chuyển gen kháng sâu cry1ab và cry1b 1ab vào giống mía vn84 4137 (saccharum officinarum l ) bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn agrobacterium tumefacien

Phi n lá, b lá dài ra theo sau là lóng mía ế ẹcũng dài ra... Trong thân cây mía ch a trên 70%ứ kh i lố ượng là nước.

Đ I H C QU C GIA THÀNH PH H CHÍ MINH Ạ Ọ Ố Ố Ồ

Đ I H C KHOA H C T NHIÊN Ạ Ọ Ọ Ự KHOA SINH H C – CÔNG NGH SINH H C Ọ Ệ Ọ

Đ TÀI : Ề CHUY N GEN KHÁNG SÂU cry1Ab VÀ cry1B-1Ab VÀO GI NG Ể Ố

MÍA VN84 4137 (Saccharum officinarum L.) B NG PH Ằ ƯƠ NG PHÁP S D NG VI KHU N Ử Ụ Ẩ Agrobacterium tumefacien

M C L C Ụ Ụ

o……… .46

I M đ u ở ầ

- Vi t Nam, mía là m t lo i cây tr ng mang l i giá tr kinh t , nỞ ệ ộ ạ ồ ạ ị ế ước ta có đ c đi m khíặ ể

h u, cùng v i kh năng thích ng trên nhi u lo i đ t khác nhau nh đ t than bùn, đ tậ ớ ả ứ ề ạ ấ ư ấ ấhoàn toàn cát, đ t chua m n, đ t đ i, khô h n ít màu m … nên cây mía đấ ặ ấ ồ ạ ỡ ược tr ngồ

kh p các vùng mi n trên c nắ ề ả ước Do đó phát tri n ngành mía để ường được xem là

chương trình kh i đ u đ ti n hành công nghi p hóa, hi n đ i hóa nông thôn, xóa đóiở ầ ể ế ệ ệ ạ

M t trong nh ng nguyên nhân quan tr ng nh t d n đ n gi m năng su t, s n lộ ữ ọ ấ ẫ ế ả ấ ả ượngmía nở ước ta là do phá ho i c a sâu b nh, trong đó ph bi n là loài sâu đ c thân thu cạ ủ ệ ổ ế ụ ộ

b cánh ph n Lepidoptera, hàng năm nhi u n i có th gây thi t h i đ n 30% s nộ ấ ở ề ơ ể ệ ạ ế ả

lượng M c dù nhi u bi n pháp khác nhau đã đặ ề ệ ược áp d ng đ phòng tr các lo i sâuụ ể ừ ạnày nh dùng lư ướ ắi b t sâu, bướm, dùng thu c tr sâu, thiên đ ch…nh ng nh ng lo iố ừ ị ư ữ ạcôn trùng này thường khó ki m soát do chúng di chuy n và l y th c ăn bên trong thânể ể ấ ứmía Do đó vi c t o ra các gi ng mía có kh năng kháng các lo i sâu b nh là m t nhuệ ạ ố ả ạ ệ ộ

Áp d ng công ngh sinh h c có th kh c ph c đụ ệ ọ ể ắ ụ ược nh ng khó khăn trên b ng cáchữ ằ

đ a các gen kháng sâu ư Bt vào b gen mía, t o ra gi ng mía kháng sâu trong th i gianộ ạ ố ờ

ng n.ắ

M c đích nghiên c uụ ứ

Lý lu n ậ : kh o sát quy trình chuy n gen cry1Ab và cry1B-1Ab vào mô s o mía thôngả ể ẹqua vi khu n A ẩ tumefaciens, làm c s cho vi c ng d ng chuy n gen nói chung vào câyơ ở ệ ứ ụ ể

mía (Saccharum officinarum L.) thông qua vi khu n A ẩ tumefaciens.

Th c ti n ự ễ : T o đạ ược các dòng mía mang gen kháng sâu cry1Ab và cry1B-cry1Ab b ngằ

phương pháp chuy n gen thông qua vi khu n ể ẩ Agrobacterium tumefaciens

II T ng quan tài li u ổ ệ

đ n Trung Qu c, n Đ và các đ o Thái Bình D ng.ế ố Ấ ộ ả ở ươ

T Trung Qu c cây mía đừ ố ược tr ng các nồ ở ước phía Đông Nam nh : Philippin,ư

Nh t B n, Indonesia; t n Đ mía đ c phát tri n ra các n c phía Tây nh :ậ ả ừ Ấ ộ ượ ể ướ ở ưIran, Ai C p, Tây Ban Nha, Ý.ậ

Cây mía được tr ng các nồ ở ước Đ a Trung H i t th k th XIII, Châu Mỹ tr ngị ả ừ ế ỉ ứ ồmía mu n h n vào th k XV Trong l n th hai vộ ơ ế ỉ ầ ứ ượt bi n sang Tân Th gi i,ể ế ớChristophe Colombus đã đ a gi ng mía đ n tr ng Châu Mỹ vào năm 1490 ư ố ế ồ ở ởSanto Domingo, sau đó đ n Mexico (1502), Brazin (1533), Cuba (1650).ế

Đ n th k th XVI đế ế ỉ ứ ường mía là m t hàng trao đ i gi a các nặ ổ ữ ước Nam Mỹ và thị

trường Châu Âu

2.2 Phân bố

Mía là cây nhi t đ i, phát tri n t t trong ph m vi t 35ệ ớ ể ố ạ ừ o vĩ tuy n B c đ n 35ế ắ ế o vĩtuy n Nam, trên các lo i đ t t cát đ n sét n ng.ế ạ ấ ừ ế ặ

Vi t Nam là nệ ước n m t 8ằ ở ừ o đ n 23ế o vĩ tuy n B c và có khí h u nhi t đ i nóngế ắ ậ ệ ớ

m, l ng m a cao, r t thích h p v i cây mía

2 B c Trung b (Thanh Hóa, Hà Tĩnh, Qu ng Bình)ắ ộ ả 59.168

3 Trung Trung B (Qu ng Ngãi, Bình Đ nh, Phú Yên)ộ ả ị 47.995

4 Tây Nguyên (Kon Tum, Gia Lai, Đ c Lăk, Đ c Nông)ắ ắ 34.747

5 Đông Nam B (Đ ng nai, Bình Dộ ồ ương, Bình Phước, Long An,

Tây Ninh)

29.092

6 Đ ng b ng sông C u Long (B n Tre, Trà Vinh, Sóc Trăng,ồ ằ ử ế

Ti n Giang, H u Giang, Đ ng Tháp, Kiên Giang, Cà Mau)ề ậ ồ

56.838

3 Đ c tính th c v t h c ặ ự ậ ọ

a) Thân mía

- Thân cây mía cao trung bình 2-3 m, m t s gi ng có th cao 4-5m Thân míaộ ố ố ể

được hình thành b i nhi u đ t h p l i Chi u dài m i đ t t 15-20 cm, trên m iở ề ố ợ ạ ề ỗ ố ừ ỗ

đ t g m có m t mía (m t m m), đai sinh trố ồ ắ ắ ầ ưởng, đai r , s o lá…ễ ẹ

o Thân mía có màu vàng, đ h ngỏ ồ

ho c đ tím.ặ ỏ

o Tuỳ theo t ng gi ng mà lóngừ ố

mía có nhi u hình d ng khácề ạnhau nh : Hình tr , hình tr ng,ư ụ ốhình ng ch … Thân đ n đ c,ố ỉ ơ ộkhông có cành nhánh, tr m từ ộ

s trố ường h p b sâu b nh.ợ ị ệ

Hình 1: các d ng lóng mía ạ b) Rễ

- R mía: Cây mía có 2 lo i r là r s sinh và r th sinh.ễ ạ ễ ễ ơ ễ ứ

+ R s sinh (r hom): Mía đễ ơ ễ ược tr ngồ b ng thân (sinhằ

s n vô tính) Khi tr ng, thân mía đả ồ ược ch t thành t ngặ ừ

đo n, m i đo n có t 2 đ n 4 m tạ ỗ ạ ừ ế ắ m m (thầ ường

g i là hom gi ng) Đai r các hom míaọ ố ễ ở đâm ra nh ngữ

r đ u tiên nh , m nh, có màu tr ngễ ầ ỏ ả ắ ho c màu tr ngặ ắ

Cây mía con th i kỳ đ u s d ng các ch t dinh dờ ầ ử ụ ấ ưỡng ch a trong hom gi ng, doứ ố

đó nhi m v chính c a l p r này là bám đ t và hút nệ ụ ủ ớ ễ ấ ước cung c p cho homấmía

+ R th sinh (r vĩnh c u): Ti p sau r s sinh, lúc m m mía đâm lên kh i m tễ ứ ễ ử ế ễ ơ ầ ỏ ặ

đ t, g c c a m m mía (cây mía non) b t đ u xu t hi n nh ng chi c r vĩnhấ ở ố ủ ầ ắ ầ ấ ệ ữ ế ễ

Lo i r này to và tr ng Ch c năng ch yêu là hút nạ ễ ắ ứ ủ ước, dinh dưỡng, cung c pấ

cho cây Cây mía con d n d n thoát ly kh i s ph thu c vào ch t dinh dầ ầ ỏ ự ụ ộ ấ ưỡng

d tr trong hom mía Hom mía khô qu t l i, r s sinh cũng đ ng th i h t vaiự ữ ắ ạ ễ ơ ồ ờ ếtrò c a nó, teo d n r i ch t ủ ầ ồ ế

Các r th sinh dính tr c ti p v i tr c cây, phát tri n cùng v i s phát tri n c aễ ứ ự ế ớ ụ ể ớ ự ể ủcây đ hoàn thành ch c năng sinh lý c a nó Nh ng r này c u t o ch yêu làể ứ ủ ữ ễ ấ ạ ủ

ch t x và đấ ơ ược chia thành 3 l p theo ch c năng riêng c a m i l p.ớ ứ ủ ỗ ớ

L p r th sinh sau cùng là nh ng r ăn sâu, ch c năng chính là hút nớ ễ ứ ữ ễ ứ ước nên

g i là l p hút nọ ớ ước Tùy thu c vào t ng lo i đ t khác nhau, các r này có khi ănộ ừ ạ ấ ễ

r t sâu t i 5-6 m.ấ ớ

- R ph sinh: Lo i r này thễ ụ ạ ễ ường đâm ra t đai r các lóng mía dừ ễ ở ưới cùng c aủthân mía M t s trộ ố ường h p khác do đ c tính c a gi ng ho c do đi u ki n c aợ ặ ủ ố ặ ề ệ ủmôi trường (ch y u là m d ) các r ph sinh phát tri n nhi u t các đai rủ ế ẩ ộ ễ ụ ể ề ừ ễtrên thân mía làm nh hả ưởng x u đ n ch t lấ ế ấ ượng mía nguyên li u Do v y,ệ ậ

nh ng gi ng mía hay ra r trên thân thữ ố ễ ường không đượ ảc s n xu t ti p nh n.ấ ế ậ

c) Lá

- Lá mía thu c lo i lá đ n g m phi n lá và b lá Phi n lá dài trung bình t 1,0-ộ ạ ơ ồ ế ẹ ế ừ1,5m có m t gân chính tộ ương đ i l n Phi n lá có màu xanh th m, m t trên cóố ớ ế ẩ ặnhi u lông nh và c ng, hai bên mép có gai nh B lá r ng, ôm kín thân mía,cóề ỏ ứ ỏ ẹ ộnhi u lông N i gi a b và phi n lá là đai dày c lá Ngoài ra còn có lá thìa , taiề ố ữ ẹ ế ổlá… Các đ c đi m c a lá cũng khác nhau tuỳ vào gi ng mía.ặ ể ủ ố

d) Hoa và h t mía ạ

- Hoa mía (còn g i là bông c ): ọ ờ

+ Hoa mía có hình chi c qu t m Khi mía k t thúc th i kỳ sinh trế ạ ở ế ờ ưởng

m m hoa đầ ược hình thành đi m trên cùng c a thân cây (đi m sinhở ể ủ ể

trưởng) và phát tri n thành hoa (cây mía chuy n sang giai đo n sinhể ể ạ

th c) Hoa mía đự ược bao b c b i chi c lá cu i cùng c a b lá (lá c t), khiọ ở ế ố ủ ộ ụ

đã được thoát ra ngoài, hoa xòe ra nh m t bông c (nên g i là bông c ).ư ộ ờ ọ ờ

C u t o c a hoa mía g m tr c chính và các nhánh c p 1, c p 2, (còn g iấ ạ ủ ồ ụ ấ ấ ọ

là gié và gié con) và trên nh ng gié con là nh ng hoa mía nh M i hoaữ ữ ỏ ỗmía được bao b i 2 m nh v , đở ả ỏ ượ ạc t o thành b i hai l p màng trong vàở ớmàng ngoài. 

+ T ch c sinh s n c a hoa: Hoa mía là lo i hoa có t ch c sinh s n ng mổ ứ ả ủ ạ ổ ứ ả ầ(Hipogina) và c u trúc đ n gi n M i hoa bao g m c tính đ c và tính cái,ấ ơ ả ỗ ồ ả ự

v i ba nh đ c, m t t cung và hai nh cái Khi hoa mía n , các bao ph nớ ị ự ộ ử ị ở ấ

nh đ c tung ph n, nh gió mà các nh cái d dàng ti p nh n nh ng h tị ự ấ ờ ị ễ ế ậ ữ ạ

n ng t 0,15 đ n 0,25 mg Trongặ ừ ế công tác lai

t o gi ng m i, lai h u tính là m t phạ ố ớ ữ ộ ương pháp đượ ức ng d ng r ng rãi và thuụ ộ

được nhi u k t qu , do đó, s ra hoa k t h t c a mía có ý nghĩa r t tíchề ế ả ự ế ạ ủ ấ

c c đ i v i m c đích này Hình 3: hoa míaự ố ớ ụ

Theo Jeswiet, các loài mía tr ng là :ồ

- Loài Saccharum officinarum L, còn g i là mía quí (noble cane): Loài mía nàyọ

tr ng thích h p các vùng khí h u nhi t đ i nồ ợ ở ậ ệ ớ Ở ước ta hi n nay còn g p r tệ ặ ấnhi u d ng c a loài mía quí nh mía voi, mía đ , mía tím (còn g i là mía tiên,ề ạ ủ ư ỏ ọmía thu c), Thanh Di u, mía m ng, mà bà con nông dân thố ệ ư ường tr ng đ ănồ ể

tươi, gi i khát Nh ng đ c đi m chính là: cây to th t m m, ít x , nhi u nả ữ ặ ể ị ề ơ ề ước, t lỉ ệ

đường cao Cây có màu xanh, vàng, đ x m ho c tím, không ho c r t ít ra hoa ỏ ẫ ặ ặ ấ Ở

nh ng n i đ t t t, đi u ki n khí h u thu n l i năng su t mía có th đ t r t caoữ ơ ấ ố ề ệ ậ ậ ợ ấ ể ạ ấ

mà ít có loài mía khác có th đ t t i Kh năng đ g c kém Loài mía này khôngể ạ ớ ả ể ố

m n c m v i b nh than và m t s b nh khác Tuy nhiên, nhìn chung kh năngẫ ả ớ ệ ộ ố ệ ảkháng sâu b nh kém, nh t là các b nh b r Chính vì v y, ngệ ấ ệ ở ộ ễ ậ ười ta đã áp d ngụ

phương pháp lai v i nh ng gi ng mía có s c ch ng ch u cao đ i v i sâu b nh đớ ữ ố ứ ố ị ố ớ ệ ểtìm các gi ng mía m i v a có năng su t mía cao, giàu đố ớ ừ ấ ường l i kháng sâu b nh.ạ ệ

Hình 5: Loài Saccharum officinarum L

- Saccharum barberi Jeswiet: Là loài mía có ngu n g c t vùng B c n Đ , thíchồ ố ừ ắ Ấ ộ

h p v i nh ng đi u ki n á nhi t đ i Loài mía này nghèo đợ ớ ữ ề ệ ệ ớ ường h n loàiơSaccharum officinarum, cây mía nh , dóng hình tr có màu xanh ho c tr ng, xỏ ụ ặ ắ ơ

bã nhi u, b n lá h p, s c s ng cao, kháng đề ả ẹ ứ ố ược nhi u lo i sâu b nh.ề ạ ệ

- Saccharum sinense Roxb.: Loài mía này còn được g i là mía Trung Qu c cácọ ố Ở

t nh phía B c nỉ ắ ước ta có nhi uề

d ng c a loài mía Saccharumạ ủ

sinense, đó là các d ng mía Gie,ạ

nh Gie Tuyên Quang, Gie L ngư ạ

S n,… Loài mía này thích h p v iơ ợ ớ

Hình 6: Loài Saccharum sinense Roxb

Các loài mía hoang d i thu c lo i Saccharum khác là:ạ ộ ạ

- Saccharum spontaneum L.: Loài này còn g i là mía d i c a vùng Tây Nam châuọ ạ ủ

Á Đó là các loài lau, s y v n thậ ẫ ường g p nhi u vùng trên kh p đ t nặ ở ề ắ ấ ước ta

Đ c đi m c a loài S spontaneum là cây thân nh , v c ng, s c s ng kh e, hàmặ ể ủ ỏ ỏ ứ ứ ố ỏ

lượng đường ít, t l x cao, ra hoa m nh, th i gian ra hoa s m, kh năng thíchỉ ệ ơ ạ ờ ớ ả

ng r ng, ít b sâu phá h i và có kh năng kháng nhi u lo i b nh nh mosaic,

gôm, b nh th i r và m t s b nh khác nh ng l i m n c m v i b nh than.ệ ố ễ ộ ố ệ ư ạ ẫ ả ớ ệ

Hình 7: Loài Saccharum spontaneum L

- Saccharum robustum Brandes & Jeswiet: Đ c đi m c a loài mía này là thân to,ặ ể ủlóng dài, đường ít do Jeswiet phát hi n Tân Guine vào năm 1929 Loài mía S.ệ ởrobustum có s c s ng m nh, đ nhi u và ra hoa Thân c ng nên ch ng đứ ố ạ ẻ ề ứ ố ược gióbão và sâu đ c thân, nh ng kháng b nh kém nh các b nh b lá và b r ụ ư ệ ư ệ ở ộ ộ ễTheo Carassi thì loài mía này cùng v i loài Erianthus maxinus đã tham gia vào sớ ựphát tri n c a loài mía quí Đi u đó có th ch ng minh qua vi c nghiên c u hìnhể ủ ề ể ứ ệ ứthái h c và t bào h c các loài mía.ọ ế ọ

Hình 8: Loài Saccharum barberi Jeswiet

4.2 Gi ng mía VN84 4137 ố

a VN84 4137 (VN) là gi ng mía do vi n nghiên c u Mía Đố ệ ứ ường B n Cát lai t oế ạnăm 1984, Ja60-5 lai v i đa giao, có năng su t khá, ch t lớ ấ ấ ượng cao, chín trungbình, thích ng r ng VN tr ng nhi u các vùng Nam Trung b , Trung Trung b ,ứ ộ ồ ề ở ộ ộTây Nguyên, Đông Nam b , Tây Nam b , tuy nhiên tình tr ng sâu b nh h i pháộ ộ ạ ệ ạ

ho i l n, do đó di n tích tr ng VN ngày càng s t gi m.ạ ớ ệ ồ ụ ả

b Đ c đi m hình thái: thân to trung bình, phát tri n th ng, lóng hình chùy ngặ ể ể ẳ ược,

v màu xanh n tím M t m m hình tròn ho c hình h n tròn, không có rãnhỏ ẩ ắ ầ ặ ế

m m Phi n lá r ng trung bình, màu xanh đ m B lá có nhi u lông, màu ph tầ ế ộ ậ ẹ ề ớtím, c lá hình s ng bò, lá thìa cong đ u Có m t tai lá nh Lá đ ng, dáng ng nổ ừ ề ộ ỏ ứ ọ

th ngẳ

c Đ c đi m nông nghi p: m c m m và đ nhánh m nh, s m, t p trung Tặ ể ệ ọ ầ ẻ ạ ớ ậ ỷ

l m c m m khá, s c đ nhánh cao, m t đ cây h u hi u cao T c đ vệ ọ ầ ứ ẻ ậ ộ ữ ệ ố ộ ươnlóng khá Kh năng tái sinh t t, l u g c đả ố ư ố ược nhi u năm Ch u h n t t aề ị ạ ố Ưthâm canh và kh năng thích ng r ng Gi ng m n c m đ i v i sâu đ cả ứ ộ ố ẫ ả ố ớ ụthân 4 v ch, sâu đ c thân mình tím và sâu đ c thân mình h ng l n.ạ ụ ụ ồ ớ

d Đ c đi m công nghi p: Năng su t mía đ t trên 80 t n/ha, vùng đ t đ m cóặ ể ệ ấ ạ ấ ở ấ ủ ẩ

th đ t trên 100 t n/ha Tr để ạ ấ ữ ường cao trên 11% Hàm lượng đường cao đ uở ầ

v , có th đụ ể ưa vào ép đ u v ầ ụ

Hình 9: gi ng mía VN84 4137ố

5 Giai đo n sinh tr ạ ưở ng

5.1 Giai đo n n y m m c a cây mía ạ ẩ ầ ủ

Được tính t khi tr ng đ n khi m m m c kh i m t đ t, chia 3 giai đo n: B từ ồ ế ầ ọ ỏ ặ ấ ạ ắ

đ u m c (10% m c), m c r (>50% m c), th i kỳ cu i (>80% m c) Quá trìnhầ ọ ọ ọ ộ ọ ờ ố ọ

n y m m là quá trình chuy n bi n t tr ng thái ng c a n t r , m m sangẩ ầ ể ế ừ ạ ủ ủ ố ễ ầ

tr ng thái ho t đ ng c a cây con và r non, sinh sôi thêm nhi u thân mía m i.ạ ạ ộ ủ ễ ề ớ

5.2 Giai đo n cây mía con ạ

B t đ u t khi cây có lá th t th nh t cho t i khi ph n l n s cây trong ru ng cóắ ầ ừ ậ ứ ấ ớ ầ ớ ố ộ

5 lá th t R cây b t đ u phát tri n khi cây con có 2 lá th t.ậ ễ ắ ầ ể ậ

Th i kì cây mía con ngoài ph thu c vào ch t dinh dờ ụ ộ ấ ưỡng thì cũng ph thu cụ ộvào đ c tính gi ng và các y u t ngo i c nh nh đ m, nhi t đ , đ t, kĩ thu tặ ố ế ố ạ ả ư ộ ẩ ệ ộ ấ ậcanh tác…Gi ng chín mu n, gi ng phát tri n giai đo n đ u ch m thố ộ ố ể ạ ầ ậ ường kéo dài

th i kỳ cây con so v i gi ng chín s m ho c có đ c tính phát tri n nhanh giaiờ ớ ố ớ ặ ặ ể ở

đo n đ u ạ ầ

5.3 Giai đo n mía nh y b i ạ ả ụ

Khi cây mía có 6 - 7 lá th t thì b t đ u đ nhánh, kho ng 10 lá th t mía đ r , ậ ắ ầ ẻ ả ậ ẻ ộsau đó gi m d n Nhánh do nh ng m m ph n g c c a cây mía n m dả ầ ữ ầ ở ầ ố ủ ằ ở ưới

Ph m ch t hom: Cây m to m p có kh năng đ nhánh s m và t p trung, cây ẩ ấ ẹ ậ ả ẻ ớ ậcon kh e h n.ỏ ơ

Y u t ngo i c nh: nhi t đ (26ế ố ạ ả ệ ộ oC-30oC là nhi t đ thích h p), đ m (75%-ệ ộ ợ ộ ẩ85% mía đ kh e, s m, g n), ánh sáng, kĩ thu t chăm sóc…ẻ ỏ ớ ọ ậ

5.4 Giai đo n mía v ạ ươ n lóng

Trong đi u ki n bình thề ệ ường, 4 tháng sau khi tr ng th i kỳ đ nhánh hoàn ồ ờ ẻthành R phát tri n, m m vễ ể ầ ươn cao Phi n lá, b lá dài ra theo sau là lóng mía ế ẹcũng dài ra Th i kỳ vờ ươn cao b t đ u t khi mía có lóng t i khi ng ng sinh ắ ầ ừ ớ ừ

trưởng

5.5 Giai đo n mía chín ạ

Bước vào th i kỳ làm lóng là đã b t đ u tích lũy đờ ắ ầ ường nh ng v i hàm lư ớ ượng không đáng k và ch y u là để ủ ế ường không k t tinh (đế ường kh ) Lử ượng đường saccaro tích lũy trong thân tăng d n theo tu i cây.ầ ổ

Khi mía có nhi u tháng và th i ti t thích h p cho s tích lũy đề ờ ế ợ ự ường thì hàm

lượng đường trong thân đ t t i m c t i đa và ch y u là đạ ớ ứ ố ủ ế ường k t tinh ế

(C12H22O11) lúc này g i là th i kỳ chín công nghi p.ọ ờ ệ

Khi đ t m c t i đa, tùy gi ng và đi u ki n th i ti t, lạ ứ ố ố ề ệ ờ ế ượng đường này có th ể

gi l i kho ng 15 ngày đ n 2 tháng Sau đó b t đ u gi m d n do b hô h p ữ ạ ả ế ắ ầ ả ầ ị ấ

ho c tái sinh tr l i, thặ ở ạ ường g i là mía quá l a ho c quá chín.ọ ứ ặ

6 Đi u ki n sinh thái ề ệ

6.1 Nhi t đ : ệ ộ

M i gi ng mía thỗ ố ường c n m t lầ ộ ượng nhi t nh t đ nh trong su t c cu c đ i c aệ ấ ị ố ả ộ ờ ủ

nó (t khi tr ng đ n khi mía chín và thu ho ch) m i th i kỳ sinh trừ ồ ế ạ Ở ỗ ờ ưởng mía

c n nh ng kho ng nhi t đ thích h p riêng Nhi t đ nh hầ ữ ả ệ ộ ợ ệ ộ ả ưởng đ n quangế

h p, v n chuy n và quá trình tích lũy đợ ậ ể ường Nhi t đ bi n đ i trong kho ng 30ệ ộ ế ổ ả

- 40°C, t c đ quang h p c a cây mía v c b n không thay đ i Tuy nhiên, v iố ộ ợ ủ ề ơ ả ổ ớnhi t đ quá cao ho c quá th p đ u làm gi m t c đ quang h p V i n ng đệ ộ ặ ấ ề ả ố ộ ợ ớ ồ ộCO2 thích h p, nhi t đ 34°C quang h p đ t m c cao nh t.ợ ở ệ ộ ợ ạ ứ ấ

Đ i v i cây mía, t lúc tr ng hom gi ng xu ng đ t cho đ n khi thu ho ch, ngố ớ ừ ồ ố ố ấ ế ạ ười

ta có th chia ra làm b n th i kỳ nh sau:ể ố ờ ư

- Th i kỳ tr ng, mía có th n y m m nhi t đ 15°C, nh ng t c đ n y m m sẽờ ồ ể ả ầ ở ệ ộ ư ố ộ ả ầtăng lên và t p trung h n theo đ tăng c a nhi t đ T t nh t là trong kho ngậ ơ ộ ủ ệ ộ ố ấ ả

t 20 - 25°C.ừ

- Th i kỳ mía đ nhánh, nhi t đ c n t 20 - 25°C.ờ ẻ ệ ộ ầ ừ

- Th i kỳ mía làm lóng vờ ươn dài c n nhi t đ trung bình trên 23°C và thích h pầ ệ ộ ợ

nh t là t 30 - 32°C.ấ ừ

- Th i kỳ mía chín, nhi t đ c n th p dờ ệ ộ ầ ấ ưới 20°C và biên đ nhi t l n gi a ngàyộ ệ ớ ữ

và đêm đ giúp cho quá trình chuy n hóa và tích lũy để ể ường đượ ốc t t

6.2 Ánh sáng:

Cùng v i nhi t đ , ánh sáng có vai trò quan tr ng trong ho t đ ng sinh lý c aớ ệ ộ ọ ạ ộ ủcây tr ng Cây mía là cây tr ng có b lá xanh l n, kh năng tích lũy ch t khô cao.ồ ồ ộ ớ ả ấTrong quá trình sinh trưởng và phát tri n, cây mía c n cể ầ ường đ , ánh sángộ

m nh Khi cạ ường đ và ánh sáng tăng, ho t đ ng quang h p b lá cũng tăngộ ạ ộ ợ ở ộlên, thi u ánh sáng, mía phát tri n y u, lóng cây, hàm lế ể ế ượng đường trên mía

th p, cây d b sâu, b nh t n công Trong su t cu c đ i, cây mía c n kho ngấ ễ ị ệ ấ ố ộ ờ ầ ả2.000 – 3.000 gi chi u sáng, t i thi u cũng ph i t 1.200 gi tr lên.ờ ế ố ể ả ừ ờ ở

6.3 Đ m trong đ t: ộ ẩ ấ

M c dù là cây tr ng c n, mía r t c n nặ ồ ạ ấ ầ ước Trong thân cây mía ch a trên 70%ứ

kh i lố ượng là nước Do đó, nước đ i v i đ i s ng cây mía là không th thi uố ớ ờ ố ể ế

được Nước tham gia quá trình quang h p t ng h p ch t khô, nợ ổ ợ ấ ước là môi trườnghòa tan các ch t dinh dấ ưỡng, nh đó mà cây có th h p th đờ ể ấ ụ ược Nước giúp chohom mía n y m m, cho cây đ nhánh, phát tri n vả ầ ẻ ể ươn dài và tích lũy đường Ở

nh ng vùng đ t cao, đ i gò, khô h n thì vai trò c a nữ ấ ồ ạ ủ ước càng tr nên quanở

tr ng h n Ngoài lọ ơ ượng m a t nhiên, đ cho cây mía có th phát tri n t t,ư ự ể ể ể ố

người ta c n tầ ưới vào các tháng mùa khô h n Ngạ ượ ạc l i, mía cũng là cây r t sấ ợ

nướ ởc, nh ng đ t b úng ng p và kh năng thoát nữ ấ ị ậ ả ước kém, cây mía sinh

trưởng và phát tri n khó khăn.ể

- Th i kỳ n y m m và đ nhánh, mía c n đ m trong đ t kho ng 65%.ờ ả ầ ẻ ầ ộ ẩ ấ ả

- Th i kỳ làm dóng vờ ươm dài mía c n nhi u nầ ề ước nh t, chi m t 50 - 60% nhuầ ế ừ

c u nầ ướ ủc c a quá trình sinh trưởng, đ m trong đ t c n t 75 - 80%.ộ ẩ ấ ầ ừ

- Th i kỳ mía chín, tích lũy đờ ường, mía c n đ m trong đ t dầ ộ ẩ ấ ưới 70% đ choểquá trình sinh hóa ti n tri n đế ể ược thu n l i.ậ ợ

nh ng lo i đ t x p, sâu, đ phì nhiêu cao, gi m t t và d thoát nữ ạ ấ ố ộ ữ ẩ ố ễ ước (đ t phùấ

sa b i ven các sông r ch, đ t v ng, đ t c n) Đ pH thích h p cho mía phát tri nồ ạ ấ ồ ấ ồ ộ ợ ể

t t t 5,5 - 7,5 Th c t đã ch ng minh, n u tr ng mía trên nh ng lo i đ t kémố ừ ự ế ứ ế ồ ữ ạ ấ

k c v hóa tính và lý tính thì không th có năng su t cao, ph m ch t t t, dùể ả ề ể ấ ẩ ấ ố

r ng đó là nh ng gi ng mía th t t t Cây mía s ng đằ ữ ố ậ ố ố ược và phát tri n ph thu cể ụ ộ

r t nhi u vào các đ c tính hóa, lý, c a đ t Nh ng lo i đ t sét n ng, nén ch t,ấ ề ặ ủ ấ ữ ạ ấ ặ ặchua, m n, ho c b úng ng p, thoát nặ ặ ị ậ ước kém Không ch nh hỉ ả ưởng đ n sế ự

phát tri n c a b r , đ n s h p th dinh dể ủ ộ ễ ế ự ấ ụ ưỡng, không khí và các quá trìnhsinh trưởng và phát tri n c a cây tr ng mà còn gây tr ng i cho công vi c tr ngể ủ ồ ở ạ ệ ồ

tr t, chăm sóc, thu ho ch, Đ i v i nh ng lo i đ t có đ phì nhiêu kém, đ câyọ ạ ố ớ ữ ạ ấ ộ ểmía phát tri n t t, c n ph i để ố ầ ả ược bón phân đ y đ , cân đ i và ph i tầ ủ ố ả ưới cho míavào các tháng c a mùa khô h n.ủ ạ

7 Nghiên c u nuôi c y mô mía ứ ấ

7.1 Nghiên c u t o mô s o ứ ạ ẹ

V t li u: các lo i mô phân sinh nh lá non.ậ ệ ạ ư

Nhi u lo i Auxin khác nhau nh : 2,4-D, IBA, NAA đã đề ạ ư ược th nghi m trênử ệnhi u gi ng mía thì 2,4-D khi s d ng riêng l thì cho k t qu t t nh t đ kíchề ố ử ụ ẻ ế ả ố ấ ểthích hình thành mô s o có kh năng sinh phôi, t l m u t o mô s o cao nh tẹ ả ỷ ệ ẫ ạ ẹ ấ

đ t đạ ược 100%

• Trên 2 gi ng mía: HSF-243 và HSF-245 Pakistan, nghiên c u s nh ố ở ứ ự ả

hưởng c a 2,4-D và s k t h p gi a 2,4-D v i BAP cho s t o mô s o ủ ự ế ợ ữ ớ ự ạ ẹ

K t qu : 3mg/l 2,4-D cho s t o mô s o t t nh t; còn s k t h p gi a ế ả ự ạ ẹ ố ấ ự ế ợ ữ2,4-D và BAP cho t l mô s o th p h n 80%(HSF-243) và 85% (HSF-ỷ ệ ẹ ấ ơ245)

• Ở ố gi ng mía Nayana: nh hả ưởng s t o mô s o c a 2,4-D, IBA, NAA ự ạ ẹ ủ(Behera và Sahoo năm 2009)

K t qu : 2,5mg/l 2,4-D cho t l t o mô s o là 100%; 2,5mg/l NAA ch là ế ả ỷ ệ ạ ẹ ỉ30% và sau khi c y truy n mô s o không còn kh năng tái sinh; IBA ấ ề ẹ ẳkhông có kh năng kích thích s phát sinh mô s o.ả ự ẹ

• Ở ố gi ng mía 1sd-16 Bangladesh: nh hở ả ưởng t o mô s o 2,4-D, NAAạ ẹ

K t qu : 3mg/l 2,4-D là 91%; NAA v i các n ng đ khác nhau đ u cho môế ả ớ ồ ộ ề

có kh năng kích thích ch i cao nh t.ả ồ ấ

7.3 Nghiên c u t o r cho ch i mía in vitro ứ ạ ễ ồ

K t qu c a nhi u nghiên c u cho th y NAA khi đế ả ủ ề ứ ấ ượ ử ục s d ng riêng rẽ có tác

d ng kích thích s t o r là t t nh t.ụ ự ạ ễ ố ấ

Trên gi ng mía Nayana n Đ : 2,5mg/l NAA cho k t qu t t nh t v i s r / ố ở Ấ ộ ế ả ố ấ ớ ố ễ

m u là 13,4±1,5; chi u dài trung bình c a r 4,0±0,94cm ẫ ề ủ ễ

- M i loài sâu có m c đ gây h i và triêu ch ng b nh khác nhau trên cây mía, tuyỗ ứ ộ ạ ứ ệnhiên cây mía nhi m sâu thễ ường có các đ c đi m đi n hình: khi mía th i kìặ ể ể ở ờcây non, sâu đ c vào gây hi n tụ ệ ượng héo nõn; đ i v i mía th i kí có lóng, sâuố ớ ở ờxâm nh p vào thân cây, đ t mía b sâu đ c d b gãy đ khi có gió to, đ ng th iậ ố ị ụ ễ ị ổ ồ ờ

b nh th i đ d phát tri n thong qua v t đ c này.ệ ố ỏ ễ ể ế ụ

Hình 10: Tr ng và sâu non sâu đ c thân b n v chứ ụ ố ạ Chilo sacchariphagus Bojer

Hình 11: Nh ng và trộ ưởng thành sâu đ c thân b n v ch Chilo sacchariphagus Bojerụ ố ạ

Hình 12: Tr ng và sâu non đ c thân mình tímứ ụ Phragmataecia castaneae Hŭbner

Hình 13:Nh ng và trộ ưởng thanh sâu đ c thân mình tímụ Phragmataecia

castaneae Hŭbner

Hình 14: Tr ng và sâu non sâuứ sâu đ c thân mình h ng l n (cú mèo) Sesamiaụ ồ ớ sp

Hình 15: Nh ng và trộ ưởng thành sâu đ c thân mình h ng l n (cú mèo) Sesamia sp.ụ ồ ớ

9 Ph ươ ng pháp t o dòng ạ

M c đích: Nh m thu đụ ằ ược m t lộ ượng l n b n sao c a m t trình t DNA xác đ nh.ớ ả ủ ộ ự ị

Ti n trình th c hi n bao gòm các bế ự ệ ước:

- Ch n và x lí vector: vector là m t DNA, thọ ử ộ ường có d ng vòng, mang nhi uạ ề

đ c tính có kh năng xâm nh p vào t bào vi khu n và mặ ả ậ ế ẩ ượn b máy t bàoộ ế

vi khu n đ t o ra nhi u b n sao khác gi ng h t vector ban đ u sau khi l aẩ ể ạ ề ả ố ệ ầ ự

ch n phù h p, th c hi n x lí b ng c t vector m t v trí xác đ nh v i m tọ ợ ự ệ ử ằ ắ ở ộ ị ị ớ ộenzym gi i h n, sau đó hai đ u ch n i đớ ạ ầ ỗ ố ược x lí đ chúng không t n iử ể ự ố

v i nhau tr l i.ớ ở ạ

- X lí DNA c n t o dòng: hai đ u c a đo n DNA đử ầ ạ ầ ủ ạ ược x lí phù h p v i 2ử ợ ớ

đ u ch n i c t c a vector.ầ ỗ ố ắ ủ

- T o vector tái t h p: vector và DNA c n t o dòng sẽ đạ ổ ợ ầ ạ ược tr n chung theoộ

m t t l nh t đ nh v i s hi n di n c a ligase, sẽ n i vector và DNA t oộ ỉ ệ ấ ị ớ ự ệ ệ ủ ố ạthành vector tái t h p.ổ ợ

- Chuy n vector tái t h p vào t bào ch : nh m s d ng t bào ch sao chépể ổ ợ ế ủ ằ ử ụ ế ủ

lượng l n b n sao vector tái t h p.ớ ả ổ ợ

- Có 2 lo i t bào ch thông d ng là: t bào vi khu n (thạ ế ủ ụ ế ẩ ường là E.coli), t bàoếeucaryote

- Ch n l c dòng vi khu n có ch a vector tái t h p c n tìm.ọ ọ ẩ ứ ổ ợ ầ

10 Ph ươ ng pháp chuy n AND plasmid vào t bào vi khu n ể ế ẩ

Plasmid được chuy n vào vi khu n E coli đ thu nh n nhi u b n sao sau đó chuy nể ẩ ể ậ ề ả ểplasmid này vào vi khu n A tumefacient t o ch ng vi khu n mang c u trúc gen bi nẩ ạ ủ ẩ ấ ế

n p Có 2 phạ ương pháp ph bi n đ chuy n gen plasmid vào vi khu n: ổ ế ể ể ẩ

+ Phương pháp xung đi n ệ+ Phương pháp s c nhi tố ệ

• Phương pháp xung đi n : là phệ ương pháp hi u qu nh t đ chuy nệ ả ấ ể ểgen ngo i lai vào t bào vi khu nạ ế ẩ

- S d ng s c đi n đ t o nh ng l trên màng t bào vi khu n Nh ng lử ụ ố ệ ể ạ ữ ỗ ế ẩ ữ ỗnày ph i đ l n đ phân t DNA có th vào trong t bào.ả ủ ớ ể ử ể ế

- S h i ph c c a vi khu n ph thu c vào s tái s p x p màng cho phép tự ồ ụ ủ ẩ ụ ộ ự ắ ế ếbào t n t i sau khi b s c nhi t ồ ạ ị ố ệ

- S thành công c a phự ủ ương pháp ph thu c vào vi c đi u ch nh đ m nhụ ộ ệ ề ỉ ộ ạ

c a đi n trủ ệ ường và đ dài xung.ộ

Nh ng thông s đữ ố ược đi u ch nh d a trên thông s c a đi n trề ỉ ự ố ủ ệ ường và

đi n tr trên máy t o xungệ ở ạ

Đ t o xung b nh hộ ạ ị ả ưởng l n b i đ ion c a dung d ch ch a DNA vào viớ ở ộ ủ ị ứkhu n.ẩ

• Phương pháp s c nhi t : Là phố ệ ương pháp nhanh và đ n gi n đơ ả ểchuy n gen plasmid vào t bào vi khu n ể ế ẩ

- Ph thu c vào s t n thụ ộ ự ổ ương c a màng khi b s c nhi t k t h p v i sủ ị ố ệ ế ợ ớ ựtác đ ng c a ion hóa tr 2 d n đ n s thay đ i tính l u đ ng c a màng tộ ủ ị ẫ ế ự ổ ư ộ ủ ếbào

- Phương pháp này cho phép t o 102- 103 t bào bi n n p trên m i ugạ ế ế ạ ỗDNA

- Phương pháp này th p h n phấ ơ ương pháp xung đi n nh ng nó đ n gi nệ ư ơ ả

h n không đòi h i thi t b đ c bi t.ơ ỏ ế ị ặ ệ

11 Ti-plasmid

Ti-plasmid được tìm th y trong t t c các dòng A.tumefaciens gây đ c Kích thấ ấ ả ộ ướckho ng 200-800kb, d ng vòng xo n kép, đóng vai trò quy t đ nh trong s chuy nả ạ ắ ế ị ự ểgene c a vi khu n A.tumefaciens vào t bào th c v t Trong Ti-plasmid có 2 vùngủ ẩ ế ự ậquan tr ng là: vùng T-DNA, và vùng gây đ c (vir gene).ọ ộ

T-DNA là vùng được chuy n vào t bào th c v t, kích thể ế ự ậ ướ ừc t 10-30kb Được gi i ớ

h p opine đợ ượ ạc t o thành t s k t h p gi a amino acid và đừ ự ế ợ ữ ường th c v t, chúng ự ậ

là ngu n cung c p nitrogen và carbon chuyên bi t cho vi khu n.ồ ấ ệ ẩ

Vùng gen vir là vùng g m nh ng trình t mã hóa cho các protein c n thi t cho s ồ ữ ự ầ ế ự

t ng h p, v n chuy n và h p nh t các vùng T-DNA vào t bào ch Kích thổ ợ ậ ể ợ ấ ế ủ ước kho ng 20-40kb g m 6 operon quan tr ng là VirA, VirB,VirC, VirD, VirE,VirG, và 2 ả ồ ọoperon khác ít quan tr ng h n là VirF, VirH.ọ ơ

VirA và VirG là 2 vùng quan tr ng nh t, có vai trò kích ho t ho t đ ng c a các vùngọ ấ ạ ạ ộ ủVir khác, các protein VirA và VirG luôn hiện di n trong t bào vi khu nệ ế ẩ

• VirA mã hóa cho protein VirA n m trên màng t bào vi khu n, protein nàyằ ế ẩ

nh n bi t s hi n di n c a các h p ch t phenol và nh ng phân t đậ ế ự ệ ệ ủ ợ ấ ữ ử ường

do t bào t n thế ổ ương c a th c v t ti t ra.ủ ự ậ ế

• VirG mã hóa cho protein G có vai trò nh m t y u t phiên mã, giúp ho t ư ộ ế ố ạhóa hay gia tăng cho s phiên mã c a gen Vir trên Ti-plasmid giúp cho ự ủquá trình bi n n p gen di n raế ạ ễ

• VirD1 và VirD2 mã hóa cho protein có ch c năng nh n bi t cho đo n DNAứ ậ ế ạ

n m gi a b ph i và b trái c a T-DNA sau đó c t và t o đo n DNA ằ ữ ờ ả ờ ủ ắ ạ ạchu i đ n Protein VirD1 có vai trò hỗ ơ ướng đo n T-DNA m ch đ n vào ạ ạ ơnhân, VirD2 g n vào đ u 5’ b o v nó kh i b c t b i exonuclease Khi ắ ầ ả ệ ỏ ị ắ ởvào nhân t bào th c v t, protein VirD2 giúp T-DNA hòa nh p vào b gen ế ự ậ ậ ộ

t bào th c v tế ự ậ

• VirE2 mã hóa cho protein E2, các protein này liên k t v i ph c h p ssT-ế ớ ứ ợDNA-VirD2 đ b o v ph c h p kh i các nucleasa, đ ng th i giúp đ nh ể ả ệ ứ ợ ỏ ồ ờ ị

hướng và v n chuy n ph c h p vào nhân th c v tậ ể ứ ợ ự ậ

• VirB mã hóa cho protein giúp v n chuy n m ch đ n T-DNA ra kh i màng ậ ể ạ ơ ỏ

t bào vi khu nế ẩ

12 C ch chuy n T-DNA t vi khu n A.tumafaciens sang t bào th c v t ơ ế ể ừ ẩ ế ự ậ

Trong t nhiên A.tumafaciens ch có th gây b nh trên các vùng b t n thự ỉ ể ệ ị ổ ương ở

th c v t, vì khi đó t bào sẽ ti t ra các h p ch t phenol, m t s lo i đự ậ ế ế ợ ấ ộ ố ạ ường đ n ơ

đ ng th i làm cho môi trồ ờ ường có tính acid, đây là nh ng tín hi u giúp ho t hóa ữ ệ ạprotein VirA trên màng t bào vi khu n, kh i đ u cho quá trình bi n n p T-DNA ế ẩ ở ầ ế ạvào t bào th c v tế ự ậ

Các h p ch t phenol có vai trò quan tr ng nh t khi hi n di n nòng đ th p (10ợ ấ ọ ấ ệ ệ ở ộ ấ

-7M) sẽ giúp thu hút ch ng A.tumefaciens gây đ c, còn n ng đ cao (10ủ ộ ở ồ ộ -5-10-4M) giúp ho t hóa các gen vir thông qua h th ng VirA/VirG.ạ ệ ố

T-DNA được lo i b các gen gây đ c t ng h p auxin, cytokinin, opine và thay th ạ ỏ ộ ổ ợ ế

b i các gen mong mu n bi u hi n trong th c v t nh gen kháng sâu b nh, ch m ở ố ể ệ ự ậ ư ệ ậ

chín trái… Đ ng th i khi bi n n p v i vi khu n A.tumefaciens ch m t s ít t bào ồ ờ ế ạ ớ ẩ ỉ ộ ố ế

nh n đậ ượ ực s hòa nh p b n v ng gen mong mu n vào b gen nhân Do đó c n ậ ề ữ ố ộ ầthi t ph i c u trúc thêm các gen ch n l c và gen ch th trong c u trúc đ ng ế ả ấ ọ ọ ỉ ị ấ ồ

chuy n v i gen mong mu n trên T-DNA.ể ớ ố

Gen ch n l c s dung đ ch n l c th chuy n gen, mã hóa m t protein cho phép ọ ọ ử ể ọ ọ ể ể ộ

nh ng t bào chuy n gen có kh năng phát tri n trên môi trữ ế ể ả ể ường có nh ng h p ữ ợ

ch t đ c v i t bào không chuy n gen Gen ch n l c có th mã hóa 1 enzym gi i ấ ộ ớ ế ể ọ ọ ể ả

đ c giúp phân h y tác nhân ch n l c, ho c mã hóa cho 1 enzym không h y c m vộ ủ ọ ọ ặ ạ ả ớ

s c ch c a tác nhân ch n l c, enzym này sẽ thay th cho enzym đã b bi n đ i ự ứ ế ủ ọ ọ ế ị ế ổtrong th chuy n genể ể

Nh ng gen ch n l c thữ ọ ọ ường s d ng: nptII, hpt, bar…ử ụ

 Gen bar

Nó được phân l p t vi khu n steptomyces hygroscopicus mã hóa cho ậ ừ ẩ

enzym phosphinothricin acetyl transferase có kh năng phosphoryl hóa và ảlàm m t ho t tính c a phosphinothricin, đây là m t lo i thu c di t c đấ ạ ủ ộ ạ ố ệ ỏ ược

b sung vào môi trổ ường đ sàng l c thê chuy n gen.ể ọ ể

phosphinothricin c ch enzym glutamine synthetase trong t bào th c v t ứ ế ế ự ậlàm gián đo n quá trình chuy n hóa amonia d n đ n tích lũy ch t này và ạ ể ẫ ế ấgây đ c cho t bào.ộ ế

15 Đ c t c a Bt ộ ố ủ

Bt là 1 lo i thu c tr sâu đạ ố ừ ượ ạc t o b i vi khu Bacillus thuringiensis, là 1 lo i vở ẩ ạkhu n Gram dẩ ương có kh năng t o bào t t n t i trên nhi u n i: đ t, cây, xácả ạ ử ồ ạ ề ơ ấ

ch t sâu b … Trong quá trình hình thành bào t , Bt t o 1 hay nhi u th vùi, b nế ọ ử ạ ề ể ả

ch t là các tinh th protein có đ c đ i v i nhi u sâu b khác nhau.ấ ể ộ ố ớ ề ọ

Cu i nh ng năm 1970, đ u nh ng năm 1980 d a trên nh ng ng d ng c a kỹố ữ ầ ữ ự ữ ứ ụ ủthu t sinh h c phân t m i đ nghiên c u Bt ngậ ọ ử ớ ể ứ ười ta ch ng minh đứ ược thu cố

tr sâu có đ c tính tr sâu c a Bacillus ừ ộ ừ ủ thuringiensis subsp kurstaki (HD1) là do

2 lo i tinh th g m 4 lo i protein : Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry2Aa.ạ ể ồ ạ

Nh ng gen t o các tinh th đ c đữ ạ ể ộ ược phân l p và chuy n vào th c v t, t đó raậ ể ự ậ ừ

đ i nh ng cây tr ng Bt có kh năng kháng nhi u lo i sâu khác nhau.ờ ữ ồ ả ề ạ

16 Các ph ươ ng pháp sinh h c phân t dùng trong phân tích th chuy n gen ọ ử ể ể

PCR là phương pháp đ n gi n, ít t n th i gian, tuy nhiên do hi n tơ ả ố ờ ệ ượng

dương tính gi do nhi m DNA ngo i lai r t d x y ra.ả ễ ạ ấ ễ ả

Bước 1: giai đo n bi n tính, giai đo n này c n nhi t đ cao h nạ ế ạ ầ ệ ộ ơ

Tm c a phân t , thủ ử ường là 94oc-96oc trong vòng 30s-1 phút

Bước 2: giai đo n lai Nhi t đ trong khoang 40ạ ệ ộ oC-70oC, cho phépcác m i b t c p v i nhau.ồ ắ ặ ớ

Bước 3:giai đoang kéo dài m ch DNA Nhi t đ là 72ạ ệ ộ oC th i gianờtùy thu c vào đ dài trình t c n khu ch đ i, thộ ộ ự ầ ế ạ ường t 30s-ừnhi u phút.ề

Đây là s khu ch đ i theo c p s nhân, sau 30 chu kì sẽ có ự ế ạ ấ ố

106 so v i s lớ ố ượng b n m u ban đ u.ả ẫ ầ

b Ki m tra s bi u hi n c a protein tái t h p b ng que th nhanh ể ự ể ệ ủ ổ ợ ằ ử

Phương pháp que th nhanh, là m t th nghi m mi n d ch d a trên sử ộ ử ệ ễ ị ự ự

g n k t đ c hi u gi a kháng nguyên và kháng th , ph n ng gi a khángắ ế ặ ệ ữ ể ả ứ ữnguyên và kháng th x y ra trên màng nitrocellulose k nể ả ỵ ước ho c màngặcellulose acetate