Nghiên cứu hoạt động của gen điều khiển quá trình ra hoa ở cây hoa cúc chiếu sang phá đêm bằng đèn led

Nhiều giống hoa cúc có phản ứng rất chặt với ánh sáng ngày ngắn cúc vàng pha lê, chi trắng… chính vì vậy ngay khi mới trồng mà gặp điều kiện ánh sáng ngày ngắn cây đã ra hoa, không đủ t

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

Nguyễn Thị Thu Hiền

Nghiên cứu hoạt động của gen điều khiển quá trình ra hoa ở cây hoa

cúc chiếu sang phá đêm bằng đèn led

Chuyên ngành: sinh học thực nghiệm

Hướng dẫn khoa học: PGS TS Chu Quang Hà

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v

LỜI CẢM ƠN vii

LỜI CAM ĐOAN vii

DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ix

MỞ ĐẦU 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÂY HOA CÚC 3

1.1.1 Giới thiệu về cây hoa cúc 3

1.1.2 Nhu cầu ánh sáng cho quá trình sinh trưởng, phát triển của cây hoa cúc 5 1.2 TỔNG QUAN VỀ SỰ RA HOA Ở THỰC VẬT 9

1.2.1 Con đường ra hoa tự khiển 10

1.2.2 Con đường phụ thuộc gibberellin đòi hỏi mức hoocmon gia tăng 11

1.2.3 Con đường ra hoa phụ thuộc nhiệt độ ( sự xuân hóa) 11

1.2.4 Quang chu kì 13

1.3 TỔNG QUAN VỀ ĐÈN LED 21

1.3.1 Giới thiệu về đèn LED 21

1.3.2 Ảnh hưởng của ánh sáng LED đến sự phát triển của thực vật 22

1.3.3 Ưu, nhược điểm của đèn LED 23

1.4 CÁC NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ẢNH HƯỞNG CỦA ĐỘ DÀI THỜI GIAN CHIẾU SÁNG ĐẾN QUANG CHU KỲ CỦA THỰC VẬT 24

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.1 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA CÂY HOA CÚC DƯỚI ĐIỀU KIỆN CHIẾU SÁNG BẰNG ĐÈN LED 38

3.1.1 Đánh giá sinh trưởng và phát triển của cây Hoa cúc 40 ngày tuổi 39

3.1.2 Đánh giá sinh trưởng và phát triển cây Hoa cúc 50 ngày tuổi 40

3.1.3 Đánh giá sinh trưởng và phát triển của cây Hoa cúc 70 ngày tuổi 42

3.1.4 Đánh giá sinh trưởng và phát triển của cây Hoa cúc 110 ngày tuổi 45

3.1.5 Hiệu quả tiết kiệm điện năng của đèn LED 49

3.2 KẾT QUẢ PHÂN LẬP GEN CO ĐIỀU KHIỂN QUÁ TRÌNH RA HOA Ở CÂY HOA CÚC 51 3.2.1 Tách chiết RNA tổng số 51 3.2.2 Kết quả phân lập gen CO 54 3.2.3 Kết quả đánh giá sự biểu hiện của gen CO và FT cảm ứng ra hoa ở cây Hoa cúc 61 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.2: Các gen điều khiển quá trình ra hoa ở cây Arabidopsis 17

Bảng 2.1: Trình tự nucleotide các cặp mồi sử dụng 28

Bảng 2.2: Sơ đồ bố trí đèn trong các ô thí nghiệm 29

Bảng 2.3: Kí hiệu mẫu thí nghiệm 31

Bảng 2.4: Thành phần phản ứng PCR 33

Bảng 2.5: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 33

Bảng 2.6: Thành phần phản ứng gắn gen vào vector pBT 35

Bảng 3.1: Sinh trưởng và phát triển cây hoa cúc sau 50 ngày tuổi 40

Bảng 3.2: Sinh trưởng và phát triển của hoa cúc 70 ngày tuổi 43

Bảng 3.3: Sinh trưởng và phát triển của hoa cúc sau 110 ngày tuổi 45

Bảng 3.4: Hiệu quả tiết kiệm năng lượng 50

Bảng 3.5: Kết quả định lượng RNA tổng số bằng Nano Drop 53

Bảng 3.6: Mã số trong Ngân hàng dữ liệu gen và vùng phân lập của các thể phân lập thuộc chi cúc Chrysanthemum sử dụng trong phân tích, so sánh trình tự gen CO 58

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.2: Cây hoa cúc vàng pha lê 5

Hình 1.3 Sự ra hoa ở cây ngày ngắn và cây ngày dài 13

Hình 1.4: Con đường quang chu kỳ điều khiển sự ra hoa ở cây Arabidopsis 19

Hình 1.5: Ảnh hưởng của ánh sáng đỏ và đỏ xa đến sự ra hoa của cây ngày ngắn và cây ngày dài 20

Hình 1.6: Hình ảnh đèn Led và đèn Led sử dụng trong nuôi cấy mô 22

Hình 3.1: Cây hoa cúc 40 ngày tuổi 39

Hình 3.2: Hình ảnh cây hoa cúc 50 ngày tuổi 41

Hình 3.3: Ảnh hưởng của đèn Led đến thời gian ra hoa của cây hoa cúc 50 ngày tuổi 42

Hình 3.4: Ảnh hưởng của đèn Led đến thời gian ra nụ của cây 70 ngày tuổi 44

Hình 3.5: Hình ảnh Hoa cúc sinh trưởng ở 70 ngày tuổi 44

Hình 3.6: Hình ảnh hoa cúc ở 110 ngày tuổi 47

Hình 3.7: Ảnh hưởng của đèn Led đến đường kính hoa 48

Hình 3.8:Tổng năng lượng sử dụng trong một vụ 51

Hình 3.9: Kết quả điện di tách chiết RNA tổng số trên gel agarose 1% 52

Hình 3.10: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR với cặp mồi MTP 55

Hình 3.11: Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR dùng cặp mồi đặc hiệu (CS_CO F/R) sử dụng khuôn là cDNA tổng hợp từ RNA tổng số của các mẫu hoa cúc 55

Hình 3.12: Kết quả điện di sản phẩm colony PCR với cặp mồi pUC18F/R 57

Hình 3.13 : Hình ảnh so sánh trình tự nucleotide gen CO của thể phân lập COL-clone36 với bốn thể phân lập khác thuộc chi Chrysanthemum trên Ngân hàng dữ liệu gen 59

Hình 3.14: Hình ảnh so sánh trình tự axit amin gen CO của thể phân lập COL-clone36 với bốn thể phân lập khác thuộc chi Chrysanthemum trên Ngân hàng dữ liệu gen 60

Hình 3.15: Cây phát sinh chủng loại dựa vào trình tự nucleotide của gen CO chi Chrysanthemum Thể phân lập COL-clone36 nghiên cứu được so sánh với bốn thể phân lập khác được công bố trên Ngân hàng dữ liệu gen 60

Hình 3.16: Kết quả phân tích mức độ biểu hiện ở cấp độ phiên mã của gen CO ở lá của cây hoa cúc ở 42, 49, 56 và 63 ngày tuổi 62 Hình 3.17: Biểu hiện của gen FT ở các giai đoạn phát triển khác nhau ở mẫu lá bánh

tẻ , lá non và đỉnh chồi của cây hoa cúc 64 Hình 3.18: Kết quả phân tích mức độ biểu hiện ở cấp độ phiên mã của gen CO ở lá của cây hoa cúc ở 42, 49, 56 và 63 ngày tuổi 65

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi, các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, chƣa đƣợc công bố trong bất kể công trình nghiên cứu nào khác

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả

Nguyễn Thị Thu Hiền

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy PGS.TS Chu Hoàng Hà, đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, làm việc và hoàn thành luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Phạm Bích Ngọc đã dành thời gian chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt quá trình làm việc Đã có những lúc khó khăn nhưng Cô luôn bên cạnh động viên và hướng dẫn giúp tôi có thể hoàn thành được luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơnThs Phạm Thị Vân, Ths Hoàng Đăng Hiếu,

CN Nguyễn Văn Đoài cùng tập thể cán bộ phòng Công nghệ tế bào thực vật, những người anh, người chị,những người đồng nghiệp đã luôn chia sẻ, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm việc

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, những người thân luôn bên tôi, ủng hộ và giúp đỡ tôi để tôi có thể hoàn thành tốt công việc cũng như luận văn này

Hà Nội, tháng 1 năm 2016 Học viên

Nguyễn Thị Thu Hiền

DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Led :Light-emitting diode

cDNA : Complementary DNA

DNA : Deoxirybonucleotide acid

Bp : base pair

PCR : Polymerase Chain Reaction

RNA : Ribonucleotide acid

CFL : Compact fluorescent lamp

RT-PCR : Reverse transcriptpolymerase chain reaction FREL : Far red light

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây nền kinh tế thị trường phát triển, một hướng chuyển đổi cơ cấu cây trồng nông nghiệp sang phát triển hoa cây cảnh đang được xã hội quan tâm vì nó không chỉ mang lại giá trị về tinh thần mà còn mang lại lợi ích kinh tế cao cho người sản xuất

Trong các loài hoa, cây hoa cúc được trồng phổ biến, phát triển nhanh vì

nó là loại hoa đẹp, được dùng nhiều trong các dịp lễ tết Cây hoa cúc vừa có giá trị trang trí lại có thể sử dụng làm dược liệu chính vì vậy nó được trồng rộng rãi

ở nhiều địa phương bởi khả năng thích nghi cao, dễ sản xuất và dễ dàng trong việc vận chuyển

Nhiều giống hoa cúc có phản ứng rất chặt với ánh sáng ngày ngắn ( cúc vàng pha lê, chi trắng…) chính vì vậy ngay khi mới trồng mà gặp điều kiện ánh sáng ngày ngắn cây đã ra hoa, không đủ thời gian để cây sinh trưởng điều này làm giảm đáng kể chất lượng của cành hoa Để khắc phục hiện tượng này, người ta thường sử dụng đèn compact, hay đèn sợi đốt để chiếu sáng bổ sung cho cây hoa cúc nhằm tăng thời gian sinh trưởng đến khi cây đạt chiều cao cần thiết mới ra hoa Tuy nhiên, khi sử dụng đèn compact hay đèn sợi đốt lượng điện năng tiêu thụ lớn, tuổi thọ không cao, mất nhiều chi phí Chính vì vậy trong những năm gần đây đèn Led được đưa vào nghiên cứu và sử dụng nhằm loại bỏ những hạn chế trên của đèn compact và đèn sợi đốt Nhưng câu hỏi đặt

ra đó là chất lượng ánh sáng của đèn Led ảnh hưởng như thế nào đến quá trình

ra hoa của cây, không chỉ ở mức độ hình thái, sinh trưởng mà ở cả mức độ phân

tử Xuất phát từ những băn khoăn này, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu hoạt động của gen điều khiển quá trình ra hoa ở cây hoa cúc chiếu sáng phá đêm bằng đèn Led” với mục tiêu, nội dung và phạm vi nghiên cứu như sau:

Mục tiêu nghiên cứu:

(1) Lựa chọn được chế độ chiếu sáng thích hợp đối với sự sinh trưởng

và phát triển của cây hoa cúc

(2) Phân lập được một gen liên quan đến sự điều khiển quá trình ra hoa

ở cây hoa cúc

(3) Đánh giá sự biểu hiện của gen điều khiển quá trình ra hoa ở cây hoa cúc

Nội dung nghiên cứu:

(1) Khảo sát sự ảnh hưởng của một số công thức đèn Led đến sự sinh trưởng và phát triển của cây hoa cúc, so sánh với các công thức chiếu sáng truyền thống

(2) Tách dòng và xác định trình tự gen CO- một gen quan trọng điều khiển quá trình ra hoa

(3) Đánh giá biểu hiện của gen CO và gen FT

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÂY HOA CÚC

1.1.1 Giới thiệu về cây hoa cúc

Cây hoa cúc có nguồn gốc từ Trung Quốc, Nhật Bản và một số nước Châu Âu

Ngành (Divisio) Thực vật hạt kín (Angiospermae)

Loài điển hình (Species) Chrysanthemum indicum

Hoa cúc được trồng ở nhiều nơi trên thế giới như: Hà Lan, Italia, Trung

quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc Ở nước ta cây hoa Cúc (Chrysanthemum sp) đã

du nhập vào từ thế kỷ XV, đến đầu thế kỷ XIX đã hình thành một số vùng chuyên canh nhỏ cung cấp hoa cho thị trường Hiện nay Cúc có mặt ở khắp nơi

từ nông thôn đến thành thị, từ miền núi đến đồng bằng Các vùng trồng nhiều mang tính tập trung là Hà Nội (450 ha), thành phố Hồ Chí Minh (370 ha), Đà Lạt (160 ha), Hải Phòng (110 ha)

Tại vùng trồng hoa Tây Tựu-Từ Liêm-Hà Nội, hoa hồng và hoa cúc là hai loại hoa có diện tích trồng và sản lượng cao nhất Hoa cúc đứng hàng thứ hai với chu kỳ 3 tháng một lần cho thu hoạch Hoa cúc của vùng không chỉ

được tiêu thụ tại các thị trường phía Bắc mà đang được đưa dần vào thị trường phía Nam và xuất khẩu sang Trung Quốc Trong diện tích gần 136 ha trồng hoa của vùng Trung du và miền núi phía Bắc, diện tích trồng hoa hồng đã chiếm tới trên 55,27% với sản lượng 26,53 triệu bông/năm Diện tích trồng hoa cúc lớn thứ hai với 14,5 ha, sản lượng 5 triệu cành/năm (Đề án Phát triển sản xuất, xuất khẩu rau, quả và hoa tươi Việt Nam)

Hoa Cúc có tác dụng sơ phong tiết nhiệt, làm nhẹ đầu mắt Trong phòng chống cảm cúm, hiệu quả kháng viêm và cải thiện hệ miễn dịch của hoa Cúc có thể rút ngắn thời gian bệnh và làm giảm các triệu chứng ho, sốt, nhức đầu, nghẹt mũi

Tất cả các loài hoa Cúc đều có thể dùng làm thuốc Tuy nhiên, do hiệu

suất cao, hoa Cúc vàng (hoàng Cúc), tên khoa học Chrysanthemum indicum L

thường được sử dụng trong Đông y Hoàng Cúc được trồng để lấy hoa làm cảnh, làm thuốc, ướp chè hoặc cất rượu Trong những năm gần đây, các nhà khoa học phương Tây đặc biệt quan tâm đến giá trị dược học của hoa Cúc tím

(Cúc dại), tên khoa học là Echinacea purpurea

Theo nghiên cứu của Tiến sĩ Jurg Gertsch, thuộc Việc Công nghệ Swiss, những hoạt chất alkylamides trong hoa Cúc dại có khả năng điều chỉnh 1 trong những yếu tố quan trọng nhất của hệ miễn dịch được gọi là tumor necrosis factor alpha (TNF-a) Alkylamides kích thích hoạt động của TNF-a để gia tăng sức đề kháng chống lại những tác động có hại vủa vi trùng, vi khuẩn

Hoa Cúc là loại dược thảo có tác dụng giải độc tốt nhất cho hệ thống tuần hoàn và hệ thống hô hấp Hoạt chất trong hoa Cúc không chỉ giúp giải tỏa những áp lực ở mắt từ bệnh cảm cúm theo mùa hoặc hiện tượng khí nghịch của Đông y mà còn có khả năng cải thiện hoạt động ở những mao mạch, tăng cường lưu thông khí huyết đến mắt Những chất chống oxy hóa trong hoa Cúc

có khả năng trung hòa những gốc tự do để bảo vệ những cấu trúc collagen ở

mắt Hoa Cúc rất thông dụng ở các dân tộc Bắc Mỹ và châu Âu Các nhà khoa học cho biết các hoạt chất của hoa Cúc vừa có tính kháng viêm giống như cortisone vừa có tác dụng kháng khuẩn

Hình 0.1: Cây hoa cúc vàng pha lê

Cây hoa cúc là cây ngày ngắn, ưa đêm lạnh Thời kỳ đầu cây non mới ra

rễ, cây cần ít ánh sáng; trong quá trình sinh trưởng, ánh sáng quá mạnh sẽ làm cây chậm lớn và chất lượng hoa giảm Ngày nay cùng với tiến bộ khoa học kỹ thuật trong nông nghiệp, thì việc trồng cây nói chung và việc trồng hoa cúc nói riêng đã được áp dụng nhiều giống mới, nhiều thiết bị kỹ thuật hiện đại như nhà lưới, nhà kính, kỹ thuật canh tác , sử dụng các chất kích thích sinh trưởng, ánh sáng, phân bón Và trong đó, việc điều chỉnh các cường độ chiếu sáng khác nhau cho hoa cúc để đem lại năng suất, chất lượng tốt nhất, có hiệu quả kinh tế cao nhất là vấn đề mà mỗi người trồng cần quan tâm

1.1.2 Nhu cầu ánh sáng cho quá trình sinh trưởng, phát triển của cây hoa cúc

Sự sinh trưởng phát triển của thực vật nói chung và của cây hoa cúc nói riêng đều chịu tác động của các yếu tố ngoại cảnh như ánh sáng, nhiệt độ, độ

ẩm, đất trồng, dinh dưỡng, quang chu kỳ bổ sung, cơ sở hạ tầng Trong đó ánh sáng (quang chu kỳ và quang chu kỳ bổ sung) và nhiệt độ thấp (sự xuân hóa) là

hai yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến giai đoạn cảm ứng hình thành hoa

Hoa Cúc là loại cây hoa ngày ngắn, sự phân hoá và phát dục của hoa được tác động dưới tác dụng đồng thời của quang chu kì và nhiệt độ Trong quá

trình sinh trưởng, phát dục, dưới tác dụng phối hợp của độ dài chiếu sáng trong ngày và nhiệt độ ở mức độ nhất định mới có thể ra hoa, trong đó độ dài chiếu sáng là yếu tố quan trọng hơn, yêu cầu khắt khe hơn Khi thời gian chiếu sáng kéo dài thì thời gian sinh trưởng của cây hoa Cúc dài hơn, thân cao, lá to, chất lượng hoa tăng Thời gian chiếu sáng ngắn thì sẽ kích thích phân hóa mầm hoa sớm: cây ngắn, chất lượng hoa kém Thời kỳ để phân hóa mầm hoa tốt nhất là

10 giờ chiếu sáng trên ngày với nhiệt độ là 20-25ºC

Khống chế chiều cao cây: Tuỳ theo các mục đích sử dụng khác nhau mà

yêu cầu độ cao của cây cũng khác nhau, vì vậy khống chế chiều cao cây cũng là một biện pháp kĩ thuật không thể thiếu đối với hoa cúc Chiều cao cây do yếu

tố di truyền của giống và điều kiện thâm canh chăm sóc quyết định Giống thấp cây nhất chỉ cao khoảng 20–30cm, giống cao nhất có thể cao trên 3m Thời gian sinh trưởng dài, ngắn ảnh hưởng trực tiếp đến chiều cao cây Trong thời gian sinh trưởng dinh dưỡng với điều kiện thích hợp mỗi tuần có thể tăng 2–4 đốt, với giống sinh trưởng nhanh có thể dài thêm 6–13cm Vì vậy điều chỉnh thời gian cắm cành, thời vụ trồng rút ngắn độ dài thời ki sinh trưởng dinh dưỡng là biện pháp khống chế chiều cao đơn giản, nhanh nhạy nhất Yếu tố ánh sáng gây tác động lên độ dài thời gian sinh trưởng sinh dưỡng nên cũng gây ảnh hưởng đến chiều cao cây

Ảnh hưởng đến độ lớn của hoa: Độ lớn của hoa là một chỉ tiêu quan

trọng để đánh giá chất lượng hoa Cúc Trong trồng trọt người ta thường dùng các biện pháp tăng cường bón phân, tưới nước, phun phân qua lá, phun chất kích thích sinh trưởng, biện pháp ghép… để làm tăng đường kính hoa Có thể dùng biện pháp kéo dài độ chiếu sáng trong ngày sau khi mầm hoa đã phân hoá

để tăng đường kính hoa Sau khi xử lí chiếu sáng ngày ngắn 35 ngày để cho mầm hoa phân hoá, khi đã có nụ và sau khi tỉa bớt nụ, đặt cây trong điều kiện chiếu sáng ngày dài cho đến khi hoa nở Điều này có thể làm cho rất nhiều giống tăng đường kính hoa

Điều chỉnh sự ra hoa: thời gian ra hoa ở cây cúc có thể điều chỉnh bằng

hoá chất và nhiệt độ hoặc khống chế quang chu kỳ Độ dài chiếu sáng tới hạn trong ngày có tác dụng điều tiết quá trình sinh trưởng phát triển của cây và phụ thuộc vào các loài khác nhau gọi là hiện tượng quang chu kỳ Mỗi loài thực vật

có độ dài ngày tới hạn nhất định, trong đó cây ra hoa trong điều kiện thời gian chiếu sáng trong ngày ngắn hơn thời gian chiếu sáng tới hạn gọi là cây ngày ngắn và cây ra hoa trong điều kiện thời gian chiếu sáng trong ngày dài hơn thời gian chiếu sáng tới hạn gọi cây ngày dài Hoa cúc thuộc lớp hai lá mầm và là loại cây ngày ngắn nghĩa là sự hình thành và phát triển của hoa diễn ra trong điều kiện ngày có thời gian chiếu sáng ngắn hơn 12-13 giờ Cây hoa cúc cần trên 16 giờ chiếu sáng để phân hóa hoa và sinh trưởng mạnh, vì vậy khi độ dài ngày tự nhiên ít hơn 16 giờ thì cần phải bổ sung thêm ánh sáng đèn để giúp cây phát triển chiều cao Ví dụ: ở Đà lạt, vào mùa hè độ dài ngày từ 12 đến 13 giờ,

vì vậy cần bổ sung quang chu kỳ từ 3 đến 4 giờ vào ban đêm sẽ đảm bảo đủ ánh sáng ngày dài cho sự sinh trưởng của cây Vào mùa đông, độ dài ngày từ

11 đến 12 giờ, vì vậy cần bổ sung quang chu kỳ từ 4 đến 5 giờ vào ban đêm Thời gian bắt đầu chiếu sáng bổ sung hiệu quả nhất là từ 22 giờ đêm đến 2 giờ sáng Những giống hoa cúc có nguồn gốc từ Châu âu cơ bản là nở vào mùa thu đông nhưng những năm gần đây người ta đã phát hiện ra phản ứng với quang chu kỳ của cúc kết hợp với việc tạo giống với các nguồn gen khác nhau, có thể khống chế làm cho cúc ra hoa theo ý muốn Hiện nay các nhà sản xuất thông qua khống chế quang chu kỳ kết hợp với khống chế nhiệt độ có thể làm cho cúc quanh năm có hoa

Nhiệt độ không chỉ ảnh hưởng đến tốc độ phát triển của nụ của cây hoa cúc mà còn ảnh hưởng đến sự phân hóa và phát dục của hoa Nụ đã được phân hóa nếu gặp nhiệt độ thấp, quá trình phát dục sẽ bị chậm nên hoa cũng nở muộn Thời gian nở hoa sớm hay muộn tùy thuộc vào chế độ nhiệt và đặc tính

di truyền của giống Khi nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự ra hoa của các giống Cúc tại Châu Âu, Karlson, chia cúc làm 3 nhóm:

 Nhóm giống không bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ: trong phạm vi từ 10 - 27ºC, nhiệt độ không ảnh hưởng gì đến sự phân hóa và phát dục của hoa Nhưng nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn nhiệt độ trên sẽ ức chế sự ra hoa

 Nhóm giống bị nhiệt độ thấp ức chế ra hoa: bình thường chúng bắt đầu phân hóa mầm hoa từ 16ºC trở lên, nhiệt độ thấp hơn 16ºC sẽ ức chế sự phân hóa hoa

 Nhóm giống bị nhiệt độ cao ức chế ra hoa: thời điểm bắt đầu phân hóa hoa của nhóm này ở nhiệt độ cao (>20ºC), nhưng nếu nhiệt độ quá cao (>35ºC) thì kéo dài sự phát dục của nụ bị ngừng trệ

Cúc là cây ngày ngắn, ưa ánh sáng và đêm lạnh Thời kỳ đầu non mới ra

rễ cây cần ít ánh sáng, nhưng trong quá trình sinh trưởng ánh sáng mạnh cũng làm cho cây chậm lớn Ngoài ra Jong (1989) và Strojuy (1985) đã khẳng định, thời gian chiếu sáng rất quan trọng cho cây hay nói cách khác ngày đêm dài hay ngắn có tác dụng khác nhau đối với loại hoa này, hầu hết các giống Cúc trong thời kỳ sinh trưởng sinh dưỡng cần ánh sáng ngày dài trên 13h, còn trong giai đoạn trổ hoa cây chỉ cần ánh sáng ngày ngắn từ 10-11h và nhiệt độ không khí < 20ºC Bởi vậy trong điều kiện Việt Nam cây Cúc rất phù hợp với thời tiết thu đông, nhưng hiện nay một số giống Cúc nhập nội có thể ra hoa trong điều kiện ngày dài Theo Wang và Chen (1990) nhiệt độ, ánh sáng không tác động một cách riêng rẽ mà phối hợp nhau, kìm hãm hay thúc đẩy sự sinh trưởng và phát triển của cây hoa Cúc Fukuda và các cộng sự (1987), đã cho rằng đối với nhóm Cúc ra hoa mùa thu, sự hình thành và phát triển chồi là trong điều kiện ngày ngắn, chồi hoa hình thành ≥ 15ºC, ở nhiệt độ cao không gây ức chế Còn nhóm ra hoa mùa đông dù trong điều kiện ngày ngắn, nhưng nếu ở nhiệt độ cao

sẽ ức chế sự phát triển của chồi hoa Riêng nhóm ra hoa ở mùa hè, chồi hoa thường hình thành ở 10ºC trong điều kiện ngày trung tính Nhiều nghiên cứu khác cũng cho thấy độ dài ngày có ảnh hưởng đến sự ra hoa của cây Cúc, theo

Novatna (1988) vào thời kỳ ra hoa, cây yêu cầu thời gian chiếu sáng là 10 giờ, nhiệt độ thích hợp là 18ºC, nếu thời gian chiếu sáng dài Cúc sẽ kéo dài thời gian sinh trưởng, cây cao, lá to và ra hoa muộn

* Biện pháp kéo dài thời kỳ sinh trưởng dinh dưỡng làm chậm sự nở hoa bằng: chiếu sáng bổ sung:Mục đích của chiếu sáng bổ sung là giảm thời gian

tối của mỗi ngày chứ không phải là kéo dài thời gian chiếu sáng liên tục vì vậy nếu chiếu sáng thực hiện vào lúc nửa đêm để chia cắt thời gian tối liên tục thành hai giai đoạn tối, đồng thời cũng là để tăng số giờ chiếu sáng thì hiệu quả hơn nhiều Nguyên tắc xác định thời gian chiếu sáng bổ sung là làm cho thời gian tối liên tục trong đêm mỗi đoạn ngắn hơn 7 h Nói chung được thực hiện vào khoảng 11h đêm đến 4h sáng hôm sau Như vậy mỗi nửa kỳ tối đều không vượt quá 7h

* Biện pháp rút ngắn thời kỳ sinh trưởng dinh dưỡng, kích thích sự nở hoa của cúc

Ở thực tế sản xuất song song với việc chiếu sáng bổ xung để làm chậm

sự nở hoa của cúc, người ta cũng còn sử dụng biện pháp ngược lại là che sáng

để kích thích hoa nở sớm hơn

1.2 TỔNG QUAN VỀ SỰ RA HOA Ở THỰC VẬT

Trong suốt cuộc đời mình, cơ thể thực vật chịu nhiều biến đổi đặc trưng phù hợp với từng giai đoạn khác nhau của vòng đời Ở thực vật có hoa, sự ra hoa là bước chuyển quan trọng đánh dấu bước phát triển mới của thực vật và có

ý nghĩa quyết định đối với sự tồn tại của thực vật Hoa được thành lập từ chồi ngọn hay chồi nách qua ba giai đoạn chính: chuyển tiếp ra hoa; hình thành cơ quan hoa; tăng trưởng và nở hoa

Sự chuyển tiếp ra hoa gây nên các biến đổi sâu sắc của mô phân sinh ngọn, từ mô phân sinh dinh dưỡng thành mô phân sinh tiền hoa Các biểu hiện đầu tiên của sự chuyển tiếp ra hoa không thấy được bằng mắt thường, chỉ biết được bởi các phân tích tế bào học hay sinh hóa học, với sự tăng mạnh hoạt tính

biến dưỡng (tổng hợp RNA, ribosome, protein), đặc biệt trong vùng đỉnh Sự chuyển tiếp ra hoa xảy ra đồng thời với sự biến đổi rất rõ của bộ máy dinh dưỡng, đặc biệt là sự kéo dài lóng thân do hoạt động mạnh của vùng dưới ngọn của mô phân sinh tiền hoa

Sự hình thành cơ quan hoa: Sự chuyển tiếp ra hoa cần khoảng 2-3 ngày

để dẫn tới hình thành cơ quan hoa (quan sát được dưới kính hiển vi) Sự phát triển của các sơ khởi hoa nói chung xảy ra nhanh chóng, làm chồi phồng lên thành nụ hoa (dễ thấy dưới kính lúp, qua lát cắt dọc)

Sự tăng trưởng và nở hoa: Khi sự tượng hoa hoàn thành, nụ hoa có thể tiếp tục tăng trưởng và nở (trường hợp các cây nhất niên) Tuy nhiên nụ hoa có thể vào trạng thái ngủ

Ngày nay, đã nhận biết được bốn con đường tạo hoa được di truyền điều phối (1) con đường phụ thuộc tuổi (tự khiển), (2) con đường phụ thuộc gibberellin, (3) con đường phụ thuộc nhiệt độ, (4) con đường phụ thuộc ánh sáng

1.2.1 Con đường ra hoa tự khiển

Ra hoa tự khiển là con đường tạo hoa không phụ thuộc vào các điều khiện ngoại cảnh Khi cây sinh trưởng đến một độ tuổi nhất định nào đó cây sẽ

ra hoa Tùy theo các loài thực vật khác nhau mà có chu kỳ phát triển khác nhau Như cây lạc ở pha chồi lá mầm đã sẵn sàng ra hoa,hay như cây lúa mạch đen chỉ ra hoa khi có ít nhất 7 lá hoàn chỉnh, một số cây cà chua sau khi có 5 lá đã bắt đầu chuyển sang trạng thái phát triển sinh sản Cây sồi ra hoa sau 10 đến 12 năm, một số loài tre bắt đầu chuyển sang pha trưởng thành ra hoa sau 50 năm

Sự chuyển đổi như vậy gọi là sự chuyển đổi pha trog mô phân sinh đỉnh cành,

nó xảy ra dưới tác động của các nhân tố nhất định, trong trường hợp này đó là

các nhân tố nội tại

1.2.2 Con đường phụ thuộc gibberellin đòi hỏi mức hoocmon gia tăng

Mỗi thời kỳ sinh trưởng và phát triển của thực vật có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau Trong thời kỳ ra hoa cây cần nhu cầu dinh dưỡng không nhiều nhưng phải cân đối Lượng dinh dưỡng phải đảm bảo nằm trong giới hạn cho phép:

Giới hạn trên là giới hạn mà ở đó sự phát triển dinh dưỡng chiếm ưu thế Giới hạn dưới là giới hạn mà dưới đó, dinh dưỡng không đủ cho sự ra hoa Thông thường, sự dinh dưỡng nhiều đạm kích thích sự phát triển dinh dưỡng và ngược lại, sự dinh dưỡng giàu carbon kích thích sự ra hoa Do đó, việc lựa chọn tỉ lệ C/N ( carbonhydrat/ nitrogen) cao thích hợp sẽ kích thích sự

ra hoa, nếu tỉ lệ này thấp sẽ làm cây phát triển sinh dưỡng cao, nếu tỉ lệ này quá cao hoặc quá thấp sẽ ức chế sinh trưởng của thực vật Tóm lại, có nhiều yếu tố dinh dưỡng ảnh hưởng tới sự ra hoa, tuy nhiên quan trọng nhất là: sự cạnh tranh giữa phát triển dinh dưỡng và phát triển sinh sản, sự thiếu dinh dưỡng nhẹ (trên mức tối thiểu), và cân bằng C/N

Tương quan hoocmon

Đỉnh sinh trưởng của cành nhận được từ những phần còn lại của cây các hoocmon và các chất khác ngoài cacbon hidrat và các chất dinh dưỡng Trong

Arabidopsis và một số loài khác, giảm thiểu các mức gibberellin đã làm chậm trễ

sự nở hoa Vai trò của GA nội sinh trong sự điều tiết sinh sản cũng đã được chứng minh trong cách xử lí khác vốn xúc tiến sự ra hoa của cây thông cũng thường do sự gia tăng lượng GA trong cây Mặt khác, trong khi GA xúc tiến sự trưởng thành sinh sản ở các loài cây Hạt trần và nhiều thực vật Hạt kín thân cỏ,

xử lí GA3 đã gây nên sự trẻ lại ở cây thường xuân và một số thực vật Hạt kín thân gỗ

1.2.3 Con đường ra hoa phụ thuộc nhiệt độ ( sự xuân hóa)

Xuân hóa là mối phụ thuộc của phát triển thực vật vào nhiệt độ Nhiệt độ lạnh có thể gia tăng hoặc cho phép tạo hoa trong nhiều loài Hiện tượng xuân hóa ở thực vật là hiện tượng cảm ứng thực vật nảy chồi hoặc ra hoa bằng xử lý

nhiệt độ lạnh (cây chỉ ra hoa sau khi trải qua một giai đoạn nhiệt độ lạnh nhất định) đặc biệt là thực vật ôn đới

Trong phản ứng xuân hóa, cơ quan tiếp nhận nhiệt độ thấp là đỉnh sinh trưởng ngọn Chỉ cần đỉnh sinh trưởng ngọn tiếp xúc với nhiệt độ thấp là đủ để gây nên sự phân hóa mầm hoa mà không cần nhiệt độ thấp ở các cơ quan khác Giới hạn nhiệt độ cho sự xuân hóa khác nhau đối với từng loại thực vật nhưng đều nằm trong khoảng từ 0ºC- 15ºC Trong khoảng nhiệt độ xuân hóa nếu nhiệt

độ càng thấp thì thời gian tiếp xúc càng ngắn

Dựa vào yêu cầu của sự xuân hóa có thể phân thực vật ra làm 3 loại:

- Cây xuân hóa tuyệt đối (thường có dạng hoa hồng): phải trải qua một thời gian nhiệt độ lạnh mới ra hoa thường là cây hai năm ( cải đường, cà rốt,…), cây nhiều năm

- Cây xuân hóa không bắt buộc (ra hoa sớm hơn nếu được tiếp xúc với nhiệt độ lạnh): lúa mạch đen Petkus ra hoa khi có 7 lá nếu hạt được tiếp xúc nhiệt độ lạnh, nhưng cần 16-25 lá nếu không được tiếp xúc với nhiệt độ lạnh

- Cây không cần xuân hóa: cây một năm không qua mùa đông, cây đa niên tượng hoa trước mùa đông Cơ quan để cây tiếp nhận kích thích của nhiệt

độ thấp là phôi hay chồi Nhiệt độ thấp là yếu tố khởi động hoạt tính phân sinh của phôi hay chồi và làm cho tất cả các chồi xuất phát từ đó cũng được xuân hóa Việc hiểu biết ảnh hưởng của nhiệt độ thấp hay hiện tượng xuân hóa đến

sự phát triển của cây có ý nghĩa trong sản xuất Bằng biện pháp xử lý nhiệt độ thấp thích hợp, người ta có thể biến lúa mì đông thành lúa mì xuân, biến cây hai năm thành cây một năm Hơn nữa, với hầu hết các loại cây trồng, việc xử lý nhiệt độ thấp hoặc bảo quản nhiệt độ thấp cho hạt giống, củ hoặc căn hành sẽ làm tăng khả năng rút ngắn thời gian sinh trưởng, xúc tiến sự ra hoa nhanh và làm tăng năng suất, phẩm chất thu hoạch

1.2.4 Quang chu kì

Sự tạo hoa đòi hỏi nhiều năng lượng được tích lũy trong quang hợp, tất

cả thực vật đều đòi hỏi ánh sáng để tạo hoa nhưng điều này khác biệt với con đường tạo hoa phụ thuộc ánh sáng, chu kì quang

Hiện tượng quang chu kì ánh sáng được khám phá bởi Tournis năm

1912, sau đó được Garner và Allard mở rộng sự quan sát trên nhiều loại cây khác trong giai đoạn 1920-1940 Sự đáp ứng của cây trồng với quang chu kì được chia thành 3 loại: Cây ngày ngắn, cây ngày dài và cây trung tính Theo quan điểm của Allard và Garner thì chu kì quang không dựa vào độ dài tuyệt đối của ngày và đêm mà nói về ngày dài hơn hay ngắn hơn độ dài tới hạn Thực vật từ ngày ngắn ra hoa được khởi đầu khi độ dài của ngày trở nên ngắn hơn so với độ dài tới hạn Đối với thực vật từ ngày dài sự ra hoa bắt đầu khi độ dài của ngày trở nên dài hơn Thực vật trung tính ra hoa trong bất kì độ dài nào của

ngày như cây hoa mõm chó ( Antirrhininum), hoa hồng ( Rose)

Cây ngày ngắn sẽ không ra hoa nếu thời gian chiếu sáng vượt quá số giờ

tới hạn xác định Như cây hoa cúc ( Chrysanthenum) sẽ không ra hoa nếu được

chiếu sáng hơn 15 giờ ( điều này có nghĩa là đòi hỏi tối thiểu 9 giờ bóng tối)

Hình 0.2 Sự ra hoa ở cây ngày ngắn và cây ngày dài

Cây ngày dài sẽ không ra hoa trừ khi nó nhận được số giờ chiếu sáng lớn

hơn một giới hạn xác định Như cây yến mạch (Avena sativa) đòi hỏi ít nhất 9

giờ chiếu sáng trong 1 ngày và nó sẽ ra hoa hầu như nhanh hơn nếu duy trì

chiếu sáng liên tục Như vậy, cây hoa cúc (Chrysanthenum sp), cây ngày ngắn

có khả năng ra hoa trong thời gian ngày sáng dài hơn so với thời gian tối thiểu cần cho cây yến mạch, một cây ngày dài

Từ những năm 40 của thế kỉ XX đã có nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng sự ra hoa và các phản ứng khác nhau đối với quang chu kì thực chất là độ dài đêm

mà không phải độ dài ngày Như vậy, với những cây ngày dài thực chất là độ dài đêm ngắn, còn cây ngày ngắn là thực vật có đêm dài Có nhiều nghiên cứu thực nghiệm cho thấy rằng những cây được cho là ngày ngắn cần có đêm tối liên tục Nếu trong thời gian tối bị lóe sáng với cường độ rất thấp (khoảng 3-5 lux) trong thời gian 3-5 phút đủ để ngăn chặn cây ngày ngắn ra hoa Thực nghiệm ngắt quãng chu kì tối bằng ánh sáng có thành phần quang phổ khác nhau đến thực vật ngày ngắn cho thấy hiệu quả nhất là các tia đỏ (660 nm) và cũng như ảnh hưởng của ánh sáng đỏ bị các tia đỏ xa (730 nm) loại bỏ

Chu kì quang được các dạng khác nhau của phytocrom cũng như các phân tử nhạy cảm đối với ánh sáng xanh (blue light) tiếp nhận Phân tử nhạy cảm ánh sáng xanh, đó là phân tử phototropin Phototropin ảnh hưởng đến phát sinh hình thái và crytocrom ảnh hưởng đến các phản ứng chu kỳ quang

1.2.4.1 Quang chu kì của cây hoa cúc

Cúc là cây ngày ngắn Hầu hết các giống cúc, việc thay đổi từ ngày dài sang ngày ngắn có ảnh hưởng đến sự ra hoa của cúc Cúc sẽ ra hoa khi độ dài đêm dài hơn thời gian tối thiểu Nếu chia một vòng đời của cây cúc thành hai đoạn là giai đoạn sinh dưỡng (từ lúc nảy mầm đến khi chẩn bị ra hoa) và giai đoạn sinh sản (từ lúc ra hoa đến khi đậu quả và chết) thì: ở giai đoạn sinh dưỡng, cây cần lượng chiếu sáng đủ lớn, kéo dài trong ngày (ngày dài) để tích

cực tổng hợp chất dinh dưỡng cho sự phát triển Quá trình chuyển đổi từ giai đoạn sinh dưỡng đến sinh sản có liên quan mật thiết đến việc chuyển từ ngày dài sang ngày ngắn

Các nghiên cứu về quang chu kì của hoa cúc được tiến hành từ rất lâu Năm 1990, công bố trên tạp chí khoa học làm vườn (Scientia Horticulturae) của Andersson và cộng sự về ảnh hưởng của cường độ và thời gian ánh sáng bổ sung đối với sự phát triển của hoa cúc Công trình cho thấy, trong trường hợp ngày ngắn (11h ánh sáng mặt trời) việc bổ sung thời lượng chiếu sáng nhân tạo làm tăng số lượng hoa và giảm thời gian sản xuất (phát triển) khi cây trong giai đoạn sinh dưỡng Đến năm 1994, Cecilia Hidén và Rolf U Larsen đã lập ra mô hình dự đoán gần chính xác sự phát triển của hoa cúc trong nhà kính dựa vào các thông số về chế độ ánh sáng và nhiệt độ Phát hiện này dựa trên hiện tượng quang chu kì của hoa cúc

Năm 2012, nghiên cứu về ảnh hưởng của chất lượng ánh sáng sử dụng trong kỹ thuật phá đêm, Higuchi và cộng sự tiến hành thử nghiệm các chế độ sáng khác nhau cho kỹ thuật này ở cúc Trong thí nghiệm này, ngày dài được duy trì 16h chiếu sáng bằng các nguồn sáng khác nhau Ngày ngắn dưới 12h chiếu sáng Ánh sáng cung cấp cho ban ngày 200 μmol.m−2.s−1 Ánh sáng cho

16 phản ứng ngắt đêm 90 μmol.m−2.s−1 Sự ra hoa có thể bị ức chế khi đêm dài bị gián đoạn bởi việc chiếu ánh sáng đỏ trong thời gian ngắn (4 tiếng vào ban đêm 23h – 3h) (night break) Sự ra hoa được theo dõi dưới chế độ ngày ngắn có bổ sung chiếu sáng với ánh sáng trắng, ánh sáng đơn sắc màu đỏ (660 nm), đỏ xa (740 nm), ánh sáng đơn sắc màu xanh (465 nm) Khi sử dụng ánh sáng trắng cho ngày ngắn, phá đêm bằng ánh sáng đơn sắc đỏ tỏ ra hiệu quả nhất, trong khi với ánh sáng đơn sắc xanh và đỏ xa thì gây ức chế ra hoa ít Ngược lại khi sử dụng ánh sáng đỏ cho ngày ngắn, sự ức chế ra hoa khi chiếu sáng bổ sung với ánh sáng đơn sắc xanh và đỏ xa cho ban đêm lại mạnh hơn Tuy nhiên, khi sử dụng ánh sáng xanh cho ban ngày, kết hợp với ánh sáng đơn

sắc xanh và đỏ, không có sự ức chế ra hoa khi phá đêm bằng ánh sáng xanh và

đỏ xa Tác giả cũng đặt ra giả thuyết : “có ít nhất 2 phức hệ phytochromes liên quan đến phản ứng ra hoa của hoa cúc” và hơn nữa, chất lượng ánh sáng cho thời gian chiếu sáng ban ngày ảnh hưởng đến chất lượng ánh sáng cần thiết cho phản ứng ngắt đêm

1.2.4.2 Gen kiểm soát sự ra hoa

Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về những gen kiểm soát quá

trình ra hoa, chủ yếu nghiên cứu trên đối tượng là cây Arabidopsis Đây là loài

cây được sử dụng phổ biến trong những nghiên cứu thực vật, là thực vật ngày dài không bắt buộc và nở hoa trong phản ứng đối với cả hai ánh sáng đỏ và ánh sáng xanh

sự ra hoa của cây cây Arabidopsis được quy định bởi bốn con đường

chính: con đường tự khiển, xuân hóa, con đường phụ thuộc GA và con đường

quang chu kì (Zeevaart et al.,2008), Song (et al., 2013)

Có hơn 80 locus liên quan đến sự ra hoa được giải mã trong bộ gen của cây Arabidopsis thông qua đột biến Nhiều gen trong số này đã được xác định chức năng, cùng với những nghiên cứu toàn bộ bộ gen đã cho ta những hiểu biết về các mô hình sinh học phức tạp qui định trong Arabidopsis (Locke et al 2006; Zeilinger et al 2006) Tùy thuộc vào thời kỳ hoạt động khác nhau trong

sự kiểm soát sự ra hoa, các gen này có thể chia thành hai nhóm là nhóm gen định dạng mô phân sinh hoa và gen định dạng cơ quan Sự sinh trưởng dinh dưỡng và sự ra hoa là hai mặt trái ngược trong cây được cân bằng bởi nhiều yếu tố Một số gen thúc đẩy sự sinh trưởng dinh dưỡng và ức chế sự ra hoa và một số gen có tác động ngược lại Do đó, có hai con đường kiểm soát sự ra hoa

là ức chế và thúc đẩy

Bảng 0.1: Các gen điều khiển quá trình ra hoa ở cây Arabidopsis

EMF Ra hoa sớm, ra hoa mà không cần sự

sinh trưởng dinh dưỡng

Sunget al., 1992

TFL Ra hoa sớm, phát hoa xác định Bradley et al., 1997

FCA Đột biến ra hoa trễ và đáp ứng rất

FPA, FVA, FY Đột biến ra hoa trễ và đáp ứng với sự

HY4 Đột biến ra hoa trễ Koornneef et al., 1980

FD, FE, FT, FWA,

GI,

Đột biến ra hoa trễ Pineiro &

Coupland,1998

LHY, CCAI Đột biến ra hoa trễ và biến

mất theo chu kỳngày/lần

Wang & Tobing,1998

3 Ảnh hưởng

nhiệt độ thấp

VRN1, VRN2,

VRN3,VRN4

Đột biến ra hoa trễ kết hợp với sự đáp ứng với sự thụ hàn

Chandler et al.,1996

Có hơn 29 đột biến ra hoa trễ trên cây Arabidopsis tuy nhiên trong tất cả

những đột biến này không có đột biến nào không ra hoa tuyệt đối Điều này cho thấy rằng sự mất chức năng trong những đột biến có thể được bổ sung bằng

những gen khác Đột biến ra hoa trễ bao gồm các gen co, fd, fe, fha, ft, fwa và

gi ít hoặc không đáp ứng với nhiệt độ thấp và kiểu hình ra hoa dưới điều kiện

ngày dàigiống như dưới điều kiện ngày ngắn Điều này cho thấy rằng nhóm này tác động theo con đường ngày dài mà thúc đẩy sự ra hoa Một số gen quan trọng trong con đường quang chu kì như COSTANS (CO), FLOWERING LOCUS T (FT) và TWIN SISTEROF FT (TSF)

Gen CO mã hóa một yếu tố phiên mã kiểu ngón tay kẽm (Ballerini,

2011; Valverde, F.(2011)) Sự thể hiện chủ yếu của CO dẫn đến sự ra hoa sớm

và những bản sao của CO có tương quan thuận với thời điểm ra hoa Điều này cho thấy rằng gen CO có vai trò thúc đẩy sự ra hoa và sự hoạt động của nó là

một yếu tố giới hạn điều chỉnh thời điểm ra hoa Ở miền Bắc nước ta , sự biểu hiện của gen CO phong phú trong cây dưới điều kiện ngày dài hơn là cây trồng trong điều kiện ngày ngắn Trong các nghiên cứu trước đã chỉ ra rằng promoter điều khiển gen CO đóng vai trò quan trọng trong việc nhận thức ngày dài và biểu hiện những quy định phức tạp mRNA CO được quy định bởi đồng hồ sinh học và protein CO được ổn định bằng ánh sáng và suy thoái bởi bóng tối Các promoter điều khiển gen CO là một thành phần quan trọng trong việc thúc đẩy quá trình ra hoa ở cây ngày dài Protein CO là sản phẩm của thời gian chiếu

sáng ở ngày dài và kích hoạt FT và TSF phiên mã (Tiwari et al,2010) Độ dài ngày ảnh hưởng trực tiếp đến sự tích lũy FT mRNA (Imaizumi et al 2003; Corbesier et al 2007) Ngược lại với FT, CO mRNA có thể dễ dàng phát hiện

trong cả ngày ngắn và ngày dài

Gen FT và TSF biểu hiện ở lá và trụ dưới lá mầm , protein của nó sẽ di chuyển lên mô phân sinh đỉnh chồi ( SAM) (Yamaguchi, 2005).Tại các mô phân sinh chồi , gen FT và TSF tạo thành một phức hợp với FLOWERINGLOCUS D (FD) và tăng điều tiết ở mô phân sinh hoa đến gen

APETALA1 để phát triển thành nụ hoa (Abe et al, 2005).Nói chung, chức

năng của gen FT giống nhau ở đa số các loài thực vật nhưng có biểu hiện khác nhau ở từng loài

Hình 0.3: Con đường quang chu kỳ điều khiển sự ra hoa ở cây Arabidopsis

Một số thí nghiệm trên cây Arabidopsis chỉ ra rằng FT mRNA nhiều hơn

ở trong lá đặc biệt là ở lá mầm và trong lá già hơn là ở đỉnh chồi (Wigge et

al.,2005), thí nghiệm này cũng được lặp lại với đối tượng là cây rau bina cũng

cho kết quả tương tự (Erika Abe et al., 2014) Khác với thí nghiệm ở gen FT,

thí nghiệm biểu hiện quá mức ở một mô cụ thể đã cho thấy rằng CO không có hiệu quả khi chỉ ở chồi đỉnh, trong khi đó biểu hiện quá mức đặc hiệu ở những

tế bào chuyên biệt trên lá có tác dụng tương tự như biểu hiện quá mức ở mọi nơi

(An et al 2004; Ayre and Turgeon 2004;Corbesier et al 2007) Thí nghiệm ngược

lại, biểu hiện quá mức ở mô cụ thể FT gây ra hoa sớm, cho dù điều này xảy ra

trong các tế bào chuyên biệt ở lá và thân cây hoặc đỉnh chồi (An et al 2004)

Một minh chứng cụ thể khi nghiên cứu điều khiển sự ra hoa của cây

Arabidopsis(hình 1.3) cho thấy: khi lá nhận đúng quang chu kỳ sẽ kích thích

nhóm gen CO tăng biểu hiện → gen T Locus Flowerring (kí hiệu FT) tạo sản

phẩm là một loại protein có khối lượng 20 kDa, protein này sẽ di chuyển theo

mạch đến mô phân sinh đỉnh, hoạt hóa sự biểu hiện nhóm gen LFY, nhóm gen này hoạt động chuyển mô phân sinh đỉnh thành hoa

Sự ra hoa không chỉ phụ thuộc vào thời gian chiếu sáng mà nó còn được qui định bởi chất lượng ánh sáng (Sang Yeol Kim, 2008) Các chất nhận ánh sáng đỏ, ánh sáng xanh và phytocrom và crytocrom điều hòa tương ứng sự ra hoa theo con đường gen CO Co được ổn định bằng ánh sáng xanh , đỏ xa hay trắng bởi phytocrom A và crytocrom nhưng xuống cấp dưới ánh sáng đỏ bởi

phytocrom B hay trong bóng tối (Valverde et al., 2004).Nhiều nghiên cứu chỉ

ra rằng cây trồng dưới điều kiện làm giàu ánh sáng đỏ xa chứa hàm lượng mRNA CO cao hơn cây trồng dưới ánh sáng trắng (Sang Yeol Kim, 2008)

Tỷ lệ thấp ánh sáng đỏ: đỏ xa được cảm nhận bởi phytocrom trong tế bào cảm quang gây ra một loạt những phản ứng gồm kéo dài thân và cuống lá, giảm bớt nhánh và ra hoa sớm

Hình 0.4: Ảnh hưởng của ánh sáng đỏ và đỏ xa đến sự ra hoa của cây ngày ngắn và cây

ngày dài

Bổ sung ánh sáng đỏ trong chu kì tối sẽ kích thích tạo hoa ở cây ngày dài

và ức chế sự tạo hoa ở cây ngày ngắn, còn ánh sáng đỏ xa có tác dụng ngược lại tức là ức chế sự ra hoa ở cây ngày dài và kích thích sự tạo hoa ở cây ngày

Cây ngày ngắn

( đêm dài)

Cây ngày dài

(đêm ngắn)

ngắn Các tác dụng giàu ánh sáng đỏ xa (FREL) về thời gian ra hoa đã được

nghiên cứu trên cây Arabidopsis hoang dại cũng như những dòng chứa đột biến

trong con đường ra hoa tự khiển hay gen trong con đường quang chu kì (Martinez-Zapater and Somerville,1990; Eskins, 1992; Bagnall, 1993; Lee and Amasino,1995; Cerdan and Chory, 2003) Ở mức độ phân tử về cách FREL thúc đẩy quá trình ra hoa còn chưa rõ ràng nhưng tỷ lệ thấp ánh sáng đỏ: đỏ xa được

biết là làm tăng biểu hiện của FT (Cerdan & Chory, 2003; Halliday et al., 2003)

Đã có rất nhiều nghiên cứu nhằm đánh giá biểu hiện hoạt động của gen

CO và FT cũng như một số gen đồng dạng của hai gen này trên các đối tượng

thực vật khác nhau như trên cây rau bina (Erika Abe et al., 2014), trên cây mô hình Arabidopsis (Wigge et al.,2005; Cheng et al, 2005; …), cây lúa (Ryosuke Hayama et al, 2003)

1.3 TỔNG QUAN VỀ ĐÈN LED

1.3.1 Giới thiệu về đèn LED

Đi-ốt phát quang (LED) là nguồn sáng bán dẫn, sẽ cung cấp lượng ánh sáng đơn sắc (1/2 chiều rộng dài sóng khoảng 30 nm) khi có dòng điện một chiều chạy qua nó LED đầu tiên được phát minh bởi Texas Instrument vào năm 1960 Tại thời điểm đó cường độ sáng của LED còn rất thấp và chỉ có ánh sáng đơn sắc đỏ Sau này cường độ sáng của LED đã tăng lên rất nhiều và biên

độ dải màu cũng tăng theo (đỏ, cam, vàng, xanh lá, xanh dương, trắng,…)

Đến những năm cuối thế kỷ 20 và đầu thế kỷ 21, đèn LED tạo nên một cuộc cách mạng nhanh chóng, đem lại nhiều tiện dụng cho các thiết bị kỹ thuật

số và một dãy các thiết bị mới đa chức năng, như tín hiệu ra vào, đèn nổi, đèn giao thông, đèn vòm, đèn tường, đèn dưới nước, đèn ngoài trời Trong những năm gần đây, LED mới thực sự được quan tâm như là một nguồn bức xạ cho thực vật do tiềm năng ứng dụng thương mại của nó rất lớn (Nhut, 2002)

Hình 0.5: Hình ảnh đèn Led và đèn Led sử dụng trong nuôi cấy mô

1.3.2 Ảnh hưởng của ánh sáng LED đến sự phát triển của thực vật

Trong những năm gần đây, ánh sáng đèn Led là nguồn chiếu sáng nhân tạo đang được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô thực vật cũng như ngoài nhà lưới Đèn Led có thể khắc phục được một số hạn chế khi sử dụng đèn huỳnh quang như quang phổ phát ra từ đèn huỳnh quang ngoài vùng ánh sáng đỏ và xanh có hiệu quả với khả năng quang hợp của cây thì vẫn còn một tỉ lệ lớn các vùng quang phổ xanh lá cây và vàng gây lãng phí năng lượng Cùng với sự phát triển của công nghệ chiếu sáng LED, nhiều loài cây đã được khảo sát khả năng sinh trưởng và phát triển dưới điều kiện chiếu sáng LED

Khi bổ sung 10% ánh sáng đèn huỳnh quang xanh vào ánh sáng LED đỏ

đã cho trọng lượng khô và sản lượng hạt của cây Lúa mì gần với cây sinh trưởng

và phát triển dưới điều kiện ánh sáng trắng (Goins, 1997) Moreira da Silva và Debergh (1997) đã đánh giá ảnh hưởng của tỷ lệ ánh sáng xanh/đỏ cao (2,3), thấp (0,9) và tỷ lệ ánh sáng đỏ/đỏ xa cao (1,1), thấp (0,6) lên sự phát triển chồi

cây Azorina vidalii Seeds trong nuôi cấy in vitro Chiều cao, chiều dài đốt thân, diện tích lá của cây Azorina vidalii Seeds đạt cao nhất khi nuôi cấy dưới tỷ lệ

thấp ánh sáng đỏ/đỏ xa Tuy nhiên, tỷ lệ chồi bất định phát sinh trong điều kiện này lại rất thấp Ánh sáng xanh khi phối hợp với ánh sáng đỏ ở các tỷ lệ dù cao hay thấp cũng ức chế sự phát triển chiều cao, chiều dài đốt thân cũng như diện tích lá (Moreira da Silva 1997)

emitting_diode#/media/File:RBG-LED.jpg

Nguồn:https://en.wikipedia.org/wiki/Light-Mặc dù ánh sáng xanh ức chế sự phát triển chiều cao cây nhưng nếu thiếu ánh sáng xanh trong quá trình sinh trưởng thì thân và cuống lá của cây con kéo dài bất thường Sự tăng trưởng bình thường của cây rõ ràng có liên quan đến sự hiện diện của loại ánh sáng này Ánh sáng xanh dường như tương tác với hệ thống phytochrome hoặc thông qua một thụ quan ánh sáng xanh, gây ra các phản ứng của thực vật (Rajapakse 1999)

Trong nước cũng đã có một số nghiên cứu về ảnh hưởng của đèn Led đến sự sinh trưởng và phát triển của thực vật Cây Dâu tây tăng trưởng khỏe mạnh khi nuôi cấy dưới nhiều tỷ lệ đỏ/xanh khác nhau, nhưng chúng tăng trưởng tốt nhất ở điều kiện 70% ánh sáng LED đỏ và 30% ánh sáng LED xanh

(Nhut et al., 2003a) Mặc khác, cây Chuối, Eucalyptus citriodora, Phalaenopsis

tăng trưởng tốt dưới điều kiện 80% ánh sáng LED đỏ và 20% ánh sáng LED

xanh (Nhut et al., 2000; 2002a; 2002b; 2003b)

Ngoài việc tăng năng suất thu hoạch rau, quả, hoa, nếu thay đèn compact bằng đèn LED chúng ta có thể tiết kiệm trên 50% lượng điện tiêu thụ ( Phan Hồng Khôi và cộng sự 2011, 2012)

1.3.3 Ưu, nhược điểm của đèn LED

Đèn LED có các ưu điểm vượt trội so với các loại đèn truyền thống như tuổi thọ cao, tiết kiệm năng lượng Mặt khác khả năng tạo màu và tính uyển chuyển trong việc tích hợp với các hệ thống chiếu sáng và hiển thị mới đem lại cho chúng những giá trị độc đáo

Tuổi thọ của đèn Led cao: từ 20 000- 100 000 giờ chiếu sáng trong khi

đèn sợi đốt là 1000 giờ và đèn huỳnh qung có tuổi thọ 8000 giờ

Dải màu: Led có nhiều dải màu gồm cả ánh sáng trắng Ánh sáng trắng

có thể được tạo ra khi hòa trộn Led đỏ, xanh lơ và xanh lục Thay vào đó, thông qua việc kết hợp một cách sáng tạo các Led có dải màu sắc khác nhau, ảnh hưởng thay đổi màu có thể tạo ra từ một vật cố định đơn giản nhờ sự hoạt hóa động lực của các phần khác nhau của Led

Không phát ra tia UV và tia hồng ngoại: Led không tạo ra tia UV, tạo ra

rất ít nhiệt và hầu như không làm nóng môi trường xung quang, do đó làm giảm nhu cầu sử dụng hệ thống làm lạnh Ánh sáng Led không gây chói, mỏi mắt

Độ bền: Đèn LED có độ bền rất cao vì nó không có dây tóc nên ít bị hư

hỏng do va chạm và dao động Mặt khác, đèn LED thường được chế tạo từ vật liệu polyme nên không vỡ giúp vận chuyển dễ dàng

Kích thước nhỏ và dễ thay đổi linh hoạt trong thiết kế: Một LED đơn lẻ

rất nhỏ và tạo ra ít ánh sáng toàn bộ Tuy vậy, điểm yếu thực sự là thế mạnh của nó Các LED có thể gắn với nhau thành bất cứ hình dạng nào tạo nên một loạt kiện lumen mong muốn Thêm nữa, LED có thể thu nhỏ hỗn hợp ánh sáng; kiểm soát sự phân phối ánh sáng nhờ các thấu kính epoxy, đơn giản hóa cấu trúc của hệ đèn LED Một thiết bị kiểm soát có thể được gắn với phức hợp đèn LED để làm mờ một cách chọn lọc các đèn LED độc lập, dẫn đến việc kiểm soát phân phối động lực, lượng và màu của ánh sáng

Nhược điểm của đèn LED:Ít sự lựa chọn, chất lượng ánh sáng, tiêu chuẩn

hóa sản phẩm, giá thành cao

Rõ ràng đèn LED có rất nhiều ưu điểm và chính những đặc trưng đó đóng vai trò quan trọng trong việc lựa chọn nguồn sáng nhân tạo giúp cây trồng sinh trưởng tối ưu Với khả năng phát xạ các quang phổ tùy chọn, các nguồn sáng LED có thể tùy biến để phù hợp với yêu cầu của từng loại cây trồng và cho phép điều chỉnh ánh sáng theo từng thời kỳ sinh trưởng của cây Có thể nói LED cho phép điều khiển các tính năng của ánh sáng mà các công nghệ chiếu sáng truyền thống không thể làm được

1.4 CÁC NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ẢNH HƯỞNG CỦA ĐỘ DÀI THỜI

GIAN CHIẾU SÁNG ĐẾN QUANG CHU KỲ CỦA THỰC VẬT

Cây họ cúc Chrysanthemum đã được nghiên cứu kỹ lưỡng và được phân

loại là cây ngày ngắn, tức là chỉ ra hoa khi độ dài của ngày ngắn hơn khoảng 13,5 giờ, hay nói cách khác là đêm dài hơn 10,5 giờ (tùy theo loại Cúc) Như vậy ở Viêt nam, cây Cúc sẽ không ra hoa trong khoảng từ tháng 5 đến tháng 8,

và có thể ra hoa trong những tháng còn lại Vấn đề là ở chỗ, để cây cúc chậm ra hoa, có thời gian dài hơn để sinh trưởng, nhất là vào mùa đông khi cây cúc rất

dễ ra hoa, người ta dùng chiếu sáng nhân tạo để ức chế sự ra hoa của cây cúc Các giải pháp điều khiển này đã được nghiên cứu rất nhiều trên thế giới, chủ yếu dựa trên hai phương pháp: chiếu sáng bổ sung kéo dài ngày và dùng ánh sáng đặc biệt để phá đêm Để kéo dài ngày cho cây cúc thương mại quan trọng (Dendranthema grandiflora), người ta dùng đènsợi đốt hoặc đèn huỳnh quang chiếu khoảng 4- 6 giờ một từ ngày, nhưng cũng có thể dùng phương pháp phá đêm dùng ánh sáng đo trong khoảng vài chục phút để ức chế hoàn toàn sự ra hoa Việc ứng dụng phương pháp phá đêm phụ thuộc vào đặc tính quang chu

kỳ của từng loại cây, độ nhạy phá đêm phụ thuộc vào cấu trúc phổ của ánh sáng, thông lượng ánh sáng hấp thụ bởi sắc tố thực vật Phytochrome PC, thời điểm chiếu sáng trong đêm và độ dài chiếu sáng Học thuyết được chấp nhận rộng rãi nhất điều chỉnh quá trình ra hoa của thực vật dưới tác dụng của ánh sáng là học thuyết dựa trên tế bào nhạy quang Phytochrome (PC) do Hendrick

và Borthwick đề xuất Phytochrome là loại sắc tố có hai trạng thái, Pfr và Pr, trạng thái Pfr là trạng thái kích hoạt, còn trạng thái Pr là trạng thái ức chế Hai trạng thái này của một loại sắc tố gọi là trạng thái đồng phân, tức là có thể luân chuyển tương hỗ sang nhau khi hấp thụ ánh sáng có bước sóng thích hợp Trạng thái ức chế Pr sẽ chuyển sang trạng thái kích hoạt Pfr khi Phytochrome hấp thụ ánh sáng đỏ R (660 nm), ngược lại, Phytochrome khi ở trạng thái Pfr có thể chuyển lại trạng thái Pr khi hấp thụ ánh sáng FR (730nm), hoặc để lâu trong bóng tối Phytochrome có mặt trong lá cây từ lúc bắt đầu nảy mầm, trong khi

đó diệp lục phát triển dần dần khi được chiếu sáng Quá trình sinh trưởng của cây tiếp tục cho đến khi chuyển sang giai đoạn sinh sản, mà ánh sáng đóng một vai trò quan trọng đối với các loại cây nhạy sáng, trong trường hợp này là cây hoa Cúc Có bốn thông số chiếu sáng đóng vai trò quan trọng trong tương tác của thực vật với ánh sáng, đó là cấu trúc phổ của ánh sáng, cường độ chiếu sáng, thời gian và thời điểm chiếu sáng Các thông số này không hoàn toàn độc

lập mà phụ thuộc lẫn nhau một cách tương đối, vì vậy để có thể nghiên cứu được một cách toàn diện tác động của ánh sáng vào quy trình quang hợp và hiện tượng quang chu kỳ của một giống thực vật nào đó cần rất nhiều thời gian thí nghiệm

Các kết quả nghiên cứu tại Việt Nam

Tại Việt nam, một số nghiên cứu về sử dụng ánh sáng điều khiển ra hoa của cây hoa cúc có thể được tóm tắt như sau Năm 2011, tác giả Đặng Thị Tố Nga và các đồng nghiệp (Đại học Thái nguyên) đã sử dụng bóng đèn sợi đốt 100

W chiếu bổ sung 4 giờ 1 đêm, t 22 giờ đêm đến 2 giờ sáng, mật độ 5 m2/bóng,

đã tăng chiều cao của cây hoa khoảng 25 cm Năm 2012, Công ty Bóng đèn Phích nước Rạng Đông đã sử dụng các loại đènkhác nhau như đèn sợi đốt, đèn compact, đèn phóng điện cao áp (HID) tiến hành chiếu sáng bổ sung với cây hoa Cúc (pha lê vàng Hà nội và đại đóa Đà lạt), trong khoảng thời gian 4 tiếng Kết quả cho thấy, tỷ lệ ra hoa của công thức không chiếu sáng bổ sung là 73%, trong khi các công thức khác là hoàn toàn không xuất hiện hoa Vài năm gần đây, những người trồng hoa ở Đà lạt đã biết sử dụng các loại nguồn sáng khác nhau

để chiếu sáng bổ sung cho cây hoa Cúc, nhằm ngăn cản không cho cây ra hoa sớm khi còn chưa trưởng thành, đồng thời điều khiển cho cây Cúc ra hoa đúng những thời kỳ quan trọng nhất như những ngày lễ, ngày Tết

Trong nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng đèn LED bổ sung vào ban đêm lên

sự sinh trưởng và phát triển của hoa Cúc, các tác giả Dương tuấn Nhựt và Nguyễn Bá Nam (2013) đã sử dụng đènLED có công suất 10 để thay thế bóng đèn compact Việc sử dụng đènLED không chỉ giảm công suất tiêu thụ điện năng uống 50% mà còn giúp cây sinh trưởng mạnh hơn so với đèncompact Tóm tắt lại, quá trình sử dụng kỹ thuật chiếu sáng bổ sung để ức chế sinh sản (ra hoa) ở Việt nam đã trải qua các giai đoạn sau đây:

- Giai đoạn tự phát (trước 2010): sử dụng đènsợi đốt 75-100 W chiếu sáng 4-6 giờ mỗi đêm

- Các nhà sản xuất đèn (Cty Rạng Đông, Điện quang 2011): sử dụng đèn compact 20 W chiếu sáng 4-6 giờ mỗi đêm, tiết kiệm khoảng lần điện năng

- Chương trình quốc gia về sử dụng năng lượng tiết kiệm cùng các đơn vị Công ty Rạng Đông, Viện Sinh học Tây nguyên (2012): thử nghiệm dùng đènCFL hai phổ và LED tăng trưởng chiếu sáng 5 giờ mỗi đêm cho cây hoa Cúc, tiết kiệm thêm 0% đến 50% so với đèn CFL thông thường

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu thực vật

Cây hoa cúc giống cúc vàng pha lê trồng tại Trại thực nghiệm Sinh học Cổ Nhuế, được chiếu sáng phá đêm bằng hệ thống đèn Led do phòng Công nghệ tế bào Thực vật cung cấp

đo nano drop và một số máy móc dụng cụ, thiết bị khác của các hãng

Hóa chất: Sử dụng các loại phân bón vi sinh để bón cho cây hoa Các hóa chất như Trizol, ethanol, isopropanol, isoamyl, chloroform, Master mix, bộ kit tổng hợp cDNA, thang marker chuẩn… được cung cấp bởi các hãng hóa chất

uy tín và chất lượng trên thế giới như Thermo Fisher, sigma…

Bảng 2.1: Trình tự nucleotide các cặp mồi sử dụng

Mục đích Tên mồi Trình tự nucleotide (5’-3’)

MTP-R ATCTATCTCTCGTGGGGTGCTTT Phân lập gen CO CS-CO- F AAGGTTGAAGTTCGTGGTGG

CS-CO- R TACCTCAACACCCTTGCCTC Đánh giá biểu hiện gen CO CO -F TGGGTGTGTGAAGCTTGTGA

CO- R CCTAGGCCTATGACGGACCT Đánh giá biểu hiện gen FT FT- F AGGGAAGTTGCTAACGGGTG

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Đánh giá ảnh hưởng của đèn LED đến sự sinh trưởng phát

triển của cây hoa cúc

Mầm sống của cây hoa cúc được sử dụng làm nguyên liệu để trồng thí nghiệm Tất cả phần mái và khung sắt bao quanh đều được che bằng lưới trắng để chống côn trùng gây hại, đồng thời có chức năng tán xạ ánh sáng mặt trời chiếu thẳng Khu vực xung quanh được cách ly với khu dân cư và hoàn toàn không có ánh sáng nhân tạo vào ban đêm Nhà thực nghiệm được chia thành 16 ô thí nghiệm, mỗi ô có kích thước 2m*2,5m Các ô thí nghiệm được che ánh sáng xuất phát

từ các nguồn sáng treo ở các ô bên cạnh nhờ có các tấm bạt màu trắng cao 2m

sử dụng làm tấm cách ly giữa hai phía Thời gian chiếu sáng và đèn thí nghiệm được bố trí theo sơ đồ:

Bảng 2.2: Sơ đồ bố trí đèn trong các ô thí nghiệm

TT Ký hiệu ô Tên đèn Thời gian chiếu Chế độ chiếu

Mục đích của chiếu sáng bổ sung là giảm thời gian tối của mỗi ngày chứ không phải là kéo dài thời gian chiếu sáng liên tục vì vậy nếu chiếu sáng thực hiện vào lúc nửa đêm để chia cắt thời gian tối liên tục thành hai giai đoạn tối, đồng thời cũng là để tăng số giờ chiếu sáng thì hiệu quả hơn nhiều Nguyên tắc xác định thời gian chiếu sáng bổ sung là làm cho thời gian tối liên tục trong đêm mỗi đoạn ngắn hơn 7 h

Điều kiện nuôi trồng: các ô thí nghiệm được trồng trong nhà lưới chống

côn trùng chế độ chăm sóc và phân bón như nhau

Sau khi trồng 10 ngày bắt đầu thời gian chiếu sáng phá đêm

Thời gian chiếu sáng 25 ngày, sau đó dừng chiếu sáng để cây tiếp tục phát triển và ra hoa

Chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hại: sau 3 ngày phun thuốc diệt nấm bệnh, cách 15 ngày phun thuốc trừ sâu và nấm 1 lần

Quan sát và đánh giá sự sinh trưởng và phát triển của cây hoa cúc sau khi trồng 40, 70, 100 ngày tuổi

Song song với việc đánh giá quá trình sinh trưởng của cây, tiến hành thu mẫu lá non ở các dàn đèn để nghiên cứu hoạt động của gen điều khiển quá trình

ra hoa Các mẫu được thu và cất giữ trong tủ -80 đến khi sử dụng

2.2.2 Phương pháp thu mẫu và tách chiết RNA

Bắt đầu thu mẫu hoa cúc sau khi ngừng chiếu đèn 1 tuần, mỗi tuần thu mẫu một lần đến khi cây hoa cúc bắt đầu xuất hiện nụ thì dừng việc thu mẫu Thời điểm thu mẫu vào lúc xế chiều khi chuẩn bị bắt đầu chu kì tối

Bảng 2.3: Kí hiệu mẫu thí nghiệm

Mẫu sau khi thu được bảo quản trong tủ âm 80ºC trước khi sử dụng làm thí nghiệm tiếp theo

Tất cả dụng cụ dùng để tách chiết RNA đều được khử trùng bằng dung dịch DEPC 0,1% để tránh nhiễm RNase từ dụng cụ

Quy trình tách chiết RNA được thực hiện theo các bước sau: Cân 100 mg mẫu, nghiền nhanh bằng nitơ lỏng Bổ sung 1ml Trizol đảo đều trong 5 phút

Bổ sung tiếp 200 µl chrolofrom: isoamyl (v/v: 24:1) và đảo đều Li tâm dịch