Phân lập và xác định đặc tính enzyme n acyl l homoserine lactone (AHL) lactonase của vi khuẩn nội sinh sử dụng trong phòng trừ bệnh thối nhũn củ khoai tây

AHL LACTONASE CỦA VI KHUẨN NỘI SINH SỬ DỤNG TRONG PHÒNG TRỪ BỆNH THỐI NHŨN CỦ KHOAI TÂY LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC HÀ NỘI - 2015... AHL LACTONASE CỦA VI KHUẨN NỘI SINH SỬ DỤNG TRONG P

(AHL) LACTONASE CỦA VI KHUẨN NỘI SINH

SỬ DỤNG TRONG PHÒNG TRỪ BỆNH THỐI NHŨN

CỦ KHOAI TÂY

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2015

(AHL) LACTONASE CỦA VI KHUẨN NỘI SINH

SỬ DỤNG TRONG PHÒNG TRỪ BỆNH THỐI NHŨN

CỦ KHOAI TÂY

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60420103

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS Hoàng Hoa Long

HÀ NỘI - 2015

3

MỞ ĐẦU

Cây khoai tây (Solanum tuberosum L), thuộc họ Cà (Solanaceae) là loài

cây nông nghiệp ngắn ngày, trồng lấy củ chứa tinh bột Khoai tây có nguồn gốc ở vùng cao thuộc dãy núi Andes, Nam Mỹ, được người Pháp đưa vào Việt Nam từ năm 1890 Có thời kỳ khoai tây được xem là cây lương thực có tầm quan trọng thứ ba sau lúa và ngô

Khoai tây có giá trị dinh dưỡng cao vì trong khoai tây có chứa các vitamin, khoáng chất, caronoids và phenol tự nhiên Khoai tây không chỉ là lương thực mà còn là dược phẩm Một nhà khoa học của Viện Thực phẩm Anh mới đây phát hiện trong khoai tây chứa hợp chất sinh học cucoamin có tác dụng làm giảm huyết áp nếu ăn thường xuyên Trong một nghiên cứu khác gần đây, GS Venket Rao, Khoa Dinh dưỡng Đại học Y Toronto Canada đã phát hiện thấy trong khoai tây có nhiều chất chống oxy hóa Nó có khả năng ngăn ngừa quá trình lão hóa, hạn chế sự phát triển của ung thư và một số bệnh khác

Theo thông tin của Cục Trồng trọt, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, Việt Nam là quốc gia có khả năng phát triển mạnh khoai tây, nhiều nhất

ở đồng bằng Bắc Bộ, miền núi phía Bắc, Bắc Trung Bộ và Tây Nguyên, với diện tích ước tính 200.000 ha Tuy nhiên, hiện nay diện tích trồng khoai tây chỉ đạt 30.000-35.000 ha, với năng suất 10-11 tấn/ha Một trong những nguyên nhân dẫn đến giảm năng suất và diện tích trồng khoai tây là do tình

trạng gây hại của sâu bệnh, đặc biệt là bệnh thối nhũn do vi khuẩn Erwinia gây ra, phổ biến nhất là loài Erwinia carotovora subsp carotovora (Ecc)

Bệnh gây ra chủ yếu trên các loài cây trồng có giá trị kinh tế cao thuộc họ cà,

họ thập tự, họ bầu bí, họ hành, một số loài hoa lan… Bệnh gây hại cho cây từ khi còn được trồng ở ngoài đồng ruộng cho đến khi thu hoạch và bảo quản trong kho Đặc biệt khi điều kiện thời tiết nóng ẩm và mưa nhiều thì bệnh trở

nên trầm trọng hơn Vi khuẩn Ecc sử dụng Quorum Sensing (QS) như một cơ

4

chế trao đổi thông tin giữa các tế bào và phụ thuộc mật độ quần thể để kiểm soát gen liên quan đến tính độc và các hoạt động của tế bào vi khuẩn Trong

cơ chế này, N-acyl-L-homoserine lactones (AHLs) đóng vai trò như các chất

tự cảm ứng (autoinducer) và cũng là các phân tử tín hiệu được tổng hợp và tiết ra trong suốt quá trình phát triển của vi khuẩn Khi nồng độ phân tử AHLs tăng lên cùng với sự phát triển của quần thể vi khuẩn và đạt đến một ngưỡng nhất định (quorum level), AHLs sẽ gây ra những hiệu ứng kiểu hình thông

qua việc điều hòa sự biểu hiện gen đích, mà ở vi khuẩn gây bệnh Ecc là gen

quy định tính độc đối với cây chủ

Hiện nay, biện pháp phòng trừ bệnh chủ yếu dựa vào các phương pháp truyền thống và sử dụng thuốc trừ sâu hóa học Tuy nhiên, các biện pháp này đều không mang lại hiệu quả cao, đặc biệt là việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học đang gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng nông sản và môi trường sống của con người Do đó biện pháp phòng trừ sinh học sử dụng các

vi sinh vật đối kháng trong tự nhiên ngày càng được đặc biệt quan tâm Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra trong tự nhiên tồn tại một nhóm vi khuẩn cư trú bên trong mô cây chủ và không gây triệu chứng bệnh cho cây được gọi là vi khuẩn nội sinh (bacterial endophyte) Trong số chúng, có những vi khuẩn có khả năng phân hủy AHLs qua cơ chế Quorum Quenching (QQ), là một hoạt động xảy ra trong tự nhiên có tác dụng chặn đứng những bước quan trọng của

hệ thống QS như sự hình thành, tích lũy hoặc tiếp nhận phân tử tín hiệu Dựa vào cấu trúc phân tử AHLs, các nhà khoa học đã xác định được 3 nhóm enzyme phân hủy AHLs: AHL-lactonase, AHL-acylase và AHL-oxidoreductase Cho đến nay, enzyme AHL-lactonase được nghiên cứu nhiều

nhất Enzyme này được phát hiện lần đầu tiên từ chủng vi khuẩn Bacillus sp

240B có khả năng bất hoạt phân tử AHL Gen mã hóa enzyme này khi được

chuyển vào chủng vi khuẩn gây bệnh E carotovora SCG1 đã làm giảm đáng

phân hủy AHLs của vi khuẩn gây bệnh trong phòng trừ bệnh thối nhũn Do

vậy, tôi đã tiến hành chọn nghiên cứu đề tài “Phân lập và xác định đặc tính

enzyme N-acyl-L-homoserine lactone (AHL) lactonase của vi khuẩn nội sinh sử dụng trong phòng trừ bệnh thối nhũn củ khoai tây” với hy vọng

hướng nghiên cứu này sẽ góp phần đặt một trong những viên gạch để thiết lập

một biện pháp phòng trừ hiệu quả bệnh thối nhũn khoai tây do vi khuẩn Ecc gây ra tại Việt Nam

Mục đích của đề tài

Xác định được các hoạt tính của enzyme phân hủy homoserine lactones (AHLs), AHL lactonase của các chủng vi khuẩn nội sinh

N-acyl-L-sử dụng trong phòng trừ bệnh thối nhũn củ khoai tây

Yêu cầu của đề tài

- Phân lập và xác định khả năng phân hủy AHLs của vi khuẩn nội sinh từ

6

- Thử nghiệm hiệu quả phòng trừ bệnh thối nhũn củ khoai tây của các chủng vi khuẩn nội sinh có hoạt tính enzyme AHL lactonase trong điều kiện phòng thí nghiệm

Ý nghĩa của đề tài

Ý nghĩa khoa học

- Thực hiện đề tài này giúp tôi có thêm kinh nghiệm, kiến thức về các kỹ thuật phân lập, xác định khả năng phân hủy, xác định hoạt tính enzyme phân hủy AHLs từ vi khuẩn nội sinh, đối tượng quan tâm, ngoài ra còn cung cấp thêm hiểu biết về các kỹ thuật khác mà công nghệ sinh học hiện đại đang áp dụng

- Kết quả nghiên cứu của để tài sẽ cung cấp các vật liệu khởi đầu cho việc nghiên cứu về enzyme phân hủy AHLs sẽ là tiền đề phát triển một chiến lược phòng trừ bệnh thối nhũn khoai tây an toàn và bền vững sau này

Ý nghĩa thực tiễn

Ngoài ý nghĩa về khoa học, các vấn đề nghiên cứu trong đề tài còn có ý nghĩa trong thực tiễn Các chủng vi khuẩn có ích mang enzyme phân hủy AHLs sử dụng để ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh thối nhũn trên nhiều loài cây trồng có giá trị hoặc chuyển những gen mã hóa enzyme này vào cây trồng giúp cây trồng chống chịu được với bệnh hại

7

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về cây khoai tây

1.1.1 Nguồn gốc địa lý và sự phân bố của cây khoai tây

Khoai tây có tên khoa học Solanum tuberosum, thuộc họ Cà (Solanaceae) Đây là loài cây nông nghiệp ngắn ngày, trồng lấy củ chứa tinh

bột Cây khoai tây có nguồn gốc ở vùng cao thuộc dãy núi Andes, Nam Mỹ và

du nhập vào Tây Ban Nha vào khoảng năm 1570 và Anh Quốc vào năm

1590 Sau đó, nó được lan truyền khắp châu Âu và tiếp theo là châu Á (Hawkes, 1994)

Sau nhiều thế kỷ chọn lọc và nhân giống, hiện nay đã có hơn một nghìn loài khoai tây khác nhau Hơn 99% các loài khoai tây được trồng hiện nay trên toàn cầu có nguồn gốc từ nhiều giống khác nhau ở vùng đất thấp Trung-Nam Chile, các giống này đã được di dời từ các cao nguyên Andes

Trên thế giới, cây khoai tây được coi là cây lương thực có tầm quan trọng đứng hàng thứ tư sau lúa mì, lúa nước và ngô (Steveson và cs., 2001)

Năm 1890, một người Pháp là Giám đốc Vườn bách thảo Hà Nội đem hạt khoai tây trồng thử ở nước ta Điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa, mùa đông có nhiệt độ trung bình 15 – 250C, thuận lợi cho khoai tây sinh trưởng và phát triển Vào năm 1980, Việt Nam đã trở thành nước sản xuất khoai tây lớn nhất Đông Nam Á với hơn 100.000 ha diện tích trồng (Batt., 2002) Khoai tây trở thành cây lương thực có tầm quan trọng thứ ba sau lúa và ngô ở Việt Nam Tuy nhiên, theo thống kê của Tổ chức Nông lương Liên hợp quốc (FAO), những năm gần đây diện tích trồng khoai tây chỉ dao động trong khoảng 35.000 - 40.000 ha (Bảng 1.1) Trong đó 90% diện tích tập trung ở các tỉnh thuộc đồng bằng Bắc Bộ, một số ít ở miền núi phía Bắc và Trung Bộ, 0,5% diện tích còn lại được trồng ở Đà Lạt (Lâm Đồng) (Phạm Xuân Tùng, 2001)

1.1.2 Đặc điểm nông sinh học của cây Khoai tây

Khoai tây là thân thảo, tán gọn, ưa lạnh, phát triển khoảng 60 cm chiều cao, khoai tây có thời gian sinh trưởng ngắn 80-100 ngày, cây chết sau khi ra hoa Hoa

có màu trắng, hồng, đỏ, xanh, hoặc màu tím, nhụy hoa màu vàng Khoai tây được thụ phấn chủ yếu bởi côn trùng, ong vò vẽ mang phấn hoa từ cây này đến cây khác.Sau khi khoai tây ra hoa, một số giống cho ra quả màu xanh lá cây giống màu xanh trái cây cà chua anh đào, có thể chứa 300 hạt (Wikipedia)

9

1.1.3 Vai trò của cây Khoai tây

Khoai tây là một nguồn cung cấp lương thực dồi dào Theo báo cáo của

Tổ chức Nông Lương Liên Hợp Quốc (FAO) sản lượng khoai tây toàn Thế giới đến năm 2010 là 320 triệu tấn, trong đó hơn 2/3 là thức ăn trực tiếp của con người, còn lại là thức ăn cho động vật và nguyên liệu sản xuất tinh bột

Ở Việt Nam, khoai tây được nhập vào từ năm 1890 Do có giá trị kinh tế cao, thuộc nhóm ưa lạnh nên có lợi thế trong sản xuất vụ đông, thời gian sinh trưởng ngắn, dễ trồng, ít tốn công chăm sóc, phù hợp với nhiều loại đất trồng nên khoai tây đang trở thành cây trồng xóa đói giảm nghèo cho bà con nông dân ở nhiều địa phương thuộc các tỉnh miền Bắc như Thái Bình, Lạng Sơn, Yên Bái,… (Nguồn báo điện tử: Thái Bình, Lạng Sơn, Yên Bái)

Tuy nhiên, ngành Nông nghiệp Việt Nam mới cung cấp được 80% nhu cầu tiêu dùng khoai tây trong nước, chúng ta vẫn phải nhập khẩu gần 100.000 tấn khoai tây hàng năm

Khoai tây là thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, trong đó có 2% protein bao gồm cả lysine (một axit amin thường không có trong protein thực vật) nên phối hợp tốt với ngũ cốc Trong protein khoai tây còn có một số axit amin tự do và các chất kiềm purin Giá trị sinh học của khoai tây tương đối cao lên tới 75% (theo phương pháp Mittchell) Người ta đã tính khoảng hơn 200g khoai tây nướng cả vỏ cung cấp 844mg Kali (gấp đôi 1 quả chuối), 28% khẩu phần sắt hàng ngày, 43% khẩu phần vitamin C, 35% khẩu phần vitamin B6 và nhiều chất khác như niacin, thiamin, folat…

Việc sử dụng khoai tây làm thực phẩm còn được khuyến khích hơn nữa khi một số nhà khoa học của Viện Thực phẩm Anh mới đây phát hiện, trong khoai tây có hợp chất sinh học cucoamin có tác dụng làm giảm huyết áp nếu

ăn thường xuyên và chữa bệnh “ngủ” ở Châu Phi

10

Không chỉ được sử dụng để làm lương thực và thực phẩm khoai tây còn được sử dụng trong y dược Qua nghiên cứu, GS Venket Rao, Khoa Dinh dưỡng Trường đại học Y Toronto, Canada, phát hiện thấy trong khoai tây có nhiều chất chống oxy hóa Nó có khả năng ngăn ngừa quá trình lão hóa, hạn chế sự phát triển của ung thư và một số bệnh khác Còn các nhà nghiên cứu Đại học Y Harvard, Mỹ, đã phát hiện ra rằng những người thường xuyên ăn khoai tây có khả năng giảm ung thư tuyến tiền liệt

1.2 Bệnh thối nhũn khoai tây

1.2.1 Tác nhân gây bệnh và tác hại của bệnh

Trong điều kiện thời tiết khí hậu nước ta những năm gần đây nắng nóng, mưa nhiều đan xen nhiều cơn bão liên tục là điều kiện thuận lợi cho các loài vi khuẩn gây bệnh trên cây trồng Bệnh do vi khuẩn gây ra rất nguy hiểm

và gây nhiều khó khăn cho công tác phòng trừ và bảo quản Thời gian ủ bệnh rất khó phát hiện và đã gây ra những thiệt hại lớn trong thời kỳ sinh trưởng cũng như trong thời gian bảo quản, lưu trữ nông phẩm Đối với những khu vực sản xuất thuộc vùng nhiệt đới bệnh thối nhũn ở khoai tây, cà rốt, hành

tây, bắp cải….chủ yếu là do vi khuẩn Erwinia gây nên Những nghiên cứu

trước đây đã kết luận rằng vi khuẩn gây thối nhũn khoai tây có ba loài:

Erwinia carotovora pv carotovora (Ecc), Erwinia carotovora pv atroseptica (Eca) và E chrysanthemi (Ech) Trong đó Ecc là loài chủ yếu gây bệnh thối

nhũn củ khoai tây (Jerenial), (Randall và cs) Vi khuẩn này khá phổ biến trên

bề mặt, trên vết thương của củ khoai tây sau khi thu hoạch Ecc gây bệnh ở cả vùng khí hậu ôn đới và nhiệt đới, và có phổ ký chủ rộng Ecc cư trú trong đất,

nước như sông, hồ thậm chí là đại dương Vi khuẩn này có thể nhân lên và tồn tại trong vùng rễ của rất nhiều cây chủ hoặc không phải là cây chủ cũng như

nhiều loài cỏ dại Hai loài Eca và Ech là tác nhân chính gây ra bệnh thối đen

11

(blackleg) trên khoai tây Tuy nhiên, đôi khi chúng cũng gây ra triệu chứng

thối nhũn củ Eca gần như chỉ gây hại trên khoai tây ở vùng ôn đới Chúng

không thể tồn tại trong đất hơn một năm, trừ khi chúng đã cư trú trong củ khoai tây bị bệnh hoặc những phần cây khoai tây mục nát khác Ngược lại,

Ech là tác nhân gây bệnh cho nhiều loài thực vật ở các cùng nhiệt đới và cận

nhiệt đới, nhưng cũng có thể ảnh hưởng đến một số cây trồng (ngô, thược dược) ở vùng ôn đới Nhiễm trùng tiềm ẩn của củ khoai tây bởi vi khuẩn gây

thối nhũn Erwinia là phổ biến và vì bệnh có xu hướng phát triển chỉ khi sức

đề kháng của cây chủ bị suy yếu, chúng được mô tả như là tác nhân gây bệnh

cơ hội (Pérombelon và Kelman, 1987; Perombelon và Salimond, 1995; Perombelon, 2002;Prajapat và cs., 2003)

Vi khuẩn gây bệnh Ecc là loài đa thực, ký sinh và gây hại trên nhiều

loại cây trồng khác nhau Tế bào hình gậy, hai đầu hơi tròn, có 2 - 8 lông roi bao quanh mình (Hình 1.1) Vi khuẩn không có vỏ nhờn, nhuộm Gram âm, hiếu khí, dịch hoá gelatin, tạo H2S, thuỷ phân tinh bột và không tạo NH3 Đặc tính của vi khuẩn gây bệnh là sản sinh một lượng lớn enzyme phân hủy pectin ngoại bào, một trong số những enzyme này phân hủy thành tế bào thực vật Nuôi cấy trên môi trường pepton saccaro, khoai tây - agar khuẩn lạc có màu trắng xám, hình tròn hoặc hình bầu dục không đều, bề mặt khuẩn lạc ướt (Hình 1.1) Trên môi trường có TZC khuẩn lạc của vi khuẩn có màu đỏ ở

giữa, rìa ngoài màu trắng đó là đặc trưng để nhận biết loài Erwinia sp Vi

khuẩn phát triển thuận lợi trong phạm vi nhiệt độ khá rộng, nhiệt độ thích hợp nhất là 27 – 37oC, nhiệt độ tới hạn chết là 50oC; phạm vi pH cũng khá rộng từ 5,3 - 9,2, thích hợp nhất là pH 7,2 Vi khuẩn có thể bị chết trong điều kiện khô

và dưới ánh nắng

12

Hình 1.1 Khuẩn lạc vi vi khuẩn Ecc trên môi trường YPDA (ảnh a)

và tế bào vi khuẩn Erwinia carotovora subsp carotovora dưới

kính hiển vi điện tử (ảnh b) (Nguồn: Dong Hwan Lee và cs., 2013)

Hình 1.2: Bệnh thối nhũn trên khoai tây (Nguồn Wikipedia)

Hiện tượng thối hỏng là hậu quả của quá trình phá vỡ cấu trúc mô tế bào do tác động chủ yếu của các enzyme phân giải của vi khuẩn Triệu chứng bệnh bắt đầu mềm và sũng nước, sau đó vết bệnh chuyển thành nhớt và bốc mùi thối khó chịu (Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân., 1999) Đây là loại bệnh phổ biến và gây thiệt hại nghiêm trọng đối với khoai tây trong quá trình bảo quản, cất giữ, chuyên chở và xuất nhập khẩu (Hình 1.2)

vì vi khuẩn này có khả năng ký sinh, chọn lọc phạm vi kí chủ rất rộng bao gồm nhiều loại cây trong nhiều họ thực vật khác nhau, trong côn trùng cũng như trong đất (Hình 1.3) Hiện nay chưa có cách phòng trị hiệu quả, thiệt hại

do vi khuẩn này gây ra là rất lớn

Hình 1.3 Các giai đoạn sống trong chu kỳ gây bệnh của vi khuẩn gây bệnh thối nhũn các loại rau củ thuộc chi Erwinia, Pectobacterium và Dickeya

(Allen và cs., 2009)

Trên thế giới, bệnh thối nhũn được xem là nguyên nhân gây thiệt hại đến sản xuất lớn nhất so với các bệnh vi khuẩn khác Thiệt hại do vi khuẩn thối nhũn sau thu hoạch được đánh giá từ 15-30% năng suất cây trồng sau thu

14

hoạch (Agror, 2006) Một đánh giá khác của Balus cho rằng thiệt hại do bệnh thối nhũn củ khoai tây có thể xảy ra trong quá trình vận chuyển và bảo quản, ước tính mất mát có thể lên đến 40% nếu như thiếu phương pháp bảo quản thích hợp (Balus, Dahiru, 2006) Tại một số vùng trồng khoai tây chính ở

Zimbabwe mùa vụ 2009-2010, thiệt hại do bệnh thối nhũn gây ra bởi Erwinia carotovora đã lên đến 65% (Elizabeth Ngadze, 2012) Trong một chương

trình kéo dài 9 năm khảo sát bệnh trên củ khoai tây giống nhập khẩu vào

Israel từ Bắc Âu của Tsror đã thống kê được sự nhiễm tiềm tàng Eca ở mức

độ 103 tế bào/g vỏ có ở 30% lô củ giống hàng năm (Tsror và cs, 1993) Cũng một khảo sát khác của Tsror trên một lô khoai tây nhập khẩu từ châu Âu vào Israel cho thấy 7% lô hàng bị nhiễm bệnh blackleg và thối nhũn củ khoai tây

gây ra bởi Erwinia spp ở mức độ mạnh, 65% bị nhiễm ở mức độ trung bình

(Tsror và cs., 1999) Tại Keren County, California, Farrar đã theo dõi 30%

khoai tây sau thu hoạch bị tấn công bởi Ecc Tiếp theo, họ đã thông báo những thiệt hại nghiêm trọng gây ra bởi Ecc cho khoai tây sau thu hoạch tại

San Joaquin Valley (Farrar và cs., 2009)

Ở Việt Nam, đến nay tuy chưa có một con số thống kê cụ thể về thiệt

hại của bệnh thối nhũn khoai tây gây ra bởi vi khuẩn E carotovora, nhưng bệnh

đã được thông báo có mặt ở tất cả các vùng trồng khoai tây trên cả nước Đặc biệt do thời gian bảo quản khoai tây ở nước ta tương đối dài (8-9 tháng), điều kiện thời tiết nóng ẩm khiến cho bệnh là mối nguy hiểm nghiêm trọng gây thiệt hại đến năng suất và chất lượng củ khoai tây Khoai tây giống sau 8 tháng bảo quản thường bị hao hụt khoảng 30-50%, thậm chí có nơi hao hụt lên tới 70% tổng số khoai bảo quản Một trong những nguyên nhân gây ra thiệt hại này là do sâu bệnh và nấm mốc, trong đó có bệnh thối nhũn (Vũ Quốc Trung, 2005) Một nghiên cứu chi tiết về diễn biến của bệnh trong quá trình bảo quản khoai tây sau

15

thu hoạch cho thấy bệnh xuất hiện với tỷ lệ thấp ở tháng 1 đến tháng 3 do nhiệt

độ không thuận lợi cho vi khuẩn xâm nhập gây bệnh Trong những tháng mùa hè bệnh thối nhũn củ phát triển mạnh nhất, cao nhất của bệnh vào tháng 6, 7, 8 Bệnh tiếp tục phát sinh gây hại ở mức độ bệnh giảm dần khi điều kiện ngoại cảnh không thuận lợi (tháng 10 đến tháng 12) (Trần Thị Thúy) Bệnh thối nhũn

củ khoai tây được đặt trong danh sách các bệnh cần phải kiểm nghiệm củ giống khoai tây theo tiêu chuẩn quốc gia do Bộ NN & PTNT và Bộ Khoa học và Công nghệ ban hành (TCVN 8549-2011)

1.2.2 Quorum sensing (QS) và mối liên quan đến khả năng gây bệnh thối

nhũn khoai tây của tác nhân gây bệnh

Vi khuẩn Gram âm (trong đó có Erwinia) sử dụng một dạng “giao tiếp

của vi khuẩn” gọi là Quorum Sensing (QS) QS dựa trên cơ sở tổng hợp, giải phóng, phát hiện và phản ứng với các phân tử tín hiệu AHLs của tế bào vi khuẩn liền kề Khi mật độ tế bào vi khuẩn tăng lên, các phân tử này sẽ được tích lũy trong môi trường ngoại bào và thông qua đó giúp vi khuẩn có thể kiểm soát được số lượng tế bào cũng như sự hiện diện của các loài vi khuẩn khác Những phân tử này khi đạt đến một ngưỡng nhất định sẽ kích hoạt tín hiệu bên trong vi khuẩn và cực đại hóa hoạt động của một số gen đặc hiệu Điều hòa biểu hiện gen thông qua cơ chế QS có sự tham gia của gen luxR và luxI mã hóa cho nhân tố phiên mã LuxR và AHL synthase (LuxI) Phân tử tín hiệu AHL đóng vài trò là chất tự cảm ứng (autoinducer) vì nó kiểm soát quá trình tổng hợp chính bản thân phân tử AHLs thông qua vòng điều khiển gen sinh tổng hợp AHL synthase Hầu hết vi khuẩn gây bệnh sử dụng hệ QS đã được nghiên cứu đều cho thấy rằng QS có liên quan đến các gen gây bệnh (Hình 1.4) (Coutteau và Goossens, 2013; Dong và cs., 2000; Whitehead và

cs., 2001)

16

Hình 1.4 Cơ chế Quorum Sensing ở vi khuẩn Gram âm

(r: gen mã hóa cho nhân tố phiên mã LuxR (R);

i: gen mã hóa cho AHL synthase LuxI (I)

Ở các loài vi khuẩn gây bệnh thuộc chi Erwinia có tồn tại ít nhất hai hệ

thống QS và được xác định bởi bản chất của các tín hiệu hóa học liên quan: acyl homoserine lactones (AHLs; còn gọi là tín hiệu AI-1), được tổng hợp bởi nhóm protein LuxI; và tín hiệu AI-2, được tổng hợp bởi nhóm protein tương

N-đồng LuxS Hệ thống QS ở một số loài Erwinia đóng vai trò quan trọng trong

điều hòa biểu hiện gen, tổng hợp các chất trao đổi thứ cấp và khả năng gây bệnh trên cây chủ Nghiên cứu này của chúng tôi tập trung chính vào khả năng sản

sinh phân tử tín hiệu AHLs của loài vi khuẩn Erwinia carotovora subsp carotovora có liên quan đến khả năng gây bệnh thối nhũn trên khoai tây

(Barnard và Salmond, 2006; Engebrecht và cs., 1983; Nasser và cs., 1998; Schaefer và cs., 1996)

đổi (Hình 1.5) Mỗi tế bào trong quần thể vi khuẩn đều có khả năng sản sinh

ra các tín hiệu QS, cho biết sự hiện diện của chúng với các tế bào khác trong quần thể AHLs được tạo ra từ một phản ứng enzyme hóa, được xúc tác bởi

LuxI autoinducer synthase LuxI tổng hợp N-AHLs:

N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lactone (3-oxo-C6-HSL), sử dụng S-adenosyl methionine và protein mang nhóm hexanoyl acyl làm cơ chất cho phản ứng Các đồng phân LuxI khác cũng xúc tác cho phản ứng tương tự để tạo ra các AHLs cần thiết như: N-(3-oxooctanoyl)-L-homoserine lactone (3-oxo-C8-HSL), N-hexanoyl-

L-homoserine lactone (C6-HSL)… (Toth và cs., 2003; Val và Cronan, 1998)

N-acyl homoserine lactone

(AHL)

18

Bảng 1.2: Hệ thống QS sử dụng phân tử tín hiệu N-AHLs

của một số loài Erwinia (Barnard và Salmond, 2006)

chính

Đồng phân LuxI

Đồng phân LuxR

Tác động của QS

Erwinia nhóm 1

Ecc EC153 3-oxo-C8-HSL

và 3-oxo-C6-HSL

AhlI ExpR Tổng hợp enzyme

ngoại bào

Ecc SCC3193 3-oxo-C8-HSL

và 3-oxo-C6-HSL

AhlI ExpR1(ExpR)*,

ExpR2

Gây bệnh, tổng hợp enzyme ngoại bào

Erwinia nhóm 2

Ecc ATCC39048 3-oxo-C6-HSL CarI CarR,

EccR(ExpR)*, VirR

Tổng hợp kháng sinh, gây bệnh, tổng hợp enzyme ngoại bào

Ecc SCRI193 3-oxo-C6-HSL AhlI ExpR, VirR,

[CarR (cryptic)]

Gây bệnh, tổng hợp enzyme ngoại bào

Ecc 71 3-oxo-C6-HSL AhlI

(HslI)*

ExpR1(ExpR)*, ExpR2

Gây bệnh, tổng hợp enzyme ngoại bào

Eca SCRI1043 3-oxo-C6-HSL ExpI ExpR, VirR Gây bệnh, tổng

hợp enzyme ngoại bào

ExpI ExpR Tổng hợp enzyme

pectinase

*Danh pháp thay thế

19

Theo như bảng 1.2 thì ở hầu hết các loài thuộc chi Erwinia có mối quan

hệ mật thiết giữa khả năng sản sinh phân tử tín hiệu AHLs và khả năng gây bệnh trên cây chủ Đây là cơ sở chính để chúng tôi tiến hành nghiên cứu này

1.2.3 Các biện pháp phòng trừ bệnh

Bệnh thối nhũn củ khoai tây do vi khuẩn Ecc gây ra chủ yếu lây qua

củ giống và sẵn sàng lan rộng bởi những củ nhiễm tiềm tàng Bên cạnh đó

vi khuẩn có thể lây qua không khí, côn trùng, động vật (côn trùng, chuột, )

và các dụng cụ lao động Nhiều phương pháp phòng trừ đã được tổng hợp dưới đây nhưng ở mức độ thành công khác nhau (Czajkowski và cs., 2011)

Phương pháp tránh lây nhiễm và cấp chứng chỉ củ giống: Đây được xem là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất và có những thành công nhất định Sử dụng nguồn củ giống khỏe, được cấp chứng chỉ sạch bệnh Trong quá trình canh tác, dụng cụ phải được rửa sạch Loại bỏ củ thối trên đồng ruộng và thu hoạch Tránh làm xây sát củ Trước khi bảo quản không

đổ khoai tây thành đống củ, cần phải giàn thành từng lớp, hong nhẹ dưới ánh sáng tán xạ để giảm bớt lượng nước, vỏ củ khô và dần chuyển thành màu hơi xanh Khoai tây phải được bảo quản trong điều kiện thông gió, tốt nhất trong phòng lạnh để làm giảm nguồn nhiễm và tránh bệnh lây lan

Chế độ dinh dưỡng ảnh hưởng lên tính chống chịu bệnh Dinh dưỡng ảnh hưởng đến sự phát triển của cây, sự tương tác giữa cây trồng với tác nhân gây bệnh cũng như với những vi sinh vật khác Canxi đóng vai trò quan trọng nhất quyết định đến tính chống chịu bệnh của cây do ion canxi cải thiện cấu trúc và độ cứng của thành tế bào thực vật Đất tự nhiên thiếu canxi có thể được bổ sung CaSO4 (gypsum) không những làm tăng tính chống chịu của cây với bệnh thối đen (blackleg) mà với cả bệnh thối nhũn củ khoai tây Tuy nhiên một chế độ dinh dưỡng cân bằng cùng với việc tăng hàm lượng Ca

số giống chống chịu cục bộ, cùng với sự kém đa dạng di truyền của nguyên liệu chọn giống bố mẹ được sử dụng, Trong khi đó việc tạo ra những cây trồng biến đổi gen lại được xem như là phương pháp hứa hẹn để thay thế cho phương pháp truyền thống Tuy đã có rất nhiều nghiên cứu khả thi nhưng thực tế cho đến nay cũng chưa có dòng khoai tây chuyển gen nào được thương mại hóa Mọi nghiên cứu chỉ dừng ở quy mô nhà lưới, nhà kính nhằm kiểm tra tiến trình và đánh giá những nguy hiểm tiềm năng đến môi trường của cây chuyển gen

Sử dụng biện pháp lý học (xử lý nước nóng): Biện pháp này được áp dụng trước khi bảo quản củ khoai tây Đây được xem là biện pháp thân thiện với môi trường Biện pháp này có thể giúp loại trừ được vi khuẩn gây bệnh thối nhũn cùng với một số vi khuẩn gây bệnh bề mặt củ khác Tuy nhiện hạn chế của nó là không diệt được vi khuẩn nằm sâu bên trong củ mà không làm tổn thương củ, giá thành đắt và không áp dụng được trên quy mô lớn

Biện pháp hóa học: Biện pháp này nhằm loại bỏ tận gốc tác nhân gây bệnh và tạo ra một môi trường không thuận lợi cho bệnh phát triển Một khi bệnh đã phát triển, sự phòng trừ bệnh sẽ gặp khó khăn do sự nhân nhanh và lây lan của vi khuẩn, và chất hóa học khó xâm nhập vào bên trong mô củ Tuy nhiên, biện pháp này nếu không được kiểm soát chặt chẽ sẽ gây hại đến môi trường, sức khỏe con người và tạo ra tính kháng thuốc của tác nhân gây bệnh

Biện pháp sinh học: Biện pháp này có thể thay thế biện pháp hóa học,

lý học và chọn tạo giống chống chịu trong tương lai Đã có rất nhiều nghiên cứu được thực hiện nhằm sàng lọc và phát hiện vi sinh vật có khả năng ức chế

21

sự xâm nhiễm của tác nhân gây bệnh Tuy nhiên thực tế những nghiên cứu

cũng chỉ dừng lại ở mức độ in vitro và in vivo Để có được một sản phẩm

phòng trừ sinh học được thương mại hóa cần phải đầu tư rất nhiều thời gian

và kinh phí để nghiên cứu và giải quyết được những vấn đề liên quan như tính

an toàn, độ bền vững của sản phẩm,…

1.3 Quorum Quenching (QQ) và hiệu quả kiểm soát bệnh thối nhũn khoai tây

1.3.1 Cơ chế Quorum Quenching

Quorum quenching (QQ) đề cập đến một quá trình phá vỡ hệ thống QS

có liên quan đến phân tử tín hiệu AHLs (Yi-Hu Dong và cs., 2007) QS giúp

vi khuẩn “giao tiếp” với nhau trong quần thể nhưng không phải là yếu tố thiết yếu cho sự sống sót hoặc sinh trưởng của tế bào vi khuẩn Do đó, phá vỡ hệ thống QS có thể ức chế các kiểu hình nhất định, ví dụ như làm giảm độc tính của vi khuẩn gây bệnh

Một số chiến lược QQ đã được sử dụng để phá hủy quá trình QS bao gồm: i) Ức chế sinh tổng hợp AHLs bằng cách ngăn chặn hoạt động của protein AHL synthase (LuxI-type synthase); ii) Phá hủy các phân tử AHLs bằng enzyme AHL-acylase và AHL-lactonase, qua đó cản trở quá trình tích lũy phân tử AHLs và iii) Ngăn chặn sự hình thành phức hợp AHL/LuxR (Hình 1.6)

23

tử tín hiệu (Bokhove, 2010) (Hình 1.7) Nhóm thứ ba là enzyme AHL oxidoreductase Ngược lại với enzyme AHL lactonase và AHL acylase, oxy hóa hoặc khử chuỗi bên acyl của phân tử AHLs làm biến đổi phân tử này Các phản ứng này không phân hủy phân tử tín hiệu mà sự biến đổi phân tử ảnh hưởng đến tính đặc hiệu của nó và do đó tác động đến sự kết hợp giữa phân tử tín hiệu và thụ quan của AHL (receptor)

Hình 1.7 Cơ chế phân hủy AHL bằng enzyme (1) AHL lactonase và (2) AHL acylase

Kể từ khi được phát hiện ở loài vi khuẩn Bacillus sp 240B1 (Dong và

cs., 2000), hoạt động enzyme AHL lactonase vẫn được tiếp tục tìm thấy và

nghiên cứu ở rất nhiều loài vi khuẩn khác như Agrobacterium tumefaciens (Zhang và cs., 2002; Carlier A và cs., 2003), Arthrobacter sp và Rhodococcus sp (Park và cs., 2003), R erythropolis (Uroz và cs., 2008), …

Ưu điểm của QQ khiến cho nó trở thành chiến lược phòng trừ bệnh tiềm năng bởi mục đích của QQ nhằm tắt sự biểu hiện tính độc của vi khuẩn gây bệnh nhưng không hạn chế sự phát triển tế bào, do đó khắc phục được tính nhờn thuốc, bội nhiễm và kháng kháng thể (Chen và cs., 2013)

24

1.3.2 Ứng dụng của Quorum quenching

Ứng dụng công nghệ sinh học phân hủy AHL, một phương pháp mới, đầy hứa hẹn cho việc đấu tranh với vi khuẩn gây hại, đã thu hút nhiều sự quan tâm của các nhà nghiên cứu Vì nhiều vi khuẩn gây bệnh cho người và động vật sử dụng cơ chế QS dựa trên AHL để điều hòa sự tổng hợp yếu tố quyết định tính độc hoặc sự hình thành màng sinh học, sự ứng dụng chiến lược QQ

có thể là một phương án phòng trừ những vi sinh vật này Có thể nói những nghiên cứu ứng dụng QQ hiệu quả nhất đã được thực hiện trên vi khuẩn gây

thối nhũn Erwinia

Ứng dụng đầu tiên của chiến lược QQ trong việc bảo vệ cây trồng chống lại vi sinh vật đã được tiến hành bởi Dong và cộng sự, 2000 Dong và

cộng sự đã phát hiện được gen aiiA240B1 mã hóa cho enzym AHL lactonase

AiiA từ chủng vi khuẩn Bacillus sp 240B1 Vai trò của gen này trong sinh tổng hợp được củng cố khi biểu hiện trong vi khuẩn gây bệnh E.carotovora SCG1 Kết quả cho thấy vi khuẩn gây bệnh biểu hiện gen aiiA240B1 giảm khả năng giải phóng AHLs và khả năng gây bệnh trên một số loài cây trồng như

khoai tây, cà rốt… Từ đó gen aiiA đã được chuyển thành công vào tác nhân gây bệnh E carotovora để làm giảm bệnh thối nhũn ở cải thảo Chủng vi khuẩn B thuringiensis được phát hiện mang gen aiiA mã hóa enzyme lactonase bởi Lee và cộng sự có khả năng phân hủy AHL E coli tái tổ hợp

sản xuất protein AiiA cũng có hoạt động phân hủy AHL và làm giảm độc tính

gây bệnh của E carotovora trên cây (Lee và cs., 2002).

Hoạt động của enzyme AHL lactonase cũng được phát hiện ở chủng vi

khuẩn phân lập từ đất Arthrobacter sp IBN110 Vi khuẩn này phát triển nhanh

trên môi trường chứa N-3-oxohexanoyl-L-homoserine lactone (OHHL) và

phân hủy nhiều loại AHLs khác nhau Khi đồng nuôi cấy Arthobacter sp

25

IBN110 với E carotovora, chủng IBN110 đã làm giảm đáng kể lượng AHLs

và hoạt tính enzyme pectate lyase của vi khuẩn gây bệnh E carotovora trong

môi trường (Park và cs., 2003) Mei và cộng sự đã phát hiện ra một loại protein mới AidH có tính năng như AHL lactonase từ chủng vi khuẩn đất

Ochrobactrum sp T63 AidH đã làm giảm đáng kể độc tính của vi khuẩn gây thối nhũn E carotovora (Mei và cs., 2010).Gần đây, Han đã phân lập được từ đất chủng vi khuẩn B macrorestinctum có khả năng phân hủy mạnh phân tử AHLs Khi xử lý B marcorestinctum lên lát cắt củ khoai tây được nhiễm vi khuẩn gây bệnh E carotovora subsp carotovora (Ecc), triệu chứng thối nhũn

đã suy yếu một cách có ý nghĩa Điều đó cho thấy rằng nếu đồng nuôi cấy vi khuẩn QQ với tác nhân gây bệnh được điều khiển bởi hệ thống QS gây bệnh trung gian có thể được sử dụng để bảo vệ cây chủ khỏi sự nhiễm bệnh bằng việc bất hoạt chất tự cảm ứng AHLs (Han và cs., 2010)

Trong một nghiên cứu khác đã xác định khả năng của các enzyme QQ

để ngăn chặn khả năng gây bệnh thối đen hạt lúa và sản xuất toxoflavin bởi

tác nhân gây bệnh Burkholderia glumae Gen aiiA mã hóa enzyme lactonase từ vi khuẩn Bacillus sp đã được đưa vào vi khuẩn này Vi khuẩn B glumae biểu hiện gen aiiA không những giảm đáng kể sự tổng hợp AHLs mà

AHL-còn làm giảm sự biểu hiện triệu chứng thối nhũn trên lát cắt khoai tây khi

đồng lây nhiễm với Ecc (Park và cs., 2010)

Vi khuẩn Microbacterium testaceum StlB037 được phân lập từ bề mặt

lá khoai tây, có hoạt động phân hủy AHLs Gen aiiM từ thư viện gen của

StLB037 được phân lập Protein AiiM tinh sạch thể hiện hoạt tính phân hủy AHLs mạnh ở cả dạng chuỗi dài và ngắn Phân tích sắc ký lỏng chứng tỏ rằng AiiM hoạt

động tương tự như enzyme AHL lactonase Thêm nữa vi khuẩn Ecc khi được chuyển gen aiiM đã khiến cho hoạt động pectinase giảm đáng kể và làm suy yếu

triệu chứng thối nhũn trên lát cắt khoai tây (Wang và cs., 2010)

26

Rất nhiều nghiên cứu ứng dụng QQ trên thế giới đã và đang tiếp tục được nghiên cứu cho chúng ta thấy tầm quan trọng của việc sử dụng QQ để nghiên cứu trong lĩnh vực kiểm soát bệnh hại bằng các tác nhân sinh học

1.4 Chủng chỉ thị

Chromobacterium violaceum là một loài vi khuẩn Gram âm thường

được tìm thấy trong đất và nước, sản xuất các sắc tố màu tím đặc trưng

Chủng CV026 là một đột biến mini-Tn5 của C violaceum mất khả

năng sản sinh sắc tố violacein nhưng khả năng tổng hợp sắc tố này được khôi phục khi tiếp xúc với dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn dạng dại không bị đột biến có chứa phân tử AHLs Nghiên cứu sử dụng các phân tử AHLs cho thấy rằng violacein có thể được cảm ứng tổng hợp bởi các phân tử AHLs

chuỗi ngắn có chiều dài chuỗi N-acyl từ 4-8 Cacbon và các phân tử AHLs có chiều dài chuỗi N-acyl từ 10 đến 14 Cacbon không có khả năng cảm ứng

tổng hợp sắc tố này Do vậy, chủng vi khuẩn CV026 được sử dụng làm chỉ thị sinh học (biosensor/reporter strain) để xác định khả năng sản sinh phân

tử AHLs chuỗi ngắn (McClean và cs., 1997; Morohoshi và cs., 2008)

1.4.2 Chromobacterium violaceum VIR07

27

Chủng VIR07 cũng là một chủng đột biến của C violaceum không có

khả năng tổng hợp violacein Khả năng tổng hợp violacein của chủng vi

khuẩn này được khôi phục khi bổ sung các phân tử AHLs chuỗi dài (chuỗi

N-acyl có chiều dài từ 10-16 Cacbon), nhưng bị ức chế tổng hợp sắc tố này khi thêm các phân tử AHLs chiều dài chuỗi N-acyl từ 4-8 Cacbon Chủng VIR07

có phản ứng tổng hợp violacein khi AHLs khuếch tán từ một số chủng vi khuẩn sản sinh AHLs trên đĩa thạch Do vậy, có thể sử dụng chủng này làm chỉ thị sinh học để xác định khả năng sản sinh AHLs chuỗi dài (Morohoshi

và cs., 2008)

- Mẫu cây cà dại không bị bệnh

- Mẫu củ khoai tây sạch bệnh

Hóa chất chuyên dụng: 3 loại AHLs tổng hợp: homoserine lactone (C6-HSL); N-(3-Oxooctanoyl)-L-homoserine lactone (C8-HSL); N-decanoy-L-Homoserine lactone (C10-HSL)

N-hexanoyl-L-2.1.4 Môi trường sử dụng trong nghiên cứu

2.1.4.1 Môi trường phân lập và nuôi cấy vi khuẩn

Thành phần môi trường YPDA (g/l): cao nấm men 1.5, dextrose 1.5, peptone 0.3, agar 20, nước cất, pH 7.2, khử trùng 121ºC trong 15 phút

2.1.4.2 Môi trường bảo quản vi khuẩn

Thành phần môi trường sữa tách béo (%): skim milk 10, L-glutamic acid 0.05, glycerol 10, nước cất, khử trùng 121ºC trong 15 phút

2.1.4.3 Môi trường thử khả năng sản sinh và phân hủy AHLs

Thành phần môi trường LB (g/l): tryptone 10, cao nấm men 5, NaCl 5,

29

agar 20, nước cất, pH 7, khử trùng 121ºC trong 15 phút

2.1.4.4 Cách pha một số hóa chất dùng trong thí nghiệm

Dung dịch NaClO3% (Pha 500ml): lấy 272ml NaClO + thêm 228ml

H2O cất, sau đó cho 3 giọt Tween vào và lắc đều

2.1.4.5 Môi trường TSB

Môi trường TSB thành phần (g/l): Tryptone 17, Soytone 3, Sodium Chloride 5, Dipotassium phosphate 25, Dextrose 2.5, Agar 15, nước cất, pH 7.3, khử trùng 1210C trong 15 phút

2.1.6 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Luận văn được thực hiện tại Bộ môn Bệnh học Phân tử - Viện Di truyền Nông nghiệp từ tháng 1 đến tháng 12 năm 2015

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Nội dung 1: Phân lập và xác định khả năng phân hủy AHLs của vi

khuẩn nội sinh từ cà dại

- Nội dung 2: Thử nghiệm ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy VKNS

đến hoạt tính enzyme AHL lactonase

30

- Nội dung 3: Thử nghiệm các loại môi trường nuôi cấy VKNS ảnh

hưởng đến hoạt tính enzyme AHL lactonase

- Nội dung 4: Xác định hoạt tính enzyme AHL lactonase của các

chủng VKNS phân hủy các loại AHLs tổng hợp C6, C8 và C10

- Nội dung 5: Thử nghiệm hiệu quả phòng trừ bệnh thối nhũn củ khoai

tây của các chủng vi khuẩn nội sinh có hoạt tính enzyme AHL lactonase trong điều kiện phòng thí nghiệm

2.3.1.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn nội sinh

Phân lập VKNS được tiến hành theo phương pháp của Furuya và cs, (2002) với một số thay đổi như sau:

Từ những mẫu thu được ngoài tự nhiên được đưa về rửa sạch dưới vòi nước để chuẩn bị các bước tiếp theo Ngâm mẫu trong cồn 70% trong 3 phút tiếp đến ngâm mẫu trong dung dịch NaClO 3% trong 5 phút Sau đó rửa 3 lần với nước cất đã khử trùng Nghiền mẫu trong đĩa petri đã khử trùng Nhỏ 1ml nước cất đã khử trùng vào dịch nghiền và trộn đều tạo thành dung dịch gốc Chuẩn bị 6 ống eppendorf 1.5ml, mỗi ống chứa 900μl nước cất khử trùng Hút 100μl dịch gốc nhỏ vào ống 1 trộn đều, tiếp tục hút 100μl dịch từ ống 1 nhỏ sang ống 2 và làm lần lượt theo thứ tự cho đến ống thứ 6 để được các nồng độ pha loãng liên tiếp Lấy 100μl từ các ống với 6 nồng độ đã được pha loãng

31

nhỏ lần lượt vào từng đĩa môi trường YPDA và trang đều trên bề mặt đĩa Để mẫu trong tủ 280C, sau 24h kiểm tra khuẩn lạc Mô tả đặc điểm của các khuẩn lạc trên đĩa, sau đó cấy chuyển vào môi trường YPDA mới Bảo quản các chủng VKNS phân lập được trong dung dịch sữa tách béo 10% có bổ sung glycerol ở - 200C để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo

2.3.2 Xác định các chủng vi khuẩn nội sinh có khả năng phân hủy AHLs trong điều kiện in vitro và in vivo

2.3.2.1 Vật liệu nghiên cứu

- Các chủng VKNS phân lập được từ cà dại

- Các chủng chuẩn Ecc, CV026

- Môi trường YPDA và LB

2.3.2 2 Phương pháp nghiên cứu

Xác định khả năng phân hủy AHLs của vi khuẩn gây bệnh theo phương pháp đồng nuôi cấy của Molina và cs (2003) với một số thay đổi

- Chủng vi khuẩn chỉ thị CV026 và Ecc được cấy trên môi trường LB

và YPDA tương ứng và ủ ở 28oC trong 48h

- Các chủng Vi khuẩn nội sinh được cấy trên môi trường YPDA và ủ ở

28oC trong 24h

- Thử khả năng phân hủy AHLs của vi khuẩn gây bệnh theo phương pháp đồng nuôi cấy

- Các chủng VKNS được cấy vạch thành một đường trên môi trường,

kèm sát hai bên là chủng vi khuẩn Ecc và chủng vi khuẩn chỉ thị CV026 cũng

được cấy vạch thành một đường, tạo thành 3 đường cấy song song

- Đối chứng dương chỉ gồm hai chủng Ecc và CV026 cấy sát nhau

- Đối chứng âm là chủng Ecc và chủng CV026 được cấy riêng biệt

- Mẫu được để trong tủ 280C

Hình 2.1 Phương pháp xác định VKNS phân hủy AHLs

2.3.3 Phương pháp thử nghiệm ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy VKNS đến hoạt tính enzyme AHL lactonase

2.3.3.1 Vật liệu nghiên cứu:

- Chủng vi khuẩn nội sinh phân hủy AHLs

- Chủng vi khuẩn chỉ thị CV026

33

- Hóa chất: AHL tổng hợp C6-HSL

- Môi trường nuôi cấy YPD

2.3.3.2 Phương pháp nghiên cứu:

- Chủng vi khuẩn nội sinh được nuôi lắc trong môi trường lỏng YPD chứa 10μM C6-HSL ở 280C trong các khoảng thời gian khác nhau 1h, 6h và 24h

- C6-HSL không bị phân hủy trong môi trường được xác định bằng

cách bổ sung vi khuẩn chỉ thị CV026 và tiếp tục nuôi cấy trong thời

gian 24h Nếu xuất hiện màu tím chứng tỏ AHL chưa bị phân hủy hết

- Hoạt tính enzyme AHL lactonase được xác định thông qua cơ chế tái tạo vòng lactone của phân tử AHL trong dung dịch axit 90μl của dịch nuôi cấy VKNS chứa 10μM C6-HSL ở 280C sau các khoảng thời gian khác nhau 1h, 6h hoặc 24h được trộn với 10μl dung dịch 1N HCl sau khi ủ ở 40C trong 48h, dùng 20μl 1M Phosphate buffer (pH 7.0) được bổ sung vào hỗn hợp để tạo môi trường trung tính Sự

có mặt của phân tử AHL tái tạo lại trong môi trường axit được xác

định bằng cách bổ sung chủng vi khuẩn chỉ thị CV026 và tiếp tục

nuôi cấy trong thời gian 24h Nếu dịch nuôi cấy chuyển sang màu tím chứng tỏ vòng lactone của phân tử AHL được khôi phục và hoạt tính enzyme AHL lactonase của VKNS được xác định

2.3.4 Phương pháp thử nghiệm các loại môi trường nuôi cấy VKNS ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme AHL lactonase

2.3.4.1 Vật liệu nghiên cứu:

- Chủng vi khuẩn nội sinh có khả năng phân hủy AHLs

- Chủng vi khuẩn chỉ thị C violaceum CV026