Vitamin E là tên gọi của 1 nhóm hợp chất gồm các tocopherol và các tocotrienol (gọi chung là các tocol). Chúng là những chất tan trong lipid, dễ bị oxi hóa khi tiếp xúc với các điều kiện nhiệt, ánh sáng, môi trường kiềm. Cấu tạo của chúng gồm vòng chromanol phân cực và nhóm 16 carbon kị nước (Hình 1). Vitamin E tự nhiên tồn tại dưới 8 dạng khác nhau, trong đó có 4 tocopherol và 4 tocotrienol phân biệt bởi số và vị trí nhóm methyl trên vòng chromanol.
Trang 1Phân tích vitamin E trong một số loại dầu thực vật
bằng phương pháp HPLC đảo pha
1.Đặc điểm của chất cần phân tích:
Vitamin E là tên gọi của 1 nhóm hợp chất gồm các tocopherol và các
tocotrienol (gọi chung là các tocol) Chúng là những chất tan trong lipid, dễ bị oxi hóa khi tiếp xúc với các điều kiện nhiệt, ánh sáng, môi trường kiềm Cấu tạo của
chúng gồm vòng chromanol phân cực và nhóm 16 carbon kị nước (Hình 1)
Vitamin E tự nhiên tồn tại dưới 8 dạng khác nhau, trong đó có 4 tocopherol và 4 tocotrienol phân biệt bởi số và vị trí nhóm methyl trên vòng chromanol
Hình 1 Cấu trúc hóa học của tocopherols và tocotrienols
Các tocol đều có hoạt tính sinh học giống α-tocopherol α-tocopherol trong tự nhiên có hoạt tính cao nhất, β-, γ- and δ-tocopherols và α- and β-tocotrienols có hoạt tính bằng 50%, 10%, 3%, 30% và 5% α-tocopherol Là 1 chất chống oxy hóa, các tocol làm chậm các quá trình phát triển của một số bệnh như tim mạch hay ung thư Ngoài ra chúng còn được chứng minh là có tác dụng điều hòa biểu hiện gene, tín hiệu tế bào, đáp ứng miễn dịch và làm giảm mức cholesterol trong máu
Trang 2Vì các tocol là các hợp chất dễ hòa tan trong lipid Chúng dễ dàng hòa tan trong dung môi hữu cơ Sử dụng Methanol-Nướclàm dung môi
2.Nguồn gốc:
Tocopherols có mặt trong hầu hết các thực phẩm từ thực vật như dầu thực vật
và các loại hạt Hầu hết các tocotrienols bắt nguồn từ dầu cọ và một số ngũ cốc ngũ cốc, như lúa mì, lúa mạch và yến mạch
Dầu ô liu và dầu đậu nành được sử dụng làm nguồn phân tích các tocopherol
3.Cách chuẩn bị mẫu:
Chuẩn bị mẫu là bước tiêu tốn nhiều thời gian nhất khi phân tích và ảnh hưởng
đến độ chính xác Để giảm sự mất mát của các tocol, việc chuẩn bị mẫu nên làm đơn giản
Các tocopherol dễ bị oxi hóa khi gặp các điều kiện như nhiệt độ, ánh sáng hay kiềm Để tránh mất mát Vitamin E, ta sử dụng những vật liệu tối màu và ánh sáng hồng ngoại
Với mẫu dầu không cần thiết phải chiết tách các Tocopherol ra khỏi dầu trước
khi chạy sắc kí do các thành phần khác của dầu như phytosterols hay carotenoids
có thời gian lưu khác với chất cần phân tích
Các bước chuẩn bị mẫu:
-Dầu được pha với hexane (1:10)
-Sau đó 200 μl được chuyển sang ống có chứa 600 μl methanol và 200 μl dung dịch chuẩn (300 μg/ml α-tocopherol acetate trong ethanol)
-Sau đó mẫu được trộn vortex và ly tâm (5000RPM,5mins)
-Có thể lọc qua màng lọc 0,45 μm trước khi đưa mẫu vào
-50μl mẫu được nạp vào bộ nạp mẫu
-Mẫu có thể được giữ trong bình tối màu ở -20 °C trong khoảng 1 tuần
4.Điều kiện chạy sắc kí:
Trang 3HPLC là kĩ thuật được sử dụng rộng rãi để phân tích các tocol, bao gồm HPLC
thường (NP HPLC) và HPLC đảo pha (RP HPLC) Các tocol ổn định ở các điều kiện HPLC, dễ tan vào các dung môi thích hợp và có thể kết hợp với nhiều loại
detector Fluorescence detection (FLD) và ultraviolet detection (UV) được sử dụng rộng rãi nhất Khi cả 8 tocol cần được phân tách thì hay sử dụng NP HPLC Nhưng khi chỉ cần tách 1 số loại nhất định thì có thể dùng RP HPLC
Với NP HPLC, mẫu được hòa tan trong dung môi hữu cơ không phân cực và
phân tách bởi sự hấp thụ Sự phân cực của các tocol bị ảnh hưởng bởi số nhóm
metyl trên vòng chromanol
RP HPLC cũng được dùng để phân tích các tocol RP HPLC có lợi thể là sử
dụng pha động ít độc hại hơn NP HPLC (VD: methanol, ethanol, ) Vì RP HPLC
có thể phân tách các chất cần phân tích mà có sự khác nhau lớn trong cấu trúc hóa học, RP HPLC có thể dùng để phân tách cùng lúc các tocol và các hợp chất tan
trong chất béo khác
4.1 Pha động:
Pha động được sử dụng là Methanol-Nước (96:4)
4.2 Dung môi:
Dung môi là Methanol-Nước Dầu được pha với hexane tỉ lệ 1:10
4.3 Cột sắc kí:
Sử dụng cột thẳng.
Kích
thước hạt
Hình
dạng
hạt
Diện tích bề mặt
Kích thước lỗ
Thể tích lỗ
Nhóm được gắn vào
Lượng Carbon
Khoảng pH
cầu
320
m2/g
mL/g
Octadecyl
C18-18.5% 2 - 7.5
Kích thước cột: 150x4,4 mm I.D
Vật liệu nhồi cột: Silica gel
4.4 Pha tĩnh:
Trang 4Silica gel được gắn với C18
5 Các yếu tố ảnh hưởng:
Tốc độ dòng chảy: 2 ml/min
Nhiệt độ cột: 45°C
Sử dụng detector UV λ = 292 nm đo sau mỗi 6 phút chạy sắc kí
6 Kết quả:
6.1 Kết quả điện di:
Trang 5Các tocol có hấp thụ ánh sáng UV ở λ = 290-300 nm và thường được sử đụng để phát hiện và định lượng các mẫu có hàm lượng tocopherol cao như là dầu thực vật
Do không chiết tách tocopherol trước khi chạy sắc kí , phần đầu của bảng là một
số thành phần khác của dầu như carotenoids hay phytosterols, chúng có thời gian lưu khác với các tocopherol Hỗn hợp dầu và hexane tỉ lệ 1:10 sẽ làm cho các peak tách rời nhau
6.2 Thẩm định phương pháp:
α-tocopherol acetate được sử dụng làm chất chuẩn do sẵn có và chất có cấu trúc gần giống với chất cần phân tích Tỷ lệ giữa diện tích peak giữa tocopherol và α-tocopherol acetate (y) với khối lượng chuẩn của α-α-tocopherol (x) là tuyến tính trong khoảng phân tích δ-tocopherol cũng tuyến tính với hệ số tương quan lên đến hơn 0.999 trong khoảng phân tích
Độ chính xác trong quá trình chạy cũng được đo bằng cách tính RSD của
α-tocopherol và δ-α-tocopherol trong 10 mẫu dầu ô liu và 10 mẫu dầu đậu nành Ở cả 2 trường hợp, kết quả cho ra đều chấp nhận được với nồng độ khoảng 1 μmol/l
Trang 6Một phương pháp khác để kiểm tra độ chính xác của phương pháp là cho của α-tocopherol và δ-α-tocopherol chuẩn vào với tường mức nồng độ khác nhau để đo lượng mẫu thu hồi được Kết quả thu được với của α-tocopherol là 100%,
107.05%, 102,02%, với của δ-tocopherol là 91.95%, 94.50%, 94.40%
Để kiểm tra độ nhạy của phương pháp, đo giới hạn phát hiện (Detection limit) và giới hạn định lượng (Quantification limit) DL của α-tocopherol và δ-tocopherol là 11.5 ng và 12 ng Q của α-tocopherol và δ-tocopherol 23 ng và 25 ng
6.3 Nhận xét:
Ưu điểm:
Chuẩn bị mẫu nhanh, đơn giản
Độ nhạy cao
Phương pháp có độ chính xác cao (RSD=2.69%) và lượng mẫu thu hồi được cao (98,14%)
Mẫu dầu có thể được phân tích nhiều lần mà không làm ảnh hưởng đển chất lượng của cột sắc kí
Nhược điểm:
Cột C18 không phân tách được β- và γ- tocol
7 Giới thiệu hệ thống thiết bị:
HPLC được tiến hành với bộ thiết bị sắc kí lỏng Hewlett Packard, bơm HP1050,
bộ nạp mẫu Rheodyne model 7125, Detector HP-1040 và cột sắc kí Tracer Extrasil ODS-2
Trang 7Tài liệu tham khảo:
Journal of Chromatography A: Volume 881 issue 1-2 2000 E Gimeno; A.I Castellote; R.M Lamuela-Raventós; M.C de la Torre Rapid determination of vitamin E vegetable oils by RP HPLC.
Analysis of Tocopherols and Tocotrienols by HPLC
http://lipidlibrary.aocs.org/Analysis/content.cfm?ItemNumber=40389