29

2.1.2 Các dòng khoai tây dại 29

2.2 Nội dung, địa điểm và thời gian nghiên cứu 29

2.2.1 Nội dung nghiên cứu 29

2.2.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 31

2.3 Phương pháp nghiên cứu 31

2.3.1 Phương pháp tách protoplast (Theo quy trình của viện JKI – viện 31

2.3.2 Phương pháp đếm protoplast và pha loãng mật độ 32

2.3.3 Phương pháp chuẩn bị hóa chất tách protoplast 33

2.3.5 Phương pháp dung hợp protoplast bằng xung điện 34

2.3.6 Phương pháp chuẩn bị dung dịch dung hợp 34

2.3.7 Phương pháp nuôi cấy và tái sinh protoplast sau khi dung hợp 35

2.3.8 Các chỉ tiêu theo dõi 35

2.3.9 Phuơng pháp xử lý số liệu: 35

PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 Các kết quả tách protoplast 36

3.1.1 Thí nghiệm 1: So sánh khả năng tách protoplast của các kiểu gen khác nhau 36

3.1.2 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi lá cây in vitro đến năng suất và chất lượng tách protoplast của các dòng khoai tây dại và giống Atlantic 39

3.1.3 Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dung dịch Enzyme đến năng suất và chất lượng của protoplast 41

3.2 Các kết quả nuôi cấy protoplast 44

3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy đến sự phân chia và tái sinh của protoplast 44

3.2.2 So sánh ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy đến sự phân chia và tái sinh của protoplast 48

3.3 Các kết quả dung hợp protoplast 54

3.3.1 Tối ưu hóa các thông số của quy trình dung hợp bằng xung điện giữa giống khoai tây Atlantic và dòng khoai tây dại 54

PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 57

4.1 Kết luận 57

4.2 Đề nghị 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

PHỤ LỤC 62

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1: Diện tích, năng suất và sản lượng khoai tây các khu vực trên thế giới năm

2007 6

Bảng 2: Diện tích, năng suất và sản lượng khoai tây ở Việt Nam 9

Bảng 3: Khả năng tách protoplast của các vật liệu nghiên cứu 36

Bảng 4: Ảnh hưởng của tuổi lá cây in vitro đến năng suất và chất lượng protoplast

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 1: Ảnh hưởng của tuổi lá cây in vitro đến năng suất protoplast 41 Biểu đồ 2: : Ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy đến sự phân chia protoplast 46 Biểu đồ 3: Ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy đến sự phân chia và hình thành

microcalli của protoplast 49

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1: Hình ảnh lớp nổi protoplast sau khi li tâm lần 1 37

Hình 2: protoplast của các dòng sau khi tách 38

Hình 3: Mật protoplast của giống Atlantic tách bằng các dung dịch enzym khác nhau 43

Hình 4: Hình ảnh microcallus trên các nền môi trường khác nhau của giống Atlantic 47

Hình 5: Hình ảnh callus của giống Atlantic phân chia trên các nền môi trường 51

Hình 6: Hình ảnh protoplast của giống Atlantic phân chia trên môi trường VKM II 53

Hình 7: Protoplast sau khi xung điện 56

CÁC KÍ TỰ VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU

I Đặt vấn đề

Khoai tây là một loại cây trồng quan trọng của Việt Nam, đặc biệt là đốivới vùng Đồng bằng Sông Hồng Gần đây, do sự biến đổi của khí hậu toàncầu đã làm thay đổi sản xuất cây trồng trên thế giới cũng như ở Việt Nam Sựbiến đổi của khí hậu kéo theo sự xuất hiện của hàng loạt các loại bệnh và dịchhại làm thiệt hại đến năng suất và sản lượng cây trồng nghiêm trọng Để đốiphó với những tác động của sự biến đổi khí hậu toàn cầu trong tương lai,nhiệm vụ cấp thiết đặt ra cho các nhà chọn tạo giống khoai tây là phải tạo racác giống mới không chỉ có năng suất cao, chất lượng tốt mà đồng thời phảichống chịu được với các stress môi trường

Hiện nay, sản xuất khoai tây trên thế giới nói chung và của Việt Nam nóiriêng đang phải đối mặt với 2 loại bệnh virus, trong đó PVY là bệnh nguy hiểm

hơn cả và bệnh mốc sương (do nấm Phytophthora infestans) Chiến lược sử dụng

các loại thuốc bảo vệ thực vật để phòng trừ bệnh virus PVY đã không thành công(Jones và cộng sự, 1982; De Bokx và Van der Want, 1987; Valkolen và cộng sự,

1996) Việc trồng các củ giống vị nhiễm virus PVY (potato Y potyvirus) hoặc PLRV (potato leafroll luteovirus) đã làm giảm năng suất tới 80% (Banttari và

cộng sự, 1993) Bên cạnh đó, bệnh mốc sương cũng được cho là một bệnh hạikhoai tây nghiêm trọng nhất hiện nay trên toàn thế giới (Hammann, 2009;Thieme, 2010) Để phòng trừ bệnh này đã phải mất lượng lớn thuốc bảo vệ thựcvật mỗi năm (mất khoảng 14 lần phun/mỗi vụ) Mỗi năm nước Đức đã phải chi tới

470 EURO/ha để phòng trừ bệnh này bằng thuốc bảo vệ thực vật (Darsow, 2008).Các dòng khoai tây dại có khả năng kháng cao với hầu hết các chủnggây bệnh virus và mốc sương Do đó, các loài khoai tây dại này như mộtnguồn cung cấp gen giàu có cho quá trình cải tiến giống khoai tây của các nhàchọn tạo giống và các nhà di truyền học Tuy nhiên rất khó để lai tạo hữu tính

giữa các loài dại (2n = 2x = 24) với khoai tây trồng (2n = 4x = 48) do sựkhông tương hợp về genom, sự bất thụ trong lai xa… Chính vì thế lai somabằng dung hợp protoplast là một giải pháp rất hữu hiệu để khắc phục nhữngnhược điểm trên

Đối với Việt Nam, công tác chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh vẫn cònnhiều hạn chế, chủ yếu vẫn áp dụng các phương pháp truyền thống, chưa ápdụng các phương pháp CNSH hiện đại, chưa có bộ vật liệu phong phú mangcác tính trạng quý như mang gen kháng virus, mốc sương, chống chịu với cácstressmôi trường

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình tách và dung hợp protoplast giữa các dòng khoai tây dại với giống khoai tây trồng Atlantic phục vụ chương trình chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh virus và bệnh mốc sương”

II Mục đích và yêu cầu

1 Mục đích

Tối ưu hóa quá trình tách và dung hợp tế bào trần của các dòng khoaitây dại và các dòng khoai tây trồng phục vụ chương trình chọn tạo giốngkhoai tây kháng bệnh virus và mốc sương bằng dung hợp tế bào trần

2 Yêu cầu

- Xác định được các thông số tối ưu cho quy trình tách protoplast của

mỗi dòng giống nghiên cứu (nồng độ enzym, tuổi cây in vitro thích hợp để

tách protoplast, …)

- So sánh khả năng tách protoplast của các dòng giống nghiên cứu (mật

độ protoplast, chất lượng protoplast, khả năng phân chia khi nuôi cấy)

- Xác định nền môi trường thích hợp để nuôi cấy

- Xác định được loại môi trường nuôi cấy protoplast thích hợp

- Tối ưu hóa quy trình dung hợp protoplast bằng xung điện giữa dòng

khoai tây dại S tarnii với giống khoai tây Atlantic.

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về khoai tây

1.1.1 Nguồn gốc

Khoai tây là loại cây trồng cổ đại Theo các bằng chứng về khảo cổhọc, lịch sử và thực vật học cho biết trung tâm khởi nguồn cây khoai tâythuộc vùng Nam Mỹ, gần hồ Titicaca giữa ranh giới Peru và Bolivia Ngàynay, nhiều loại khoai tây dại còn tồn tại ở đây, đặc biệt ở dãy Andes (Tạ ThuCúc,2006)[1]

Vào khoảng những năm 1500 cây khoai tây bắt đầu “cuộc hành trìnhtới các châu lục”, từ dãy Andes đi tới các nước Châu Âu, Châu Á

Khoai tây vào Pháp năm 1600 do hai nhà thực vật học người Thụy sỹC.Bauhin và J.Bauhin mang tới và được trồng rộng rãi vào năm 1773 TừChâu Âu khoai tây sang tới Ấn Độ năm 1610, vào Trung Quốc năm 1700 vànăm 1766 vào Nhật Bản Khoai tây đến với Áo, Italia, Đức rồi lan rộng rãi ởcác vùng lãnh thổ Châu Âu vào cuối thế kỷ XVII Khoai tây được trồng trênquy mô lớn vào những năm 1800 và tới khoảng thế kỷ XIX mới thực sự phổbiến trên các châu lục

Ở Việt Nam, khoai tây được người Pháp đưa vào trồng năm 1890 ở một

số vùng: Tú Sơn- Hải Phòng, Trà Lĩnh – Cao Bằng (1907), Thường Tín HàTây Hiện nay, khoai tây được trồng tập trung chủ yếu ở Đồng Bằng SôngHồng, Sapa, Đà Lạt những vùng có khí hậu mát mẻ, ôn hòa…

1.1.2 Phân loại

Khoai tây (Solanum tuberosum L.) thuộc loài S tuberosum, chi

Solanum, họ cà Solanaceae, bộ Solanales, phân lớp Asteridae, lớpMagnoliopsida, ngành Magnoliophyta

Được phân thành Theo J.G.Hawkerkks (1991), khoai tây 18 nhóm,trong đó có 68 loài hoang dại, chỉ có 8 loài trồng trọt, chia thành 4 nhóm chủyếu dựa vào số lượng NST (Tạ Thu Cúc, 2006)[1]

Nhóm 1: Diloids: 2n = 24

1.S.x Ajanhuiri Juz.et Buk

2.S.Gomiocalyx Juz.et Buk

3.S.Stenotomum Juz.et.Buk

4.S.Phureja Juz.et Buk

Trong 4 loài, loài S.Phureja Juz.et Buk có ý nghĩa lớn nhất với trồng trọt

Có một loài là S x curtilobum Juz.et Buk

Đặc điểm: lá thẳng, cứng, cuống nhỏ, đốt dài, tràng hoa to màu tím,đường kính 3 - 3,5cm

1.1.3 Đặc điểm thực vật học của cây khoai tây

Cây khoai tây là cây họ cà, thân thảo, cây hàng năm, có hai lá mầm

Thân.

Thân khoai tây mọc thẳng, đôi khi có cấu tạo zích zắc, có 3-4 cạnh,cao trung bình từ 40-70cm đến 1-1,2m Phụ thuộc vào giống, thời kỳ chămsóc… mà chiều cao cây có thể khác nhau Thân thường có màu xanh hoặcxanh nhạt hay đậm, đôi khi có màu phớt hồng hoặc tím…tùy thuộc vào giống

Lá.

Lá khoai tây tương tự như lá cà chua nhưng có khác ở một số điểm,thuộc lá phức tạp, bản lá to, mọc cánh xẻ lông chim, có 3-4 đôi mọc đối xứngqua trục và một lá lẻ trên cùng thường lớn hơn gọi là lá chét đỉnh Lá khoaitây dài khoảng 10-15cm, mặt lá phẳng hoặc gợn sóng, bản lá thường to hơn lá

cà chua Màu sắc lá phụ thuộc vào giống, thời vụ, điều kiện chăm sóc mà cóthể màu xanh, xanh đậm hoặc xanh nhạt…

Hoa.

Hoa khoai tây thường mọc thành chùm hoa, thuộc hoa lưỡng tính,

có cấu tạo (5:5:5) 5 cánh, 5 nhị, 5 nhụy, cuống ngắn Hoa có nhiều màu sắckhác nhau tùy thuộc giống như: Màu trắng, tím, phớt hồng, vàng hay đỏ

Quả.

Quả thuộc loại quả mọng Hình dạng tròn hoặc trái xoan Khi chínquả màu trắng bạc hoặc phớt hồng, mùi dễ chịu Quả có từ 2-3 ngăn, trong đóchứa nhiều hạt (30-300 hạt)

1.1.4 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới và trong nước

1.1.4.1 Tình hình sản xuất trên thế giới

Vào thế kỷ XIX khoai tây thực sự được trồng phổ biến ở các châu lụcvới khoảng 150 nước Ngày nay, khoai tây được trồng chủ yếu ở khu vựcChâu Á, Châu Âu cho năng suất và sản lượng lớn

Bảng 1: Diện tích, năng suất và sản lượng khoai tây các khu vực

trên thế giới năm 2007

Chỉ tiêu

hoạch (ha)

Năng suất(tấn)

Sản lượng(tấn/ha)

(ha) và khoai tây được trồng ít nhất ở Bắc Mỹ vào khoảng 615.878 (ha) Tuynhiên ở Bắc Mỹ lại cho sản lượng khoai tây lớn nhất đạt 41,2 (tấn/ha) tươngứng với năng suất đứng thứ 3 đạt 25.345.305 (tấn), Châu Á cho năng suấtkhoai tây cao nhất đạt 137.343.664 (tấn), sản lượng khoai tây đứng thứ 2khoảng 17,4 (tấn/ha), với Châu Âu đứng thứ 3 về năng suất và sản lượngtương ứng là 15.682.943 (tấn), 16,3 (tạ/ha)

Theo cuốn “Các loại khoai tây trên thế giới, năm 2005” Khoai tây cósản lượng lớn nhất trong số các loại cây trồng sau lúa gạo, ngô, lúa mỳ Khoaitây tạo ra khối lượng sinh học và năng lượng nhiều hơn bất kỳ một loại câytrồng lương thực nào trên mỗi hecta trong thời gian ngắn Và theo nguồn

FAO on IYP homepage, năm 2006 “Lương thực của tương lai” khi giá lúa

gạo và lúa mỳ tăng lên, lúc này khoai tây được phát hiện như nguồn cây trồnggiàu dinh dưỡng mà chúng ta có thể sử dụng rất rẻ ở các nước đói nghèo trênthế giới

Do đó Khoai tây chính là cây trồng giàu tiềm năng phát triển trongtương lai, với diện tích trồng ngày càng được mở rộng và năng suất, chấtlượng khoai tây ngày càng tăng

Từ năm 1991- 2003 sản lượng khoai tây ở các nước đang phát triểntăng liên tục từ 84,86 triệu tấn (1991) – 152,11 triệu tấn (2003) và tăng đềuhơn so với các nước phát triển mặc dù sản lượng thấp hơn Bởi các nước đangphát triển ngày càng mở rộng diện tích trồng nhưng năng suất không cao, còncác nước phát triển thì diện tích thu dẹp dần, năng suất khá cao do có vốn vàkinh nghiệm trồng trọt Những năm 2005, lần đầu tiên, sản lượng khoai tây ởcác nước đang phát triển vượt qua sản lượng khoai tây ở các nước phát triển.Trong đó Trung Quốc là quốc gia dẫn đầu về sản lượng khoai tây đạt 72 (triệutấn ) năm 2007 và 1/3 lượng khoai tây của thế giới được thu hoạch ở TrungQuốc và Ấn Độ

Ở các nước đang phát triển có diện tích trồng lớn nhưng năng suất kémmột phần là do nguồn giống không đảm bảo chất lượng, củ giống không rõnguồn gốc, dễ bị nhiễm bệnh nhất là bệnh virus sau vài năm trồng Dẫ đến sựthoái hóa củ giống nghiêm trọng ảnh hưởng đến năng suất và chát lượng Dovậy các nhà nghiên cứu đang xây dựng chiến lược sản xuất củ giống sạchbệnh và có phẩm chất tốt phục vụ sản xuất khoai tây thương mại.

1.1.4.2 Tình hình sản xuất khoai tây ở Việt Nam

Ở Việt Nam, khoai tây do người Pháp đưa vào năm 1890, sau đó đượctrồng rộng rãi và chủ yếu tập trung ở lưu vực Đồng Bằng Sông Hồng.Trong vài năm trở lại đây, diện tích và sản lượng khoai tây tại Đồng BằngSông Hồng và một số địa phương khác giảm rõ rệt, nguyên nhân là dothiếu nguồn giống tốt

Vấn đề khó khăn nhất hiện nay đối với ngành sản xuất khoai tây đó làgiống Hiện giống khoai tây ở trong nước mới chỉ đáp ứng 20 đến 25% nhucầu, số còn lại phải nhập khẩu từ Trung Quốc, Hà Lan…

Khoai tây trở thành cây trồng vụ đông quan trọng ở các tỉnh Đồng BằngSông Hồng, tuy nhiên nguồn giống chưa đáp ứng đủ và đảm bảo Giống khoaitây mà người dân sử dụng hầu hết nông tự duy trì từ vụ này sang vụ kháchoặc giống do người dân tự mua không rõ nguồn gốc do vậy mà giống khôngnhững bị thoái hóa mà còn có tỷ lệ nhiễm virus cao từ 54 – 65%, hao hụttrong bảo quản từ 45 – 60% Củ khoai tây trồng chủ yếu bằng con đườngnhân giống vô tính nên tỷ lệ tái nhiễm virus cao Hơn nữa trong điều kiện sảnxuất ở Việt Nam, củ giống lại được bảo quản trong thời gian dài khoảng 9tháng (từ tháng 2 – tháng 10), điều kiện nóng ẩm của mùa hè củ giống bị giàsinh lý nhanh chóng, khi trồng khả năng sinh trưởng kém, hậu quả là năngsuất và chất lượng củ thấp

Việc sản xuất và cung ứng giống khoai tây ở Việt Nam còn nhỏ lẻ, chưa mangtính hệ thống Trước tình hình đó cần xây dưng các chương trình nhân tạo giốngkhoai tây sạch bệnh, có chất lượng và phẩm chất tốt phục vụ bà con nông dân.

Bảng 2: Diện tích, năng suất và sản lượng khoai tây ở Việt Nam

(Cục Khuyến Nông - Khuyến Lâm - Bộ NN&PTNT, 1997).

Năm Diện tích (ha) Năng suất (tấn/ha) Sản lượng (tấn)

1.1.4.3 Giá trị dinh dưỡng của cây khoai tây

Thành phần dinh dưỡng trong củ khoai tây khá phong phú và đa dạngbao gồm tinh bột, đường, protein, gluxit, một số loại vitamin và khoáng chấtkhác, là các yếu tố dinh dưỡng cần thiết cho cơ thể con người Vì vậy mà củkhoai tây được ví như những “túi dinh dưỡng”, với hàm lượng tinh bột rấtcao Vị trí quan trọng của khoai tây được khẳng định hàng đầu ở nhiều nướcchâu Âu (Liên Xô cũ, Hà Lan, Đức), Nam Mỹ và châu Mỹ latinh Mức tiêuthụ khoai tây ở đây đạt bình quân 33 -35 kg/ người/năm Riêng ở Đức, mứctiêu thụ đứng hàng đầu thế giới (140 – 144 kg/người/năm)

1.2 Tình hình nhiễm bệnh virus ở khoai tây

1.2.1 Tình hình nhiễm bệnh vius

Khoai tây là loại cây trồng rất dễ bị tấn công bởi một số tác nhân gây

bệnh: Virus (PVX, PVY, PLRV, LR, S, M, A, PSTVD), vi khuẩn (Ralstonia

solanacearum), nấm (Phytophthora infestans), nhóm ngành giun tròn (bệnh

do tuyến trùng), và một số loại bệnh khác…

Theo Ross (1961), khoai tây là ký chủ của khoảng 33 loài virus Ôngkhẳng định hiện tượng thoái hóa khoai tây là do virus Việc phát hiện này đãchứng minh quan điểm môi trường của H Morsstatt (1925), quan điểm dinhdưỡng và nước của F Merkenschlager (1929) và L V Rozalin (1960) về sựthoái hóa giống là chưa đầy đủ.

Virus xâm nhiễm rộng khắp các vùng trồng khoai tây, tập trung chủyếu ở Andean thuộc Nam Mỹ trung tâm khởi nguyên cây khoai tây (Jones1981; Valkonen 1994)

Năm 1991 Ủy Ban Quốc Tế về phân loại virus (ICTV – InternationalCommittee on Taxonomy of Viruses) đã xây dựng hệ thống dữ liệu về cácnhóm virus gồm đặc điểm của từng nhóm và hệ thống hóa số liệu đo lường(số hóa) các loại virus đó

Với loài S tuberosum phát hiện tác nhân virus gây bệnh chính như sau:

triệu chứng khác nhau Loại virus này gây hại mạnh ở Châu Âu Khả nănggiảm năng suất từ 40-90% Ở Việt Nam khoai tây ít bị nhiễm virus này(Bode 1969)

chính: PVYO gây bệnh quan trọng ở khắp thế giới , PVYN gây ra các vết chếthoại trên gân lá thuốc lá, PVYC ít nguy hiểm, không phổ biến trên thế giới.Bên cạnh đó mới phát hiện ra PVYNTN, PVYNW, PVYZ.PVYNTN Virus Y kếthợp với virus PLRV sẽ gây hại rất nặng ở Châu Âu Khả năng gây giảm năngsuất từ 50-90% Riêng virus Y đặc biệt gây hại nặng ở các vùng trồng khoaitây có khí hậu nóng kèm một vụ lạnh như ở Việt Nam (Vũ Triệu Mân 1986)[2]

Mckay phát hiện ở Eire năm 1932 Trong nhóm này phát hiện có 2 dòng

chính: Dòng A1 cảm ứng phản ứng siêu nhạy ở loài S tuberosum.cv King

Edward, ngược lại dòng A2 thì không (Valkonen et al.1995a) Virus này gây

hại giảm năng suất trên 50% (Bode 1969, Resstman 1970…)

Valkonen et al.(1996) PVX được chia thành 4 nhóm dựa trên phản ứng củagen trội tạo HR: PVX1, PVX2, PVX3, PVX4, ngoài ra mới phát hiệnPVXHB ( Rozendaal 1971) Gây giảm năng suất từ 10-25%

ở Châu Âu và Nam Mỹ, không có sự phân chia thành các nhóm Qua phân

tích Cp (Coat protein) chỉ ra isolate ở Châu Âu có sự cảm ứng HR ở loài S.

tuberosum cv Pentland Dell (Spetz et al 2002)

và gây ra vài triệu chứng lạ Theo Konovalov (1986), Vũ Triệu Mân (1984)cho biết hai giống khoai tây ở Nga đã bị nhiễm virus PVM làm giảm năngsuất tới 60-70%

gây hại ít làm giảm năng suất từ 10-15% thường gây hại khi kết hợp với cácvirus khác

1.2.2 Tác hại của bệnh virus

Virus khoai tây được đánh giá là một tác nhân gây bệnh nguy hiểm,làm giảm đáng kể năng suất và chất lượng củ Bởi bệnh virus có những đặctính sau:

- Là bệnh không chữa được khi đã bị nhiễm Do virus khi xâm nhiễmvào cây trồng chúng không có sự trao đổi chất riêng và độc lập mà phải sửdụng vật chất của ký chủ để nhân lên, tấn công các tế bào khác từ vị trí xâmnhiễm Như vậy, tế bào ký chủ đã làm nhiệm vụ nhân virus lên, nên nếu tácnhân nào ngăn chặn sự tái bản của phân tử virus đồng thời cũng ức chế cácquá trình sinh tổng hợp của ký chủ

- Bệnh virus khoai tây có đặc tính di truyền Ở những cây nhân giống

theo con đường hữu tính, bệnh virus rất ít truyền qua hạt Ngược lại cây nhângiống vô tính, virus có mặt ở mọi tế bào đang sống nên rất dễ lan truyền Khivirus xâm nhiễm vào cây chúng nhân lên và di chuyển theo dòng nhựa luyệntới các bộ phận trong cây, tới tận các củ con Khi đó, một củ mẹ bị nhiễmbệnh sẽ tạo ra một cây bệnh, cây này lại tạo ra các thế hệ củ con bị nhiễmvirus Do vậy, năm này qua năn khác bệnh càng mở rộng, tăng lên nhanhchóng Sự xâm nhiễm virus rất khó phát hiện, diễn ra trong suốt quá trìnhsống của cây.

- Bệnh virus lan truyền qua các vector truyền bệnh và tiếp xúc cơ giới.Tùy từng kiểu truyền bệnh của côn trùng mà virus được truyền ngay hoặc cóthời gian tiềm ẩn trong cơ thể côn trùng kể từ khi trích nạp virus cho tới lúctruyền sang cây mới

Từ những nguyên nhân trên dẫn tới khi khoai tây bị nhiễm virus sẽ gâynên hiện tượng thoái hóa giống Nghĩa là làm giảm dần năng suất gieo trồngcủa củ, biểu hiện củ nhỏ đi về kích thước và trọng lượng, chất lượng củ xấu,hàm lượng dinh dưỡng giảm so với trước, thân lá bị biến dạng làm giảm khảnăng quang hợp Nếu hiện tượng này diễn ra dài có thể dẫn đến tiêu diệthoàn toàn giống khoai tây nào đó Ngoài ra, khi củ giống bị già sinh lý do bảoquản lâu trong điều kiện nóng ẩm cũng dẫn đến hiện tượng thoái hóa củ.Trong đó virus là nguyên nhân chính dẫn tới hiện tượng thoái hóa

Ở Anh khoai tây bị nhiễm virus PLRV, PVY và PVX gây thiệt hạitrung bình từ 30 – 50 triệu pound mỗi năm (Hull 1984)

Khoai tây khi nhiễm virus PLRV làm sản lượng củ bị giảm khoảng 20triệu tấn/ha mỗi năm trên thế giới (Kojima và Lapierre, 1988)

Theo Banttari et al (1993) khi củ khoai tây bị nhiễm virus PVY vàPLRV dẫn tới năng suất giảm 80%

Hiện nay, người trồng khoai tây đã sử dụng quá nhiều lượng thuốc trừsâu, với mục đích tạo ra củ sạch bệnh và kiểm soát côn trùng truyền bệnh (rệp

muội, bọ phấn…) Tuy nhiên, theo kết quả nghiên cứu của Jones et al.(1982),Debok và Vander want (1987), valkonen et al.(1996) cho thấy giải pháp sửdụng thuốc trừ sâu để kiểm soát sự nhân lên của virus là không hiệu quả Do

đó, việc sử dụng thuốc trừ sâu tràn lan không những không cho hiệu quả trừbệnh mà còn làm tăng tính kháng thuốc của côn trùng truyền virus, xuất hiệnnhiều loài mới trong quần thể, hơn nữa còn gây ảnh hưởng tiêu cực đến hệsinh thái nông nghiệp và môi trường sống xung quanh Quan trọng nhất làlượng thuốc còn tồn dư trong củ khoai tây sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng tới sứckhỏe người tiêu dùng

Cho nên hướng đi theo con đường tạo giống khoai tây kháng virus,kháng vector truyền bệnh được xem là giải pháp tối ưu Hướng đi này đã vàđang nhận được sự quan tâm, chú ý của nhiều nhà nghiên cứu nhằm bảo vệcây khoai tây nói riêng và cây trồng nói chung

1.2.3 Tình hình nhiễm bệnh mốc sương ở khoai tây

Bệnh mốc sương (gây ra bởi một loại nấm có tên là Phytophthora

infestans (Mont.) de Bary được thừa nhận là một loại bệnh hại nghiêm

trọng nhất ở khoai tây trên toàn thế giới (Thieme và cộng sự, 2010)[19]

Để phòng trừ bệnh này đã phải mất lượng lớn thuốc bảo vệ thực vật mỗinăm (mất khoảng 14 lần phun/mỗi vụ) Mỗi năm nước Đức đã phải chi tới

470 EURO/mỗi ha để phòng trừ bệnh này bằng thuốc bảo vệ thực vật(Darsow, 2008)

Trước đây, các giống khoai tây có tính kháng cao với bệnh mốc sương đãđược tạo ra bằng phương pháp chuyển nhóm gen R gồm 11 gen trội (R1-11)

từ loài dại S.demissum Lindl Đây là tính kháng đơn gen và kháng với chủng

nấm đặc hiệu Tuy nhiên hiệu quả của các gen này không bền vững so với cácchủng gây bệnh có khả năng thích nghi cực kỳ cao (Fry và Goodwin, 1997)

Có một nhóm gen R khác cũng có tính kháng với một hốn hợp các chủng mốc

sương được phát hiện ở các loài khoai tây dại S pinnatisectum Dun.,

S.bulbocastanum Dun., S.berthaultii Hawkers và S.mochiquense Ochoa Một

chiến lược khác là sử dụng tính kháng về lượng (hoặc tính kháng không đặchiệu), cho phép tồn tại bệnh mốc sương ở một mức độ đủ lớn để tránh áp lựcchọn lọc đối với các chủng bệnh gây hại và ở mức độ đủ nhỏ để hạn chế ảnhhưởng tới năng suất tiêu thụ

Theo Hammann Thilo và cộng sự (2009), tính kháng về lượng được kiểmsoát bởi một số hoặc nhiều gen và được duy trì trong một thời gian dài Cũngcần phải lưu ý thêm là bệnh mốc sương trên lá và mốc sương trên

củ có sự khác nhau (về mức độ) bởi vì bệnh mốc sương trên lá tương quan với

sự thành thục muộn của cây ( late maturity) trong khi ở củ lại không có tính

chất này.

* Nguồn kháng bệnh mốc sương và chiến lược chọn tạo giống:

Loài dại có quan hệ thân thuộc với khoai tây trồng là nguồn gen kháng rấtquan trọng và đã được sử dụng để tạo các con lai soma khác loài trong nhiều

năm nay Tính kháng bệnh mốc sương đã được lấy từ các loài dại Solanum có

nguồn gốc từ trung tâm đa dạng di truyền khoai tây và các loại bệnh của

chúng và theo đó, qua hàng nghìn năm với sự đồng phát triển của P.i Trước

đây, tính kháng bệnh mốc sương cũng đã được khai thác ở những loài khoai

tây dại S demissum, S stoloniferum, S acaule và S chacoense bằng phương

pháp lai truyền thống Để mở rộng phổ kháng tiềm năng, phương pháp laichéo và lai soma đã được sử dụng (Thieme và cộng sự, 1997) với các loài dại

S circaeifolium, S bulbocastanum và S pinnatisectum để khắc phục những

rào cản trong lai hữu tính giữa khoai tây trồng tứ bội với khoai tây dại

Solanum Các con lai khác loài sẽ được lai lại (backcross) một số lần để thích

ứng như với dạng khoai tây trồng

1.3 Các hướng nghiên cứu tạo giống khoai tây

1.3.1 Nghiên cứu chuyển gen

Đã có nhiều công bố về việc chuyển các gen kháng bệnh vào khoai tâybằng công nghệ gen (Harrison, 1992; Fitchen và Beachy, 1993; Wilson, 1993;Baulcombe, 1994;Pierpoint, 1996; Fuchs và cộng sự, 1997; Barker vàWaterhouse, 1999; Solomon-Blachburn và Baker, 2001a) Năm 1990,Monsanto đã công bố tạo được khoai tây chuyển gen kháng được với bệnhvirus Đây là nỗ lực đầu tiên trong việc chuyển gen tổng hợp vỏ bọc proteincủa virus PVX và PVY vào khoai tây trồng (Villalobos và Rivera, 1997).

Sau này, hàng loạt các công bố nghiên cứu về chuyển tính khángbệnh vào khoai tây trồng bằng công nghệ gen như Smith và cộng sự (1997);Voinet và cộng sự (2000); Li và Ding (2001) Elena Rakosy và Tican (2006)

đã chuyển thành công các gen gfp (green fluorescent protein) và gen nptII

(neomycin phosphotransferase) vào 3 dòng khoai tây nhị bội và 4 giống khoai

tây thương phẩm quan trọng bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Đối với phương pháp chuyển gen cũng gặp không ít rắc rối bởi khichuyển gen kháng virus vào cây chúng có thể không biểu hiện tính kháng(Cockerham, 1970; Ross, 1986; Jones 1990; Mendoza et al, 1990) mà còn xuấthiện các sản phẩm phụ (protein) từ gen chuyển gây rối loạn hoạt động của câychủ Nhược điểm của phương pháp chuyển gen là mang tính kháng đặc hiệudòng virus, dễ bị phá vỡ tính kháng khi lây nhiễm virus với nồng độ cao, chỉ có

ý nghĩa với nhóm virus lây nhiễm cơ giới mà không có hiệu quả với nhómvirus truyền qua tuyến nước bọt của côn trùng (Anderson et al, 1989; Stark vàBeachy, 1989)

Hơn nữa, các thực phẩm chuyển gen hiện nay vẫn còn đang được tranhcãi về ảnh hưởng và những rủi ro của nó đối với sức khỏe con người cũng nhưđối với môi trường sinh thái

1.3.2 Nghiên cứu dung hợp tế bào trần

Trong chương trình chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh và dịch hại,chúng ta mong muốn chuyển được các gen kháng từ các loài khoai tây dại

(những loài có nguồn gen kháng bệnh tiềm năng) vào nguồn gen khoai tâytrồng Tuy nhiên rất khó để lai tạo hữu tính giữa các loài dại (2n = 2x = 24)với khoai tây trồng (2n = 4x = 48) do sự không tương hợp về genom, sự bấtthụ trong lai xa… Chính vì thế lai soma bằng dung hợp protoplast là một giảipháp rất hữu hiệu để khắc phục những nhược điểm trên

Sự ra đời của sơ đồ tạo giống tổng hợp - phân tích của Wenzel và cộng

sự (1979)[24] là bước ngoặt quyết định trong việc sử dụng phối hợp cácphương pháp kinh điển và hiện đại vào công tác giống khoai tây

Khâu cuối của sơ đồ tạo giống này là sự dung hợp của hai tế bào trầnnhị bội để cuối cùng tái sinh nên con lai tứ bội Hai dạng nhị bội dị hợp tử đãqua chọn lọc sẽ tổ hợp nên một thể tứ bội định hướng hoàn toàn dị hợp không

hề phải trải qua một quá trình giảm phân nào Thể tứ bội này có thể đượcnhân vô tính và ngay lập tức trở thành một giống ổn định (Deimling, 1989)[13] Mặt khác, thông qua dung hợp, hàng rào lai tạo giữa các cây xa nhau vềmặt di truyền cũng được vượt qua (Nguyễn Quang Thạch, 1993)[5]

1.3.2.1 Tình hình nghiên cứu dung hợp tế bào trần trên thế giới

Hầu hết khoai tây trồng hiện nay thuộc nhóm cây tứ bội (2n=4x=48),

do đó muốn dung hợp ở mức nhị bội cần giảm độ bội xuống trước khi tiếnhành lai soma bằng kỹ thuật nuôi cây bao phấn

Sơ đồ tạo giống khoai tây sử dụng tổng hợp kỹ thuật:

Lai tạo, nuôi cấy hạt phấn, nhân đôi nhiễm sắc thể và dung hợp tế

tạo giống này là sự dung hợp của hai tế bào trần nhị bội (2x) để tạo con laisoma tứ bội (4x) Thể tứ bội này có thể được nhân vô tính và trở thành mộtgiống ổn định (Diemling, 1989)[13] Mặt khác thông qua dung hợp tế bàotrần hàng rào lai tạo giữa các cây xa nhau về mặt di truyền cũng được khắcphục.

Những năm 1960 Cocking[12] đã tách thành công các tế bào trần riêngbiệt từ mô đỉnh rễ cà chua Tiếp sau đấy Takebe et al (1968) ở viện nghiêncứu virus thực vật, Aobacho, Chiba/Nhật Bản đã cải tiến kỹ thuật trên và lần

đầu tiên tách được lượng lớn các tế bào trần từ mô tế bào thịt lá của Nicotiana

tabacum Đây là tiền đề quan trọng cho sự tái sinh thành công cây thuốc lá từ

tế bào trần của Nitschothyama (1971); Takebe et al (1971) Tiếp sau đó làhàng loạt kết quả tách và tái sinh tế bào trần nhiều thực vật thành công Trong

đó, cây khoai tây đầu tiên tái sinh thành công từ tế bào trần với công trình củaShepard và Toten (1977) rồi Binding et al (1978) Đồng thời với nhữngnghiên cứu về tái sinh tế bào trần, vấn đề dung hợp tế bào trần cũng được đặt

ra Peletier và Chupeau (1984) đã có tổng kết về những nghiên cứu lai soma

từ năm 1974, trong đó đặc biệt đề cập đến những công trình của Kao et al(1974)[14] Vai trò của các cation hóa trị hai đặc biệt là Ca2+ đối với sự dunghợp các tế bào trần có bề mặt tích điện âm đã được Pilet và Stem (1974) đềcập Để tăng cường điện tích âm trên bề mặt tế bào trần các tác giả đã đề nghịtăng giá trị pH của môi trường dung hợp (Keller và Melchers, 1973; Binding,1974) Với sự phối hợp của Ca2+ và giá trị pH cao trong môi trường, thể laisoma đầu tiên của thuốc lá đã được Melchers và Labib (1974)[15] thực hiệnthành công Hiệu quả của PEG (polyethylen glycol) trong môi trường dung hợp

để tăng độ tích điện của tế bào trần đã được Kao, Michayluk (1974) và Wallin

et al (1974) phát hiện Sử dụng PEG để thu hút các tế bào trần cùng với sự bổsung một dung dịch CaCl2 có pH cao (pH khoảng 10) đã cải thiện một cách rõrệt quá trình dung hợp tế bào trần (Kao et al, 1974; Burgess; Fleming, 1974)

Phương pháp này cho tới nay vẫn đang được ứng dụng rộng rãi Bên cạnhphương pháp dung hợp hóa học tế bào trần, gần đây đã xuất hiện phương phápdung hợp xung điện Phương pháp này thu được kết quả tốt đẹp lần đầu với tếbào trần của Vicifaba (Zimmerman và Scheurch, 1981) Đến nay phương phápdung hợp xung điện được sử dụng rộng rãi và hết sức có hiệu quả (Deimling

1989, Moller 1990) Bởi giữa các tế bào trần có tỷ lệ gắn kết cao hơn phươngpháp dung hợp hóa chất và nhất là ít gây độc với tế bào

Việc nghiên cứu tái sinh tế bào trần khoai tây được rất nhiều tác giảquan tâm (Binding và Nehls, 1977; Binding et al, 1978; Bokemaln và Roest,1983; Schuchman, 1985)[9] Theo hướng giáo sư Wenzel đã đề xuất , cáccông trình nghiên cứu về dung hợp tế bào trần cũng dần được tăng lên Côngtrình nổi tiếng của Melchers et al (1978)[15] về lai soma giữa loài khoai tây

S tuberosum và cà chua lycopersicom esculentum là một mở đầu về hàng loạt

các nghiên cứu về dung hợp giữa loài khoai tây dại với khoai tây trồng vốnkhông thể tiến hành bằng con đường lai hữu tính Butenko và Kuchko (1980)

[10] đã tiến hành dung hợp tế bào trần S tuberosum với S chacoense mang

đặ tính kháng virus PLRV (Browwn và Thomas ,1979) tạo con lai soma mangđặc tính rất kháng với dòng virus PLRV Nhiều tác giả (Barsby et al, 1984;Austin et al, 1985; Helgeson et al, 1986; Fish et al, 1987) đã tập trung nghiên

cứu sử sụng S brevidens như một ”partner” nghiên cứu vì giống này chống

chịu với rất tốt với virus PVX và PVY Khi đó các ông tiến hành lai soma

giữa S brevidens với loài khoai tây trồng S tuberosum nhằm tạo con lai mang

đặc tính kháng hai loại virus đó

Nghiên cứu của Pehu et al (1990) về dung hợp protoplast giữa S.

tuberosum và S brevidens đã tạo con lai soma thành công Để xác định con

lai soma ông tiến hành phân tích thành phần SGAA (Steroidal GlycoalkaloidAglycone) của cây lai Kết quả cho thấy các thành phần alkaloid của bố mẹ

bao gồm solanidine và slanthrene của S tuberosum, tomatidine của S.

brevidens (Laurila et al 1996) đều có mặt trong cây lai So sánh với bố mẹ,

cho biết thành phần SGAA trong cây lai cao hơn so với S tuberosum nhưng

hàm lượng thấp vào khoảng 20 mg/ 100g tươi

N.Q.Thach, U Frei và G Wenzel (1993)[22] đã tạo thành công con lai

soma mang đặc tính kháng virus giữa các nhóm khoai tây thuộc loài Solanum

tuberosum L, xác định con lai soma bước đầu đánh giá độ bội bằng phương

pháp đếm nhiễm sắc thể, sau đó tiến hành phấn tích isozym esterase vàperoxidase (Deimling et al 1988), kỹ thuật RFLP (Enzyme cắt là EcoRI) Kếtquả cho thấy các con lai đều có sự biểu hiện của 2 allele trội đơn gen Rx và

Ry từ bố mẹ dung hợp (partners)

Với tổ hợp lai điển hình giữa S tarnii (2n=2x=24) và S etuberosum cv.

Delikat đã được dung hợp xung điện thành công Con lai soma tạo thành được

xác định độ bội bằng máy Flowcytometry, xác nhận con lai soma hetezygotebằng kỹ thuật SSR, chỉ thị AFLP và phân tích đa hình isozym Những cây lai

soma đều biểu hiện tính rất kháng với dòng virus PVY và kháng nấm P.

infestans rất tốt qua phản ứng siêu nhạy (HR-hypersensitive reaction) Thế hệ

BC1 và BC2 cũng biểu hiện tính kháng virus và kháng nấm cao, không nhữngvậy tính kháng này rất bền vững ở cả con lai và thế hệ BC (Ramona Thieme;Elena Rakosy–Tican; Tatjana Gavrilenko; Thomas Thieme 2007)[18]

1.2.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Cùng với những tiến bộ và thành tựu đạt được của thế giới trong nghiêncứu cải tạo giống cây trồng bằng dung hợp tế bào trần, Việt Nam đang dần kếthừa và bắt đầu nghiên cứu kỹ thuật dung hợp tế bào trần tạo giống khoai tâykháng virus và bệnh cũng như một số sâu hại nguy hiểm khác

Trên đối tượng cây khoai tây, đã cải tạo nguồn gen của một số dòngkhoai tây trồng, loại bỏ hoàn toàn bệnh virus của một số dòng khoai tây nhưKT2, giống khoai tây Thường Tín (Ackersegen)…bằng việc ứng dụng côngnghệ sinh học thực vật gồm các kỹ thuật nuôi cấy mô (nuôi cấy meristem…) và

các kỹ thuật phân tử khác

Nghiên cứu dung hợp tế bào trần cây khoai tây còn rất mới mẻ và đangđược tiến hành khá thành công tại Viện Sinh Học Nông Nghiệp–TrườngĐHNNHN do GS.TS Nguyễn Quang Thạch và TS Nguyễn Phương Thảo chủtrì đề tài “Tạo giống khoai tây kháng bệnh virus bằng dung hợp tế bào trần”giai đoạn 2006 – 2011 Nghiên cứu đã bước đầu thành công ở quy trình tách,dung hợp, nuôi cấy và tái sinh protoplast của các dòng khoai tây nhị bội phục

vụ cho chương trình chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh virus Quá trìnhnghiên cứu hứa hẹn nhiều thành công và góp phần cải tạo nguồn gen khoaitây trồng, phát triển sản xuất khoai tây giống sạch bệnh virus

1.3 Tạo giống khoai tây bằng dung hợp tế bào trần

Đối với hướng tạo giống khoai tây bằng dung hợp tế bào trần giữa haihay nhiểu dòng mang đặc tính kháng tỏ ra có nhiều ưu điểm: Tổ hợp được bộgenome của cả hai bố mẹ tạo thành một cấu trúc genome dị hợp tử mới,không có sự biệt lập trong quá trình giảm phân, rút ngắn thời gian chọn tạo,khắc phục những rào cản về mặt di truyền trong lai hữu tính… Cho nên trởthành công cụ đầy hứa hẹn phục vụ chương trình chọn tạo giống cây khoai tâykháng virus

Mà trong tự nhiên tồn tại khá nhiều nguồn gen kháng virus, theo một sốnghiên cứu đã xác định có khoảng 206 loài khoai tây dại mang củ, 7 loài

nguyên thủy và một loài khoai tây trồng Solanum spp, cũng như một số loài

dại không mang củ có đặc tính kháng virus tốt (Spooner và Hijmans , 2001)

Trong số đó dòng S etuberosum có đặc tính kháng cao với bệnh virus PVY, PVA…(Valkonen et al, 1992b; Thieme et al, 2000 ), S tarnii rất kháng với dòng virus PVY (Thieme et al, 2003), loài khoai tây S cardiophyllum Lindl và

S etuberosum Lindl thuộc chi Pinnatisecta và Etuberosa (Hawkes, 1990) thể

hiện tính kháng cao với nấm Phytophthora infestans (Hanneman và Bamberg

1986) Chúng được thu thập và thăm dò về tính kháng virus và tác nhân gây

bệnh khác kể cả sâu hại Một số nghiên cứu về khoai tây ở Châu Âu khẳngđịnh 90% loài khoai tây dại trong quỹ gen thu thập là nguồn gen kháng mới

có ý nghĩa Đây là nguồn gen kháng quan trọng phục vụ chương trình chọntạo giống khoai tây kháng virus bằng dung hợp tế bào trần Nếu lai tạo giốngtheo phương pháp truyền thống giữa những dòng dại có tính kháng virus vàdòng trồng thường gặp rào cản về mặt di truyền, thời gian chọn tạo lâu

Rất khó khăn để có thể tập hợp nguồn gen dại vào dòng khoai tây trồngChâu Âu bằng lai hữu tính, do đó dung hợp tế bào trần là phương pháp hữu

hiệu để đưa nguồn gen đó vào quỹ gen của loài S Tuberosum, vượt qua được

tính không tương hợp trong lai hữu tính và sự phân tách gen trong chươngtrình chọn tạo giống (Millam et al, 1995) Sự dung hợp giữa tế bào trần của

loài khoai tây dại không có củ S Brevidens với loài khoai tây trồng S.

Tuberosum tạo con lai soma biểu hiện tính kháng cao với một số nhóm virus

và kháng vector truyền bệnh (Austin et al, 1985b; Fish et al, 1987; Gibson et

al, 1988; Pehu et al, 1990; Vankonen et al, 1994b)

Tùy thuộc vào thành phần gen của con lai soma mà biểu hiện một sốcác biến đổi về tính trạng hình thái và phản ứng lại sự xâm nhiễm virus PVXbởi vector (Thieme et al, 2000) Một số con lai soma được lai lại thành côngvới dòng khoai tây trồng mà vẫn biểu hiện tính kháng (Willliams et al, 1992;

Helges et al, 1993; Thieme et al, 2002) Hàng loạt con lai soma của S.

etuberosum và S tuberosum và dòng BC1 thể hiện kháng tốt với PVY (Novy

và Helgeson, 1994b) và tính rất kháng với PVX (Gavlirenco et al, 2003).Nghiên cứu của Polgar et al (2002) đã tạo được 150 dòng lai soma giữa thứ

khoai tây Hungari và S brevidens cùng một vài thế hệ BC Kết quả cho thấy

rằng tất cả con lai và hầu hết dòng BC biểu hiện mức kháng cao với virusPVY và PLRV

Một nghiên cứu mới mẻ của Thieme et al (2008) cho biết loài khoai tây

dại S tarnii là nguồn gen kháng quan trọng với cả sâu hại và bệnh hại, biểu

hiện tính rất kháng với virus PVY, tính kháng cao với nấm Phytopthera

infestans Khi đó tiến hành lai soma với một số dòng khoai tây trồng thuộc

loài S tuberosum để tạo thể lai mới kế thừa tính kháng từ dòng khoai tây dại

S tarnii.

Trong số các phương pháp tạo giống khoai tây kháng virus thì phươngpháp lai soma có nhiều ưu điểm và hiệu quả hơn cả Về phương pháp lai hữutính gặp nhiều khó khăn về mặt di truyền, tốn thời gian chọn tạo

Để có thể giải quyết vấn đề bệnh virus của cây khoai tây, cần áp dụngnhiều biện pháp khác nhau, trong đó ưu tiên giải pháp tạo giống kháng vectortruyền bệnh virus và kháng trực tiếp dòng virus

1.3.1 Khái niệm tế bào trần (protoplast) và con lai soma (somatic hybrid)

Tế bào trần là tế bào đã bị tách bỏ thành tế bào bằng phương pháp cơ họchay enzym, phần còn lại sau phân giải thành là màng nguyên sinh chất baobọc nhân và các bào quan bên trong Màng nguyên sinh chất là phần ranh giớiphân biệt giữa môi trường bên trong tế bào và bên ngoài tế bào trần

Mỗi tế bào thực vật đều có tính toàn năng (tipotential) nghĩa là có tiềmnăng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Do đó việc dung hợp hai haynhiều tế bào trần nhằm tạo con lai soma hoàn toàn có thể phát triển thành câylai hoàn chỉnh

Con lai soma là sản phẩm của sự dung hợp giữa các nguồn tế bào trầnkhác nhau Nhân và các bào quan là sự lai giữa hai bố mẹ dung hợp, vớimục đích kết hợp các tính trạng tốt của bố mẹ vào con lai để cải tạo nguồngen của cây trồng Con lai soma được tạo ra khi phương pháp lai hữu tính gặpkhó khăn về mặt di truyền hoặc các thao tác lai…

1.3.2 Quá trình tách, dung hợp, nuôi cấy và tái sinh protoplast

Sự ra đời của kỹ thuật dung hợp tế bào trần ở thực vật cho phép tạo ranhững cơ thể lai mới, mang các đặc tính tốt mà phương pháp lai truyền thốngrất khó hoặc không thể tạo ra được con lai Hơn nữa, cây khoai tây là một loại

cây rất dễ nuôi cấy mô, do vậy các nhà nghiên cứu dễ dàng áp dụng kỹ thuậtdung hợp tế bào trần tạo thể lai soma để cải tiến một số tính trạng mongmuốn, đặc biệt là tính kháng Đặc tính kháng bệnh trong con lai soma có được

là do một trong hai đối tượng tế bào dung hợp có mang tính chất đó Đồngthời tế bào lai soma là sự dung hợp của gen nhân và các bào quan (ty thể lai,lạp thể lai), nên cũng góp phần tăng cường các đặc tính nông sinh học khác ởcon lai soma

Vào những năm 60 của thế kỷ XX, E C Cooking đã sử dụng mộtenzyme để phân giải thành tế bào và kết quả là tạo ra các protoplast tế bàochóp rễ của cây cà chua

Sau đó I.Takebe và cộng sự (Viện nghiên cứu virus thực vật, Aobacho,Chiba/Japan)[21] đã cải tiến kỹ thuật trên và đã tạo được một lượng lớn tế bàotrần của các tế bào thịt lá cây thuốc lá Quy trình này cũng được áp dụngthành công trên nhiều đối tượng thực vật khác, rất dễ sử dụng và đạt hiệu quảcao Quy trình này được tiến hành qua hai bước: đầu tiên là phân giải lớpmàng mỏng bằng enzym pectinase; sau đó, phân giải thành tế bào bị phân giảibằng enzym cellulase

Đây là những người đặt nền móng đầu tiên cho các nghiên cứu về tế bàotrần Những kết quả nghiên cứu trên góp phần vào sự thành công tạo nguồn tếbào trần phục vụ dung hợp

1.3.2.1 Tách protoplast

Để tách được protoplast người ta có thể sử dụng hai phương pháp tách cơhọc và tách bằng enzyme Tách cơ học là làm cho protoplast ở trạng thái conguyên sinh sau đó tác động cơ học để giải phóng tế bào trần Tuy nhiênphương pháp này có nhiều mặt hạn chế: chỉ áp dụng trên một vài đối tượngthực vật; mật độ protoplast thu được không cao; khả năng tái sinh yếu.Phương pháp tách protoplast bằng enzyme đã khắc phục được những nhược

điểm trên Hiện nay, phương pháp enzyme được sử dụng rộng rãi và có hiệuquả cao.

1.3.2.2 Dung hợp

Hai đối tượng tế bào đem lai có thể dung hợp thành một tế bào mới mộtcách tự phát hoặc được cảm ứng bởi tác nhân như hóa chất (dung hợp hóachất polyethylen glycol, ký hiệu là PEG) hay xung điện (dung hợp xung điện-electrofusion) Đối với cây khoai tây người ta đã sử dụng cả hai phương pháptrên Tuy nhiên so với phương pháp dung hợp bằng hóa chất, dung hợp xungđiện được áp dụng phổ biến và đạt hiệu quả cao hơn hơn do thao tác đơn giản,tốc độ nhanh, hiệu suất dung hợp cao trong cùng một thời điểm và ít gây độcđối với tế bào (Banner, 1990) Phương pháp dung hợp bằng hóa chất PEGthường gây độc cho tế bào trần do không rửa sạch hết PEG, do vậy sẽ ảnhhưởng đến khả năng tái sinh sau này

1.3.2.3 Nuôi cấy và tái sinh tế bào trần sau dung hợp

Sản phẩm sau khi dung hợp sẽ được nuôi cấy trong môi trường lỏng chotới khi microcallus xuất hiện Trong giai đoạn ban đầu protoplast “rất yếu ớt”

do chưa có thành tế bào, do vậy môi trường nuôi cấy cần phải đảm bảo ápsuất thẩm thấu để không làm vỡ tế bào, ngoài các yếu tố dinh dưỡng cần thiếtcòn cần cung cấp đủ ion Ca2+ cho quá trình phân chia hình thành thành vách

tế bào mới Tiếp đó, các microcalli này sẽ được chuyển sang môi trường rắn

để tạo thành macrocallus, tùy thuộc vào từng loại cây trồng mà sử dụng loạimôi trường khác nhau Cho tới khi kích thước calli đạt tiêu chuẩn thì cấychuyển sang môi trường tái sinh để tạo chồi và cuối cùng tạo cây hoàn chỉnh

1.3.3 Xác định con lai soma

Sản phẩm sau dung hợp là hỗn hợp gồm: Các dạng bố hoặc mẹ dùng đểlai partners), các thể lai đồng hợp (do các tế bào của cùng 1 loài kết hợp lạivới nhau - homozygous) và thể lai dị nhân (các tế bào khác loài kết hợp lạivới nhau -hetezygous) do quá trình dung hợp xảy ra ngẫu nhiên và không

kiểm soát được Chính vì vậy việc chọn lọc chính xác con lai soma trong hỗnhợp sản phẩm sau dung hợp là rất cần thiết Có rất nhiều phương pháp đểchọn lọc con lai soma khác nhau, có thể xếp vào hai nhóm là chọn lọc ở mức

tế bào (hay calli) và chọn lọc ở mức cây hoàn chỉnh (planlet) Tùy từng loạicây trồng mà có thể áp dụng các phương pháp khác nhau, tuy nhiên thườngthì chọn lọc con lai ở giai đoạn cây hoàn chỉnh cho hiệu quả cao hơn

* Phương pháp nhuộm huỳnh quang:

Puite và Pijnacker (1986)[17] đã đề xuất phương pháp chọn lọc sản phẩmdung hợp bằng cách nhuộm huỳnh quang Tiến hành nhuộm flouresenceindiacetate (FDA) cho nguồn protoplast thu được từ mẫu lá xử lý trong dungdịch thuốc trừ cỏ, các protoplast này không hoặc có rất ít lục lạp, sau đó tiếnhành dung hợp với nguồn protoplast bình thường có chứa lục lạp Sau khi xử

lý dung hợp, kết quả cho thấy các protoplast xuất hiện màu đỏ và màu xanhcủa FDA được xác nhận là con lai soma (heterokaryon) Tuy nhiên yêu cầucủa phương pháp này là mật độ nuôi cấy protoplast phải thấp

Theo Harkins và Galbrain, 1984, các ông tiến hành nhuộm flouresentkhác nhau cho cả hai nguồn protoplast dung hợp Sau dung hợp, hỗn hợpprotoplast được chiếu tia laser khi đó các tế bào hấp thu năng lượng ánh sáng,cuối cùng tiến hành chọn lọc con lai dựa trên định lượng hàm lượngflouresent

* Dựa trên các biểu hiện di truyền, sử dụng các gen chỉ thị và gen đánh dấu:

Chẳng hạn như các gen đột biến gây bạch tạng, các đột biến hóa sinhlàm ức chế gen nào đó dẫn tới sự thiếu hụt enzyme hoạt động, các gen đánhdấu có được bằng phương pháp chuyển gen, các gen kháng sinh hoặc khángthuốc trừ cỏ Có thể nêu một số ví dụ sau:

Gây đột biến tính lặn mẫn cảm với ánh sáng SSvv và ssVV của cây

thuốc lá (Nicotiana tabacum), khi đó dạng lai giữa hai kiểu đột biến trên có

kiểu gen SSssVVvv không mẫn cảm với ánh sáng Các dòng tế bào tồn tạihình thành diệp lục ở cường độ ánh sáng cao do không mẫn cảm với ánh sáng,

đó chính là con lai soma (Athuja 1982)

Dạng lai giữa Solanum nigrum và Petunia hybrida có thể phát triển trên

môi trường có chứa diethylpyrocarbamate (hợp chất gây mẫn cảm với

Solanum nigrum) và iodine acetate (gây mẫn cảm với Petunia hybrida).

Protoplast bố mẹ dung hợp không phát triển trên môi trường có đồng thời haichất trên do đó dễ dàng chọn lọc được con lai soma (Davey và Kumar 1983)

Hai nguồn protoplast Nicotiana glauca và B.langsdorfii cần có auxin

trong môi trường mới có thể phát triển được, ngược lại dạng lai giữa chúng cóthể tự tổng hợp được auxin do vậy phát triển được trong môi trường thiếuauxin Qua đó con lai soma dễ dàng xác định được trong điều kiện môitrường nuôi cấy (Pelletier và Chupeau 1984)

Dòng tế bào A của Shaerocarpos donelli chỉ phát triển được khi trong

môi trường có acid nicotinic và dòng tế bào B (dạng bạch tạng) thì cần đường.Dạng lai giữa A và B phát triển bình thường trên môi trường không có cả acidnicotinic và đường Dòng tế bào A và B được gọi là dòng tế bào đột biến dinhdưỡng thụ động (auxotrophic) theo Gonzales và Widholm 1985

Chọn lọc ở mức cây hoàn chỉnh

Bằng các phương pháp chỉ thị phân tử (AFLP, RAPD, RELP, PCR) hoặc Isozyme có thể xác định chính xác các con lai soma mang các gen của cả bố

và mẹ dung hợp

Theo N.Q.Thach và U Frei và G Wenzel (1993)[22] đã tạo thành công con

lai soma giữa các nhóm khoai tây thuộc Solanum tuberosum L., việc xác định

con lai dựa trên phân tích isozyme esterase, peroxidase (Deimling et al 1988) và

kỹ thuật RFLP (Enzyme cắt là EcoRI) đã xác định được các con lai đều có sựbiểu hiện của 2 allele trội đơn gen Rx và Ry từ bố mẹ dung hợp (partners)

Theo Ramona Thieme và Elena Rakosy – Tican (2007)[18], Con lai giữa

Solanum tuberosum cv Delikat và S tarnii được xác nhận bằng chỉ thị phân

tử SSR (Simple Sequence Repeat ) và AFLP (Amplified Fragment lengthpolymorphism), đồng thời cũng dựa vào đặc điểm hình thái và phân tích Flowcytometry Kết quả cho thấy SSR không cho kết quả với tổ hợp lai trên và cáccon lai BC1 còn AFLP cho kết quả tốt để khẳng định đúng con lai soma Ngoài ra, để xác định con lai soma một số tác giả đã nghiên cứu thànhphần, hàm lượng alkaloid trong các cây lai Theo nghiên cứu của Pehu và

cộng sự (1990) về dung hợp protoplast giữa S tuberosum và S brevidens đã

tạo con lai soma thành công Để xác định con lai soma ông tiến hành phântích thành phần SGAA (Steroidal Glycoalkaloid Aglycone) của cây lai Kết

quả cho thấy các thành phần alkaloid của bố mẹ bao gồm solanidine và

slanthrene của S tuberosum, tomatidine của S brevidens (Laurila et al 1996)

đều có mặt trong cây lai So sánh với bố mẹ, cho biết thành phần SGAA trong

cây lai cao hơn so với S tuberosum nhưng hàm lượng thấp vào khoảng 20

mg/ 100g trọng lượng tươi

Hơn nữa người ta có thể xác định con lai dựa vào đặc điểm hình thái khi

bố mẹ có đặc điểm khác nhau rõ rệt Tuy nhiên phương pháp này chỉ được áp

dụng đông thời với phương pháp xác định ở mức phân tử thì mới cho kếtquả chính xác nhất.

PHẦN II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Giống khoai tây Atlantic (Solanum tuberosum cv.Atlantic)

- Nguồn gốc: xuất xứ từ Mỹ, là giống khoai tây phục vụ chế biến chip phổbiến nhất hiện nay

- Giống khoai tây Alantic được nhập vào Việt Nam lần đầu tiên tại Đà Lạtnăm 2000, đến năm 2004 được đưa ra trồng ở Miền Bắc, và từ năm 2008được bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn công nhận sản xuất thử ở ViệtNam

- Hiện nay diện tích của giống khoai tây Atlantic đạt gần 800 ha

- Đặc tính: + Củ hình tròn, vỏ củ màu sáng, ruột trắng, mắt ngủ sâu

+ Thân lá đứng, phát triển ở mức trung bình, hoa màu trắng + Chống chịu bệnh virus, ghẻ củ, héo xanh khó, mẫn cảm vớibệnh mốc sương

+ Hàm lượng chất khô khoảng 24%, hàm lượng tinh bột khoảng18-20%, hàm lượng đường khử thấp thích hợp cho chế biến chip

2.1.2 Các dòng khoai tây dại

Dòng Solanum.tarnii (trn 3G) và dòng Solanum.pinnatisectum (pnt 2G)

- Nguồn gốc: Từ Mê-hi-cô (Mexico), được cung cấp bởi viện JKI (Institite

of Breeding Research an Agricultural Crops) – CHLB Đức