Nghiên cứu tạo các dòng ngô mang gen isopentenyl transferase (IPT) bằng phương pháp biến nạp nhờ vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ------ LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 NGHIÊN C U TẠO CÁC NG NG MANG G N

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

- -

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

NGHIÊN C U TẠO CÁC NG NG MANG G N

ISOPENTENYL TRANSFERASE (IPT NG PH NG PHÁP I N NẠP NH VI KHU N AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

Người hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Văn Đồng

H vi n : Tr n uy H ng

Hà Nội – 2015

Tôi xin g i l i cả ơn ến phòng ào t o t o i u i n và tận t nh h ớng dẫn

ọi th t c ể tôi c thể hoàn thành luận văn này

ôi xin g i l i cả ơn tới tập thể c n b hòng thí nghi m Trọng iể Công ngh

tế bào hực vật - Vi n Di truy n ông nghi p giúp ỡ nhi t t nh trong suốt th i gian tôi thực hi n h a luận

Cuối c ng nh ng hông ph n quan trọng, tôi xin g i tới bố mẹ, anh chị c ng

b n bè, nh ng ng i luôn quan tâ , ng h và là chỗ dựa cho tôi trong suốt th i gian là h a luận này, c ng nh trong cu c sống

ôi luôn ghi nhớ và hông bao gi qu n sự giúp ỡ vô c ng to lớn ôi xin g i

ến tất cả qu th y cô, gia nh, b n bè lòng biết ơn vô tận

Hà Nội, ngày 24 tháng 12 năm 2015 Học viên

n y H ng

M c c

L i cảm n i

M c c ii

nh m c h nh v iv

nh m c ảng v

nh m c c c ch vi t t t vi

M Đ U 1

Ch ng –T NG QUAN 3

1.1 Nguồn gốc cây ngô 3

1.2 T nh h nh nghiên cứu ngô trên th giới 5

1.3 T nh h nh nghiên cứu ngô ở Việt Nam: 9

1.4 C sở ho học v nghiên cứu nạp gen vào thực vật bằng ph ng ph p Agrobacterium tumefaciens 13

1.4.1 Ti-Plasmid 14

1.4.2 Chức năng c T-DNA 16

1.4.3 C ch chuy n gen ằng A tumefaciens 16

1.4.4 Gen ch th - gen chọn ọc và c ch hoạt động chọn lọc c a hygromycin 18

1.5 C ch ch u hạn hiện t ng già h và gen IPT 19

1.5.1 C ch ch u hạn c thực vật 19

1.5.2 Hiện t ng già h và c c y u tố ảnh h ởng 20

1.5.3 Đi u hò sự già h và v i trò c Cyto inin 20

1.5.4 Gen ipt và promoter pSARK12 21

1.6 C c ph ng ph p i m tra sự c mặt và i u hiện c a gen bi n nạp 21

1.6.1 Ph ng ph p Southern ot 21

1.6.2 Ki m tr hả năng ch u hạn ở t i cây con 22

Ch ng – VẬT LIỆU VÀ PH NG PHÁP 24

2.1 Vật liệu 24

2.1.1 Vật liệu thực vật 24

2.1.2 Ch ng vi khuẩn và vector dùng trong chuy n gen 24

2.1.3 H chất và thi t b sử d ng 24

2.2 Ph ng ph p nghiên cứu 25

2.2.1 Quy tr nh chuy n gen vào phôi non thông qu vi huẩn Agrobacterium tumefaciens 25

2.2.2 Phân tích cây chuy n gen bằng ph ng ph p sinh học phân tử 27

2.2.3 Đ nh gi hả năng ch u hạn c c c dòng ngô chuy n gen ở th i cây con 30 2.2.4 Đ nh gi sự h già c trong đi u iện c t h i cành 31

2.3 Đ đi m, th i gi n và ph ng ph p xử ý số liệu 31

Ch ng - K T QUẢ 32

3.1 K t quả c qu tr nh chuy n gen,chọn ọc và t i sinh c giống ngô 32

3.2 Ki m tr ằng ph ng ph p sinh học phân tử 35

3.2.1 K t quả t ch chi t NA t ng số 35

3.2.2 K t quả phân tích cây chuy n gen ằng ph ng ph p PCR gen hpt 36

3.2.3 K t quả phân tích cây chuy n gen ằng ph ng ph p PCR gen ipt 37

3.2.4 K t quả phân tích Southern ot c c dòng ngô chuy n gen th hệ T 38

3.3 K t quả đ nh gi hả năng ch u hạn c c c dòng ngô chuy n gen ở th i cây con 40 3.4 K t quả đ nh gi qu tr nh h già c hi c t 45

Ch ng – THẢO LUẬN 46

4.1 Chuy n gen thông qu vi huẩn 46

4.2 Phân tích ằng ph ng ph p sinh học phân tử 47

4.3 Đ nh gi s ộ i u hiện ch u hạn c cây con ở đi u iện phòng thí nghiệm 49

Ch ng – K T LUẬN VÀ KI N NGH 52

5.1 K t uận 52

5.2 Ki n ngh 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

PH L C 59

nh m c h nh v

H nh 1: ấu trú Ti-plasmid 14

H nh 2 : Hệ thống ve tor li n hợp 15

H nh 3 : Hệ thống vector nhị thể (kép) 15

H nh 4: ấu trú T-DNA 16

H nh 5 : S ấu trú ve tor pSI hyg-2 24

H nh 6 : S quy tr nh huyển gen 27

H nh 7: Kh n ng ph h i- ti p nh n- t i sinh giống ng 32

H nh 8: T n số huyển gen gi ịnh 33

H nh 9: M t số h nh nh gi i o n huyển gen 33

H nh 10: K t qu iện i N t ng số 36

H nh 11: K t qu ph n t h P R gen hpt th hệ T0 37

H nh 12: K t qu ph n t h P R gen ipt th hệ T0 37

H nh 13: K t qu ph n t h P R gen ipt th hệ T1 38

H nh 14: K t qu Southern lot ng huyển gen ở th hệ T1 39

H nh 15: nh gi kh n ng hịu h n ở gi i o n y on ở nh lưới số 1 r y x l h n 40

H nh 16: K t qu nh gi kh n ng hịu h n gi i o n y on n v o hi u o th n l v hi u i r i nhất t i nh lưới số 1 41

H nh 17: K t qu nh gi kh n ng hịu h n gi i o n y on n v o tr ng lượng tư i t i nh lưới số 1 41

H nh 18: K t qu nh gi kh n ng hịu h n gi i o n y on n v o tr ng lượng kh t i nh lưới số 1 41

H nh 19: nh gi kh n ng hịu h n ở gi i o n y on ở nh lưới số 2 r y x l h n 43

H nh 20: K t qu nh gi kh n ng hịu h n gi i o n y on n v o hi u o th n l v hi u i r i nhất t i nh lưới số 2 43

H nh 21: K t qu nh gi kh n ng hịu h n gi i o n y on n v tr ng lượng tư i t i nh lưới số 2 44

H nh 22: K t qu nh gi kh n ng hịu h n gi i o n y on n v o tr ng lượng kh t i nh lưới số 2 44

H nh 23: nh gi qu tr nh h gi l H9 45

H nh 24: nh gi qu tr nh h gi l M8 45

nh m c ảng

ng 1: Ph n lo i thực v t 3

ng 2: T nh h nh s n xuất ng tr n th giới những n m g n y 5

ng 3: T nh h nh s n xuất ng ở Việt Nam những n m g n y 10

ng 4: Th nh ph n inh ư ng trong 100g h t 11

ng 5: Tr nh tự m i 29

ng 6: K t qu t ng hợp th nghiệm huyển gen chịu h n 32

ng 7: Số opy gen huyển 39

nh m c c c ch vi t t t

WW i u kiện tưới nướ y

WS i u kiện x l h n

SH hi u o th n l LRL hi u i r i nhất FWS Tr ng lượng tư i th n l FWR Tr ng lượng tư i r DWS Tr ng lượng kh th n l DWR Tr ng lượng kh r

IM M i trường l y nhi m CCM M i trường ng nu i ấy REM M i trường nu i ph h i ECM M i trường h n l m s o SeM M i trường ph t sinh h i

RM M i trường r r

M Đ U

y ng l y lư ng thực quan tr ng cho n n kinh t to n u, l m t trong

n m y lư ng thự h nh a th giới S n phẩm từ ng ngo i l thực phẩm nu i sống on người ũng như ng v t r thể ược ng d ng trong nhi u ng nh như ược phẩm Ở nước Trung Mỹ, N m Á v h u Phi, người ta s d ng ng l m

lư ng thự h nh ho người với phư ng th c rất ng theo vùng ị l v t p

qu n mỗi n i Ng l y lư ng thự giúp nhi u n i gi i quy t n n i trong Việt N m S n phẩm từ ng ngo i l thực phẩm nu i sống on người ũng như

ng v t r thể ược ng d ng trong ng nh kh như ược phẩm G n y th n

ng ngo i việc s d ng l m hất ốt n l nguy n liệu ti m n ng ể ch t o x ng sinh h c

S n lượng ng h ng n m ị gi m sút ng kể bởi rất nhi u nh n tố sinh v t (biotic) ũng như phi sinh (abiotic) Trong h n h n l nguy n nh n phi sinh quan tr ng nhất khi n s n lượng ng mất m t l n n h n 70% ất kh ằn c ng với lượng nướ mư ph n ố kh ng u dẫn tới k t qu thu ho ch chỉ n 1,3 tấn/ha

gi m ng kể so với ti m n ng thu ượ h n 10 tấn/ ha [64] Ch nh sự kh ằn ã l

t ng tố qu tr nh lão h l , suy gi m kh n ng qu ng hợp dẫn n gi m sút

s n lượng [84]

ytokinin v i tr thi t y u n nhi u qu tr nh t ng trưởng v ph t triển

c a thực v t ặc biệt trong sự ph n hi t o [68] Trong ng nghệ nu i ấy m

t o in vitro, ytokinin v i tr rõ r ng trong việ giúp m l t h rời ch m tho i

h iệp l c tố Ngay c trong thực ti n th việc x l ytokinin ũng m ng nghĩ thư ng m i rất lớn v ytokinin giúp uy tr sự xanh tư i l u h n a rau sau thu

ho h v kéo i tu i th c a hoa sau khi cắt khỏi y [45]

Trong khi những phư ng ph p nh t truy n thống ã những th nh ng nhất ịnh trong việc t o ra những giống y hịu h n, th việc b sung v kỹ thu t

ng nghệ sinh h v o việc t o y huyển gen th h ng ược với h n h n ũng

ã ướ u ch ng minh ược k t qu c m nh ã những nghi n u v bi n

n p gen ipt- mã h enzyme isopentenyl tr nsfer se li n qu n n sinh t ng hợp

cytokinin isopentenyl adenine, ze tin v ihy roze tin v o m t số y tr ng K t

qu cho thấy trường hợp như: lú - Oryza sativa [41], súp l - Brassica oleracea [72] v x l h- Lactuca sativa L cv Evola [65], thuố l [84], ng [58], l c[78]

v ng [85] u t những th nh ng nhất ịnh Nhằm ướ u t o ra giống ng

kh n ng hịu h n, húng t i ti n h nh t i “Nghiên cứu tạo c c dòng ngô

mang gen isopentenyl transferase (ipt) ằng ph ng ph p i n nạp nh vi huẩn Agrobacterium tumefaciens” với m ti u:

 Bi n n p th nh ng gen ipt v o m t số ng ng h n l c

 Kiểm tra sự mặt c a gen ipt bằng kỹ thu t sinh h ph n t

 ướ u nh gi kh n ng hịu h n ở y on th hệ T1

Ch ng –T NG QUAN 1.1 Nguồn gốc cây ngô

Ng hay bắp t n kho h l Zea mays L Trong ti ng Anh từ “m ize” ắt

ngu n từ ti ng T y n Nh (m z) (“M ize”- Oxford English Dictionary online edition) Từ “ orn” thường hay s d ng hiện n y l h g i rút g n c “In i n orn” nghĩ l “ y lư ng thực c người nh i ng” (“M ize”-Oxford English Dictionary online edition.)

ảng 1: Phân oại thực vật

Giới (kingdom): Plantae(kh ng ph n h ng): Angiosperms(kh ng ph n h ng): Monocots(kh ng ph n h ng): Commelinids

h v ỏ teosinte 3.Tr i qua hai hay nhi u qu tr nh thu n h a c ng ho ng

d i v teosinte 4.Ti n h từ y l i c a Z diploperennis thu lo i Trips um [73,

102] Những nghi n u v i truy n h g n y ho rằng qu tr nh thu n h ng

i n r v o kho ng n m 7000 T N t i mi n trung Mexi o v t ti n n l lo i

ỏ teosinte ho ng i g n giống nhất với ng ng y n y vẫn n m trong lưu vự

s ng ls s [36] George Beadle v o n m 1939 ã hi sẻ qu n iểm n y trong nghi n u c m nh v ngu n gố y ng [27] Trướ v o n m 1926 Vavilop ũng ã h ng minh mi n trung n m Mehi o l trung t m ph t sinh th nhất v

vùng núi Andet thu Peru l trung t m ph t sinh th hai c y ng [98] ng

qu n iểm với ng l Galinat v K to l n lượt v o n m 1977 v 1988 [42, 55] Theo những nghi n u v kh o c h người t t m thấy những h th ch bắp ng

t i h ng Guil N quitz trong thung lũng O x ni n i kho ng n m 4250 T N,

v nhất l t i h ng ng Tehu n, Pue l ni n i 3450 TCN [86] n nh những nghi n u v o n m 2009 hỉ ra rằng ã những ng bằng ược

ho l ùng ể nghi n ng ở lớp tr m t h 8700 n m tu i [77, 80]

Từ ngu n gố ng ã l n r ng h t vùng thu h u Mỹ L n ph ắc,

s ng ph T y N m Ho kỳ v n ũng như xuống ph N m hile, E u or, olum i v nhi u vùng thu r zin Qu qu tr nh thự n h h u Mỹ c a người h u Âu m khởi u l huy n th m hiểm c olom us n m 1493 v ặc biệt l huy n th m hiểm th h i n m 1494, Ng ã ượ ư v o u ti n t i T y

n Nh v l n truy n khắp vùng n l i c h u Âu [21] Người t nh nh h ng

nh n bi t ượ gi trị c y ng v ph bi n húng ng y ng r ng rãi V o những n m u th kỷ XVI, ằng ường th y t u o Nh , T y n

Nh , It li ã ư y ng r h u h t l ị th giới ũ N m 1517, ng xuất hiện ở i p, Th Nhĩ Kỳ, Ph p, , s u l n m h u Âu v ắ Phi

N m 1521, ng n ng Ấn v qu n o In onesi V o kho ng n m 1575

ng ượ ư n Trung Quố [37]

Theo nh h L Qu n trong “V n i lo i ngữ”, ng ượ ư v Việt N m qu huy n i s Trung Quố (thời Kh ng Hy) ng Tr n Th Vinh (người huyện Ti n Phong, S n T y) v o uối th kỷ XVII Với ặ t nh qu u l

kh n ng th h ng r ng tr n nhi u ị h nh t i Việt N m , ng ã ượ nh n r ng

u ti n t i S n T y v vùng kh , ặ iệt l những vùng o kh ng kh

n ng tưới nướ thường xuy n Ng sớm ượ hấp nh n v ã trở th nh y lư ng thự ng th h i hỉ s u lú nướ t i Việt N m

1.2 T nh h nh nghiên cứu ngô trên th giới

y ng ược tr ng r ng rãi khắp n i tr n th giới, v s n lượng ng h ng

n m nhi u h n ất c lo i ngũ ố n o Theo số liệu n m 2009, t ng s n lượng ng

s n xuất ượ tr n th giới l 817 triệu tấn nhi u h n lú nước (678 triệu tấn) hay

lú m (682 triệu tấn) Trong s n lượng c a Mỹ l o nhất chi m n 40%, ti p

n l Trung Quốc, Brazil, Mexico, Indonesia, Ấn , Ph p, rgentin , N m Phi, Ukraine (theo FAOSTAT 2009) Trong n m 2009, h n 159 triệu h ng ược tr ng khắp n i tr n th giới với s n lượng trung nh l 5 tấn/ha

ảng 2: T nh h nh sản xuất ngô trên th giới nh ng năm g n đây

(FAOSTAT 04/08/2014)

(Triệu ha)

Năng suất (Tấn/ha)

Sản ng (Triệu tấn/ha)

Theo thống k uối n m 2014 u n m 2015 th t ng s n lượng ng s n xuất

ượ tr n th giới l n tới tr n 1 tỷ tấn (vượt tr i so với lú nước 740 triệu tấn v lú

mỳ 715 triệu tấn) H i nướ ng u v s n lượng vẫn l Mỹ (35%) v Trung Quốc (21%), ti p n l r zil, rgentin , Ukr ine (theo F OST T 2015) Diện

t h tr ng v n ng suất u t ng so với n m 2012 trở v trước

Như v y trong nhưng n m g n y, n ng suất v iện t h tr ng ng t ng nhưng kh ng th y i ng kể kéo theo t ng s n lượng ng ũng hỉ t ng nh Theo

dự o thực hiện n m 2003 c a viện nghi n u hư ng tr nh lư ng thực th giới IPRI nhu c u v ng sẽ n t ng cao h n nữa v o n m 2020 [76] Tuy nhi n, rất nhi u y u tố nh hưởng n n ng suất ũng như s n lượng ng o g m y u tố ngu n gốc từ sinh v t ( ioti ) như ỏ d i, s u ệnh… v y u tố phi sinh ( ioti ) như nhiệt , nh s ng, ngu n nướ …

Những ti n b v khoa h n i hung h y huyển gen n i ri ng u nhằm m c

h khắc ph c những vấn v ũng t ược m t số th nh tựu kh quan ng thời ng huyển gen ũng ượ ưu ti n theo hướng rõ r ng h n Quy tr nh ể

ph t triển y ng t i sinh từ m t t o i n n p ể ược t n suất cao với m c

ti u ặt ra: tố , u ra, kiểu gen c l p v v t ch ph t triển b n vững l ưu ti n quan tr ng h ng u trong ng nghệ sinh h c thực v t ể t m r quy tr nh

lo i m kh nh u l n lượt ược th nghiệm ể kiểm tra kh n ng t i sinh o g m:

ch i ỉnh, l , th n, tr tr n v ưới l m m, ph i non v h t [96]

Sự ph t triển nu i ấy m thực v t ặc biệt l ngũ ố ược thực hiện c

l p với những nỗ lực chuyển n p gen li n qu n ho n khi kỹ thu t bi n n p ược

ph t triển tr n y thuố l th người ta mới t nh n việc ng d ng ho y ngũ

cố V v y, qu tr nh ph t triển nu i ấy m v i n n p hư ượ ph t triển m t

h song song Nỗ lực bi n n p u ti n oe v S rk r v o n m 1966 l tr n phấn c y ng [34] G n y noãn ã th phấn ã ượ th nghiệm th nh ng như l m t ối tượng i n n p ởi nh kho h Trung Quố [33]

Ph i non ược s d ng r ng rãi trong việ t i sinh v i n n p ng từ khi

, việ tối ưu h th nh ph n m i trường ũng rất qu n tr ng, th nh ph n ã

ượ nghi n u h n l kỹ ng [28, 38, 106] Tuy nhi n, những h hất ặ iệt hỉ th h hợp với m t v i ối tượng thể [46] V v y việ h nh th nh hệ thống m i trường th h hợp ho m t v t liệu mới rất ấp thi t, ặ iệt trong huyển gen [75] Việ tối ưu h i u kiện ể h nh th nh m s o to n n ng kh n ng t i sinh từ ph i non ti p t ượ nghi n u v ã t ượ k t qu J ku ekov v

ng sự ã t i sinh th nh ng từ ph i non h i ng ng 18 v 19 ể r ượ

y ho n hỉnh [54]

n n m 2014, Lee v Zh ng ã ng ố quy tr nh ho n thiện v huyển gen

v o ng từ v t liệu n u l ph i non th ng qu vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens [60]

Những th nh ng u ti n v ng huyển gen thu v ng huyển gen

kh ng s u v thuố trừ ỏ Tuy nhi n, m t mối nguy hiểm ặt r l t n t i sự trao

i v t chất di truy n giữ y huyển gen v ỏ d i khi n thuốc diệt cỏ mất t

d ng m t gi i ph p ược Tilney- ssett ư r l huyển gen kh ng v o l c

l p DNA l c l p sẽ di truy n theo ng m v kh ng l n truy n qua h t phấn [97]

ặc biệt g n y gen chịu h n rất ượ qu n t m Tuy nhi n, kh n ng chịu h n l m t t nh tr ng ph c t p, nghi n u ã hỉ ra rằng m t chi n lược

ch n t o y ng hịu h n bi n i gen hiệu qu l hi n lược s d ng ùng m t lú nhi u gen chịu h n hiệu qu hoặc s d ng hỉ m t gen i u khiển t ng i u khiển nhi u gen th m gi qu tr nh hịu h n n nh gen i u khiển n gen

mã h ho protein h n ng th m gi v o những ph n ng uối ( ownstre m) trong huỗi p ng, giúp k h ho t những ph n ng ặ iệt p l i sự thi u h t nướ o h n h n

Theo nghi n u c Nelson v ng sự v o n m 2007 th gen

ZmNF-YB2 giúp t ng n ng suất giống ng i n i gen l n h n gấp hai l n so với y ối

ch ng y huyển gen iểu hiện chịu h n tốt với kh n ng uy tr qu ng

hợp, h m lượng diệp l c tố n ịnh, gi m héo rũ Gen ZmNF-YB2 l gen ược

x ịnh từ b gen c y m h nh Arabidopsis v ngu n gốc từ lo i h

h ng y ng ượ ng ty Mons nto u tư v thư ng m i h s n phẩm ng chuyển gen chịu h n [71].

N m 2009, ssem ã nghi n c u chuyển gen NPK1 (Nicotiana Protein Kin se) v o giống ng i p th ng qu vi khuẩn A tumefaciens Gen NPK1 li n

qu n n kh n ng hịu p suất thẩm thấu giúp ng hống chịu ượ t nh tr ng thi u nướ ũng như sống trong m i trường n ng muối cao ssem n k t

hợp chuyển gen bar- gen kh ng thuốc trừ cỏ như l m t nh n tố ch n l c thực v t

K t qu chuyển gen th nh ng với hai lo i ng i p (Gz 639 v Gz 649) v

ng ng Mỹ A188 với sự trợ giúp a promoter 35S C4 PPDK [23]

Gen DREB ( ehy r tion-responsive element- in ing) l nh n tố phi n mã

th m gi t h ự v o qu tr nh hống hịu với i u kiện ất lợi m i trường ằng h k h ho t sự ho t ng gen th m gi trự ti p hống l i i u

kiện ất lợi m i trường như h n h n, mặn, l nh Gen DREB ã ượ i n n p

v o ng g m DREB1A/CBF3 t h từ r i opsis [16] hay ZmDREB ượ t h

từ h nh gen giống ng 73 [62]

Gen ipt mã h enzyme isopentenyl tr nsfer se, enzyme n y t ng t ng

n ng ytokinin th ng qu việ t ng hợp ti n hất trong qu tr nh t ng hợp Khi qu tr nh h gi l ượ nh n i t ởi promoter, n ng ytokinin trong

m sẽ ượ t ng l n giúp tr hoãn qu tr nh Qu tr nh n y l m t ng n ng h

-m n hệ thống nhưng l i kh ng l -m th y i lớn v kiểu h nh V o n -m 2004,

Ro son v ng sự ã nghi n u chuyển gen ipt từ vi khuẩn Argrobacterium s

d ng promoter PSEE1 từ ng ể l m h m qu tr nh lão suy ở l ng ng

biểu hiện gen chuyển ã ượ ph n t h hi ti t ở ấp biểu hiện kh nh u

tr n kiểu h nh M t trong ng ng ã những biểu hiện rõ r ng Nghi n u

n y ã h ng minh ược việc chuyển gen kh n ng l m h m qu tr nh lão h thực hiện ượ tr n y m t l m m n i hung h y ng n i ri ng [85]

n nh n hướng nghi n u nhằm t ng o những ặ t nh lợi cho thực v t như huyển gen t o y s n xuất protein ng v t [88, 89] Chuyển gen th y i h m lượng v hất lượng hất inh ư ng c y [59]

Giống ng huyển gen u ti n ượ hấp nh n l SYN-EV176-9 t i Ho Kỳ

o ng ty Syngent ng k v o n m 1995 y l giống ng huyển gen hống thuố trừ ỏ glufosin te v kh ng s u nh v y Lepi opter V s u g n 20 n m,

n m 2013 giống ng huyển gen hịu h n roughtG r TM l n u ti n ượ tr ng ũng t i Ho kỳ ho n n y 4 sự kiện ng huyển gen chịu h n ã ượ thư ng

m i h t i Mỹ, trong 01 sự kiện n t nh tr ng l MON87460 m ng gen cspB (gen

ph n l p từ Bacillus subtilis)-t n thư ng m i: Genuity® roughtG r ™ v 03 sự kiện

t nh tr ng ượ l i t o từ sự kiện tr n: (1) MON87460 x MON89034 x

MON88017: kh ng thuốc trừ cỏ Glyphosate (cp4 epsps), kh ng s u nh ng (cry3Bb1), nh v y (cry1A.105, cry2Ab2), chịu h n (cspB); (2) MON87460 x MON89034 x NK603: t nh tr ng: kh ng thuốc trừ cỏ Glyphosate (cp4 epsps),

kh ng s u nh v y (cry1A.105, cry2Ab2), chịu h n (cspB); (3) MON87460 x NK603: t nh tr ng: kh ng thuốc trừ cỏ Glyphosate (cp4 epsps), chịu h n (cspB)

(ISAAA,2015)

1.3 T nh h nh nghiên cứu ngô ở Việt Nam:

Ở Việt N m, ng l y lư ng thự ng h ng th h i s u lú nước Ph n ố

r ng khắp c nước ở h u h t vùng sinh th i với 8 vùng h nh: vùng ng ng bằng Bắc b , vùng ng Việt Bắ v ng ắc b , vùng ng T y ắc b , Vùng ng Bắc Trung b , vùng ng uy n h i Nam Trung b , vùng ng T y Nguy n, vùng ng

ng N m v vùng ng ng bằng s ng u Long Diện t h gieo tr ng v n ng suất, s n lượng ng ũng t ng m nh, từ h n 200 ng n h với n ng suất 1 tấn/ha (n m 1960) nhờ mở r ng giống ng lai s n xuất v i thiện iện ph p nh

t , n n m 2009 ã vượt ngư ng 1 triệu ha với n ng suất 4,3 tấn/ha So với nước tr n th giới th n ng suất ng ở ta vẫn thu c lo i kh thấp, ưới m n ng suất trung nh t i thời iểm l 5tấn/ha (theo FAOSTAT, 2009) ặc biệt t i m t

số ị phư ng mi n núi vùng s u, vùng x tỉnh L i h u, S n L , Th nh

H , Qu ng N m, L m ng… m t số ng o n t t người s d ng ng l ngu n lư ng thực, thực phẩm h nh, s d ng giống ng ị phư ng v t p qu n

nh t l c h u n n n ng suất ng ở y hỉ t tr n ưới 1 tấn/ha Theo số liệu

thống k mới nhất từ FAOSTAT-2015, s n lư ng ng a Việt Nam n m 2013 l 5,2 triệu tấn với diện t h gieo tr ng t ng nh so với n m 2010 n 1170 ngh n h

t n ng suất 4,44 tấn/h t ng h n 3% so với n m 2012 M t ng trưởng n y

kh ng thể p ng nhu u trong nước, h ng n m húng t n ph i nh p khẩu kh nhi u ng h t (trị gi tr n 500 triệu US ) ể s n xuất th n gi sú

ảng 3: T nh h nh sản xuất ngô ở Việt Nam nh ng năm g n đây

(FAOSTAT 04/08/2014)

(Ngh n h

Năng suất (Tấn/ha)

Sản ng (Triệu tấn/ha)

Hiện n y v trong những n m tới, ng vẫn l y ngũ ố v i tr qu n tr ng

ở nước ta Gi trị inh ư ng c ng kh o với 10,6% protein (zein), 4-5% lipit (50% l xit linolei , 31% l xit olei , 13% l xit p nmiti v 3% l Ste ri ), 69% gluxit (ch y u l tinh t v m t số ường n v kép), hất kho ng (gi u photpho, nghèo nxi) v vit min ( 1, rotene- ti n vitamin A) Ng rất nhi u ng

d ng, tất c ph n c y ng từ h t, n th n, l u thể s d ng ượ ể

l m lư ng thực, thực phẩm ho người, th n ho gi sú , l m nguy n liệu cho

ng nghiệp như rượu ng , s n xuất eth nol ể ch bi n x ng sinh h c, th m h

n n h bi n t o ra m t số v t d ng ùng, trang s c c a ph nữ H u h t

ph n c ng h a m t số chất v i tr như m t lo i thuốc chữa bệnh

nhờ ch h m lượng kali cao H t ng v m m ng giúp t ng ường kh n ng hấp

th inh ư ng, trị i ngo i ph n sống, l ng r u ng ru t bấ th n ng un nước uống t ng lợi tiểu, lõi ng un nướ l vị thuốc chữa ch ng bệnh ra m h i [1] Ngo i r ph n bỏ i thể l m hất ốt

tr nh sinh trưởng ng l m gi m n ng suất [40]

Hệ thống tưới ti u th s n n việc tr ng ng ở Việt Nam ph thu c ch y u từ

“nước trời” chi m tr n 70%, diện t h h ng tưới chỉ kho ng 30% Ngu n nước cung cấp ho ng ượ hi r l m h i ngu n h nh g m nướ mư v từ ao h

s ng suối Tuy lượng mư trung nh h ng n m nướ t v o kho ng 1700-2000 mm cho nhu c u sinh trưởng v ph t triển c y ng nhưng lượng mư l i t p trung theo mù n n v o mù kh y ng thường bị thi u nước Với những hiện tượng

i n i kh h u g n y, h n h n nguy x y thường xuy n h n [87] M g n

y nhất l ợt h n h n từ uối n m 2014 n t n giữ n m 2015 ở tỉnh N m Trung ặ i t l Ninh Thu n khi n t nh h nh s n xuất h n 6.100 h ất ph i

t m ngừng s n xuất Nhu u t o r giống y tr ng hịu h n n i hung h y ng hịu h n n i ri ng l ấp thi t h n o giờ h t

Ng chuyển gen chịu h n l th h th c lớn ngay c ối với huy n gia

h ng u tr n th giới bởi v n ph thu v o nhi u gen kh nh u h kh ng ph i

n gen nh kho h c Việt N m ã s d ng phư ng ph p truy n thống

k ross (l i ngượ ) ể l i t o t nh tr ng chịu h n v o m t số ng ng thư ng

m i Hay ng ng sinh h ph n t v o h n giống ể t n ng giống s n

ở Việt N m ng hú nhất g n y l “ t i nghi n u huyển gen n ng cao t nh hịu h n v o m t số ng ng ố m ng ượ p ng trong s n xuất”,

m t t i cấp nh nướ , mang mã số KC.04.02/11-15 do TS ùi M nh ường- Viện ph Viện nghi n u Ng l h nhiệm t i V o u n m 2014 Viện Nghi n u Ng ũng ã th ng o ã huyển th nh ng 3 gen hịu h n o g m

DREB2A, HVA1 v CspB v o 3 ngu n v t liệu ng Việt N m ằng phư ng

ph p huyển gen th ng qu vi khuẩn A tumefaciens

ùng với phư ng ph p h n t o giống truy n thống ng y ng hiệu qu h n

th việc ng d ng ng nghệ sinh h ể t o r giống ng i n i gen kh

n ng chống chịu với i u kiện bất thu n sinh h v phi sinh h c ũng ã ược triển khai t i Viện Di Truy n N ng Nghiệp Từ n m 2003, l n u ti n ở Việt N m,

Ph m Thị L Thu ã nghi n u x y ựng hệ thống t i sinh ở ng ph v ho

huyển gen ằng Agrobacterium v súng ắn gen t o y huyển gen b n vững

bằng phư ng ph p n y tr n ng ng ngu n gố n ới như 188, H99 Viện ã t o ượ ng ng huyển gen b n vững m ng gen: kh ng thuốc

diệt cỏ, gen GFP, gen kh ng kh ng sinh, gen t ng ường hấp th nit v gen hịu

l nh [8-10] V v o n m 2007 ã ti n h nh i n n p gen gus/p t v o ng ng

m h nh (HR8 HR9) [7]

N m 2009, Nguy n V n ng v ng sự ã những th nh ng ướ u trong nghi n u kh n ng ph t sinh m s o ph i h v m t i sinh y ho n chỉnh từ ph i non a m t số ng ng Việt Nam [3] Nghi n u n y ũng l ước

ệm c hư ng tr nh ng Nghệ Sinh H N ng Nghiệp t o i u kiện cho những

th nh ng s u n y Ph i kể n l i n n p th nh ng gen Cry 1Ac v o 2 ng

ng m h nh HR8 v HR9 [4] H n th nữa l n u ti n t i Việt N m, gen kh ng

s u Cry 1Ac ã ược bi n n p th nh ng v o ng ng h n l c [5] Nghi n

c u v bi n n p gen kh ng h n v o m t số ng ng h n l th ng qu vi khuẩn A

tumefaciens ũng ng ướ u ược triển kh i nghi n u v t ược m t số k t

qu nhất ịnh [6] Ph n l p v thi t k ve tor m ng gen i u khiển t nh hịu h n

ph c v ng t t o giống y tr ng chuyển gen ũng ng thực hiện ở Viện Di Truy n N ng Nghiệp [13] ước ti p c n với vấn chuyển gen chịu h n v o

ng ng ở Việt N m ũng ng thời ược triển khai t i ph ng th nghiệm tr ng iểm ng Nghệ T o Thực V t – Viện Di Truy n N ng Nghiệp

Việ tr ng th nghiệm y tr ng i n i gen mặ ù vẫn ng tr nh ãi, nhưng từ n m 2011, N ng nghiệp v Ph t triển n ng th n ã ấp phép kh o nghiệm nh gi nh hưởng n m i trường v ng sinh h m t số giống

ng huyển gen ã ượ thư ng m i h như: (1) ng ty Syngent kh o nghiệm

ng huyển gen G 21 kh ng s u th n v ng t11 kh ng thuố trừ ỏ (2)

ng ty eK l kh o nghiệm ng MON89034 kh ng s u nh v y v ng NK603 kh ng thuố trừ ỏ (3) ng ty Pioneer Hi- re kh o nghiệm ng EVENT

T 1507 kh ng s u nh phấn ướ kh o nghiệm n n y (n m 2015) ã

k t thú v mới y ã ấp h ng nh n ho h i ng ty eK l v Syngent

ượ n r ng rãi ng i n i gen tr n thị trường Việt N m H i ng ty n y ng triển kh i m h nh iểm tr ng th nghiệm giống ng i n i gen n y t i tất vùng tr ng ng tr ng iểm tr n to n quố

1.4 C sở ho học v nghiên cứu nạp gen vào thực vật bằng ph ng ph p

Agrobacterium tumefaciens

Hiện n y rất nhi u kỹ thu t chuyển gen kh nh u v o t o song kỹ thu t

chuyển gen bằng vi khuẩn A tumefaciens vẫn ược ng d ng r ng rãi l nhờ những

ưu iểm sau:

 Kh ng i hỏi d ng c ặc biệt

 Số lượng b n copy thấp v n ịnh ở th hệ on h u

 D th o t invitro, l m

 y l kỹ thu t n gi n, hi ph thấp

1.4.1 Ti-Plasmid

Ti-pl smi l m t plasmid lớn với k h thước kho ng 200k Tr n Ti-plasmid

o n T- N (tumor N ) ược giới h n bằng bờ ph i (right or er) v ờ tr i (left or er) Tr nh tự nucleotid c a bờ ph i v ờ tr i tư ng tự nhau T- N l

m t o n k h thước 25kb ch gen t ng hợp opine v o n n y sẽ ược chuyển v o t o thực v t gắn v o nhi m sắc thể c a t o y h v g y r bệnh u

H nh 1: Cấu trúc Ti-plasmid

Ngu n: L Thị Thu Hi n (2003), “T o ch ng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens m ng gen kh ng

n trùng ể chuyển v o y tr ng”, Luận văn iến sĩ sinh học, Viện ng nghệ sinh h , H N i

[14]

Ngo i T- N , tr n Ti-pl smi n vùng vir (vir region) chịu tr h nhiệm

ho t ng l y nhi m, chuyển n p ( onjug tive tr nsfer) v ti u h opine (opine catabolism)

Dự v o h n y on người lợi d ng vi khuẩn ất ể chuyển gen mong muốn ho m nh tr n sở thi t k l i hệ thống Ti-plasmid c a vi khuẩn sao cho vẫn

m b o ược ch n ng chuyển gen nhưng kh ng m ng gen g y ho y Người t ã t o r ng vector mới ể chuyển gen l những ve tor li n hợp (co-intergr te ve tor) v ve tor nhị thể (Binary vector)

a H thống vector ng li n hợp

Hệ thống ve tor li n hợp (co-integr te ve tor) l k t qu c a sự li n hợp hai

lo i plasmid: Ti-pl smi ã lo i trừ vùng gen g y khối u v gen t o hợp chất

opine nhưng vẫn giữ l i vùng vir v vùng ờ tr i, ờ ph i Th y v o những gen bị

cắt bỏ l o n tư ng ng với m t o n tr n pl smi th hai (plasmid trung gian)

ể ph c v cho việ li n hợp hai lo i pl smi Pl smi trung gi n l m t plasmid

t h ng từ vi khuẩn E.coli v thể t i sinh ược ở Agrobacterium Pl smi n y

h vùng gắn gen c n chuyển n p, gen hỉ thị ph c v việc ch n l v mặt o n tư ng ng Khi ho tư ng t h i lo i pl smi n y với nh u húng sẽ

li n hợp qua sự tr o i héo giữ h i o n tư ng ng v h nh th nh n n ve tor

li n hợp Ve tor li n hợp n y nằm trong vi khuẩn A tumefaciens v ho t ng theo

h chuyển gen th ng thường c a vi khuẩn ất Do t n số ư pl smi trung gi n

từ E.coli sang Agrobacterium rất thấp (10-7-10-5) n n ve tor n y t ược s d ng

H nh 2 : Hệ thống vector iên h p

Ngu n: L Thị Thu Hi n (2003),“T o ch ng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens m ng gen kh ng

n trùng ể chuyển v o y tr ng”, Luận văn iến sĩ sinh học, Viện ng nghệ sinh h , H N i

[14]

b H thống vector p

Hệ thống vector nhị thể kh với ve tor li n hợp l húng h i ve tor

(pl smi ) ùng mặt v ho t ng trong Agrobacterium M t pl smi t h ng

từ E.coli trong thi t k vùng ờ tr i v ờ ph i, nằm giữ húng l gen hỉ

thị v vùng gắn gen c n chuyển Plasmid th h i l Ti-plasmid c i ti n: to n

vùng T- N v vùng ờ tr i v ờ ph i bị cắt bỏ chỉ giữ l i vùng vir, pl smi n y

ược g i l pl smi hỗ trợ Hệ thống ve tor n y ũng ho t ng theo h chuyển

gen c a vi khuẩn ất A tumefaciens m t h rất hữu hiệu

H nh 3 : Hệ thống vector nh th ( ép

Ngu n: L Thị Thu Hi n (2003), “T o ch ng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang gen

kh ng n trùng ể chuyển v o y tr ng”, Luận văn iến sĩ sinh học, Viện ng nghệ sinh

h , H N i [14]

Thực t cho thấy, plasmid với h i n vị s o hép thể kh ng n vững

trong E.coli khi c h i vùng n y ho t ng Tuy nhi n, ve t nhị thể m t số ưu

iểm sau:

+ Kh ng x y r qu tr nh t i t hợp giữ pl smi

+ K h thướ ve t kh nhỏ

Nhờ v y, hiệu qu chuyển gen giữa E.coli với Agrobacterrium t ng l n Hiện

nay, ve t nhị thể ược s d ng r ng rãi với rất nhi u lo i ược thi t k phù hợp với y u u c qu tr nh huyển gen

1.4.2 Chức năng c T-DNA

H nh 4: Cấu trúc T-DNA

Khi y nhi m A tumefaciens, o T- N n p v o trong hệ gen y h

ắt u ho t ng v s n sinh r uxin, ytokinin v opine, to n sinh trưởng

y ị rối lo n, t o ph n hi v t h v t o r khối u Opine ượ vi

khuẩn s ng như m t lo i “thức ăn” Nhờ gen huyển h opine tr n Ti-plasmid

Ph n t h i truy n v ng d ng kỹ thu t l p b n li n k t gen ho phép húng t hiểu ược ch n ng vùng m ng T- N , vùng n y ược thể hiện theo

sự li n hợp nhất T- N ượ ư v o N thực v t trong nh n t o Vị tr gắn

v o thường l ngẫu nhi n, tuy nhi n thường l những vùng kh n ng s o hép

Sự t ng hợp opine ượ i u khiển bởi T-DNA Những enzime như: o topine

synth se, nop line synth se ượ mã h tr n T-DNA t i những loci: ocs v nos

theo th tự, những vùng a T- N kh quen thu c với c hai plasmid: octopine

v nop line

1.4.3 C ch chuy n gen ằng A tumefaciens

t o thực v t bị t n thư ng sẽ ti t r hợp chất h h c dẫn d vi khuẩn như: etosyringone, hy roxyl- etosyringone… ưới t d ng c hợp

chất n y, A tumefaciens nh n bi t r i m v o th nh t o h v huyển T-DNA

v o t o thực v t Qu tr nh n y ược sự trợ giúp ặc biệt c gen Vir v R ,

L ũng h nh hợp chất n y, với v i tr m ng, giúp ho gen vùng vir

ho t ng v t ng ường biểu hiện

Ho t ng c gen vir sinh ra sợi n T- N l m xuất hiện b n copy sợi

n ưới c a T-DNA Chỉ o n sợi n N giữ h i tr nh tự i n (L v R ) a T-DNA mới ược chuyển v o t o thực v t, v ược gắn v o genome c a t o

l y u tố ho t ng cis c a hệ thống v n chuyển T-DNA Protein vir D1, D2

ng v i tr l h kh trong ướ n y, húng nh n r tr nh tự i n T- N v ắt sợi n ưới t i mỗi n iểm cắt l iểm u v k t thú a sợi t i sinh S u , protein vir D2 vẫn n gắn k t với u cuối 5‟ a sợi T- N v t o thực v t

N u g y t bi n hay lo i bỏ o n R th h u như mất ho n to n kh n ng huyển T- N , n n u t bi n LB sẽ l m gi m hiệu qu chuyển T- N i u h ng

tỏ t ng hợp sợi T-DNA từ u 5‟ n 3‟, ược bắt u từ o n R v k t thú ở LB Phư ng tiện ể chuyển o n T- N v o nh n t o thực v t l ph c protein

v sợi T- N Theo số nh kho h c cho rằng, ph c hợp sợi n T-DNA-vir

2 ược bao b c bởi protein vir E2 tr ng lượng 96 kDa Sự phối hợp n y giúp

ng n n sự tấn ng nu le se, h n nữa sợi n T-DNA duỗi thẳng l m gi m

k h thước c a ph c xuống xấp xỉ 2 nm, t o i u kiện thu n lợi ho qu tr nh i chuyển qu k nh ẫn truy n tr n m ng t o Protein vir E2 ch ựng h i t n hiệu ịnh vị trong nh n t o thực v t v m t protein vir D2 Thực t cho thấy 2 protein n y v i tr qu n tr ng trong việ n x p sự hấp th ph v o trong nh n

t o thực v t N u lo i bỏ t n hiệu ịnh vị trong nh n th m t trong protein n y

bị gi m, nhưng kh ng c ch ho n to n qu tr nh huyển T- N v tư ng t giữa T-DNA với genome t o thực v t, ch ng tỏ m t th nh vi n kh thể m

nh n m t ph n tối thiểu v i tr a protein bị thi u Protein vir E c n thi t ối với

qu tr nh i xuất protein vir E2 sang t o thực v t

Protein vir 4 kh ng thể thi u ối với sự v n chuyển ph c ss-T-DNA Ch c

n ng protein vir 4 l li n k t với TP c l p với ph c protein c n thi t ối với qu tr nh huyển T-DNA

nghi n u ng ố trướ y ã mi u t v i tr protein vir k h thướ 9,5 k trong qu tr nh s n sinh cấu trú mặt c a t o ối với sự v n chuyển ph c từ vi khuẩn sang t o thực v t

Protein vir l protein t nh kị nướ tư ng tự protein k t hợp tr n m ng

kh Ph n lớn protein vir ã ượ ph t hiện giống như k nh protein xuy n m ng Tuy nhi n, ũng thể v i protein vir kh ượ ph n phối l i trong qu tr nh

ph t sinh sinh v t v thực hiện ch n ng k nh k t hợp qua t o v n chuyển

ng hú l trong protein vir 2, vir 11 l th nh ph n n c a b m y v n chuyển T-DNA từ t o vi khuẩn sang t o thực v t Sau khi T- N qu m ng

t o, húng i thẳng v o nh n v k t hợp với hệ gen thực v t, bắt u ho t ng

v s n sinh r uxin, ytokinin v opine g y n n sự ph t triển th i qu h ng

lo t t o l n n dẫn n sự h nh th nh khối u

Hiện n y nh nghi n u ã t m r h ng A tumefaciens mẫn c m với

y 1 l m m trong ng , lú v ã nh n ượ y huyển gen hữu th [53] A tumefaciens ng v i tr qu n tr ng trong kĩ thu t di truy n thực v t ũng

như nghi n u n v sinh h ph n t A tumefaciens ược s d ng r ng

rãi v ưu iểm h n hẳn phư ng ph p huyển gen trực ti p kh thể l : số

b n s o ược chuyển v o t o thực v t thấp o t ng kh n ng huyển gen b vững v hiệu qu chuyển gen o Ngo i r phư ng ph p n y tr nh ược sự h nh

th nh y huyển gen thể kh m [39]

Hiệu qu bi n n p th ng qu A tumefaciens n ph thu v o m t số y u tố

kh như: h ng lo i A tumefaciens, cấu trú ve tor chuyển gen, kiểu gen thực v t,

h x l m thực v t, ngu n v t liệu g y nhiểm, m t vi khuẩn,thời gi n ng

nu i ấy, th nh ph n c m i trường nu i ấy, nhiệt ặc biệt l kh n ng t i sinh c a thực v t sau khi bi n n p

1.4.4 Gen ch th - gen chọn ọc và c ch hoạt động chọn lọc c a

hygromycin

ể ch ng minh gen m ti u mặt trong m thực v t hay lo i bỏ ũng như

t h những m h y t o huyển gen ra khỏi m kh ng ược chuyển gen,

nh nghi n u thường s d ng gen chỉ thị v gen ch n l c Những gen n y ược

lắp ghép trong NA pl smi v ùng ược chuyển v o t o nh n với gen m c

ti u

Gen ch n l thường ược s d ng l gen mã h ho m t số enzyme chỉ trong vi khuẩn ch kh ng trong thực v t ở i u kiện tự nhi n S u khi huyển gen n u thấy sự ho t ng c a enzyme vi khuẩn th thể ho l gen ch n l ũng như gen m ti u ã ược gắn v o m y i truy n c a thực v t

M t gen chỉ thị hay ch n l ượ xem l hữu h khi n kh ng g y h i n sự

tr o i chất c y, thể ùng ng v nh y c m với th nghiệm ph t

hiện M t số gen hiện n y thường ùng ể chỉ thị trong kỹ thu t chuyển gen: gus,

gal, luc, cat, nos v gen h n l c: nptII, hpt, gent, aat, bleo, bar, bxn

Hygromy in phosphotr nsfer se mã h từ gen hpt l m t gen ch n l th h

hợp cho c ng lẫn thực v t Gen n y ượ ph n l p v ng h từ m t t bi n ở

E oli Gen n y ng ược s d ng r ng rãi trong ng nghệ sinh h c thực v t Enzyme hpt t ng bất ho t hygromycin

Những t o kh ng huyển gen sẽ bị c ch sự ph t triển Biểu hiện l sự

ch t hay sự mất m u x nh a m nh m v huyển d n s ng m u trắng Những t

b o gen huyển sẽ s n xuất r enzyme hygromy in phosphotr nsfer se t

d ng phosphoryl h hygromy in v l m mất ho t t nh kh ng sinh n y Nhờ v y m những m huyển gen thể ph t triển nh thường

1.5 C ch ch u hạn hiện t ng già h và gen IPT

1.5.1 C ch ch u hạn c thực vật

h hịu h n ở thự v t ượ hi l m lo i:

 Kh n ng y thể ho n th nh hu kỳ sống n trướ khi sự thi u h t nướ xuất hiện

 Kh n ng y tể sống ,ph t triển v ho n ng suất trong i u kiện ung

ấp nướ h n h hoặ th ng tr i qu gi i o n thi u nướ v ti p t

ph t triển khi i u kiện trở l i nh thường

 Kh n ng y tr ng hống l i sự thi u h t nướ ằng h uy tr nướ trong

m t o o

1.5.2 Hiện t ng già h và c c y u tố ảnh h ởng

Sự gi h l gi i o n ph t triển cuối ùng a thực v t Ở gi i o n n y bao

g m m t chuỗi sự kiện trong xuất hi n sự t i hấp thu hất inh ư ng, dẫn

n sự ph h y t ch c t o v k t thú l sự ch t c a t o iểu hiện c a gi

h th ng qu việc mất kh n ng ph n hi t o, ph h y i ph n t như RNA, protein, diệp l c tố, ph v o qu n, t ng kh n ng ph n gi i, gi m kh

n ng t ng hợp Gi h a ở l ắt u bằng sự v ng l ở mép r i s u l n trong

Sự gi h bị k h th h ởi stress m i trường như ường chi u s ng y u, thi u h t inh ư ng, kh h n, ng p nước, sự t h rời c a thực v t hay sự tấn ng

c a vi sinh v t [43, 93]

1.5.3 Đi u hò sự già h và v i trò c Cyto inin

nhi u y u tố t ng d n việ i u h qu tr nh h gi l như: nh

s ng, nitrogen, ường, cytokinin [103] y u tố n y t ng trực ti p hoặ gi n

ti p n việ t ng ường h y k m hãm sự h gi c l

ytokinin l m t nh m h -m n thự v t ng v i tr i u khiển nhi u quy

tr nh sinh h o g m ph n ng l i với i u kiện ất lợi m i trường ằng

m ng lưới t n hiệu ph t p Tuy h n y hư th t sự rõ r ng nhưng sự th y i

n ng ytokinin v những t n hi u li n qu n nh hưởng l n h i huỗi ph n ng sinh h s isi i ( ): ph thu v kh ng ph thu h i huỗi ph n ng n y giúp thự v t th h ng với những i u kiện ất lợi m i trường [48]

H n h n h nh l nguy n nh n c ch sự t ng hợp v v n chuyển cytokinin [104] N ng cyokinin thấp g y r c ch sự sinh trưởng, gi m kh n ng hịu h n

v khởi u cho sự gi h [57] V thực t chỉ ra rằng, sự gi h x y ra khi n ng cytokinin s t gi m ưới i u kiện thi u nướ nh n t o ũng như tự nhi n [70]

V o uối th p kỷ 50, Ri hmon v L ng ã hỉ ra rằng thể tr hoãn qu tr nh gi

h bằng h s d ng cytokinin [83] Tuy nhi n s d ng cytokinin từ n ngo i

kh ng em l i hiệu qu kinh t Ho t t nh ph n t ũng như v i tr a cytokinin ũng ã ượ ng ố [30, 63] M t hướng nghi n u ượ ặt r l t o ra enzyme isopentenyl transferase nhằm t ng ường t ng hợp cytokinin trong thực v t th ng

qua gen ipt Gen ipt ượ h ng minh l kh n ng gi m sự gi h ở l , t ng

ường v uy tr qu tr nh qu ng hợp trong i u kiện ị stress kéo theo việ gi m

ng kể thiệt h i v n ng suất [48]

1.5.4 Gen ipt và promoter pSARK12

Gen ipt ã ượ t m thấy trong plasmid vi khuẩn A tumefaciens bởi Akiyoshi

v rry c l p nghi n u v o n m 1984 [15, 26] Gen n y ượ hèn ởi m t intron 252 p mã h ho m t polypeptide ch a 329 amino aci tr ng lượng

ph n t 37.2 kD Gen nằm ở vị tr th 4 trong plasmid c a vi khuẩn A tumefaciens

mã h ho enzyme isopentenyl transferase [66], l enzyme th y gi i ướ u ti n

c on ường sinh t ng hợp cytokinin [32]

Tuy nhi n m ytokinin qu o l i g y nh hưởng n sự t ng trưởng v sinh s n [61, 67, 94] ể khắ ph i u n y n ph i m t promoter ể x ịnh

v ịnh hướng sự ho t ng gen Hiện n y hỉ m t v i promoter thể s ng

hiệu qu , trong promoter SARK (p SARK: senescence associated receptor protein

kinase) Gen SARK ượ t h từ u ve (Phaseolus vulgaris) Gen hỉ iểu hiện

ở thời kỳ uối trướ gi i o n h gi [49] u iểm promoter SARK l thể

ti t h h m lượng ytokinin v i u hỉnh m t h n ằng giữ nhu u ytokinin trong i u kiện thi u nướ v tr nh nh hưởng n ng ytokinin t ng cao l n sự sinh trưởng v ph t triển y tr ng [35]

Việc nghi n u gen p SARK -IPT ã ược thực hiện tr n m t số ối tượng:

thuố l [84], ng [58], l c [78], lú [74, 79, 81]

1.6 C c ph ng ph p i m tra sự c mặt và i u hiện c a gen bi n nạp 1.6.1 Ph ng ph p Southern blot

Phư ng ph p Southern lot ượ E win Southern thu i E in urgh

ph t triển v o n m 1975, ho phép nghi n u v ph t hiện m t o n N ặ hiệu trong to n gen, giúp kiểm tr k t qu huyển gen v số opy hoặ kiểm tr sự mặt m t gen n o trong gen t o [95] ể thự hiện ượ qu

tr nh l i, u ti n, người t ph i t h DNA gen S ng enzyme ắt giới h n ể

ắt ph n t N th nh những o n nhỏ, iện i tr n gel g rose ể t h những

o n k h thướ kh nh u G y i n t nh N tr n gel ằng ung ị h NaOH

0,5M, s u , huyển N từ gel s ng m ng l i (nitro ellulose) Trong qu tr nh huyển, vị tr N ượ giữ nguy n

DNA ố ịnh tr n m ng ượ l i với mẫu ( nh ấu ph ng x hoặ kh ng),

ở nhiệt t h hợp v thời gi n l i kho ng 8-16 giờ S u qu tr nh l i người t r

m ng l i ể lo i ỏ những mẫu kh ng ắt ặp huy n iệt với N ố ịnh tr n

m ng l i

uối ùng, người t ùng kĩ thu t hiện m u hoặ ph ng x tự ghi ể ịnh vị

ph n t l i

1.6.2 Ki m tr hả năng ch u hạn ở t i cây con

Kh n ng hịu h n y ượ nh gi qu nhi u y u tố o g m: i u chỉnh p suất thẩm thấu, sự ng mở lỗ kh , ho t t nh hất iệp l , kh n ng giữ nướ l , khối lượng v thể t h r , iện t h l , t ng v t hất kh …Sự sinh trưởng v ph t triển ũng như n ng suất ng ị nh hưởng h y u v o h i thời kỳ: thời kỳ y on v thời kỳ trỗ ờ – l m h t [25] S n xuất ng t i vùng nhiệt

ới thường gặp t nh tr ng y vừ m 1-2 l nhưng s u kh ng mư hoặ

mư mu n g y r thiệt h i lớn v kinh t

Trong y u tố th tố sinh trưởng r ng v i tr rất qu n tr ng,

tố sinh trưởng r t ng h y r n s u v r ng giúp y t n ng ượ nướ ở ưới s u h y s ng nướ triệt ể theo hi u ng ng Tố sinh trưởng

r o kéo theo hi u i r v t ng khối lượng hất kh t ng, h i y u tố rõ r ng

h n lo i r kh [101] giống kh nh u kiểu r kh nh u M t số sinh nhi u r ốt, số kh l i sinh nhi u r th cấp Ch n l ng khối lượng r lớn l

m t chỉ ti u hữu h ẫn n t ng n ng suất trong i u kiện h n vừa Chi u i r

ốt s i kh nh u nghĩ giữ v t liệu ng trong i u kiện h n khẳng ịnh

rằng nhi u giống ng nhiệt ới nhi u r ốt h n, giúp y hút ẩm ở t ng ất mặt tốt h n th ng qu h i u chỉnh p suất thẩm thấu khi gặp h n tốt h n với r th cấp [69]

Tốc i l xu hướng mẫn c m nhi u h n i r Tố i l t ng trong khi gặp h n ược s d ng r ng rãi ể t o giống chịu h n c ở gi i o n trỗ lẫn gi i o n sinh trưởng inh ư ng v n tư ng qu n hặt với tố t h luỹ

v t chất kh [29]

Ch ng – VẬT LIỆU VÀ PH NG PHÁP 2.1 Vật liệu

2.1.1 Vật liệu thực vật

Nguy n liệu ược s d ng trong nghi n u l ph i ng non a 3 ng ng

kh n ng ti p nh n gen ngo i l i v t i sinh tốt: VH1, CM8 v CH9 ượ ung

ấp ởi Ph ng Th nghiệm Tr ng iểm ng nghệ T o Thự v t- Viện i truy n

N ng nghiệp y ng m cho bắp th nghiệm ược tr ng trong nh lưới ặt t i Tr i

th nghiệm Viện i truy n N ng nghiệp t i V n Gi ng, Hưng Y n

2.1.2 Ch ng vi khuẩn và vector dùng trong chuy n gen

Ch ng A tumefaciens EHA105 mang vector chuyển gen pSIChyg-2 h gen

kh ng h n ipt ượ i u khiển ởi promoter S RK v gen hỉ thị h n l hpt với promoter CaMV 35S Vector pSIChyg-2 ượ ung ấp ởi Ph ng th nghiệm Hệ

gen h u tư ng v i truy n ph n t , i h t ng hợp Misouri ( olum i , Mỹ)

nos (nopaline synthase) 3' UTR (poly A signal)

T-DNA border (R)

STA region from pVSI plasmid

Bom site from pBR322 T-DNA border (L)

CaMV 3'UTR (poly A signal)

PUC MCS

IPT gene SARK promoter

RM,YEP, ABC Th nh ph n m i trường ượ n u như trong ph l 1

kh ng sinh, hất i u ti t sinh trưởng ượ ùng trong th nghiệm t i sinh

v huyển gen như: N , P, Acetosyringone (AS), kanamycine, cefotacime, hygromycine, strepomycine, spectinomycine, rifampicin… ược cung cấp bởi hãng: New England Biolabs (Anh), Sigma (Mỹ), Merk ( )…

H hất sinh h ph n t ượ ung ấp ởi Thermo v Ro he (Mỹ)

100 mg/l spectinomycin, 100 mg/l streptomycin, 280C trong 2-3 ng y Trước khi

bi n n p, lấy 2 khuẩn l h t n v o 5ml m i trường l y nhi m IM tới OD550

0,35, b sung 200 mg/l S Ti p t nu i lắ 4-5 giờ s u ịch huy n phù vi khuẩn n y ược s d ng ể l y nhi m ngay với ph i

Lây nhi m vi khuẩn với phôi ngô non

ắp non s u khi th phấn kho ng 7-13 ng y ượ thu ể t h ph i

Kh trùng mặt ngo i ắp ằng eth nol 700, ỏ l o ngo i v t h

ph i trong i u kiện v trùng Ph i non s u ượ r 3 l n với ung ị h IM v

ng m trong dịch huy n phù vi khuẩn tr n trong 30 phút

uôi c ng sinh

S u khi nhi m khuẩn, ph i non ượ huyển s ng ấy trong m i trường nu i

ng sinh M với ph n t o v y hướng l n tr n, ph n tr ph i ti p xú với

mặt m i trường, nu i trong tối, ở nhiệt 200C, thời gi n 3 ng y

uôi ph c h i

Chuyển ph i ã i n n p từ m i trường M s ng m i trường ReM, nu i trong tối ở 28oC , thời gi n 7 ng y

Chọn lọc ô sẹo chuyển gen

M s o t o th nh từ ph i non ã i n n p tr n m i trường REM ược cấy chuyển sang m i trường ECM , nu i trong tối ở 28oC, thời gian 14 ng y

T o ch i chuyển gen

M s o ph i ho t o th nh tr n m i trường ch n l c ECM ược cấy chuyển

s ng m i trường SeM ể t i sinh h i, nu i s ng ở 28o

C, thời gian 14 ng y

i sinh cây chuyển gen hoàn chỉnh

Ch i t i sinh trong m i trường ch n l SeM ược cấy chuyển s ng m i trường t o y ho n hỉnh RM (m i trường n n l MS), nu i s ng ở 25o

C , thời gian 10-20 ng y

Tỷ lệ t o m s o chuyển gen (%) = Số m s o chuyển gen t o th nh*100%/T ng

H nh 6 : S đồ quy tr nh chuy n gen

2.2.2 Phân tích cây chuy n gen bằng ph ng ph p sinh học phân tử

y huyển gen t i sinh tr ng tr n ất xuất hiện 2-3 l mới ược ti n h nh thu mẫu l ể ti n h nh ph n t h P R v Southern lot

T h hi t DNA t ng số từ mẫu l y ng huyển gen t i sinh theo

ph i non trong i u kiện v trùng  IM-AS

Lây nhiễm – đồng nuôi cấy

L y nhi m ph i non với dịch huy n phù vi khuẩn : 30phút huyển s ng m i trường

Chuyển m s o ph i h s ng m i trường SeM nu i s ng ở 28oC trong 14-20 ng y

Tạo rễ và t i sinh cây hoàn ch nh

Chuyển ch i t i sinh s ng m i trường RM, nu i s ng ở 25oC trong 10-20 ng y

R u đất

y t i sinh tr n m i trường RM 2-3 l , 3-4 r ược chuyển ra u ất

phư ng ph p T llen [19] i ti n ho phù hợp với i u kiện ph ng th nghiệm (th nh ph n T xem ph l 2) Kiểm tra n ng v tinh s ch c a DNA t ng số bằng m y qu ng ph n no rop, s u ti n h nh iện i tr n gel g rose 1% Dự v o k t qu iện i ể kiểm tr tinh s h v t nh nguy n v n N

ượ m o, thể ùng l m khu n ho ph n t h P R h y Southern lot

Quy tr nh:

- Thu kho ng 1 g mẫu l ng v o ống eppen orf 2ml h i s , ng m trong nit lỏng trong 10 phút Nghi n th nh t mịn ằng m y lắ nghi n bi (ball mill shaker) trong 90 gi y

- Th m 800ul ệm CTAB ở 65o , votex trong 2 phút Ủ ở bể n nhiệt 65o t nhất 1giờ

- Th m 1,5 l RN se 10mg/l ở ể n nhiệt 30 phút

- Th m 24 : 1 theo tỷ lệ 1 : 1 Lắ u trong 10 phút Ly t m 15 phút ở 13.000 v/ph

Ph n t h P R ti n h nh với cặp m i HPT-F1/HPT-R1 ặc hiệu cho gen hpt

v ặp m i pSARK-F1/IPT-R1 ặc hiệu cho gen ipt ; th nh ph n P R ược b sung

et ine v MSO ể t ng nh y; chu tr nh ph n ng với cặp m i R1 l 94o /5 phút, 94o /30 gi y, 53o /30 gi y, 72o /60 gi y, lặp l i trong 35 chu

HPT-F1/HPT-k , 72o /5 phút, k t thúc 4o , o n N ượ khu h i k h thướ 219bp; chu

tr nh ph n ng với cặp m i pSARK-F1/IPT-R1 l 95o /5 phút, 95o /30 gi y,

57o /30 gi y, 72o /60 gi y, lặp l i trong 35 hu k , 72o /5 phút, k t thú 4o , o n

N ượ khu h i k h thướ 419bp; S n phẩm P R ược kiểm tra bằng iện i tr n gel g rose 1%

DNA t ng số t h từ y ng huyển gen k t qu ư ng t nh với PCR

ược x l với enzyme BamHI, ph n t ch bằng iện i tr n gel g rose 1,2%, iện

di trong thời gian 6-10 ti ng ở hiệu iện th 40V S u ti n h nh nhu m với Ethium bromide 0,002%

Ph n t h Southern lot ược ti n h nh theo phư ng ph p l i kh ng ng vị

ph ng x , nh gi số b n copy c a gen s d ng Kit DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I (Roche) theo quy tr nh:

- ặt gel trong H l 0.25 M trong 15 phút ở nhiệt ph ng R a l i bằng nước cất 2-3 l n, s u i n t nh gel trong 1,5M N l + 0,5M N OH 2 l n, mỗi l n 15 phút R a l i bằng nước cất từ 2-3 l n, ti p t ặt gel v o trong dung dị h trung t nh trong 15 phút

- R m ng 2 l n, mỗi l n 15 phút trong 50ml ung ịch 2X SSC + 0,1%

S S trong l l i 68º

- R m ng 2 l n, mỗi l n 15 phút trong 50ml ung ịch 0,5X SSC + 0,1% SDS trong l l i 68º

- ặt m ng 2 phút trong Buffer 1 (0,1M M lei i + 0,15M N l) tr n

- Ng m m ng 2 phút trong uffer 3 ( ete tion uffer)

- B sung 200 l N T/ IP sto k solution trong 10 ml ete tion uffer (trong tối), ể tối trong kho ng 16 giờ

Lấy m ng r s ng kho ng 1 phút ể ho n th nh qu tr nh hiện m u, dung dịch hiện m u v ừng ph n ng ằng ung dịch TE 1X

2.2.3 Đ nh gi hả năng ch u hạn c c c dòng ngô chuy n gen ở th i

cây con

K t hợp phư ng ph p Nelson v phư ng ph p L Tr n nh v L Thị

Mu i ể kh o s t nh gi kh n ng hịu h n ng ng huyển gen ã

ư ng t nh với P R v Southern lot [2, 71]

Mỗi ng v ối ch ng ượ gieo v o u t v ng s h k h 16x18

lỗ ở y với số lượng 5 h t/ u, l n nhắ l i Mỗi th nghiệm hi th nh 2

nh m, nh m tưới nướ nh thường- well w ter (WW) v nh m ti n h nh x l

h n- water stress (WS)

B u t ược chuẩn bị với tr ng lượng 2kg v ượ l m ẩm bằng 200ml nước cất Ti n h nh gieo h t v n l t ằng h h t n NPK v o nước cất r i tưới u với lượng 0.2g/ b u t

u ất s u khi ược gieo h t ượ h m s nh thường: tưới 2 ng y

m t l n với lượng nướ l 50ml ho n khi y 3 l Ti n h nh tỉ ỏ 2 y, giữ

l i mỗi u 3 y Khi y 3 l th nh m WW vẫn h m s nh thường trong khi nh m WS ngừng tưới ho n to n (ti n h nh việc test h n)

S u khi test h n 10 ng y

Thu to n mẫu c a c h i nh m ể ti n h nh o với c hỉ ti u: chi u i

th n (SH), r (LRL) v tr ng lượng tư i th n l v r (FWS-FWR), tr ng lượng

kh th n l v r (DWS-DWR)

2.2.4 Đ nh gi sự h già c trong đi u iện c t h i cành

L th 3 ng ng huyển gen v ối h ng tư ng ng ở gi i o n 5

l (V2) [91] ượ thu ằng h ắt ắt mẩu iện t h 2x2 m mẩu l ượ

ng m trong nướ ất trong ĩ petri ở 30o trong tối Mẫu ượ qu n s t v ghi

Thời gian thực hiện: 1/2013- 6/2015

Số liệu ược thu th p, x l t nh to n ằng ph n m m Ex el v SPSS

Ch ng - K T QUẢ

3.1 K t quả c qu tr nh chuy n gen,chọn ọc và t i sinh c ba giống ngô

K thừa s n phẩm c t i T o ng ng i n i gen kh ng s u/kh ng thuốc diệt cỏ, húng t i s d ng ph i non a ba giống ng VH1, M8 v H9 l m

v t liệu ể chuyển gen Ba giống n y ược khẳng ịnh l giống kh n ng t i sinh ũng như ti p nh n gen l tốt Tuy nhi n, kh n ng huyển gen c ve tor mang gen chuyển kh nh u l kh ng giống nhau, o mặ ù giống ng tr n

ã k t qu kh tốt với ve tor huyển gen kh ng s u v thuố iệt ỏ nhưng hư thể khẳng ịnh iểu hiện húng với ve tor gen h n Nh n chung kh n ng ti p

nh n gen c giống ng n i kém kéo theo việ huyển gen gặp nhi u kh kh n

ỷ lệ p ô s ng sót 36.41% 41.93% 42.77%

ỷ lệ o mô sẹo p ô óa yển gen 43.95% 39.16% 52.63%

ỷ lệ ồi ái sinh

ự v o ti u h nh gi : o g m kh n ng ph c h i c ph i non s u

qu tr nh l y nhi m v ng nu i ấy, kh n ng t o m s o chuyển gen ũng như

kh n ng ph t sinh h i trong m i trường ch n l c hygromycin 5mg/L

K t qu ho thấy s u qu tr nh l y nhi m v ng nu i ấy, kh n ng ph h i

ã sự kh iệt Giống VH1 ho tỷ lệ thấp nhất với 36,41%, kém h n h i giống

n l i với m nghĩ (p=0.008 &p=0.004) H i giống M8 v H9 tỷ lệ l n lượt l 41,93% v 42,77%, nhưng sự h nh lệ h n y kh ng nghĩ v mặt thống

k (p<0.05) (xem ph l 4)

Kh n ng ti p nh n gen ngo i l i giống ng iểu hiện qu tỷ lệ t o m

s o ph i h trong m i trường h n l ph i non s u qu tr nh nu i ph h i

K t qu xuất hiện sự kh iệt ở giống với H9 o nhất t 52,63%, ti p n l VH1 43,95%, uối ùng l M8 39,16% Sự s i kh kh ng lớn nhưng nghĩ