Tạo dòng phân tử và phân tích chức năng của enzyme bergaptol o methyltransferase (BMT) từ cây bạch chỉ (angelica dahurica) và ứng dụng trong sản xuất một cách có hiệu quả chất bergapten trong e coli

Tạo dòng phân tử và phân tích chức năng của enzyme bergaptol-O-methyltransferase BMT từ cây bạch chỉ Angelica dahurica và ứng dụng trong sản xuất một cách có hiệu quả chất bergapten

Nhóm 4

Xin chào thầy và các bạn!

Chiêu Hào Cam 0918040 Đàm Huỳnh Khang 0915215 Phạm Triều Nghi 0915326

SINH HỌC PHÂN TỬ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT

Tạo dòng phân tử và phân tích chức năng của enzyme bergaptol-O-methyltransferase

(BMT) từ cây bạch chỉ

(Angelica dahurica)

và ứng dụng trong sản xuất một cách có hiệu quả

chất bergapten trong E coli

(Shu-chin LO, pei-en Chung và Co-shine Wang)

• Bạch chỉ từ lâu đã được sử dụng làm kem dưỡng trắng da, do có chứa hợp chất 8-hydroxy bergapten, là sản phẩm hydroxylate từ chất bergapten nhờ enzyme 5-O-methyltransferase (BMT) phân cắt chất bergaptol trong cây bạch chỉ

• Đoạn AdBMT chứa vùng bảo tồn I-V tương tự như OMTs (O-methyltransferase) của những loài khác

• Liên kết His-AdBMTđược biểu hiện ở E coli và được làm sạch bằng cách tủa trong ammonium sulfate

• Cách sản xuất bergapten đơn giản và hiệu quả là biểu hiện vượt mức AdBMT trong nuôi cấy vi khuẩn E coli Lượng bergapten thu được cao gấp 13 lần lượng hợp chất thu từ sản phẩm làm sạch phân đoạn trong ammonium sulfate

1 Tổng quan

• Sự methyl hoá các hợp chất tự nhiên bằng S-adenosyl-L-methionine (SAM) phụ thuộc methyltransferases (OMTs) là cách chuyển đổi phổ biến trong các phản ứng tổng hợp trong tự nhiên

O-• Trong thực vật, O-methyl hoá cần thiết cho sự tổng hợp furanocoumarin mạch thẳng

• Các hợp chất mạch thẳng phong phú của furanocoumarin có thể kể đến là psolaren, bergapten, xanthotoxin và isopimpinellin.

• Bergaptol được BMT chuyển thành bergapten.

• Bergapten hơn nữa được chuyển thành 8-hydroxybergapten có thể ức chế tyrosinase của nấm, sự sức chế đó mạnh hơn cả kojic acid và arbutin – hai chất ức chế tyrosinase được sử dụng rộng rãi trong mỹ phẩm trắng da (Piao et al, 2004)

http://www.neurology.org/content/57/3/410/F2.expansion.html

2 Vật liệu và phương pháp

Vật liệu

Cây bạch chỉ Angelica dahurica (Fish.) BENTH Et HOOK được trồng trên ruộng Rễ được thu và đựơc bảo

quản lạnh ngay trong nitơ lỏng và tất cả phần vật liệu được sử dụng phải cất trữ ở -80oC

Phương pháp

Nhân bản cDNA

• Tổng số RNA được phân lập từ rễ 3 tháng tuổi của A dahurica

• Những đoạn cDNA được tạo ra bởi phản ứng RT-PCR được khuếch đại bằng cách sử dụng một cặp mồi thoái hóa được thiết kế từ 2 trình tự bảo tồn cao của OMTs thực vật:

- Mồi 5’ - (5'-gtg/tgatgttggc/tggtggg/a/cactgga/t-3') nằm trong vùng bảo vệ I.

- Mồi 3' – primer (5'-ggg/atgcatcg/t/cc/tca/gac/tg/a/cacgtga/

ggg-3') trong vùng bảo vệ II.

Biểu hiện vượt mức AdBMT và động năng chuyển hoá từ bergaptol thành

bergapten trong E coli

• Đoạn cDNA AdBMT mã hóa kích thước đầy đủ bao gồm một mẫu và một cặp mồi đặc hiệu cho gen:

- AdBMT-over-f (5’- GTCGACCATATGGCAGAAATGAAAACTAG-3’) có chứa một vị trí SalI, và

- AdBMT-over-r (5’-GCGGCCGCCTTCGAAAATTCCATAATC-3’) có chứa một vị trí NotI đã được sử dụng để

khuyếch đại PCR

• Mảnh AdBMT 1,077bp do đó đã được tạo dòng bằng trình tự cắt giới hạn SalI/NotI vào vector biểu hiện

pET32a

Biểu hiện vượt mức AdBMT và động năng chuyển hoá từ bergaptol thành

bergapten trong E coli

• Sau khi ly tâm, phần nổi được sử dụng để trích xuất bergapten để đo bằng phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu suất (UPLC ).

• Chỉ có E coli mang gene biểu hiện vượt mức AdBMT phát triển ở nhiệt độ cảm ứng tối ưu đã được thực hiện để phân tích động học Thời gian ủ kéo dài từ 24 đến 48h

Sắc ký lỏng siêu hiệu suất – UPLC

(Ultra performance liquid chromatography)

Ly tâm dịch nổi   dịch nổi   chấtrắn (bergaptol + bergapten)  phântíchbằnghệthống UPLC

•  

Hệ thống

WatersACQUITYTMUPLC

Figure 1: An Acquity Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) instrument.

Schematic of an HPLC or UPLC system operating in isocratic mode

http://www.comsol.com/stories/waters_corp_hplc_systems/full/

Tinh chế enzyme và thử hoạt tính

• Các tếbào ở 16oC  phámàng thudịchnổi  tủaammonium sulfate  protein (bãohoà 40-50%)

 hoà tan trongphosphate kali (pH 7,5)  khửmuối qua cột PD-10  protein phânđoạn  côđặcbởi Centricon-30  Khảo nghiệm hoạt tính củaBMT.

•  

pH, nhiệt độ tối ưu và

yêu cầu kim loại của AdBMT

• Độ pH tối ưu: từ 4.0 tới 10.0 (acetate, pH 4,0-5,5; phosphate, pH 5,5-9,0; Tris-HCl, pH 7,0 -8,5; cacbonat, pH 8,5-10,0).

• Nhiệt độ tối ưu: từ 16-42oC

• Ảnh hưởng của các ion kim loại khác nhau: ở nồng độ 0,1-1,5 mM

3 Kết quả

• Tạo dòng và đặc tính của cDNA BMT từ Bạch chỉ

- Sử dụng khuyếch đại RT-PCR, một dải duy nhất của đoạn DNA 107 bp tương ứng

với trình tự AdBMT thu được.

• Bởi vì kích thước cDNA chỉ là một phần, phương pháp 5’ – và 3’-RACE PCR được sử dụng để có

được toàn bộ chiều dài 1.259 bp cDNA AdBMT (accession no JN585954) ngoại trừ đuôi poly (A).

• Chuỗi acid amin liên kết của AdBMT cho thấy rằng polypeptide AdBMT có tất cả 5 vùng được bảo tồn,

I-V (Ibrahim et al, 1998) đã được tìm thấy, chia sẻ 28%-91% sự tương đồng với OMTs thực vật và xác định ít nhất là đối với OMT của người (13%)

Biểu hiện vượt mức AdBMT trong

E coli tái tổ hợp

Đặc tính của AdBMT

Hiệu quả sản xuất bergapten trong nuôi cấy biểu hiện quá mức

AdBMT

• Sau một thời gian phản ứng ngắn khoảng 2 giờ , việc sản xuất bergapten đạt 180µg , tương ứng 60% so với mức tối đa quan sát được sau 24 giờ (nếu mức tối đa của bergapten sản xuất tại 24 giờ tính là 100%)

4 Thảo luận

• Piao et al (2004) báo cáo rằng chiết xuất ethyl acetate của A dahurica có tiềm năng hoạt động ức chế

chống lại tyrosinase của nấm Xét rằng chất tyrosinase ức chế ngăn chặn sự hình thành hắc tố melanin, chúng có thể dẫn đến giảm độ tối của da

• Một báo cáo trước đó chỉ ra rằng BMT không ổn định và do đó, phương pháp phân đoạn ammonium sulfate được áp dụng cho tinh chế enzyme (Hehmann et al, 2004)

Việc sản xuất bergapten

in vivo có một số lợi thế lớn:

• Đầu tiên, với cùng một số lượng tế bào vi khuẩn E coli, một số lượng lớn bergapten có thể được sản

xuất trong chất lỏng Quan trọng hơn, việc ủ trong môi trường có thể được tiếp tục mở rộng đến 24 giờ

để đạt được sự sản xuất bergapten tối đa, cao hơn 13 lần so với sản xuất bởi phần AdBMT tinh khiết ammonium sulfate

• Thứ hai, SAM không còn cần thiết để được thêm vào phản ứng in vitro bởi vì vi khuẩn E coli có thể tự cung cấp cofactor cho quá trình methyl hóa và do đó, làm giảm đáng kể chi phí sản xuất

• Thứ ba, sự tinh chế BMT từ các tế bào là không cần thiết E coli có thể sử dụng các bergaptol bổ sung và chuyển đổi nó thành bergapten, sự cô lập và tinh sạch bergapten do đó đơn giản rất nhiều

• AdBMT được phân loại như là một thành viên của OMTs loại II và hoạt động của enzyme của nó độc lập với Mg2+ Tuy nhiên, việc bổ sung Cu2+, Ni2+, và CO2+ ở nồng độ thậm chí thấp như 0,1 mM ức

chế nghiêm trọng hoạt động của enzyme

• Kết luận, cDNA BMT đã được xác định từ Bạch chỉ và biểu hiện quá mức trong E coli Các điều kiện tối

ưu của AdBMT được xác định trong hệ đệm kali photphat, và người ta nhận thấy rằng các enzyme không yêu cầu Mg2+ cho hoạt động xúc tác

• Với việc cung cấp bergaptol trong môi trường, các tế bào vi khuẩn E coli có thể được sử dụng như là

một lò phản ứng sinh học tiềm năng để sản xuất bergapten

Tài liệu tham khảo

from Angelica dahurica (Bai Zhi) and using it to efficiently produce bergapten in E coli,

Cảm ơn thầy và các bạn đã lắng nghe!