Tổng hợp một số dẫn xuất của axit gambogic (2017)

LỜI CẢM ƠN Khóa luận với đề tài: “Tổng hợp một số dẫn xuất của axit gambogic” được thực hiện tại phòng Hóa sinh hữu cơ - Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học v

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA HÓA HỌC

ĐỖ THỊ HỘI

TỔNG HỢP MỘT SỐ DẪN XUẤT

CỦA AXIT GAMBOGIC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Hóa học Hữu cơ

Người hướng dẫn khoa học

TS TRẦN THỊ THU THỦY

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận với đề tài: “Tổng hợp một số dẫn xuất của axit gambogic”

được thực hiện tại phòng Hóa sinh hữu cơ - Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Em xin trân trọng cảm ơn GS.TS Phạm Quốc Long và Ban lãnh đạo Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện cho em được học tập và sử dụng các thiết bị tiên tiến của viện để hoàn thành tốt các mục tiêu đề ra trong khóa luận của mình

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.Trần Thị Thu Thủy, cùng các anh - chị phòng Hóa sinh hữu cơ - Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên đã giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Hóa Học - Trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tận tình dạy dỗ và chỉ bảo cho em trong suốt 4 năm học tập tại trường

Trong quá trình thực hiện khóa luận, mặc dù đã hết sức cố gắng nhưng chắc chắn sẽ không tránh khỏi những thiếu sót Vì vậy, em kính mong nhận được sự đóng góp, chỉ bảo của các quý thầy cô và bạn bè

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 06 tháng 05 năm 2017

Sinh viên

Đỗ Thị Hội

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 3

1.1.1 Giới thiệu chi Garcinia 3

1.1.2 Giới thiệu về cây Garcinia hanburyi 4

1.1.3 Axit gambogic (GA) 8

1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

1.2.1 ớp m ng 12

1 2 2 ột 14

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC 15

1 3 1 Phổ hối ượng M 15

1.3.2 Phổ cộng từ hạt nhân ( NMR) 16

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 18

2.1 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT 18

2.1.1 Nguyên liệu 18

2.1.2 Thiết bị 18

2.1.3 Dụng cụ và hóa chất 18

2.2 CÁC QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM 19

2.2.1.Phân lập axit gambogic 19

2.2.2 Tổng hợp các dẫn xuất của axit gambogic 20

2.2.3 Thử hoạt tính gây độc tế bào của axit gambogic và các dẫn xuất 23

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

3.1 TỔNG HỢP CÁC DẪN XUẤT CỦA AXIT GAMBOGIC 25

3 1 1 Định hướng nghiên cứu 25

3.1.2 Kết quả tổng hợp các dẫn xuất 26

3.2 HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO IN VITRO CỦA AXIT

GAMBOGIC VÀ CÁC DẪN XUẤT 34

KẾT LUẬN 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 38

PHỤ LỤC 43

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Bản đồ phân bố cây Đằng hoàng 4

Hình 1.2: Lá và quả Đằng hoàng 5

Hình 1.3: Nhựa Đằng hoàng dạng bột và dạng thỏi 6

Hình 1.4 Một số hợp chất trong nhựa cây Đằng hoàng 7

Hình 1.5: Cấu trúc hóa học của axit gambogic 9

Hình 1.6: Bình giải ly bản mỏng 13

Hình 1.7: Sắc ký cột 14

Hình 2.1: Cấu trúc hóa học của axit gambogic 19

Hình 3.1: Cấu trúc hóa học và tinh thể của axit gambogic 25

Hình 3.2: Phản ứng chuyển hóa nhóm COOH của axit gambogic 27

Hình 3.3: Cấu trúc hóa học của hợp chất (2) 28

Hình 3.4: Phổ 1H-NMR của axit gambogic 28

Hình 3.5: Phổ 1H-NMR của dẫn xuất (2) 29

Hình 3.6: Phổ 13C-NMR của axit gambogic 29

Hình 3.7: Phổ 13C-NMR của dẫn xuất (2) 30

Hình 3.8: Cấu trúc hóa học của hợp chất (3) 31

Hình 3.9: Phổ 1H-NMR của chất (3) 31

Hình 3.10: Phổ 13C-NMR của dẫn xuất (3) 32

Hình 3.11: Cấu trúc hóa học của hợp chất (4) 33

Hình 3.12: Phổ 1H-NMR của dẫn xuất (4) 33

Hình 3.13: Phổ 13C-NMR của dẫn xuất (4) 34

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1: Hiệu suất phản ứng chuyển hóa của axit gambogic 34

Bảng 3.2: Hoạt tính gây độc tế bào in vitro của axit gambogic và các dẫn

xuất 35 Bảng 3.3: Giá trị IC50 của axit gambogic và các dẫn xuất 35

COSY : 1H-1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy

(Phổ tương tác hai chiều đồng hạt nhân 1H-1H) DEPT : Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

(Phổ DEPT) HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Connectivity

(Phổ tương tác đa liên kết hai chiều trực tiếp dị hạt nhân) HSQC : Heteronuclear Single Quantum Coherence

(Phổ tương tác hai chiều trực tiếp dị hạt nhân)

MS : Mass Spectroscopy (Phổ khối lượng)

HR-MS : Hight resolution Mass Spectroscopy

(Phổ khối lượng phân giải cao) s: singlet q: quartet

d: doublet dd: doublet doublet

t: triplet dt: doublet triplet

m: multiplet

δH, δC : Độ chuyển dịch hóa học của proton và cacbon

ppm : parts per million (phần triệu)

MỞ ĐẦU

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới nên được thừa hưởng nguồn thiên nhiên vô cùng phong phú và đa dạng sinh học với nhiều loại dược liệu quý Theo số liệu thống kê gần đây, hệ thực vật Việt Nam có trên 10.000 loài trong đó có khoảng 3.200 loài cây được sử dụng trong Y học dân tộc [1] Các hợp chất thiên nhiên thể hiện hoạt tính sinh học rất phong phú và là một trong những định hướng để con người có thể chiết, tách, tổng hợp tìm ra các loại thuốc mới chống lại bệnh tật, chất bảo quản thực phẩm, mỹ phẩm cũng như các chế phẩm phục vụ nông nghiệp, chăn nuôi có hoạt tính sinh học cao mà không ảnh hưởng đến môi trường sinh thái

Cùng với sự phát triển của ngành sinh học phân tử, hóa học các hợp chất thiên nhiên đã và đang được nhiều nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu Tìm kiếm và phát hiện các chất có hoạt tính sinh học trong thảm thực vật Việt Nam, qua đó đưa ra các giải pháp bảo tồn sự đa dạng sinh học của môi trường xung quanh là một nhiệm vụ luôn đòi hỏi sự cố gắng của tất cả mọi người trong xã hội đặc biệt là các nhà khoa học

Tuy nhiên, phần lớn các cây cỏ được sử dụng làm thuốc chưa được nghiên cứu đầy đủ và có hệ thống về mặt hóa học cũng như hoạt tính sinh học

mà chủ yếu dựa trên kinh nghiệm dân gian.Vì vậy chưa phát huy hết hiệu quả của nguồn tài nguyên quý giá này

Trong vô số các loài thực vật ở Việt Nam, có nhiều loài cây thuộc họ

Guttiferae có giá trị sử dụng cao được sử dụng làm thuốc chữa bệnh Đặc biệt,

trong số đó phải kể đến cây Đằng hoàng

Axit gambogic (GA) là thành phần chính mang lại hoạt tính đáng chú ý của nhựa cây Đằng hoàng Mặc dù được phân lập và xác định cấu trúc từ những năm 60 của thế kỷ trước [2,3] nhưng mãi đến năm 2004 hoạt tính ức chế sự phát triển và di căn của nhiều loại tế bào ung thư của axit gambogic

mới được giới khoa học chú ý như ung thư phổi, ung thư bạch cầu, ung thư tiền liệt tuyến, ung thư tụy, ung thư dạ dày, ung thư vú, ung thư ruột kết, ung thư não, ung thư gan…

Từ đó đến nay, các nhà khoa học trên thế giới đã phân lập được axit gambogic có độ tinh từ 95-99 và có gần 200 bài báo khoa học được công bố

về hoạt tính in vitro, in vivo, mối quan hệ hoạt tính – cấu trúc (QSAR),

chuyển hóa hóa học cũng như các kết quả thử lâm sàng của axit gambogic Hiện nay, ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về vấn đề này được công

bố Trong khi đó, nước ta lại là một trong những vùng đặc hữu mà nguồn nguyên liệu này sinh trưởng tốt Bởi vậy việc khai thác hoạt tính chống ung thư từ nhựa cây Đằng hoàng, nhất là axit gambogic là việc làm cần thiết từ các nhà khoa học để không phí hoài nguồn tài nguyên dược liệu s n có

Các nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất của axit gambogic là rất cần thiết

và tiềm năng trong việc phát hiện các chất mới có hoạt tính sinh học cao hơn chất đầu và ít độc tính hơn Việc thực hiện nhiệm vụ góp phần vào việc nâng cao trình độ nghiên cứu của các cán bộ thực hiện trong lĩnh vực tổng hợp hữu

cơ và hóa hợp chất thiên nhiên

Xuất phát từ những cơ sở trên tôi đã chọn đề tài “Tổng hợp một số dẫn xuất của axit gambogic”

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

1.1.1 Giới thiệu chi Garcinia

Garcinia là một trong những chi lớn nhất thuộc họ Bứa (hay Măng cụt)

với khoảng 400 loài trên thế giới Tên gọi Garcinia lấy theo tên của nhà thực

vật học Laurence Garcinia, người đã sưu tập các mẫu cây cỏ và sống tại Ấn

Độ vào thế kỷ 18 Họ Bứa ở Việt Nam có tất cả 62 loài, phân bố trên khắp đất nước từ vùng rừng núi phía Bắc đến ven sông rạch của các tỉnh phía Nam 1] Các loài trong họ Bứa chủ yếu là cây gỗ hoặc cây bụi, đặc trưng bởi có nhựa

mủ vàng, cành thường nằm ngang, hoa thường đơn tính, nhị thường nhiều, rời hay hợp thành bó

Ở Việt Nam, chi này có khoảng 29 loài và là chi lớn nhất trong họ Măng cụt [4] Các loài trong chi này thuộc loại thân thẳng có chiều cao trung bình 8-30m Lá của chúng có màu xanh đậm, có các đường gân r ràng Hoa màu vàng nhạt hoặc trắng hơi xanh có từ 4-5 cánh, bao phấn không cuống, buồng

phấn hẹp Nhiều loài cây trong chi Garcinia có quả ăn được như quả măng

cụt, quả dọc…Quả thường hình tròn, có từ 4-10 múi, có nhiều nước, hạt có lớp vỏ mỏng bao bọc Vỏ cây, vỏ quả và gỗ của các cây thuộc chi này thường tiết ra nhựa màu vàng hoặc trắng

Thành phần hóa học của chi Garcinia khá đa dạng, chủ yếu là các

xanthon, benzophenon, biflavonoid [5] và triterpenoid [6] Trong đó, xanthon

là nhóm hợp chất đặc trưng của chi Garcinia

Nhiều loài thuộc chi Garcinia có quả ăn được và rất ngon như quả măng cụt (G mangostana , bứa lửa (G fusca , bứa mọi (G harmandii , bứa núi (G oliveri Hạt của trái G indica có chưa một loại chất b o ăn được giống như

bơ Trái của loài G livingstonei dùng để lên men thức uống Trước đây khi

chưa có acid citric tổng hợp người ta xem tai chua (G.pendunculata là nguồn

cung cấp acid citrcic đáng quý

Trong công nghiệp, nhựa và vỏ trái nhiều loài được dùng làm phẩm

nhuộm vàng như vỏ trái sơn v (G merguensis , nhựa cây đằng hoàng (G hanburyi Dầu lọc (G multiflora được dùng làm xà phòng, dầu nhờn…

Từ lâu trong dân gian người ta đã biết sử dụng nhiều loài thuộc chi

Garcinia để làm thuốc chữa các bệnh đơn giản Vỏ cây bứa lá tròn, dài (G oblongifolia thường dùng trị lo t dạ dày, lo t tá tràng, viêm dạ dày, ho ra máu, mụn nhọt, nhựa dùng trị bỏng Vỏ trái bứa mọi (G harmandii được

dùng ăn với trầu, phối hợp với nhiều vị thuốc khác để trị tiêu chảy Dầu dọc được dùng để đắp mụn nhọt khi chưa vỡ mủ Ngoài ra, khi phối hợp với các thuốc khác như Calomel và Lô hội, nhựa của chúng còn được dùng để trị giun

và cả sán sơ mít…

1.1.2 Giới thiệu về cây Garcinia hanburyi

1.1.2.1 Đặ điểm hình thái và phân bố

Cây Garcinia hanburyi có tên thông thường là Đằng hoàng, thuộc họ

Măng cụt Clusiaceae (Guttiferae) phân bố đặc hữu ở vùng Đông Nam Á bao gồm Việt Nam, Hải Nam (Trung Quốc), Campuchia, Thái Lan, và mới đây được trồng thành công ở Singapo [7]

Hình 1.1: Bản đồ phân bố cây Đằng hoàng

Cây cao, to 10 - 20cm, thân nh n, thẳng đứng Lá mọc đối, cuống ngắn, hình bầu dục hay hình mác, hai đầu hơi tù, phiến lá dai, nguyên nh n, rộng 3 - 10cm Quả mọng hơi hình cầu, đường kính 2 - 5cm, phía cuống có đài tồn tại,

4 ngăn, mỗi ngăn có một hạt hơi cong hình cung Mùa hoa tháng 12 - 1, mùa quả tháng 2 - 3

Hình 1.2: Lá và quả Đằng hoàng

Tất cả các bộ phận của cây đều có những ống bài tiết nằm trong mô vỏ,

trong libe, tủy và cả trong mô gỗ Thường sau mùa mưa (ở miền Nam, vào các tháng 1 - 5 người ta dùng rìu khía thành vòng xoắn ốc trên thân, những khía sâu vài mm từ dưới đất lên đến cành thứ nhất Một chất dịch mủ màu vàng chảy ra được hứng vào các ống tre, sau một thời gian nhựa mủ đặc lại

Hơ nóng đều ống tre cho nước bốc hết đi Chẻ lấy vị Đằng hoàng Mỗi cây mỗi năm có thể cho ba thỏi đằng hoàng dài 0,50cm, đường kính 4cm Loại Đằng hoàng thỏi này được chuộng nhất trên thị trường tiêu thụ Nhưng có khi

vị Đằng hoàng còn đang mềm, người ta nặn thành bánh hay thành miếng to nhỏ không đều Có nơi người ta uốn cong cả cành Đằng hoàng cắt đầu cho nhựa mủ chảy ra, hứng vào ống tre hay vại rồi chế thành đằng hoàng thỏi hay miếng Vị Đằng hoàng thỏi thường là những thỏi dài 15-20 cm, đường kính 3-

6 cm, trên mặt thường có những khía dọc dấu vết của ống tre, trên mặt có bụi màu vàng nhạt Đằng hoàng dễ vỡ, vết vỡ bóng hay mờ, màu vàng, sẫm hay

vàng cam nâu nhạt Khi miết ngón tay ướt lên vị đằng hoàng ta sẽ thấy tay có màu vàng tươi Đằng hoàng tan trong cồn (cho màu đỏ), trong ete (cho màu vàng Đun nóng mềm ra nhưng không chảy lỏng và cháy không cho mùi gì đặc biệt Vị hắc, mùi không rõ

Hình 1.3: Nhựa Đằng hoàng d ng ột và d ng th i

1.1.2.2 hành ph n h h ủ nh ây Garcinia hanburyi

Trong nhựa cây Đằng hoàng có 70-80% chất nhựa, 18 đến 24% chất gôm,

ngoài ra còn có tinh dầu, một ête phenolic Thành phần chính của chất nhựa

này là axit gambogic (G , axit neogambogic và axit allogambogic [8,9] Ngoài ra còn có một số xanthone, các triterpene khác và có hoạt tính gây độc

tế bào nhưng ở hàm lượng rất nhỏ [10,11]

H nh 1.4 Một số hợp chất t ong nhựa cây Đằng hoàng

1.1.2.3 Công dụng

- Là thuốc tẩy rất mạnh: với liều 0,1 đến 0,2g đã cho phân lỏng, với liều 0,25 đến 0,4g phân rất nhiều, đau bụng và có khi nôn, với liều cao nữa thì độc (nôn, viêm dạ dày và ruột) có khi đến chết sau khi đau bụng nặng, phân có máu… Đằng hoàng chỉ có tác dụng ở khu vực ruột khi tiếp xúc với chất béo

và với mật nhung không có tác dụng thông mật

- Nhựa Đằng hoàng là một vị thuốc cổ truyền được dùng để điều trị một

số bệnh như cầm máu, tẩy giun sán, viêm hô hấp, viêm phế quản, sổ mũi, nhuận tràng, trị các vết thương nhiễm trùng ngoài da

- Trong công nghiệp dùng trong sơn, vẽ màu, phẩm nhuộm và chế vecni phủ lên kim loại

1.1.3 Axit gambogic (GA)

1.1.3.1 Giới thiệu về axit gambogic

Axit gambogic (GA- còn gọi là -guttiferin, axit guttatic) là thành phần chính mang hoạt tính của nhựa cây Đằng hoàng

Hình 1.5: Cấu trúc hóa học của axit gambogic

1.1.3.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của G được thực hiện chủ yếu tại các nước châu Á như Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan và Hàn Quốc

Mặc dù được phân lập và xác định cấu trúc từ những năm 60 của thế kỷ trước [12,13] nhưng mãi đến năm 2004 hoạt tính chống ung thư của axit gambogic mới được chú ý Từ đó đến nay, đã có gần 200 bài báo khoa học

trên thế giới công bố về hoạt tính in vitro, in vivo, mối quan hệ hoạt tính – cấu

trúc (QSAR), chuyển hóa hóa học cũng như các kết quả thử lâm sàng của AG

xit gambogic đã được chứng minh in vitro và in vivo là có hoạt tính

ức chế sự phát triển và di căn của nhiều loại tế bào ung thư 14,15], ví dụ như: ung thư phổi (IC50 tại 24h, 48h, 72 h : 1,74 ; 1,01; 0,81g/mL thấp hơn 4 lần

so với thuốc chống ung thư hydroxycamthothecin , ung thư bạch cầu (ED50

0,35 g/mL , ung thư tiền liệt tuyến, ung thư tụy, ung thư dạ dày (MGC-803:

IC50 0,96 g/mL , ung thư vú (ED50 1,64 g/mL , ung thư ruột kết (ED50 0,45

g/mL , ung thư não, ung thư gan…Ngoài ra, axit gambogic còn được phát hiện có hoạt tính ức chế kênh ion chỉnh lưu Kir2.1 (EC< 100 nm 16]

Cơ chế chống ung thư của G có liên quan đến việc thúc đẩy quá trình tự chết (apoptosis) của tế bào bằng cách hoạt hóa enzyme caspase 3 (EC50 0,78 M),

ức chế sự gắn kết của protein anti-apoptotic với peptid BH3 (IC50 = 1,47; 1,21; 2,02; 0,66; 1,06; 0,79 M lần lượt đối với Bcl-XL, Bcl-2, Bcl-W, Bcl-B, Bfl-1,

Mcl-1) [12, 13, 14] AG gắn với thụ thể transferring (IC50 = 4,1 M) gây ra sự chết lập trình của nhiều dòng tế bào ung thư 17,18]

Một số nghiên cứu khác chỉ ra AG ức chế hoạt động của chymptrypsin trên 20S proteasome [19], gây độc trên dòng tế bào ung thư não thông qua cơ chế AMPK ảnh hưởng trên EGFR và tín hiệu Akt/mTORC1 [20] G ngăn chặn sự tạo mạch máu, ức chế quá trình tăng sinh tế bào và di căn 21]

xit gambogic có độc tính thấp, hoạt tính chọn lọc và khả năng là một tác nhân hóa trị tiềm năng Nghiên cứu độc tính cấp và trường diễn trên chuột

và chó đã chỉ ra liều không gây độc theo đường uống là 60 mg/kg trọng lượng trong 13 tuần, gấp 18 lần so với liều thử lâm sàng trên người (20 mg/60 kg, hàng ngày) [22,23] Hiện tại, axit gambogic đã được các nhà khoa học Trung Quốc điều chế thuốc từ trạng thái tinh khiết 92-95 và đã thử nghiệm lâm sàng ở các giai đoạn I và II trên bệnh nhân ung thư phổi, ruột và thận [24] Kết quả nghiên cứu lâm sàng giai đoạn II đã bước đầu chứng minh tác dụng hiệu quả của AG trên các bệnh nhân ung thư và cho thấy AG dạng bào chế an toàn hơn so với nhựa Đằng hoàng tự nhiên, đồng thời có thể tiếp tục đưa vào thử nghiệm lâm sàng ở các giai đoạn sau

Nhiều công trình khoa học gần đây nhất cũng cho thấy AG còn thể hiện khả năng tăng cường hiệu lực điều trị (synergistic) khi kết hợp với một số loại thuốc điều trị ung thư khác như docetaxel, vincristine, verapamil, adreamycin, cisplatin, 5-fluorouracil hay sunitinib trên các dòng tế bào ung thư ác tính khác nhau [25,26,27,28]

Cấu trúc hóa học của axit gambogic đã được xác định bằng phương pháp phổ NMR [29], và gần đây được khẳng định thêm nhờ phân tích nhiễu

xạ tia X tinh thể [30] Nó bao gồm một hệ vòng

4-oxatricyclo[4.3.1.0]decan-2-one, một dạng cấu trúc của một số hợp chất thiên nhiên phân lập được từ

các loài Garcinia (chi Bứa) [31]

Vào năm 2004, công trình đầu tiên về việc chuyển hóa AG nhằm nghiên cứu mối quan hệ hoạt tính – cấu trúc (S R được công bố bởi các nhà khoa học của hãng Dược Maxim (San Diego, Mỹ) [32] Từ đó đến nay, đã có hơn 10 công bố về việc tổng hợp các dẫn xuất (derivative) và các chất tương

tự (analogue) Một số chất tổng hợp được từ AG có hoạt tính mạnh hơn nhiều lần so với chất đầu, ví dụ như methyl ester của AG có hoạt tính trên dòng tế bào ung thư phổi A549 mạnh hơn 2-3 lần, dẫn xuất epoxy có hoạt tính mạnh hơn 3-6 lần GA trên dòng tế bào ung thư gan 33], 3 dẫn xuất este khác có hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào ung thư gan mạnh hơn G và hơn 27,8-14,5 lần so với taxol [34]… Các hợp chất analogue tổng hợp được tuy không có hoạt tính kháng ung thư mạnh như G nhưng việc nghiên cứu chúng đã làm sáng tỏ phần cấu trúc có hoạt tính của axit gambogic [35-38]

1.1.3.3 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

xit gambogic cũng như dược liệu Đằng hoàng chưa có trên thị trường Việt Nam nên tiêu chuẩn cơ sở là chưa có Việc xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cơ sở và phương pháp phân tích định tính, định lượng axit gambogic là rất quan trọng Nhờ thế, sản phẩm axit gambogic mới trở thành thương phẩm

có giá trị

Tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, từ năm 2013, chỉ có nhóm

TS Trần Thị Thu Thủy đang tiến hành nghiên cứu quy trình phân lập axit gambogic tinh khiết ở quy mô phòng thí nghiệm và hiện đang triển khai ở quy

mô lớn hơn Cấu trúc của axit gambogic phân lập được đã được khẳng định bằng phổ NMR và MS, kết hợp với so sánh dữ liệu đã công bố Các nghiên cứu sơ bộ về hoạt tính sinh học tại Viện đã chứng minh hoạt tính gây độc tế

bào trên 3 dòng tế bào ung thư phổi, gan và màng tim Hoạt tính và cơ chế tác dụng của axit gambogic trên dòng tế bào ung thư não T98 đã được thực

hiện và công trình đã được đăng trên tạp chí Bioorg Med Chem Lett vào

năm 2015

1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1.2.1 ớ )

Sắc ký lớp mỏng (TLC được sử dụng để phân tích định tính các hỗn hợp chất, định hướng và kiểm tra các quá trình phân tách và phân lập bằng sắc ký

Phân tích sắc ký lớp mỏng thường được thực hiện trên bản mỏng tráng silica gel, chiều dày 0,2 mm trên nền nhôm Nếu các chất không phát hiện được bằng đèn UV 256/354 nm thì dùng các thuốc thử hiện màu là dung dịch Vanilin/H2SO4 đặc1%, Ce(SO4)2/H2SO4đặc 15%, p-Anisaldehyde/H2SO4, Ce(SO4)2 / molybdate / H2SO4, I2, KMnO4, N-inhydrin…

Các dung môi thường dùng cho TLC được xếp theo thứ tự độ phân cực tăng dần là: ete dầu hỏa < hexane < cyclo hexane < toluen < diethyl ete < dichloromethan < chloroform < etyl axetat < axeton < ethanol < axit axetic

 Giải ly bản m ng

Pha dung môi (hệ dung môi) phù hợp cho vào bình giải ly có đặt s n một tấm giấy thấm (giấy lọc , nghiêng đảo nhẹ để dung môi thấm ướt tờ giấy lọc (làm cho dung môi trong bình được bão hòa)

Đặt tấm bản mỏng vào bình giải ly, cạnh đáy của bản mỏng chạm vào đáy của bình và ngập vào dung môi Các vết chấm mẫu không được ngập vào dung môi

Hình 1.6: Bình giải ly bản m ng

Khi dung môi đến mức tiền tuyến (vạch phía trên) bản mỏng thì ngưng quá trình giải ly, lấy bản mỏng ra, sấy khô dung môi và tiến hành hiện hình mẫu thử bằng các thuốc thử đặc trưng

 Hiện hình các vết sau khi giải ly

Sau khi giải ly xong, các hợp chất có màu sẽ được nhìn bằng mắt thường, nhưng phần lớn các chất hữu cơ không có màu nên muốn nhìn thấy các vết cần sử dụng các phương pháp hóa học hoặc vật lý

 Phương pháp vật lý

Phát hiện bằng tia tử ngoại (UV) Bản mỏng sau khi giải ly xong, sấy khô, đặt bản mỏng vào đèn UV, quan sát màu, nếu cần quan tâm thì dùng vết chì khoanh lại

 Phương pháp hóa h c

Phát hiện bằng các thuốc thử đặc trưng như I2, KMnO4,dung dịch vanillin, dung dịch FeCl3, dung dịch H2SO4, dung dịch Ce(SO4)2 Thường sử dụng thuốc thử vanillin

)

Trong phương pháp sắc ký cột, pha tĩnh thường là silica gel được nhồi vào cột sau đó hỗn hợp chất hoà tan trong dung môi hữu cơ được đưa lên cột sắc ký Tiếp đó sắc phổ được triển khai, nghĩa là các vùng của từng chất lúc đầu chưa tách ra khỏi nhau, thì nay do rửa giải tiếp bằng dung môi (tức là cho dung môi tinh khiết liên tục chảy qua cột) mà tách hẳn ra khỏi nhau

Đây là phương pháp được ứng dụng phổ biến nhất để phân tách các chất trong một hỗn hợp dựa vào sự khác nhau về độ phân cực của chúng Khi dung môi kém phân cực đi qua cột sắc ký, những phần kém phân cực sẽ bị rửa giải đi ra cùng dung môi, những phần phân cực hơn chỉ đi qua khi dung môi được đưa vào có độ phân cực cao hơn

Hình 1.7: Sắc ký cột

Trong sắc ký cột dung môi dùng để rửa giải thường là n-hexan, axeton,

etyaxetat, điclometan, methanol Để hứng dung môi trong quá trình rửa giải hấp phụ ta thường dùng ống nghiệm 20mL hoặc lọ thủy tinh, ống nghiệm hoặc bình nón, tuỳ vào kích thước cột mà ta sử dụng lọ hứng chất cho phù hợp

Các ống nghiệm đều được đánh số thứ tự và sắp xếp lần lượt Sau khi

kiểm tra bằng TLC để gom các phân đoạn có đặc điểm giống nhau Các phân

đoạn sau đó được chuyển vào các lọ chứa để làm các phân tích tiếp theo

Nhồi cột có 2 cách nhồi: nhồi khô và nhồi ướt

Nhồi khô: Cột sau khi được dựng cẩn thận, ta đưa silicagel vào cột theo

một tỷ lệ nhất định Dùng dung môi thích hợp cho vào cột sắc ký, sau đó từ từ

cho dung môi ngấm dần và chảy xuống cuối cột Chú ý không để các bọt khí

còn trong cột sẽ làm ảnh hưởng tới quá trình tách chất Để ổn định cột trước

khi chuyển mẫu phân tích lên

Nhồi ướt: Cột được chuẩn bị và lắp cố định vào giá, cân một lượng

silicagel thích hợp khuấy trộn đều với dung môi thành một hỗn hợp lỏng sệt

Mở và rót vào cột cho dung môi chảy và để silicagel lắng tự nhiên xuống đáy

cột Tránh xuất hiện các bọt khí Cho dung môi chảy liên tục một thời gian

đến khi cột đã hoàn toàn ổn định

Đưa chất phân tích vào cột: Có 2 cách đưa chất vào cột: tẩm mẫu bằng

silica gel hoặc đưa trực tiếp lên cột

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC

Cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ được xác định nhờ vào

phương pháp phổ kết hợp Tùy thuộc vào cấu trúc hóa học của từng chất mà

người ta sử dụng phương pháp phổ cụ thể Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu

phối hợp các phương pháp phổ càng cao Trong một số trường hợp, để xác định

chính xác cấu trúc hóa học của các hợp chất, người ta phải sử dụng các phương

pháp bổ sung khác như chuyển hóa hóa học, các phương pháp sắc ký so sánh,…

1.3.1 Phổ hối ượ M )

Máy phối khổ sử dụng một chùm electron bắn vào một lượng nhỏ chất

thử, phá chúng thành nhiều mảnh ion mang điện dương Các mảnh ion này

nhờ một bộ phận phát hiện và ghi thành pic với cường độ khác nhau tương

ứng với khối lượng của mỗi ion, đó là khối phổ Đa số ion phân tử (ion mẹ) bị phá rất nhanh từ 10-10 đến 10-3 giây để hình thành các mảnh ion mang điện dương, những ion này lại tiếp tục bị phá thành những ion nhỏ hơn Chỉ có một

số ít ion phân tử chưa kịp bị bắn phá di chuyển đến bộ phận tập hợp và thể hiện thành pic ion phân tử trên phổ, pic này sẽ cho ta biết khối lượng phân tử của chất thử

Giá trị lớn của khối phổ là việc ứng dụng các mảnh ion tạo nên để phân tích cấu trúc các hợp chất hữu cơ Vì vậy, kết quả phân tích khối phổ cho chúng ta khối lượng phân tử của hợp chất và cấu trúc sơ bộ của chúng

1.3.2 Phổ c ng từ hạt nhân ( NMR)

Phổ cộng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay Các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của các hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều

Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và phổ cacbon) là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (1H và 13C dưới tác dụng của tử trường ngoài Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ dịch chuyển hóa học (chemical shift, δ Ngoài ra, đặc trưng của phân tử còn được xác định dựa vào tương tác spin giữa các hạt nhân tử với nhau (spin coupling)

1.3.2.1 Phổ 1 H-NMR

Trong phổ 1H -NMR, độ dịch chuyển hóa học (δH) của các proton được xác định trong thang ppm từ 0 -14 ppm, tùy thuộc vào mức độ lai hóa của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phần Dựa vào những đặc trưng của độ dịch chyển hóa học và tương tác spin mà ta có thể xác định được cấu trúc hóa học của hợp chất

1.3.2.2 Phổ 13 C-NMR

Phổ này cho tín hiệu vạch phổ cacbon Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một môi trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau Thang đo của phổ 13C-NMR là ppm, với dài thang đo rộng là 0 - 230 ppm

- Phổ HSQC: Các tương tác trực tiếp H - C được xác định nhờ vào các tương tác phổ này Trên phổ, một trục là phổ 1

H-NMR, còn trục kia là phổ 13C -NMR Các tương tác HSQC nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ

- Phổ 1H- 1H COSY : Phổ này biễu diễn tương tác của H - H, chủ yếu

là các proton đính với cacbon liền kề nhau Nhờ phổ này mà các phần của phân tử được nối ghép lại với nhau

- Phổ HMBC : Đây là phổ biểu diễn tương tác xa của H và C trong phân tử Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc

Khi sử dụng thì đập vỡ các thỏi nhựa Đằng hoàng thành các mẩu nhỏ rồi nghiền mịn Đem sấy khô để loại bỏ hoàn toàn nước còn lại có trong nguyên liệu

2.1.2 Thiết bị

- Phổ cộng từ hạt nhân 1D và 2D-NMR được đo trên máy Bruker V

500 FT-NMR Spectrometer trong các dùng môi CDCl3 và CD3OD sử dụng TMS làm chất chuẩn nội

- Phổ khối phân giải cao (HR-MS được đo trên máy micro-TOF-QII 1002.7 tại Gif-sur-Yvette (Pháp)

- Máy siêu âm

- Máy cô quay chân không

- Máy sấy

- Silicagel pha thường (0,04 - 0,063 mm và 0,063 - 0,2 mm) Merck

- Bản mỏng tráng s n pha thường DC -Alufolien 60 F254 (Merck)

- Các loại dung môi hữu cơ như metanol, cloroform, axeton, etyl axetat,

n-hexan, butanol…được tinh chế bằng chưng cất trước khi sử dụng

- Các loại thuốc thử khác nhau: vanilin, KMnO4 , H2SO4 , FeCl3 …

2.2 CÁC QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM

2.2.1.Phân lập axit gambogic

Cặn chiết etyl axetat từ nhựa cây đằng hoàng được tách trên cột silica

gel với hệ rửa giải gradient hexane/EtO c Phân đoạn chính được tiếp tục

tinh chế trên cột Sephadex LH-20 sử dụng MeOH là dung môi rửa giải Axit

gambogic (1) thu được dưới dạng bột vô định hình màu vàng (hàm lượng

C NMR (125 MHz, CDCl3)  (ppm): 203,3 (C-12); 178,9 (C-8); 160,2 (C-30); 161,5 (C-6); 157,6 & 157,4 (C-16, C-18); 137,8 (C-27); 135,3 (C-10); 133,4 (C-9); 131,8 (C-23); 131,5 (C-33); 127,8 (C-28); 124,5 (C-3); 123,8 (C-22); 122,3 (C-32); 115,9 (C-4); 107,6 (C-17); 102,8 (C-5); 100,5 (C-7); 90,9 (C-14); 83,95 (C-13); 83,8 (C-38); 81,3 (C-2); 49,0 (C-36); 46,8 (C-11); 42,0 (C-20); 29,9 (C-39); 29,3 (C-26); 28,8 (C-40); 27,7 (C-19); 25,6 (C-24, C-35); 25,2 (C-37); 22,7 (C-21); 21,6 (C-31); 20,7 (C-29); 18,1 (C-34); 17,6 (C-25)

2.2.2 Tổng hợp các dẫn xuất của axit gambogic

2.2.2.1 Qui trình este hóa

Hỗn hợp của axit gambogic (200 mg; 0,32 mmol), DMAP (78 mg; 0,64 mmol), EDC (123 mg; 0,64 mmol) và MeOH hoặc EtOH (3,2 mmol) trong THF (5 mL được khuấy ở nhiệt độ phòng trong 3 h Dung dịch phản ứng được đổ vào nước (10 mL), chiết bằng EtOAc (3 x 10 mL) Pha hữu cơ được gộp lại, làm khan và cô đặc cho sản phẩm thô Tinh chế trên cột silica gel (hexane-EtOAc 5:1) cho sản phẩm ester

Ethyl gambogate (2): Chất dầu màu vàng (hiệu suât 75%)

1

H NMR (500 MHz, CDCl3)  (ppm): 12,84 (s, 1H, OH-6); 7,53 (d, J 7.0 Hz, H-10); 6,66 (d, 1H, J 10.0 Hz, H-4); 5,99 (t, 1H, J 8.0 Hz, H-27); 5,42 (d, 1H, J 10.0 Hz, H-3); 5,05 (m, 2H, H-22, 32); 3,89 (q, 2H, J 5.5 Hz,

OCH2); 3,46 (m, 1H, H-11); 3,30 (dd, 1H, J 8.0 & 15.0 Hz, H-31); 3,15 (dd, 1H, J 5.0 & 14.5 Hz, H-31); 3,02 (dd, 1H, J 6.5 & 16.5 Hz, H-26); 2,92 (dd, 1H, J 7.0 & 16.5, H-26); 2,50 (d, 1H, J 9.5 Hz, H-36); 2,31 (dd, 1H, J 4.5 &

13.5 Hz, H-37); 2,03 (m, 2H, H-21); 1,77 (m, 1H, H-20); 1,73 (s, 3H); 1,69 (s, 3H); 1,68 (s, 3H); 1,65 (s, 3H); 1,63 (s, 3H); 1,60 (m, 1H, H-20); 1,57 (s, 3H); 1,55 (s, 3H); 1,43 (s, 3H); 1,37 (m, 1H, H-37); 1,28 (s, 3H); 1,09 (t, 3H, J 7.0

Hz, CH3-CH2-O)

C NMR (125 MHz, CDCl3)  (ppm): 203,6 (C-8); 179,0 (C-12); 167,0 (C-30); 161,3 (C-6); 157,6 (C-16); 157,5 (C-18); 136,0 (C-10); 135,1 (C-28); 133,6 (C-9); 131,8 (C-33); 131,5 (C-23); 127,9-124,4 (C-3); 123,8 (C-22); 122,3 (C-27,32); 115,9 (C-4); 107,6 (C-17); 102,5 (C-5); 100,5 (C-7); 91,0 (C-14); 83,73 (C-2); 83,69 (C-13); 81,3 (C-38); 60,1 (OCH2); 49,1 (C-36); 46,9 (C-11); 42,1 (C-20); 29,9 (Me); 29,7 (C-26); 29,1 (Me); 28,8 (Me); 27,9 (Me); 25,6 (2Me); 25,1 (C-37); 22,7 (C-21); 21,6(C-31); 20,8 (Me); 18,1 (Me); 17,6 (Me); 14,0 (CH3-CH2-O)

HR-MS (m/z): 657,3422 [M+H]+, tính toán [C40H48O8+H]+: 657,3427

2.2.2.2 Qui trình amide hóa

Hỗn hợp của axit gambogic (200 mg; 0,32 mmol), DMAP (78 mg; 0,64 mmol), EDC (123 mg; 0,64 mg) và amine (0,64 mmol) trong THF (3 mL) được khuấy ở nhiệt độ phòng trong 6 h Dung dịch phản ứng được đổ vào nước ( 10 mL) và chiết bằng EtOAc (3 x 10 mL) Pha hữu cơ được gộp lại, làm khan và cô đặc, tinh chế trên cột silica gel (EtOAc-DCM)

N-diallyl-gambogamide (3): Chất dầu màu vàng (hiệu suất 70%)

1

H NMR (500 MHz, CDCl3)  (ppm): 12,89 (s, 1H, OH-6); 7,53 (d, J 7.0 Hz, H-10); 6,67 (d, 1H, J 10.5 Hz, H-4); 5,61 (m, 2H, 2CH= allyl); 5,44 (d, 1H, J 10.0 Hz, H-3); 5,43 (overlap, 1H , H-27); 5,09-5,02 (m, 4H, 2CH2= allyl); 5,04-5,07 (m, 2H, H-22, 32); 3,88 (m, 2H, CH2 allyl); 3,71 & 3,61 (2dd, 2H, J 4.5 & 16.0, 5.5 &16.0 Hz, CH2 allyl); 3,43 (t, 1H, J 5.5 Hz, H-11); 3,29 (m, 2H, H-31); 2,49 (d, 1H, J 9.0 Hz, H-36); 2,42 (dd, 1H, J 6.5 & 16,5

Hz, H-26); 2,29 (dd, 1H, J 4.5 & 13.5, H-37); 2,22 (dd, 1H, J 7.5 & 15.5 Hz,

H-26); 2,05 (m, 2H, H-21); 1,79 (overlap, 1H, H-20); 1,77 (s, 3H); 1,75 (s, 3H); 1,6; (s, 3H); 1,65 (s, 6H); 1,62 (overlap, 1H, H-20); 1,56 (s, 3H); 1,43 (s, 3H); 1,36 (dd, 1H, J 8.0 & 13.5 Hz, H-37); 1,27 (s, 3H)

C NMR (125 MHz, CDCl3)  (ppm): 203,3 (C-8); 179,0 (C-12); 171,0 (C-30); 161,6 (C-6); 157,7 (C-16); 157,6 (C-18); 135,6 (C-10); 133,8 (C-28); 133,6 (CH=allyl); 133,0 (C-9); 132,8 (CH=allyl); 131,8 (C-33); 131,5 (C-23); 124,6 (C-3); 123,8 (C-22); 122,3 (C-27, C-32); 117,6 (2CH2= allyl); 115,9 (C-4); 107,7 (C-17); 102,7 (C-5); 100,5 (C-7); 91,1 (C-14); 83,6(C-2); 82,9(C-13); 81,3(C-38); 49,5 (CH2 allyl); 49,0 (C-36); 47,0 (C-11); 45,5 (CH2 allyl); 42,1 (C-20); 30,1 (Me); 29,5 (C-26); 28,7 (Me); 27,8 (Me); 25,7 (Me); 25,6 (Me); 25,4 (C-37); 22,7 (C-21); 21,7 (C-31); 20,8 (Me); 18,1 (Me); 17,6 (Me)

Hz, C-31); 3,35-3,05 (m, 6H, 3CH2 piperazine); 2,50 (d, 1H, J 9.0 Hz, H-36); 2,39 (dd, 1H, J 7.0 & 16.0 Hz, H-26); 2,30 (m, 2H, H-37, H-26); 2,03 (m, 2H,

H-21); 1,79 (m, 1H, H-20); 1,76 (s, 3H, Me); 1,74 (s, 3H, Me); 1,68 (s, 3H, Me); 1,65 (s, 6H, 2Me); 1,60 (m, 1H, H-20); 1,55 (s, 3H, Me); 1,40 (s, 3H, Me); 1,35 (m, 1H , H-37); 1,25 (s, 3H, Me)

13

C NMR (125 MHz, CDCl3)  (ppm): 203,4 (C-8); 179,0 (C-12); 169,7 (C-30); 161,7 (C-6); 157,7 (C-16); 157,5 (C-18); 152,9 (C-N); 135,6 (C-10); 133,13 (C-28); 133,11 (C-9); 131,9 (C-33); 131,7 (C-23); 126,52 & 126,49 (2C, 2CH thuộc C6H4-CF3); 124,7 (C-3); 123,7 (C-22); 122,8 (C-27); 122,2 (C-32); 115,8 (C-4); 115,2 (2C, 2CH thuộc C6H4-CF3); 107,7 (C-17); 102,8 (C-5); 100,5 (C-7); 91,1 (C-14); 83,6 (C-2); 82,9 (C-13); 81,4 (C-38); 49,0

(C-36, 2CH2 piperazine); 48,04 (CH2 piperazine); 47,0 (C-11); 45,4 (C-31); 42,0 (C-20); 40,6 (CH2 piperazine); 30,1 (Me); 29,4 (C-26); 28,7 (Me); 27,8 (Me); 25,7 (Me); 25,6 (Me); 25,4 (C-37); 22,7 (C-21); 21,7 (C-31); 20,8 (Me); 18,1 (Me); 17,6 (Me)

HR-MS (m/z): 841,4016 [M+H]+, tính toán [C49H55O7N2F3+H]+: 841,4040

2.2.3 Thử hoạ í h ây đ c tế bào của axit gambogic và các dẫn xuất

Được thực hiện theo theo phương pháp của Skehan & CS (1990 và Likhiwitayawuid & CS(1993) tại phòng Sinh học thực nghiệm – Viện Hóa học

các Hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Dòng tế bào:

Dòng Hep-G2 (Human hepatocellular carcinoma – Ung thư gan

Dòng LU-1 (Human lung adenocarcinoma – Ung thư biểu mô phổi

Dòng RD (Human rhabdomyosarcoma – Ung thư màng tim)

- Môi trường nuôi ấy tế bào

DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium hoặc MEME (Minimum Essential Medium with Eagle’s salt

Có bổ xung L- glutamine, Sodium piruvat, NaHCO3, PSF (Penixillin- Streptomycin sulfate- Fungizone); NAA (Non-Essential Amino Acids); 10% BCS (Bovine Calf Serum)

Tripsin-EDTA 0,05%; DMSO (Dimethyl Sulfoside); TCA(Trichloro Acetic acid); Tris Base; PBS (Phosphate Buffered Saline); SRB (Sulfo Rhodamine B); Acid Acetic

- á dụng ụ dùng 1 n:

Bình nuôi cấy tế bào, phiến vi lượng 96 giếng, pipet pasteur, các đầu tuýp cho micropipet…

( ) ( )

( ) ( ) Giá trị CS sau khi tính theo công thức trên, đựơc đưa vào tính toán Excel để tìm ra trung bình ± độ lệch tiêu chuẩn của ph p thử được lặp lại 3 lần theo công thức của Ducan như sau: Độ lệch tiêu chuẩn 

√ ( ̅)

Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS < 50 sẽ được chọn ra để thử nghiệm tiếp để tìm giá trị IC5

Giá trị IC50: dùng giá trị CS của 10 thang nồng độ, dựa vào chương trình Table curve theo thang gía trị logarit của đường cong phát triển tế bào và nồng độ chất thử để tính giá trị IC50 Công thức: 1/y=a+blnX

Trong đó Y: nồng độ chất thử;

X: Giá trị CS (

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 TỔNG HỢP CÁC DẪN XUẤT CỦA AXIT GAMBOGIC

3 Đị h hướng nghiên cứu

Hình 3.1: Cấu trúc hóa học và tinh thể của axit gambogic

Các nghiên cứu về hoạt tính - cấu trúc (SAR) của axit gambogic [32, 36] đã chỉ ra tầm quan trọng của nối đôi trên vòng D (liên hợp với nhóm C=O của vòng C đối với hoạt tính Nhóm axit COOH có thể chuyển hóa về các dạng nhóm chức khác như ester, amide hay nhóm mang tính base khác mà không ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính apoptosis Một số dẫn xuất amide có chứa nhóm base làm tăng độ tan của chất trong môi trường axit Điều thú vị là

sự thay đổi nhiều ở nhóm carboxylic không làm mất hoạt tính, chỉ ra khả năng vùng cấu trúc này của axit gambogic không ảnh hưởng đến sự gắn kết của axit gambogic với đích sinh học Dựa trên cấu trúc tinh thể của axit gambogic, cấu trúc hệ vòng xanthone nằm trên một mặt phẳng và có hai mặt trên và dưới khác nhau Hai nhóm prenyl và vòng polycyclic nằm ở phía trên, tạo nên phía kỵ nước (hydrophobic face), còn nhóm axit carboxylic và nhóm carbonyl của hệ vòng polycyclic nằm phía dưới tạo nên phía ưa nước (hydrophilic face) Các kết quả về việc chuyển hóa nhóm carboxylic đã gợi ý rằng phía mặt phẳng hydrophilic không đóng vai trò quan trọng trong sự gắn kết với đích sinh học của nó

Các dẫn xuất tạo ra từ sự chuyển hóa nhóm 6-OH (vòng B như methyl hay acyl hóa [32] có hoạt tính tương tự như chất đầu Vì thế nhóm 6-OH này cũng không đóng vai trò quyết định đối với hoạt tính Ngoài ra còn quan sát thấy liên kết hydro nội phân tử rất mạnh giữa nhóm 6-OH và nhóm carbonyl (vòng C) bởi độ dịch chuyển hóa học về phía trường rất thấp của hydrogen thuộc nhóm OH (12,66 ppm)

Trong khi đó, các dẫn xuất với liên kết đôi (vòng D ở dạng bão hòa thì

có hoạt tính giảm hơn 10 lần so với axit gambogic trên dòng tế bào T47D, chứng tỏ liên kết đôi liên hợp keton này có vai trò quan trọng đối với hoạt tính, có thể là đích tấn công của các nucleophil có mặt trên đích sinh học (phản ứng cộng Michael) tạo ra liên kết đồng hóa trị của axit gambogic với đích, và hoạt hóa tín hiệu apoptosis, dẫn đến hoạt hóa chuỗi caspase và sự chết tế bào

Từ các kết quả hoạt tính – cấu trúc nói trên, trong khuôn khổ đề tài, một số dẫn xuất bằng cách chuyển hóa nhóm axit carboxylic về dạng ester và amide của axit gambogic được tổng hợp và nghiên cứu sơ bộ hoạt tính gây độc tế bào

3.1.2 Kết quả tổng hợp các dẫn xuất

xit gambogic được phân lập từ nhựa cây đằng hoàng với hiệu suất là

10 theo phương pháp sắc kí cột silicagel kết hợp với cột Sephadex [12] Cấu trúc của axit gambogic được xác định bằng phổ NMR 1H và 13C kết hợp với

so sánh dữ liệu nêu ra trong tài liệu tham khảo

Việc chuyển hoá nhóm COOH của axit gambogic được thực hiện theo

sơ đồ 1, bằng cách sử dụng hệ xúc tác EDC/DM P để hoạt hóa nhóm axit

R:

Hình 3.2: Phản ứng chuyển hóa nhóm COOH của axit gambogic

 Phản ứng este hóa của axit gambogic với EtOH, sử dụng hệ xúc tác

EDC/DM P thu được sản phẩm (2) với hiệu suât 75% Cấu trúc của dẫn xuất (2) được xác định bằng phổ NMR và HR-MS Phổ 1H-NMR của dẫn xuất (2)

cho thấy ngoài các tín hiệu proton của axit gambogic còn xuất hiện thêm các tín hiệu quartet tại δH 3,89 ppm của nhóm -OCH2 và tín hiệu triptet tại δH

1,09 ppm của nhóm CH3-CH2-O-

Tương tự vậy, phổ 13

C-NMR của dẫn xuất (2) cũng cho thấy ngoài các

tín hiệu cacbon của axit gambogic còn xuất hiện thêm các tín hiệu δC(ppm): 60,1 (OCH2) và 14,0 (CH3-CH2-O)

Phổ HR-MS của dẫn xuất (2) cho giá trị [M+H]+: 657,3427 ứng với hợp chất có công thức C40H48O8 (tính toán theo lý thuyết cho [M+H]+:657,3422