bài báo cáo sắc ký lỏng hiệu năng cao (hplc)

Sự tách sắc ký được dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất khác nhau vào hai pha luôn tiếp xúc nhưng không hòa lẫn vào nhau: một pha tĩnh và một pha động.. Khái niệm HPLC là một ph

Bài báo cáo SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

ĐẠI HỌC CẦN THƠ

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

GVHD: TS ĐẶNG HUỲNH GIAO

CƠ SỞ LÝ THUYẾT 2

MÁY SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 3

Nội dungGIỚI THIỆU CHUNG

THỰC HÀNH 4

Sắc ký là một nhóm các phương pháp hóa lý dùng để tách các thành phần của một hỗn hợp Sự tách sắc ký được

dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất khác nhau vào hai pha luôn tiếp xúc nhưng không hòa lẫn vào nhau: một pha tĩnh và một pha động

1 GIỚI THIỆU CHUNG

Sắc ký lỏng là phương pháp tách sắc ký, trong đó pha động là một chất lỏng chảy qua pha tĩnh chứa trong cột.

2 CƠ SỞ LÝ THUYẾT

2.1 Khái niệm

HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ

Sắc ký lỏng được tiến hành chủ yếu dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố khối lượng, trao đổi ion, loại trừ theo kích thước (sắc ký rây phân tử) hoặc tương tác hóa học lập thể.

2.2.2 Phân loại theo cơ chế phân tách

- Sắc ký trao đổi ion (IE-HPLC)

+ Sắc ký rây phân tử (sắc ký gel)

2.3 Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột

2.4 Các đại lượng đặc trưng

Kết quả của quá trình tách các chất được detector phát hiện, phóng đại và ghi thành sắc ký đồ:

Các thông số chỉ sự lưu giữ

2.4.1 Thời gian lưu tR (Retention time)

tR = tM × (1 + k')

→ Thời gian lưu thực: tR' = tR – tM

Trong một phép phân tích nếu tR nhỏ quá thì sự tách kém, còn tR lớn quá thì pic bị doãng và độ lặp lại kém, thời gian phân tích dài Để thay đổi thời gian lưu ta tìm cách thay đổi một hoặc nhiều yếu tố trong các yếu tố phụ thuộc trên đây

2.4.2 Hệ số phân bố (Distribution factor)

Là tỷ lệ giữa nồng độ chất tan trong pha tĩnh và trong pha động tại thời điểm cân bằng:

2.4.4 Độ chọn lọc α (Selectivity-factor) hay còn gọi là Độ lưu giữ tỷ đối r:

α = r = k’A / k’B = (tRA – tM) / (tRB – tM) với k’A > k’B

Độ lưu giữ tỷ đối chưa hiệu chỉnh (rG): rG = tR2 / tR1

Trừ khi có hướng dẫn khác, các trị giá độ lưu giữ tỷ đối cho trong các chuyên luận DĐVN IV là độ lưu giữ tỷ đối chưa hiệu chỉnh

Các thông số về sắc ký

2.4.5 Pic sắc ký

wh = 1,18 wi

2.4.6 Hiệu năng của cột và số đĩa lý thuyết biểu kiến N (Theoretical plates)

Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc ký nhất định:

N thay đổi theo chất, theo cột cũng như theo thời gian lưu.

Thông thường, trong thực tế N nằm trong khoảng 2500 đến 5500 là vừa đủ, tối thiểu là 1000.

2.4.7 Độ phân giải R (Resolution)

Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc ký đã cho Độ phân giải của hai pic cạnh nhau được tính theo 1 trong 2 công thức sau:

Trong thực tế nếu các pic cân đối (dạng Gauss) thì độ phân giải để 2 pic tách tối thiểu là R = 1,0 Trong phép định lượng: R ≥ 1,5 thì hai pic được tách đến đường nền.

+ Nếu R nhỏ thì các pic chưa tách hẳn, việc tính diện tích pic sẽ không chính xác, lúc này phải tìm cách tăng R theo 3

2.4.8 Hệ số đối xứng As (Symmetry factor) hay hệ số kéo đuôi T (Tailing factor)

Hệ số đối xứng (As) (hay hệ số kéo đuôi T) của một pic được tính theo công thức:

2.4.9 Tỷ số đỉnh-hõm (Peak-to-valley ratio)

Tỷ số đỉnh-hõm (p/v) có thể được dùng như một thông số của tính phù hợp của hệ thống trong phép thử các tạp chất liên quan khi hai pic không được tách đến đường nền

Pic dạng đối xứng hình Gauss trên thực tế khó đạt được,

T nằm trong khoảng 0,8 – 2,0 thì phép định lượng được chấp nhận

Nếu T > 2,0 thì điểm cuối của pic rất khó xác định, cần thay đổi các điều kiện sắc ký để làm cho pic cân xứng hơn theo các cách sau:

- Làm giảm thể tích chết, tức là đoạn nối từ cột đến detector.

- Thay đổi thành phần pha động sao cho khả năng rửa giải tăng lên.

- Giảm bớt lượng mẫu đưa vào cột

2.4.10 Tỷ số tín hiệu trên nhiễu (Signal-to-noise ratio)

2.4.11 Độ lặp lại của hệ thống (System repeatability)

Độ lặp lại của đáp ứng được biểu thị dưới dạng độ lệch chuẩn tương đối% (RSD%) của của một dãy liên

tiếp các kết quả phép tiêm và đo (≥ 3 lần tiêm) rồi tính theo công thức:

2.4.12 Các thông số động học và sự doãng pic

Phương trình Van Deemter mô tả ảnh hưởng của tốc độ dòng pha động và các thông số động học khác đến hiệu

lực của cột (đến chiều cao của đĩa lý thuyết H ):

B

H = A + - + C × U

U

I ĐẲNG DÒNG:

a) Thành phần pha động: Lượng thành phần dung môi nhỏ có thể điều chỉnh ± 30% nồng độ tương đối hay ± 2% nồng độ tuyệt đối tùy theo trị số nào lớn hơn Không thành phần dung môi nào được thay đổi lớn hơn 10% nồng độ tuyệt đối

b) pH của thành phần nước trong pha động: ± 0,2 pH, trừ các chỉ dẫn khác, hoặc ± 1,0 pH khi chất phân tích không bị

ion hóa

c) Nồng độ muối: Được thay đổi ± 10%

d) Bước sóng detector: Không được điều chỉnh.

e) Thông số cột:

Không thay đổi loại pha tĩnh (VD: không thay C18 bằng C8)

Cỡ hạt: Giảm tối đa 50% và không được phép tăng

[USP cho phép thay đổi cỡ hạt (dp) và chiều dài cột (L) sao cho tỷ số L/dp thu được nằm trong khoảng từ -25% đến +50% so với khi không thay đổi]

Chiều dài cột: ± 70%

Đường kính trong của cột: ± 25%

g) Nhiệt độ: ± 10oC nhiệt độ quy định trong tiêu chuẩn, trừ khi có chỉ dẫn khác.

h) Thể tích tiêm: Có thể giảm nếu giới hạn phát hiện và độ lặp lại của các pic được xác định là thỏa đáng Không

được tăng thể tích tiêm

Theo quy định của USP hiện hành: Khi thay đổi đường kính trong của cột (d) và cỡ hạt nhồi (dp), tốc

độ dòng có thể điều chỉnh (N ± 20%) theo công thức:

II RỬA GIẢI GRADIENT:

Điều chỉnh điều kiện sắc ký trong rửa giải gradient cần thận trọng hơn nhiều so với điều chỉnh điều kiện rửa giải đẳng dòng.

a) pH của thành phần nước trong pha động: Không được điều chỉnh.

b Nồng độ muối trong tp đệm của pha động: Không được điều chỉnh.

c) Bước sóng detector: Không được điều chỉnh.

d) Nhiệt độ: ± 5oC nhiệt độ quy định trong tiêu chuẩn, trừ khi có chỉ dẫn khác.

e) Thể tích tiêm: Có thể giảm nếu LOD và độ lặp lại của các pic được xác định là thỏa đáng Không được tăng thể tích tiêm

(Giống đẳng dòng)

f) Thành phần pha động: Có thể điều chỉnh một chút về thành phần pha động và chương trình dung môi (gradient), nhưng phải

đáp ứng các yêu cầu sau:

+ Đáp ứng đầy đủ yêu cầu về tính phù hợp của hệ thống sắc ký.

+ Pic chính được rửa giải ra trong khoảng ± 15% so với thời gian lưu ghi trong tiêu chuẩn.

+ Thành phần cuối cùng của pha động không được có hiệu lực rửa giải kém hơn so với thành phần đã ghi trong tiêu chuẩn.

g) Thông số cột:

Giống như đẳng dòng, nhưng không được thay đổi cỡ hạt.

h) Tốc độ dòng:

Khi kích thước cột thay đổi, tốc độ dòng có thể cần được điều chỉnh theo công thức (*) ở phần rửa giải đẳng dòng:

Ngoài ra, cấu hình của thiết bị sử dụng có thể thay đổi đáng kể độ phân giải, thời gian lưu và thời gian lưu tỷ đối đã

nêu trong phương pháp Nếu điều này xảy ra thì có thể do thể tích dung môi cư trú (dwell volume) (hay thể tích trễ của gradient - gradient delay volume) quá lớn.

Quy định hiện hành của USP, đối với rửa giải gradient: Không cho phép thay đổi chiều dài cột, đường kính cột và kích thước hạt nhồi

3 MÁY SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

3.1 Sơ đồ cấu tạo

1. Bình chứa dung môi động

3.2 Cấu tạo chi tiết và tính năng

3.2.1 Bình đựng dung môi và hệ thống xử lý dung môi

3.2.2 Bơm cao áp

3.2.3 Bộ phận tiêm mẫu

3.2.4 Cột phân tích

Chất nhồi cột tùy theo loại cột và kiểu SK Thông thường chất nhồi cột là Silicagel hoặc là Silicagel đã được silan hóa hoặc được bao

một lớp mỏng hữu cơ, ngoài ra người ta còn dùng các hạt khác: Nhôm oxyd, polyme xốp, chất TĐ ion

Đối với các phương pháp phân tích yêu cầu nhiệt độ cột cao hoặc thấp hơn nhiệt độ phòng thì cột sẽ được đặt trong bộ phận điều nhiệt

3.2.5 Detector

Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiêu ghi trên sắc đồ để có thể định tính và định lượng Tuỳ theo tính chất của các chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại detector thích hợp và phải thoả mãn điều kiện trong một vùng nồng độ nhất định của chất phân tích thì:

A = k x C

Trong đó: A: tín hiệu đo được C: nồng độ chất phân tích

k: hằng số thực nghiệm của detector đã chọn

Tín hiệu này có thể là: Độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ dòng điện, điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, góc khúc

xạ, phổ khối

3.2.6 Máy ghi tín hiệu

Để ghi tín hiệu phát hiện do detector truyền sang

- Máy ghi đơn giản thì có thể vẽ sắc đồ, ghi thời gian lưu , diện tích pic hoặc chiều cao pic,% diện tích pic

- Phần mềm thiết bị ngoài khả năng ghi còn có khả năng xử lý kết quả, lưu kết quả, bảo mật, phân quyền sử dụng

4.2 Chuẩn bị pha động

Các dung môi phải là loại tinh khiết HPLC

Các hóa chất phải là loại tinh khiết HPLC, PA

Pha dung môi động, đặc biệt là các dung môi để tách các hỗn hợp nhiều thành phần thì phải pha chế chính xác

và để ổn định theo đúng thời gian quy định Lọc dung môi qua màng lọc 0,2 - 0,45 µm, đuổi khí bằng một trong các phương pháp: chạy siêu âm, đun nóng và khuấy, sục khí trơ He, lọc dưới áp suất giảm

4.3 Chuẩn bị mẫu đo HPLC

Mẫu thử: Xử lý theo quy định trong tiêu chuẩn và phải tuân theo nguyên tắc:

+ Dung môi hòa tan hoạt chất phải tan trong pha động, nhiều trường hợp dùng dung môi động để hòa tan.

+ Phải loại bỏ các chất không tan trong pha động hoặc không rửa giải được bằng cách lọc hoặc chiết.

+ Phải lọc hoặc ly tâm, cuối cùng lọc qua màng lọc 0,2 - 0,45 µ m.

Mẫu chuẩn: Pha dung dịch chuẩn có thành phần giống như mẫu thử trong cùng dung môi, riêng về nồng độ các thành phần giống

mẫu thử là tốt nhất, ngoài ra có thể dùng nồng độ khác nhưng phải nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát của từng thành phần.

4.4 Cách đo HPLC

Vận hành máy đo trên các máy khác nhau theo Hướng dẫn của nhà sản xuất Cách đo tuân thủ các quy định sau:

+ Chạy máy với dung môi động trước tiên phải đuổi bọt khí có trong hệ thống trước khi vào cột, đặt các điều kiện chạy theo quy

định và chạy dung môi động để cân bằng cột và ổn định hệ thống tới khi đường nền thẳng, lấy đường nền theo điểm 0 thực.

+ Cài đặt các điều kiện sắc ký theo quy trình phân tích

+ Xác định khả năng thích hợp của hệ thống sắc ký (system suitability).

+ Tiêm dung dịch thử trong cùng điều kiện với dung dịch chuẩn.

+ Định tính: So sánh thời gian lưu, thời gian lưu tương đối, phổ UV, purity, similar factor ).

+ Định lượng: Dựa vào diện tích hoặc chiều cao pic chuẩn, thử, chuẩn nội (nếu có).

4.5 Cách tính kết quả

Dựa vào diện tích pic

Dựa vào chiều cao pic

Phương pháp dùng chuẩn ngoại

Phương pháp dùng chuẩn nội

Phương pháp thêm chuẩn

Phương pháp chuẩn hóa (tính theo% diện tích pic)

4.6 Những điều cần lưu ý khi sử dụng cột HPLC

- Lọc và đuổi khí dung môi trước khi dùng: lọc qua giấy lọc 0,45 µ m.

- Tất cả các chất tương tác được thêm vào pha động (muối, đệm, chất tạo cặp ion ) phải đạt độ tinh khiết cao (dùng cho HPLC ).

- Phải tính đến độ hòa tan của những chất hòa tan trong trường hợp chạy Gradient dung môi Khi tăng thành phần đệm trong pha động phải đảm bảo nồng độ muối là tương thích (không bị kết tủa lại) trong pha động sau cùng.

- Đối với những mẫu có chứa các thành phần tạp có thể lưu giữ mạnh trên cột thì phải xử lý mẫu trước để loại các thành phần này.

- Nhiệt độ cột và pH pha động phải tuân theo Catalog kèm theo cột.

- Áp suất cột: không để cột làm việc liên tục ở áp suất quá cao (> 200 bar).

- Phải rửa hết các dung dịch đệm trong cột và bảo quản cột trong dung môi thích hợp sau khi sử dụng, Đậy chặt 2 đầu cột.

- Tránh các tác động vật lý và sử dụng sai: đánh rơi, gõ đập mạnh hay vặn quá chặt khi lắp cột

- Sử dụng tiền cột thích hợp cho từng loại cột.

- Khi tiến hành phân tích phải đảm bảo chắc chắn dung môi pha động có thể trộn lẫn được với dung môi bảo quản cột Khi cột bị khô do bảo quản hoặc trong quá trình vận chuyển phải phục hồi cột bằng cách cho chạy qua cột hỗn hợp dung môi tinh khiết với số lượng dung môi sử dụng gấp 10 - 20 lần thể tích cột, sau đó mới tiến hành cân bằng cột bằng pha động

- Phục hồi cột HPLC nên được tham khảo các khuyến cáo của nhà sản xuất (theo Catalog kèm theo cột hoặc các tài liệu do NSX cung cấp)

Cám ơn Cô và các bạn đã chú ý lắng nghe