Bài giảng enzyme chất xúc tác trong sinh học

1.1 Khái niệm chung1.1.1 Định nghĩa Enzyme - Chất xúc tác sinh học có bản chất protein xỳc tỏc đặc hiệu cho cỏc phản ứng húa học trong và ngoài cơ thể sống 1926 – Sumner thu nhận urease

Chương 1: ENZYME - CHẤT XÚC

TÁC SINH HỌC

1.1 Khái niệm chung

1.2 Cấu tạo hóa học

1.1 Khái niệm chung

1.1.1 Định nghĩa

Enzyme - Chất xúc tác sinh học có bản chất protein xỳc tỏc đặc hiệu cho cỏc phản ứng húa học trong và ngoài cơ thể sống

1926 – Sumner thu nhận urease dưới dạng tinh thể,

đưa ra quan điểm: Enzyme có bản chất Protein

Những năm 30 – Northrop và Kunitz thu nhận

Pepsin, trypsin, chymotrypsin dưới dạng tinh thể và khẳng định quan điểm: enzyme có bản chất protein

1.1 Khái niệm chung

1.1.2 Sự giống nhau và khác nhau giữa enzyme và chất xúc tác vô cơ:

1 Hiệu quả xúc tác cao (tăng vận tốc 108 - 1011 lần): 1 g

pepsin phân giải được 5 kg protein trứng/2 h; 1 g rennin làm

đông tụ 72 T sữa trong sản xuất phomat; 1 mol catalase phân huỷ được 5.106 mol H2O2/ph Trong khi 1 mol Fe+3 chỉ phân huỷ 10-6 mol H2O2/ph

2 Tính đặc hiệu cao

3 Hoạt tính enzyme phụ thuộc vào các điều kiện môi trường:

pH, nhiệt độ, sự có mặt của chất kìm hãm và chất hoạt hoá

glutamin synthetaza

Axit α- xetoglutaric +

1.2 CÊu t¹o ho¸ häc cña enzyme

Enzym

Enzym mét thµnh phÇn Enzym hai thµnh phÇn

số gốc aminoacid nhất định tạo thành

Các gốc: - SH (Cys), -OH (Ser, Tyr), vòng Imidazol (His), -COOH (Asp, Glu), vòng Indol (Try)

Ví dụ: Chymotrypsin – 3 gốc His 57, Asp 102, Ser

195

Cholinesterase – 4 gốc His, Ser, Asp, Tyr

Chỉ cấu tạo từ Protein

Chymotrypsin

Cấu tạo của enzyme hai thành phần

Figure 2:

This is a molecular model of the

unbound carboxypeptidase A

enzyme The cpk, or space-filled,

representation of atoms is used

here to show the approximate

volume and shape of the active site

Note the zinc ion (magenta) in the

pocket of the active site Three

amino acids located near the active

site (Arg 145, Tyr 248, and Glu 270)

are labeled.

Figure 3:

This is a cpk representation of carboxypeptidase A with a substrate (turquoise) bound in the active site

The active site is in the induced conformation The same three amino acids (Arg 145, Tyr 248, and Glu 270) are labeled to

demonstrate the shape change.

Zn gắn với phần protein qua:

Cấu tạo của enzyme hai thành phần

Cấu tạo của enzyme

Phần protein: đây là phần activant (tăng hoạt lực xúc tác của phần coenzyme)

và quyết định tính đặc hiệu cơ chất của enzyme.

Phần coenzyme: trực tiếp tham gia hoạt động xúc tác, quyết định tính đặc hiệu phản ứng của enzyme và có tác dụng tăng độ bền của phần protein đối với các tác nhân gây biến tính.

Apoenzyme + Coenzyme Holoenzyme

Trung tâm hoạt động của cacboxypeptidase A

Table 11.5

• Coenzym : Nhãm thªm dÔ t¸ch khái apoenzym

Một số coenzyme quan trọng

NAD+

Một số coenzyme quan trọng

NADP+

Một số coenzyme quan trọng

FAD

Một số coenzyme quan trọng

Coenzyme Q

Một số coenzyme quan trọng

Cytochrome

Một số coenzyme quan trọng

Coenzyme A

Một số coenzyme quan trọng

Thiamine pyrophosphate (TPP)

Một số coenzyme quan trọng

Pyridoxal phosphate

1.3 C¬ chÕ t¸c dông cña enzyme

1.3.1 Sù xóc t¸c

1.3.2 Häc thuyÕt vÒ sù h×nh thµnh phøc hîp Enzyme - C¬ chÊt (ES)

1.3.1 Kh¸i niÖm vÒ xóc t¸c

Figure 11.7:

Two models for enzyme-substrate interaction.

1.4 Tính đặc hiệu của enzyme

- Tính đặc hiệu phản ứng

-Tính đặc hiệu cơ chất:

Aminopeptidase Cacboxipeptidase Urease, Arginase

a Đặc hiệu tương đối

b Đặc hiệu nhóm

c Đặc hiệu tuyệt đối

d Đặc hiệu đồng phân quang học

Một enzyme chỉ xúc tác cho 1 phản ứng hoặc 1 kiểu phản ứng

Đặc hiệu kiểu phản ứng

glutamin synthetaza

Axit α- xetoglutaric +

1.5.1 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất Phương trình

Michaelis – Menten

1.5 Cỏc yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động xỳc tỏc

của enzyme

Phương trinh Michaelis-Menten

V = k2[ES]

[E]t = [E] + [ES],

[E]t là nồng độ enzyme tổng số, [E] – enzyme tự do và [ES] – enzyme ở dạng phức hợp.

Năm1925, Briggs and Haldane: ở trạng thái cân bằng vận tốc hình thành và phân ly ES là bằng nhau, do đó

k1[E] [S] = k-1[ES] + k2[ES] (1)

Rút gọn pt (1) ta được :

[ES] = k1/(k-1 + k2) [E] [S] (2)

KÕt hîp 3 h»ng sè vËn tèc ta ®ưîc:

Km= (k-1 + k2)/k1

Phư¬ng tr×nh (2) thµnh:

Km[ES] = [E][S] (3)

V× [E] = [E]t - [ES], nªn

Km[ES] = [E]t[S] - [ES][S] (4)

Đồ thị biểu diễn quan hệ

giữa (V) và nồng độ cơ chât ([S])

Km - đặc trưng cho ái lực giữa enzym và cơ chất:

Khi Km = [S] thì V = Vmax/2

Km là [S] mà ở đó V =

Vmax/2.

Km,

1.5.2 Ảnh hưởng của chất hoạt hoá và chất kìm hãm

1.5.2.1 Ảnh hưởng của chất hoạt hoá

Chất hoạt hoá: Là những chất làm cho enzym từ trạng thái không hoạt động thành trạng thái hoạt động, từ trạng thái hoạt động yếu sang trạng thái hoạt động mạnh.

- Coenzym: NAD+, NADP+, FAD, FMN hoạt hoá các enzym oxi hoá khử

-Các chát phá vỡ sự bao vây TTHĐ:

+ Enzym khác: Enterokinase biến đổi trypsinogen thành trypsin + Các chất phục hồi chức năng của TTHĐ: Các chất giàu –SH (Cystein, Glutathion) – Papain

- Ion kim loại: Ô 11 đến ô 55

Các chất hoạt hóa

Cl - , Br - , F - , I - làm tăng hoạt tính của amylase

Mn 2+ , Zn 2+ hay Co 2+ kích thích hoạt tính của enzyme peptidase

Trypsin vs trypsinogen.png

1.5.2.2 Ảnh hưëng cña chÊt k×m h·m

• K×m h·m c¹nh tranh

a K×m h·m thuËn nghÞch

• K×m h·m kh«ng c¹nh tranh

b K×m h·m kh«ng thuËn nghÞch

Ả nh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ mà tại đó enzyme mất hoạt tính gọi là nhiệt độ tới hạn ở nhiệt độ này, các liên kết tạo và giữ vững công thức cấu tạo của enzyme bị phá huỷ, enzyme bị biến tính và không còn khả năng xúc tác.

Ả nh hưởng của pH

Saccarase (nấm men) 4,6 – 5,0 Arginase 9,8

Amylase (mạch nha) 4,4 – 5,0 Succinatdehydrogenase 9,0

amylase (nước bọt) 6,8 – 7,2 Catalase 6,8 – 7,0

Maltase (nấm men) 6,7 – 7,2 Phosphatase động vật 6,2 – 9,4

1.5.3 Ảnh hưởng của nồng độ E đến vận tốc phản ứng

Ở các điều kiện không đổi, đặc biệt [S]

không đổi, khi [E] tăng thì V tăng

Cách gọi tên enzyme

Tên enzyme = tên cơ chất hoặc tên sản phẩm + tên loại phản ứng + “ase”

Phân loại enzyme

Dextrin maltose Maltose dextrin glucose

Thủy phân liên kết

Amylolitic enzymes

POINTS OF STARCH CLEAVAGE THROUGH

DIFFERENT TYPES OF AMYLASES

α- 1,6 glucosidase

Pululanase

Glucose Maltose

Alfa and beta – amilases quan trọng trong Công nghệ thực phẩmNguồn Thực vật hoặc vi sinh vật (nấm mốc hoặc vi khuẩn)

Các loại vi sinh vật

chính sản xuất alfa và

beta amylase

Aspergillus orizae Aspergillus niger Bacillus subtilis Bacillus stearothermophillus Rhyzopos delmer

Rhyzopos orizae

Fungi

Bacteria

Amylolitic enzymes α- or β-amylase

Đặc điểm của α amylases theo nguồn gốc

Thường bị đi kèm với protease và maltase

Amylolitic enzymes: α-amylase

Amylolitic enzymes - Ứng dụng

Tăng hàm lượng đường lên men được

Thể tích Màu sắcSản xuất bánh

Amylolitic enzymes – Ứng dụng

Nghiền malt enzyme + hồ hóa tinh bột tạo gel tinh bột

Enzymes thủy phân gel tinh bột thành các đơn vị glcuose

Bia

Nước quả

Loại bỏ độ đục

Amylolitic enzymes – Ứng dụng

Enzymes thủy phân dissacarides

Glucose Fructose

(70) (170)

Glucose Galactose (70) (60)

Sucrose

2 Glucoses

Invertase (saccharase)- Ứng dụng

Saccharose Glucose + Fructose

invertase saccharaseNghịch đảo đường

Đường Lượng nước (%) hấp thụ được ở các điều kiện khác nhau

-Khả năng hấp thụ nước của các đường

– Ice cream: hạn chế kết tinh đường lactose.

Độ bền

– Giảm nhiệt độ điểm đóng băng

– Đối với những người không có enzyme lactase.– … độ ngọt cao hơn

Lactase

• Inulin là một glucofructan

• Có trong nhiều loại thực vật

• Nguồn sản xuất siro ultra-fructose

• Dễ bị thủy phân bởi exoinulinase và endoinulinase

INULINA

• Inulinases là các enzyme thủy phân

inuline thành fructan polymers hoặc

fructose

• Để sản xuất fructooligosaccharides

(FOS) and fructose.

• Hoạt động thủy phân inulin tạo một lượng lớn fructose và một lượng nhỏ glucose.

• Điều kiện hoạt động tối ưu là nhiệt độ

45oC và pH = 7

CHẤT XƠ

LIGNOCELULOSE

CELULOSE

LIGNINA

Thủy phân chất xơ

In cellulose, glucose units are linked by β (1,4) linkages.

Cellulose (C6H1005)n là polymer mạch dài được cấu tạo từ duy nhất

một loại monomer (glucose)

Cellulases xúc tác thủy phân cellulose thành dextrin và glucose

optimum pH ~ 2.7

• Hemicellulose là polymers của hexose, pentose và uronic acids, mạch thẳng hoặc phân nhánh, vô định hình và có khối lượng phân tử tương đối nhỏ

• Pentosans khi bị thủy phân tạo pentoses (xylose and arabinose).

• Hemicellulases bị làm mềm dưới tác dụng của nhiệt

và dịch dạ dày

Thủy phân chất xơ

HEMICELULOSE

Celulase C Type

Celulase Cx Type

Tác động lên cellulose tự nhiên tạo các sợi polymer không tan của

glucose.

Tác động lên các sợi cellulose bị cắt ngắn hoặc ngậm nước tạo sản phẩm có khối lượng phân tử không cao và hòa tane

Thủy phân chất xơ

Cellulose chỉ bị thủy phân dưới tác dụng của celullase được sinh tổng hợp bởi vi sinh vật có trong dạ cỏ của động vật nhai lại

• Tăng độ tiêu hóa của các sản phẩm từ hạt ngũ cốc và rau

• Cùng với pectinase làm trong nước quả và tăng hiệu suất thu hồi

• Tách chiết các chất màu tự nhiên

• Tham gia quá trình lên men trong các sản phẩm mỳ và đồ uống

• Bóc vỏ quả cho quá trình tạo pures quả

• Bia: sử dụng kết hợp với amylase và pectinase để tăng hiệu quả sửdụng ngũ cốc (tăng hiệu suất thu hồi)

Thủy phân chất xơ – Ứng dụng

The American Society of Chemistry phân loại pectin:

Protopectin: không hòa tan trong nước

pectinic acid,

pectic acid tan hoàn toàn hoặc tan một phần trong nước.pectin

Enzymes có thể có nguồn gốc từ quả họ cam chanh, hành, cà chua

và vi sinh vật như nấm mốc, nấm men và vi khuẩn

Pectic enzymes

Gây đục, dính cho nước quả

Main pectic enzymes

pectin into low metoxyl pectin

Pectic enzymes

Pectin lyases Cleavage of the α 1,4 linkages between galacturonic acids still esterified

Pectin lyases are likely on the juice and wine industries becausethey avoid the production of methanol and volatile esters

responsible of off flavours typical of these products

Pectic enzymes

Poligalacturonase

Pectic enzymes

Cleavage of the α 1,4 linkages between galacturonic acids NOT esterified

Pectin enzymes + cellulases + hemicellulases mash treatment

in the juice extraction: The application of pectin enzymes helps releasing the oil, increasing the yield, reducing the process time and improving the quality of the final product

In some cases pectinases must be inactivated e.g orange juice

Pectic enzymes

Canola, coconut, sunflower seed, palm and olive are

traditionally produced by extraction with organic solvents, most commonly hexane The degradation of cell wall by pectic enzymes allows for its use for vegetable oil extraction from aqueous

process, through the liquefaction of the structural components

of the cell walls of seeds containing oil

Virgem extra olive oil Increases the amount ofantioxidant agents (vitamin E) Reduce the induction

to rancidity

Pectic Enzyme –Applications Oil Extraction

Main applications of enzymes in the fruit

processing industry

•Extraction/liquefaction

•Clarification

•Maceration

CENTRIFUGATION

Pectinases + cellulases

Pectinases + cellulases

ENZYMATIC TREATMENT

TURBID JUICE WITH PECTIN

PRESSING ENZYMATIC TREATMENT WARMING ( ~ 50°C)

PULP

GRINDING FRUIT

CONCENTRATED and CLARIFIED JUICE

CONCENTRATION AND RECUPERATION OF AROMES

FILTRATION CLARIFICATION

• Gelatin

• Bentonite diatomaceo

us earth

Enzyme Origin Action

Papain Latex flowing

through incision in non-mature fruit of

Carica Papaya

Act on muscle fibers, collagen and elastin (connective

tissue)Bromelin Stem, leaves and

fruits of Bromaliceae

family

Ficin Latex of the plants

of the genus Ficus

Proteolitic enzymes

Purified extracts of pancreas of human, beef and pork

Proteolitic enzymes

Fourth veal stomach

Pepsin < stomach cells

Proteolitic enzymes

Trypsin extracts of Purified

the pancreas of beef and pork

Proteolitic enzymes

rennet

or chymosin Fourth veal stomach

Increased sensitivity to addition of sodium chloride

Maximum coagulation at 50°C

Maximum coagulation at 65ºC

Proteolitic enzymes

Coagulation of casein

Proteolitic enzymes

Flavor

• Bakery They act on the peptide bonds of gluten, breaking them

• To improve the extensibility and texture of the dough

• Meat and Fish:

• Release oils

• Carcasses correspond to about 5% of the total weight

development of byproducts from bone protein and

fishbone

Proteolitic enzymes

Phospholipases: catalyze the hydrolysis of esters linked to glycerophospholipids.

• Improves flavor

Cheese

P roqueforti produces a soluble lipase, which is responsible for the

release of caproic, caprylic and capric in Roquefort cheese

The addition of lipolytic enzymes in Italian cheeses of Romano and

Provolone types have produced good results, as the flavor of these

cheeses is dependent on the high concentration of free fatty acid

Lipolitic enzymes – Lipases -Applications

• Have rarely been used in baking, due to the detrimental

effect observed by the action of endogenous lipases,

releasing unsaturated fatty acids

• Replacement of the emulsifier (monoglyceride) by lipase

enzyme

• Production of mono and diglycerides from the addition of

lipids improves the specific volume, crumb softness and consequently slowing the aging of the bread Furthermore, the enzymes lipase provide increased strength and elasticity

of the dough

• The addition of lipase may produce small amounts of free

short chain fatty acids that influence the aroma of the

bread.

Lipolitic enzymes – Lipases -Applications

Modification of oils and fats

Oxidative enzymes - Glucose-oxidase

• Catalyzes the oxidation of glucose to gluconic acid and

hydrogen peroxide

• Jointly operates with catalase

• Microbial origin

Elimination of oxygen and glucose

Desiccation of eggs Elimination of glucose

Oxygen in beer, wine and butter

Browning

Oxidative enzymes - Glucose-oxidase

Applications

Oxidative enzymes - Polyphenoloxidase

Copper as a prosthetic group

Can be called fenolase, tyrosinase or o-diphenol catecholase

Activity is high at pH 5-7

Denatured at pH <3

Found in virtually all plant

Pear Chlorogenic acid

Endogenous substrates for PPO in plants

Oxidative enzymes - Polyphenoloxidase

Enzymatic browning in

plants

Oxidative enzymes - Polyphenoloxidase

Condense, forming insoluble dark pigments, called melanoidins

Reacts non-enzymatically with other phenolic compounds, amino acids and proteins, also forming melanoidins

Lost of nutritional quality Vitamins and

aa

Oxidative enzymes – Polyphenoloxidase

responsible for the development of flavor precursors

Anthocyanidins and tannins characteristic astringency of bad fermented beans

Browning of many fruits, vegetables

And their products

Oxidative enzymes – Lipoxidases or

lipoxygenase

Lipoxygenase are enzymes that catalyze the addition of molecular oxygen to mainly polyunsaturated fatty acids linoleic acid (ω6) and linolenic acid (ω 3)

• Lipases generate free fatty acids

• Lipoxygenase act on the free fatty acid form peroxides, which will break disulfide bonds of gluten favoring the elasticity

Oxidative enzymes – Lipoxidases or

lipoxygenase – Application

• Catalize the oxidation of ascorbic acid

Oxidative enzymes – Ascorbic acid - Oxidase