Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên hemagglutinin (HA) tái tổ hợp của virus cúm AH5H1 và đánh giá tinh sinh miễn dịch trên gà

Xuất phát từ yêu cầu và cơ sở khoa học trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên hemagglutinin HA tái tổ hợp của virus cúm A/H5N1 và đánh giá tính sinh miễn dị

1

MỞ ĐẦU

Virus cúm thể độc lực cao (Highly pathogenic avian influenza - HPAI)

H5N1 thuộc type A, họ Orthomyxoviridae, là chủng có khả năng gây tử vong cao

trên 50% gia cầm bị nhiễm Dịch cúm gia cầm H5N1 đã xuất hiện ở nhiều quốc gia châu Á, châu Âu, châu Phi và đang thực sự là mối đe dọa nghiêm trọng đối với toàn cầu Từ khi dịch cúm gia cầm H5N1 xuất hiện tới nay, thế giới đã có hơn 250 triệu gia cầm bị tiêu hủy, gây thiệt hại nặng nề về kinh tế cho ngành chăn nuôi Đặc biệt, không chỉ gây bệnh trên gia cầm, virus cúm A/H5N1 còn có khả năng lây truyền từ gia cầm sang người Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế gới, từ tháng 01/2003 đến tháng 12/2016 đã có 856 trường hợp mắc cúm A/H5N1, trong đó 452 trường hợp tử vong, chiếm 52,8% (www.wpro.who.int/emerging_diseases/AvianInfluenza/en) Với độc lực mạnh, khả năng đột biến lớn, số lượng các vật chủ không ngừng tăng lên, virus H5N1 trở thành mối đe dọa về một đại dịch xảy ra trên toàn cầu Do đó, việc nghiên cứu tìm ra biện pháp dự phòng và điều trị virus cúm A/H5N1 là vô cùng cấp bách

Dịch cúm gia cầm A/H5N1 bùng phát tại Việt Nam vào cuối năm 2003 ở các tỉnh phía Bắc, sau đó đã nhanh chóng lan tới hầu hết các tỉnh/thành trong cả nước chỉ trong một thời gian ngắn, hàng triệu gia cầm bị chết và tiêu hủy gây thiệt hại rất lớn về mặt kinh tế cho ngành chăn nuôi Sử dụng vắc xin cho gia cầm được xem là một trong những biện pháp hữu hiệu nhất để ngăn chặn sự lan truyền của virus cúm

và giảm thiểu những thiệt hại do virus cúm gây ra đối với ngành chăn nuôi Hai loại vắc xin thương mại đã được sử dụng rộng rãi trên thế giới để tiêm phòng cho gia cầm là vắc xin bất hoạt và vắc xin sống nhược độc sử dụng vector virus làm dẫn truyền Cúm A/H5N1 vẫn là vấn đề có tính thời sự ở Việt Nam, tuy vắc xin phòng cúm A/H5N1 đã được ứng dụng hơn 10 năm, nhưng hằng năm dịch bệnh vẫn xảy ra

và hiện nay có nguy cơ các phân type mới (H5N6, H5N2, H7N9) xâm nhập Virus cúm gia cầm biến đổi liên tục tạo nên những clade mới nên việc tiếp tục nghiên cứu

để có được công nghệ sản xuất vắc xin hiệu quả hơn, dễ tự động hóa hơn, cho phép

2

thích ứng nhanh với biến thể virus mới là hết sức cần thiết Các nhà khoa học đang

nỗ lực nghiên cứu tạo ra các loại vắc xin khác như vắc xin dưới đơn vị, vắc xin DNA, vắc xin sống nhược độc để đáp ứng yêu cầu phòng chống dịch cúm gia cầm một cách triệt để Việc nghiên cứu sản xuất kháng nguyên HA để tạo vắc xin dưới đơn vị góp phần đa dạng hóa công nghệ sản xuất vắc xin; không phụ thuộc vào nguồn cung cấp phôi trứng gà; cho phép phân biệt gia cầm tiêm vắc xin và gia cầm nhiễm bệnh ngoài môi trường bằng giám sát huyết thanh; có thể sản xuất được trong một thời gian ngắn, đáp ứng yêu cầu phòng chống dịch bệnh khi có biến chủng xảy

ra Xuất phát từ yêu cầu và cơ sở khoa học trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên hemagglutinin (HA) tái tổ hợp của virus cúm A/H5N1 và đánh giá tính sinh miễn dịch trên gà” với các mục tiêu:

- Biểu hiện kháng nguyên HA tái tổ hợp của virus cúm A/H5N1

- Đánh giá tính sinh miễn dịch trên gà của protein HA tái tổ hợp, làm cơ sở

để tạo vắc xin phòng cúm A/H5N1

Nội dung nghiên cứu của đề tài

(1) Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên HA trong hệ biểu hiện E coli BL21

- Biểu hiện gen ha1, ha1-2 trong tế bào E coli BL21

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố nhiệt độ, IPTG đến biểu hiện gen

- Tinh chế và kiểm tra tính kháng nguyên của protein tái tổ hợp

(2) Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên HA trong tế bào nấm men P pastoris

- Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên HA dưới dạng dung hợp với Trx có vị trí cắt của thrombin (T) và enterokinase (E) (Trx-TE-HA)

- Nghiên cứu cải biến mã bộ ba và biểu hiện kháng nguyên HA1 trong nấm

men P pastoris

- Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên HA dưới dạng dung hợp trx không có trình tự cắt của enterokinase và thrombin

(3) Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố lên quá trình biểu hiện protein HA tái

tổ hợp; lên men và thu hồi protein HA tái tổ hợp

(4) Đánh giá tính sinh miễn dịch trên gà của protein HA tái tổ hợp

3

Đóng góp mới của luận án

Luận án là công trình mới ở Việt Nam nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên

HA tái tổ hợp của virus cúm A/H5N1 trong E coli và nấm men P pastoris, làm cơ

sở để tạo vắc xin phòng cúm A/H5N1 Từ các cấu trúc thiết kế biểu hiện gen khác nhau, với nhiều chủng biểu hiện và điều kiện biểu hiện khác nhau chúng tôi đã

chọn được chủng nấm men P pastoris SMD1168 biểu hiện TrxHA1 Sản lượng

HA được tổng hợp trong nồi lên men đạt 84 mg/l Hiệu giá HI trung bình huyết thanh gà sau 2 tuần gây miễn dịch nhắc lại với 100 g TrxHA1 tái tổ hợp qua đường tiêm dưới da cổ đạt 7-7,2 log2, hiệu giá HI sau 2 tuần gây miễn dịch nhắc lại bằng đường nhỏ mắt mũi đạt 6,6 - 7,0 log2 Hiệu giá HI huyết thanh gà gây miễn dịch với protein HA tái tổ hợp tương đương với hiệu giá HI huyết thanh gà tiêm vắc xin bất hoạt Re-1

4

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ VIRUS CÚM A/H5N1

1.1.1 Cấu trúc virus cúm A

Virus cúm thuộc họ Orthomyxoviridae, gồm 3 type A, B, C trong đó virus

cúm type A có nhiều type huyết thanh khác nhau và chủ yếu gây bệnh cho người, động vật như chim, gia cầm, lợn Các hạt virus cúm A (virion) có hình cầu hoặc hình khối đa diện, đường kính 80 -120 nm, đôi khi cũng có dạng hình sợi, khối lượng phân tử khoảng 250 triệu Da (Hình 1.1A) Kết quả phân tích thành phần hóa học của virion cho thấy RNA chiếm khoảng 0,8 - 1,1%, protein chiếm khoảng 70 - 74%; lipid 5 - 8% còn lại là carbonhydrate Hạt virus có cấu tạo đơn giản gồm vỏ (capsid), vỏ bọc ngoài (envelope) và lõi là RNA sợi đơn âm Hệ gen virus cúm A, B có

8 sợi RNA âm (PA, PB1, PB2, HA, NA, M, NP và NS) tổng kích thước khoảng 9 kb

mã hóa cho 15 loại protein khác nhau (Hình 1.1B) (Palese, 2007; Amorij, 2008)

Hình 1.1: Hình thái và cấu trúc virus cúm A

(Nguồn: WHO; Amorij, 2008) Các đoạn PA, PB1, PB2 mã hóa các enzyme trong phức hợp polymerase (RNA transcriptase) của virus, có độ dài ổn định và có tính bảo tồn cao Phân đoạn

HA và NA (neuraminidase) mã hóa cho protein bề mặt của virus Hai protein này có tính kháng nguyên đặc trưng cho từng chủng virus cúm A Đoạn NP mã hóa cho

5

nucleoprotein (NP) - thành phần của phức hệ phiên mã, chịu trách nhiệm vận chuyển RNA giữa nhân và bào tương tế bào chủ Phân đoạn M mã hóa cho protein đệm - matrix protein của virus gồm hai tiểu phần M1 và M2 được tạo ra bởi những khung đọc mở khác nhau của cùng một phân đoạn RNA Protein M1 là một protein nền, thành phần chính của virus có chức năng bao bọc RNA tạo nên phức hợp ribonucleoprotein và tham gia vào quá trình “nảy chồi” của virus Protein M2 là chuỗi polypeptide ngắn, có khối lượng phân tử khoảng 11 kDa, protein M2 đâm xuyên và nhô ra khỏi vỏ ngoài, chịu trách nhiệm tháo vỏ virus giải phóng hệ gen virus vào bào tương tế bào chủ trong quá trình xâm nhiễm (Palese, 2007; Bouvier, 2008; Neumann, 2009)

Hiện nay, các nhà khoa học đã phát hiện ra 18 loại kháng nguyên HA H18) và 11 loại kháng nguyên NA (N1-N11) (Tong, 2013) Trong lịch sử ghi nhận chỉ phân type H1, H2, H3 và N1, N2 gây bệnh cho người Gần đây phân type H5, H7, H9 cũng gây bệnh cho người với mức độ nguy hiểm hơn (Li, 2015; Bui, 2016) Bệnh dịch do chủng H5N1 gây ra có khả năng lây lan rất cao ở các động vật lông vũ, gây chết hàng loạt ở chim và gia cầm (Webster, 2002; Schrauwen, 2014; Webster, 2014)

(H1-1.1.2 Chu trình tái bản của virus cúm A

Quá trình xâm nhiễm và nhân lên của virus xảy ra chủ yếu ở các tế bào biểu

mô đường hô hấp, đường tiêu hóa của cơ thể vật chủ (Nicholson, 2003; Palese, 2007; Neumann, 2009; de Graaf, 2014) Các giai đoạn của quá trình xâm nhiễm như sau (Hình 1.2):

Giai đoạn 1 - giai đoạn hấp phụ: các hạt virus gắn với tế bào chủ thông qua

liên kết giữa các phân tử HA với các thụ thể có chứa nhóm sialic acid trên bề mặt tế bào chủ Virus cúm gia cầm gắn đặc hiệu với thụ thể sialic acid α 2-3 galactose (SAα2-3Gal) còn virus cúm người gắn đặc hiệu với thụ thể sialic acid α 2-6 galactose (SAα2-6Gal) (de Graaf, 2014) Do có tính đặc hiệu với thụ thể nên virus cúm gia cầm không thể dễ dàng lây nhiễm sang người và ngược lại, hình thành rào cản loài, thu hẹp khả năng lây nhiễm của virus trên một hoặc một số vật chủ nhất

6

định Ở một số động vật (như lợn, gà ) có cả hai loại thụ thể nên có thể bị nhiễm

cả virus cúm gia cầm và virus cúm người (Schrauwen, 2014; Neumann, 2015)

Hình 1.2: Chu trình xâm nhiễm và sao chép của virus cúm A

(Nguồn: Neumann, 2009) Trong cơ thể vật chủ cảm nhiễm, khả năng bám gắn và gây bệnh của virus cúm còn tùy thuộc vào từng mô cơ quan Nhìn chung, virus cúm A có tính thích ứng lây nhiễm với biểu mô đường hô hấp và gây bệnh chủ yếu ở đường hô hấp (de Graaf, 2014) Tuy nhiên, khả năng liên kết của virus cúm với tế bào chủ còn phụ thuộc vào hoạt tính của neuraminidase vì trên niêm mạc đường hô hấp có một lớp mucin bao phủ, tạo nên một hàng rào mà virus phải xuyên qua để gắn với tế bào Lớp mucin này chứa nhiều sialic acid hình thành một mạng lưới có tác dụng ngăn cản virus bám vào bề mặt tế bào (Sanders, 2010) Nhờ hoạt tính sialidase phân cắt các nhóm sialic acid mà neuraminidase giúp cho virus có thể tiếp cận với các tế bào cảm nhiễm bên trong đường hô hấp

Giai đoạn 2 - xâm nhập tế bào: virus xâm nhập vào tế bào chủ yếu bằng con

đường ẩm bào Sau khi virus gắn vào tế bào, màng tế bào lõm lại hình thành túi bao bọc virus Túi này dần dần khép kín lại, sau đó tách khỏi màng tế bào tạo thành túi nội bào (endosome) Để tránh bị phân hủy bởi môi trường pH thấp trong endosome, protein M2 hoạt động mạnh, bơm ion H+ vào trong hạt virus

7

Giai đoạn 3 - tháo vỏ virus: dòng chảy của các ion H+ từ lòng túi ẩm bào vào hạt virus làm lớp protein nền M1 bị phá vỡ và tách khỏi phức hợp RNP Hoạt động của kênh ion H+

làm thay đổi cấu trúc không gian của HA và bộc lộ các peptide chịu trách nhiệm hòa tan vỏ, nhờ đó vỏ của virus có thể dung hợp với màng endosome và giải phóng các phức hợp RNP vào trong bào tương tế bào

Giai đoạn 4 - tổng hợp RNA và protein virus: Phức hợp RNP được vận

chuyển vào nhân tế bào để phiên mã tạo mRNA Phân tử mRNA được phiên mã trong nhân từ các chuỗi RNA sợi đơn (-) của virus khi sử dụng mồi là đoạn 10-13 nucleotide cắt ra từ đầu 5’ của mRNA có gắn mũ của vật chủ, sau đó được gắn đuôi polyA cũng lấy từ mRNA của tế bào chủ Enzyme cắt mồi là endonuclease do virus mang theo mRNA mới hoàn thiện của virus ra khỏi nhân, vào bào tương để tiến hành tổng hợp protein Kết quả của quá trình phiên mã từ 8 đoạn RNA hệ gen tạo ra được 15 phân tử protein

Trong nhân tế bào, các RNA hệ gen của virus tổng hợp nên các sợi dương từ khuôn là sợi âm của hệ gen virus, từ các sợi dương này chúng tổng hợp nên RNA hệ gen của virus mới nhờ RNA - polymerase Các sợi này không được adenine hóa (gắn thêm các adenine) và gắn mũ ở đầu 5’ và 3’, chúng kết hợp với nucleoprotein (NP) tạo thành phức hợp ribonucleoprotein hoàn chỉnh và được vận chuyển ra tế bào chất Đây là đặc điểm khác biệt so với các virus khác (quá trình này xảy ra trong tế bào chất của vật chủ) Các protein PB1, PB2, PA, NP của virus sau khi được tổng hợp sẽ được đưa vào nhân tế bào và kết hợp với RNA virus hình thành các phức hợp RNP, sau đó các phức hợp lại được đưa trở lại bào tương Các protein khác (HA, NA, và M2) được glycosyl hóa ở mạng lưới nội chất và phức hệ Golgi của tế bào

Giai đoạn 5 - lắp ráp và giải phóng virus khỏi tế bào: sau khi trải qua cải

biến sau dịch mã, các protein HA, NA và M2 được đưa đến màng tế bào chủ và gắn với lớp lipid kép Khi mật độ các protein màng đủ lớn thì các phức hợp RNP và protein M2 cũng tập hợp lại trên màng tế bào Sau khi cả 8 phân đoạn RNA của hệ

8

gen và các thành phần khác được tập hợp đầy đủ thì các phức hợp RNP, protein vỏ virus và protein nền M1 được lắp ráp lại với nhau để hình thành các hạt virus thế hệ mới Các virus mới hình thành được gắn vào màng tế bào bằng liên kết HA với nhóm sialic acid màng tế bào Các hạt virus sau đó được giải phóng theo cơ chế nảy chồi khỏi màng tế bào nhờ tác dụng cắt nhóm axit sialic của neuraminidase

1.1.3 Kháng nguyên của virus cúm A/H5N1

1.1.3.1 Kháng nguyên HA

HA là một kháng nguyên bề mặt quan trọng của virus cúm A do phân đoạn

gen ha mã hóa Ở virus cúm A/H5N1 phân đoạn ha có kích thước 1776 bp, trong đó

vùng mã hóa cho protein H5 khoảng 1698 - 1710 bp tùy thuộc vào từng chủng virus (Xiong, 2013; Nguyễn Thị Bích Nga, 2011) Về cấu tạo, phân tử HA có dạng trimer, gồm 3 phân tử protein HA0 (Hình 1.3) Khối lượng của mỗi phân tử HA0 là

70 - 75 kDa HA0 được chia thành hai tiểu đơn vị HA1 (36 kDa) và HA2 (27 kDa)

Hình 1.3: Mô hình cấu trúc bậc 3 và bậc 4 của hemagglutinin

(Nguồn: Amorij, 2008)

Tiểu phần HA1 kết thúc bằng nhóm amino, chứa một số vị trí gắn gốc đường, vị trí gắn thụ thể trên tế bào chủ và vị trí quyết định kháng nguyên (Amorij, 2008) Phần lớn cấu trúc bậc hai của HA1 là các phiến β cuộn xoắn lại tạo thành vùng hình cầu của phân tử HA Tiểu phần HA2 kết thúc bằng nhóm carboxyl, chứa

Vị trí liên kết thụ thể

Peptid dung hợp

Vỏ virus

9

phần xuyên màng và peptit dung hợp màng Cấu trúc bậc hai của HA2 là các đoạn xoắn  kết hợp với nhau tạo thành vùng dạng sợi, gắn với vỏ virus Cấu trúc HA0 được bền vững nhờ cầu nối disulfide giữa tiểu phần HA1 và HA2 Protein HA được tổng hợp dưới dạng polypeptide HA0 ở mạng lưới nội chất, tại đây chúng tập hợp lại thành dạng trimer Sau đó, chúng được vận chuyển tới bề mặt tế bào thông qua

bộ máy Golgi Tại bề mặt tế bào các enzym protease của tế bào chủ phân cắt HA0 thành HA1 và HA2 (Sriwilaijaroen, 2012)

Vùng nối giữa HA1 và HA2 có chứa một hoặc một số amino acid kiềm tính chính là vùng phân cắt hai tiểu đơn vị của protein HA0 dưới tác dụng của protease Trình tự amino acid vùng phân cắt HA có vai trò quyết định độc lực của virus (Velkov, 2013) Ở các chủng virus, điển hình là H5N1 thể độc lực cao, chuỗi amino acid kiềm tính trên vùng phân cắt HA được nhận biết bởi các protease nội bào phổ biến, giúp virus có thể lây nhiễm và tái bản ở nhiều mô cơ quan khác nhau trong cơ thể vật chủ và gây nên các triệu chứng toàn thân nặng nề (Perdue, 2000; Luczo, 2015) Ngược lại, vị trí phân cắt giữa hai tiểu phần HA1, HA2 ở các chủng virus thể độc lực thấp chỉ có 1 amino acid kiềm là Arg và một số amino acid kiềm ở vị trí -3 hoặc - 4 nên chỉ chịu tác dụng của các protease ngoại bào (trypsin-like) Do đó, virus H5N1 thể độc lực thấp chỉ có thể nhân lên ở các mô cơ quan có các enzym này như ở đường tiêu hóa và đường hô hấp (Steinhauer, 1999; Gambotto, 2008)

Có khoảng 400 phân tử HA trên bề mặt capsid của một virus HA có vai trò quan trọng trong quá trình nhận diện, gắn vào tế bào chủ và khởi động quá trình xâm nhiễm của virus vào tế bào chủ (Bender, 1999) Sự xâm nhiễm của virus được khởi đầu bằng sự kết hợp đặc hiệu giữa HA của virus với thụ thể trên bề mặt tế bào vật chủ, sau đó vỏ virus hòa với màng tế bào và giải phóng RNA hệ gen vào tế bào vật chủ Quá trình kết hợp phụ thuộc vào sự phù hợp cấu hình không gian của thụ thể chứa sialic acid của tế bào đích với vị trí gắn với thụ thể này trên phân tử HA của virus cúm, quyết định sự xâm nhiễm dễ dàng của virus ở các loài vật chủ khác

Vị trí amino acid 226 (aa226) của tiểu đơn vị HA1 được xác định là vị trí quyết định phù hợp gắn HA với thụ thể đặc hiệu của nó Ở hầu hết các chủng virus cúm A

10

lưu hành trong tự nhiên vị trí này là glycine, thích ứng với thụ thể Gal α-2,3 sialic acid (chứa sialic acid liên kết với nhóm hydroxyl (4-OH) của galactose ở góc quay α-2,3) của tế bào biểu mô đường hô hấp của chim và gia cầm (vật chủ tự nhiên của virus cúm A) (Gamblin, 2010) Ngoài ra, một số vị trí amino acid khác như glutamine 222, glycine 224, hay cấu trúc SGVSS và NGQSGR cũng có sự liên quan chặt chẽ đến khả năng thích ứng với thụ thể chứa sialic acid bề mặt màng tế bào chủ (Schrauwen, 2014; Luczo, 2015)

1.1.3.2 Kháng nguyên NA

Neuraminidase (sialidase), một enzyme có bản chất là glycoprotein được gắn trên bề mặt capsid của virus cúm A Gen mã hóa cho protein NA có chiều dài thay

đổi theo từng phân type virus cúm A Ở virus cúm H5N1, gen na có kích thước thay

đổi trong khoảng 1350–1410 bp (Baigent, 2001; Wagner, 2002; Keawcharoen, 2005; Nguyễn Thị Bích Nga, 2011; Xiong, 2013) NA có khối lượng phân tử khoảng 53 kDa, có cấu trúc hình nấm, bao gồm một đầu chứa 4 tiểu đơn vị và có đoạn peptide kị nước cắm sâu vào vỏ virus, 4 tiểu đơn vị tạo thành trung tâm hoạt động của enzyme NA còn chứa một chuỗi polypeptide đơn hướng về phía đối diện với kháng nguyên HA Chuỗi này gồm 6 amino acid có tính bảo thủ cao, chứa các amino acid ưa nước (Castrucci, 1993; Shtyrya, 2009)

Enzyme NA cắt đứt liên kết giữa gốc sialic acid của màng tế bào nhiễm với phân tử carbohydrate của protein HA, giải phóng hạt virus ra khỏi màng tế bào nhiễm, đẩy nhanh sự lây nhiễm của virus trong cơ thể vật chủ và ngăn cản sự tập hợp của các hạt virus mới trên màng tế bào Mặt khác, NA tham gia vào phân cắt

liên kết này trong giai đoạn “hòa màng”, đẩy nhanh quá trình “cởi áo” (uncoating)

giải phóng hệ gen của virus vào trong bào tương tế bào nhiễm, giúp cho quá trình nhân lên của virus diễn ra nhanh hơn (Wagner, 2002) Ngoài ra, NA còn phân cắt các liên kết glycoside, giải phóng neuraminic acid làm tan, loãng màng nhầy bề mặt biểu mô đường hô hấp tạo điều kiện cho virus nhanh chóng tiếp cận tế bào biểu mô

và thoát khỏi các chất ức chế không đặc hiệu Cùng với vai trò của kháng nguyên

HA, cả 3 khâu tác động trên của NA đều tham gia làm gia tăng độc lực gây bệnh

11

của virus cúm A ở cơ thể vật chủ Do đó, NA là đích tác động của các thuốc hóa dược ức chế virus không đặc hiệu hiện nay, ví dụ Oseltamivir (biệt dược là Tamiflu) phong tỏa enzyme NA, ngăn cản sự giải phóng hạt virus mới khỏi các tế bào đích, bảo vệ cơ thể (Aoki, 2007)

NA là một kháng nguyên bề mặt của virus, tham gia kích thích hệ thống miễn dịch của cơ thể chủ, sinh ra kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên NA của các chủng virus đương nhiễm (Kilbourne, 2004; Rockman, 2013) Tương tự kháng nguyên HA, hàm lượng kháng nguyên NA trên bề mặt virus khá lớn, tỷ lệ HA:NA

là 4:1 Nghiên cứu ảnh hưởng của kháng nguyên này trong vắc xin phòng cúm trên

mô hình chuột thực nghiệm cho thấy NA không có khả năng bảo hộ hoàn toàn cơ thể chống lại virus cúm nhưng lại có khả năng hạn chế hữu hiệu sự phát triển của virus Vì vậy, kháng nguyên NA được sử dụng như một nhân tố bổ trợ giúp tăng khả năng bảo vệ của vắc xin (Kilbourne, 2004; Doyle, 2013; Eichelberger, 2015)

1.1.3.3 Kháng nguyên M2

Phân đoạn M có kích thước 1027 bp, mã hóa cho protein nền M1 của virus

và protein kênh ion M2 Hai protein này được mã hóa bởi những khung đọc mở khác nhau của phân đoạn M Các phân tử M1 liên kết với nhau thành một lớp kín lót trong vỏ lipit kép, cùng với HA, NA và M2 hình thành nên vỏ capsid bao bọc các phức hợp RNP M2 là một protein xuyên màng bao gồm 97 amino acid với 3 vùng: vùng đầu N gồm 24 amino acid, nằm ở phía ngoài màng; vùng xuyên màng gồm 19 amino acid; vùng nằm ở phía bào tương gồm 54 amino acid Khối lượng phân tử M2 khoảng 15 kDa Chức năng của protein M2 là tạo kênh ion H+ cần thiết cho khả năng lây nhiễm của virus ( Holsinger, 1994; Huang, 2008; Wang, 2011) Sự hình thành nên kênh ion có vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus, tạo điều kiện để virus phá vỡ vỏ endosome, giải phóng RNP vào bào tương tế bào chủ Protein M2 là đích của các thuốc kháng virus dòng adamantane (gồm amantadine và rimantadine) Các thuốc này gắn với protein M2 làm protein mất chức năng hình thành kênh ion, do đó ngăn chặn quá trình giải phóng RNP vào bào tương tế bào nhiễm (Arinaminpathy, 2008) Tuy nhiên, một số đột biến thay thế

12

amino acid trên protein M2 của virus H5N1 gây ra hiện tượng kháng adanmatane như: L261/F; V27/A/I/G; A30/S/T; S31N (Cheung, 2006; Wang, 2013)

1.1.4 Các phương thức biến đổi kháng nguyên của virus cúm A

1.1.4.1 Hiện tượng lệch kháng nguyên

Lệch kháng nguyên là các đột biến điểm xảy ra ở các phân đoạn gen/hệ gen của virus Virus cúm A kí sinh nội bào bắt buộc, không có cơ chế đọc và sửa bản sao trong quá trình phiên mã và sao chép ở nhân tế bào chủ Sự thiếu hụt enzyme sửa chữa dẫn đến các enzyme sao chép phụ thuộc RNA có thể thêm, làm mất hoặc thay thế một hay nhiều nucleotide trong phân tử RNA chuỗi đơn mới của virus Hiện tượng này thường xảy ra ở các phân đoạn HA và NA, gây ra một hoặc một số thay đổi sau: (1) tạo ra các bộ mã tổng hợp các amino acid mới; (2) làm thay đổi cấu trúc dẫn đến thay đổi đặc tính của protein đó; (3) làm tăng mức độ glycosyl hóa trong cấu trúc chuỗi polypeptide kháng nguyên; (4) tạo ra một biến thể virus mới có độc tính và tính kháng nguyên mới trở thành chủng được chọn lọc trong quần thể do chúng có khả năng nhiễm vào vật chủ chưa miễn dịch Tần suất xảy ra đột biến điểm rất cao, cứ 10.000 nucleotide (tương ứng với độ dài của RNA hệ gen của virus cúm A) thì có 1 nucleotide bị đột biến (Webster, 1998) Như vậy, gần như mỗi hạt virus mới được sinh ra đều chứa đựng ít nhất một đột biến điểm trong hệ gen của nó

và các đột biến này được tích lũy qua nhiều thế hệ virus và sẽ làm xuất hiện phân type mới có những đặc tính kháng nguyên mới (Webster, 1998; Macken, 2006; Chen, 2008) Trên phân tử HA của virus cúm A/H5N1 có 3 vị trí kháng nguyên thường xuyên bị đột biến tạo nên các kháng nguyên mới, giúp virus thoát khỏi hệ miễn dịch của vật chủ đó là các đột biến ở vị trí amino acid 136-141; vị trí amino acid 152-153 và vị trí amino acid 124-129 (Smirnov, 2004; Hanson, 2016) Hiện tượng lệch kháng nguyên là nguyên nhân gây ra các đợt dịch nhỏ, tản phát

1.1.4.2 Hiện tượng trộn kháng nguyên

Hiện tượng trộn kháng nguyên xảy ra khi hai hay nhiều chủng virus cúm A khác nhau, với nhiều đoạn RNA khác biệt nhau về mặt di truyền cùng lúc xâm

13

nhiễm vào một cơ thể vật chủ Các phân đoạn gen của virus hoán vị với nhau Kết quả là tạo ra biến chủng virus mới có thể lây nhiễm vào vật chủ mới mà bố mẹ chúng không có khả năng gây nhiễm hoặc gia tăng độc lực gây bệnh Do đó, trộn kháng nguyên được coi là nguyên nhân gây ra các đại dịch cúm (Macken, 2006; Chen, 2008) Các virus HPAI H5N1 ở khu vực Đông Nam Á đều có gen HA và

NA có nguồn gốc từ chủng gốc Gs/Gd/1/96 trong khi 6 gen còn lại được lấy từ các nguồn khác nhau do hiện tượng trao đổi và tích hợp các phân đoạn gen Chính hiện tượng trộn kháng nguyên này đã tạo virus H5N1 gây ra đại dịch ở người năm

1997 và tiếp sau đó các dịch cúm gia cầm năm 2001 và 2002 (Chen, 2008)

Năm 1997, ở Hồng Kông virus cúm A/H5N1 lây trực tiếp từ gà sang người

đã giết chết 6 trên tổng số 18 người bị nhiễm Virus này tiếp tục lan truyền sang ngỗng ở miền Nam Trung Quốc và thay thế ngay các kiểu gen khác gây bệnh ở gà nhưng không gây bệnh ở vịt Năm 2001, 6 kiểu gen đã được xác định là A, B, C,

D, E và X0 Các kiểu gen này đều giống nhau về đột biến xóa 5 amino acid (vị trí 80-84) của protein NS1, ngoại trừ kiểu gen chủng Gs/Gd/1/96 và kiểu gen X0 Năm 2002, có 8 kiểu gen mới xuất hiện là V, W, X1, X2, X3, Y, Z và Z+

, trong khi các chủng A, C, D và E không thấy nữa Kiểu gen HPAI H5N1 trong giai đoạn này mang đột biến mất 5 amino acid của NS1 và đột biến mất 20 amino acid (49-68) trên vùng thân của NA Đến năm 2003, thêm 3 kiểu hình chính nữa là Y, Z+

và

V được phát hiện Kiểu gen G được hình thành do sự trao đổi và tích hợp giữa kiểu gen Z và W năm 2004 Trong số các kiểu gen đã xuất hiện, kiểu gen Z chiếm

ưu thế ở khu vực Đông Nam Á trong suốt giai đoạn từ 2003 đến nay (Chen, 2006)

1.1.4.3 Hiện tượng glycosyl hóa

Glycosyl hóa là sự gắn kết một chuỗi carbonhydrate vào amino acid asparagine (N) ở một số vị trí nhất định trong chuỗi polypeptide HA hay NA, hay một số polypeptide khác của virus cúm Thông thường chuỗi carbohydrate được gắn tại vị trí asparagine có motif N-X-S/T (N = asparagine; X = amino acid bất kì, trừ proline; S/T = Serine hoặc Threonine) (Tate, 2014) Nếu hiện tượng lệch kháng

14

nguyên dẫn đến hình thành bộ ba mã hóa asparagine sẽ tạo điều kiện cho hiện tượng glycosyl hóa xảy ra khi tổng hợp chuỗi polypeptide HA hay NA Điều này dẫn đến làm thay đổi đặc tính kháng nguyên của HA và NA, giúp cho virus thoát khỏi tác động miễn dịch bảo hộ của cơ thể chủ, điều hoà sự nhân lên của virus (Baigent, 2001; Wanga, 2009; Gamblin, 2010; Hervé, 2015)

Phân tích protein HA các chủng HPAI H5N1 cho thấy mỗi chủng virus chỉ

có 5-7 vị trí có khả năng glycosyl hóa tùy theo từng chủng virus Motif 10-NNST xuất hiện ở tất cả các chủng H5N1, tuy nhiên asparagin tại vị trí 10 không có khả năng glycosyl hóa Tương tự như vậy, protein HA ở một số chủng virus mặc dù có motif 154 - NNTY hoặc 273 - NCST nhưng các motif này cũng được xác định là không có khả năng glycosyl hóa Có 6 vị trí asparagine có khả năng glycosyl hóa ở các vị trí 11 (motif NSTE), 23 (motif NVTV), 165 (motif NNTN), 286 (motif NSSM), 484 (motif NGTY), và 543 (motif NGSL) Tuy nhiên do đột biến, một số

chủng còn lại 5 vị trí glycosyl (Blake, 2009) Nghiên cứu đặc điểm phân tử gen ha

của virus cúm A/H5N1 lưu hành ở miền Bắc Việt Nam (2008-2009) cho thấy một

số chủng xuất hiện đột biến N286S nên motif NSSM chuyển thành SSSM và mất khả năng glycosyl hóa ở vị trí này Bên cạnh đó xuất hiện một số chủng đột biến N166S tạo ra motif 166 - NTQS có khả năng glycosyl hóa Những chủng virus này

có 2 vị trí N-glycosil hóa liên tiếp ở amino acid 165 và 166 trên protein HA (Nguyễn Nam Thắng, 2012)

Các nghiên cứu cho thấy đặc điểm glycosyl hóa protein HA liên quan chặt chẽ đến khả năng xâm nhiễm, khả năng bám gắn và đặc điểm kháng nguyên của virus cúm Người ta thấy rằng, nếu gắn thêm gốc carbonhydrate vào gần vị trí phân cắt tiểu đơn vị HA1, HA2 của protein HA thì gốc carbonhydrate có thể ngăn cản sự tiếp xúc với protease Do đó protein HA không phân cắt sẽ làm virus mất khả năng xâm nhiễm tế bào Nếu gốc carbonhydrate nằm gần vị trí gắn thụ thể thì các đột biến này ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình nhân lên và giải phóng virus Nguyên nhân là do gốc carbonhydrate tham gia điều chỉnh ái lực bám gắn và kiểm soát tính đặc hiệu thụ thể (Deshpande, 1987; de Vries, 2010)

15

Hiện tượng “lệch kháng nguyên” và “glycosyl hóa” xảy ra liên tục theo thời gian, còn hiện tượng “trộn kháng nguyên” có thể xảy ra với tất cả các chủng của virus cúm A khi cùng nhiễm vào một tế bào ở tất cả các loài vật chủ khác nhau Đây cũng chính là vấn đề đáng lo ngại của virus cúm A/H5N1 hiện nay Mặc dù virus này chưa có sự thích nghi lây nhiễm dễ dàng ở người, nhưng nó có khả năng gây bệnh cho người Hơn nữa, rất có thể virus cúm A/H5N1 tái tổ hợp gen HA hay NA hoặc cả hai gen của các chủng virus cúm A đã thích nghi ở người để tạo ra một biến chủng virus mới thích ứng lây nhiễm dễ dàng ở người, gây ra nguy cơ của một đại dịch cúm mới (Hilleman, 2002; Watanabe, 2012)

1.2 NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮC XIN PHÒNG CÚM A/H5N1

1.2.1 Nghiên cứu vắc xin phòng cúm A/H5N1 cho gia cầm trên thế giới

1.2.1.1 Vắc xin bất hoạt truyền thống

Hai dạng vắc xin thương mại đã được sử dụng để chủng ngừa cho gia cầm chống lại sự lây nhiễm của virus cúm A/H5N1 là vắc xin bất hoạt sản xuất theo phương pháp truyền thống và vắc xin thế hệ mới hay vắc xin công nghệ gen (Chen, 2009) Theo phương pháp truyền thống, vắc xin được sản xuất bằng toàn bộ hạt virus thuộc một phân type của virus cúm gia cầm nuôi cấy trên phôi trứng gà Virus được tạo thành trong phôi gà bị bất hoạt bằng hóa chất như -propiolactone hoặc formaline (Wong, 2013) Vắc xin được chia làm 2 loại dựa vào chủng virus sử dụng sản xuất vắc xin: vắc xin bất hoạt đồng chủng và vắc xin bất hoạt dị chủng Vắc xin bất hoạt đồng chủng được sản xuất từ chủng virus có HA và NA giống với chủng virus gây bệnh trên thực địa Vắc xin bất hoạt dị chủng có HA giống với chủng virus trên thực địa, nhưng có NA dị chủng Vắc xin Nobilis Influenza H5 - vắc xin bất hoạt nhũ dầu (Hà Lan), chủng vắc xin là phân type H5N2, dòng A/chicken/Mexico/232/94 được sử dụng phòng dịch cúm A/H5N1 ở nhiều nước có dịch cúm gia cầm lưu hành (Swayne, 2006) Vắc xin bất hoạt H5N2 (Trung Quốc) được tạo ra bằng cách nuôi cấy chủng A/Turkey/England/N28/73(H5N2) trên phôi

gà, thu hoạch dịch phôi, bất hoạt bằng formaldehyde, nhũ hóa với chất bổ trợ (Qiao,

16

2006) Vắc xin này được sử dụng để phòng bệnh cúm do virus phân type H5 gây ra trên gia cầm Vắc xin này được gây miễn dịch bằng đường tiêm 2 đến 3 lần và tạo được miễn dịch vào thời điểm 14 ngày sau khi tiêm vắc xin (Swayne, 2006) Sử dụng vắc xin bất hoạt thường an toàn và có hiệu quả, vắc xin dị chủng có thể cho phép phân biệt những cá thể bị nhiễm bệnh với những cá thể được tiêm phòng Tuy nhiên vắc xin bất hoạt không ổn định, cần phải tiêm nhắc lại (2 đến 3 liều), không tiện lợi trong sử dụng (gây miễn dịch bằng đường tiêm) Trong giai đoạn 1997 -

2005, vắc xin bất hoạt dị chủng (vắc xin bất hoạt H5N2, H5N3, H5N9) đã được sử dụng để phòng cúm A/H5N1 thể độc lực cao cho gia cầm ở các quốc gia có dịch lưu hành Sau năm 2005, nhóm vắc xin thế hệ mới bao gồm các loại vắc xin được tạo ra bằng công nghệ DNA tái tổ hợp và kỹ thuật di truyền ngược được sử dụng để thay thế các vắc xin bất hoạt truyền thống trong phòng chống dịch cúm gia cầm H5N1 (Chen, 2009)

1.2.1.2 Vắc xin phòng cúm A/H5N1 tạo ra bằng công nghệ gen

Vắc xin thế hệ mới là các loại vắc xin được tạo ra bằng công nghệ tái tổ hợp DNA và kỹ thuật di truyền ngược được sử dụng để thay thế các vắc xin bất hoạt truyền thống Trong nhóm vắc xin thế hệ mới có nhiều loại vắc xin cúm A/H5N1 được tạo ra gần đây đã được thử nghiệm và sử dụng có hiệu quả như: vắc xin H5N1

có hệ thống dẫn truyền của adenovirus; vắc xin vector dẫn truyền virus đậu chim Trovac-AIV-H5; vắc xin vector dẫn truyền virus Newcastle; vắc xin tái tổ hợp dưới đơn vị; vắc xin tạo ra bằng phương pháp di truyền ngược

Vắc xin phòng cúm A/H5N1 sử dụng vector virus dẫn truyền

Virus đậu gia cầm fowlpox là một thành viên của họ Poxviridae, hệ gen là

DNA sợi kép có kích thước lớn, gây bệnh ở một số loài gia cầm (Weli, 2011) Fowlpox tái tổ hợp đã được sử dụng thành công làm vector biểu hiện gen mã hóa cho kháng nguyên của một số virus gây bệnh nhằm phát triển vắc xin phòng bệnh cho gia cầm (Boyle, 1993; Paoletti, 1996) Vector dẫn truyền virus đậu gà có khả năng mang gen mã hóa HA, NA và tổng hợp protein này trong tế bào chủ mà virus nhiễm Các kháng nguyên này kích thích đáp ứng miễn dịch dịch thể và miễn dịch

17

qua trung gian tế bào chống lại virus cúm A/H5N1 (Swayne, 2000a; Bublot, 2006) Vắc xin tái tổ hợp sử dụng virus đậu gia cầm làm vector dẫn truyền mang gen mã hóa HA, NA từ chủng H5N1 (rFPF-HA-NA) bắt đầu phát triển vào năm 1999, sau khi phát hiện chủng H5N1 độc lực cao A/goose/Guangdong/1/96 (Qiao, 2003) Vắc xin được chế tạo bằng cách nuôi cấy virus mang gen mã hóa HA, NA của virus cúm A/H5N1 trên tế bào phôi gà, thu hoạch virus, bổ sung chất ổn định, đông khô tạo thành sản phẩm cuối cùng Vắc xin được tiêm một mũi cho gà một ngày tuổi, gà tạo đáp ứng miễn dịch vào thời điểm 7 ngày sau khi gây miễn dịch và có khả năng bảo

vệ gà ít nhất 20 tuần (Bublot, 2006; Qiao, 2006; Qiao, 2009) Trong giai đoạn 2005

- 2008, khoảng 615 triệu liều vắc xin rFPF-HA-NA được sử dụng phòng dịch cúm A/H5N1 tại Trung Quốc (Chen, 2009)

Vắc xin tái tổ hợp sử dụng virus đậu gia cầm làm vector dẫn truyền có một

số ưu điểm như: (i) chỉ cần tiêm cho gà từ 1 ngày đến 1 tuần tuổi là đủ, không phải tiêm nhắc lại; (ii) có thể phân biệt được gia cầm được tiêm vắc xin và gia cầm bị bệnh tự nhiên bằng huyết thanh học (trong trường hợp sử dụng TrovacAIV-H5); (iii) không có các phản ứng phụ gây ra bởi tá chất (Bublot, 2007) Tuy nhiên, vắc xin tái tổ hợp fowlpox có một số hạn chế như hiệu quả miễn dịch giảm rõ rệt nếu gà

bị nhiễm fowlpox Ngoài ra, virus fowlpox chỉ có thể xâm nhiễm gà, khả năng sao chép rất kém hoặc hoàn toàn không sao chép trong tế bào loài khác Do đó, vắc xin tái tổ hợp fowlpox bị giới hạn về loài (Swayne, 2000b)

Vắc xin tái tổ hợp NDV - H5 (vắc xin phòng cúm A/H5N1 sử dụng virus Newcastle làm vector dẫn truyền; rLH5-1) phòng cúm gia cầm H5N1 được tạo ra lần đầu tiên vào năm 2005 Kết quả khảo nghiệm hiệu lực của vắc xin trên gà cho thấy vắc xin tái tổ hợp rLH5 có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch và bảo hộ gà khỏi virus cúm gia cầm type phụ H5 và bệnh Newcastle (Veits, 2006; Wang, 2007; Nayak, 2009; Lardinois, 2012) Năm 2006, vắc xin rLH5-1 được Trung Quốc cấp phép sử dụng như là vắc xin nhị giá phòng bệnh cúm A/H5N1 và bệnh Newcastle cho gà Giai đoạn 2006-2007, khoảng 4 tỷ liều vắc xin rLH5-1 được sử dụng ở

Trung Quốc Năm 2008, vắc xin rLH5-5 (gen ha lấy từ chủng A/duck/Anhui/1/06)

18

được sử dụng để thay thế cho vắc xin rLH5-1 (Chen, 2009) Vắc xin rLH5 sử dụng cho gà một ngày tuổi và gây miễn dịch một lần Gà gây dịch bằng đường uống hoặc nhỏ mắt mũi và có khả năng bảo hộ trong vòng 18-20 tuần Ngoài ra rNDV được xem

là vắc xin có triển vọng áp dụng cho các động vật ngoài gia cầm (Ge, 2007; Wang, 2007) Mặc dù vắc xin sử dụng chủng nhược độc, nhưng cũng đã có một số cảnh báo ban đầu về tính an toàn của loại vắc xin này (Zhang, 2010)

Vắc xin bất hoạt tạo ra bằng kỹ thuật di truyền ngược

Di truyền ngược là một công nghệ mới đã được ứng dụng để tạo ra virus RNA sống trong phòng thí nghiệm từ các gen virus độc lập Dựa trên công nghệ này nhiều chủng vắc xin cúm A/H5N1 được tạo ra để sản xuất vắc xin (Neumann, 2003) Tian và cộng sự, 2005 đã tạo ra chủng nhược độc H5N1 mang hai gen mã hóa HA, NA lấy từ chủng A/goose/Guangdong/1/96, 6 gen khung còn lại (mã hóa protein M, NS, NP, PA, PB1 và PB2) từ chủng A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), đây là chủng thích ứng tốt trên phôi gà nên được sử dụng làm bộ khung của chủng vắc xin Để giảm độc tính, trình tự amino acid kiềm vùng phân cắt HA RERRRKKRGLF được thay bằng RETRGLF (Tian, 2005) Virus tái tổ hợp có đặc điểm kháng nguyên bề mặt giống với chủng hoang dại A/goose/GD/1/96 (H5N1), chủng nhược độc tạo ra có tên là Re-1 Vắc xin Re-1 sau đó được sử dụng phổ biến

để phòng cúm H5N1 cho gia cầm ở Trung Quốc và xuất khẩu sang một số nước có dịch cúm A/H5N1 như Indonesia, Ai Cập, Việt Nam Cùng với sự xuất hiện các clade mới, chủng Re-1 (A/goose/Guangdong/1/96) lần lượt được thay thế bởi các chủng Re-4 (A/chicken/Shanxi/2/2006 clade 7) giai đoạn 2006-2007, Re-5 (A/duck/Anhui/1/2006, clade 2.3.4) giai đoạn 2008-2012, Re-6 (A/duck/Guangdong/ S1322/2010, clade2.3.2) từ năm 2012 đến nay (Lee, 2014)

Phần lớn vắc xin phòng cúm A/H5N1 cho gia cầm hiện nay là loại vắc xin bất hoạt sản xuất từ các chủng vắc xin nhược độc được tạo ra bằng kỹ thuật di truyền ngược Đây được xem là bước đột phá trong công nghệ sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 cho gia cầm (Tian, 2005) Vắc xin tạo ra bằng kỹ thuật di truyền ngược có một số ưu điểm là chủng virus tạo ra có độc lực thấp, có khả năng gây đáp ứng miễn

19

dịch bảo hộ cao và có thể dễ dàng thay đổi kháng nguyên của virus để đối phó với

vụ dịch mới Tuy nhiên có một số nhân tố gây trở ngại cho việc tạo vắc xin bằng kỹ thuật này đó là: (1) quy trình tạo chủng virus nhược độc phức tạp, tốn kém, đòi hỏi trang thiết bị kỹ thuật hiện đại; (2) cần nhiều phôi trứng gà cho quá trình sản xuất vắc xin Hiện nay, các nhà khoa học đang cố gắng nghiên cứu, đánh giá, thử nghiệm loại vắc xin khác như vắc xin dưới đơn vị, vắc xin DNA, vắc xin sống nhược độc đáp ứng nhanh nhất nhu cầu phòng cúm gia cầm một cách triệt để, hiệu quả, dễ sử dụng, ít tốn kém nhất

1.2.1.3 Nghiên cứu sản xuất kháng nguyên HA tạo vắc xin phòng cúm

Nhiều nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên HA trong các hệ biểu hiện khác nhau như: hệ biểu hiện prokaryote (Văn Thị Như Ngọc, 2007; Xie, 2009; Sączyńska, 2014), hệ biểu hiện nấm men (Saelens, 1999; Athmaram, 2011) hệ biểu hiện baculovirus/tế bào côn trùng (Treanor, 2001; Lin, 2008; Cornelissen, 2010; Nwe, 2006), hệ biểu hiện thực vật (Redkiewicz, 2014), biểu hiện HA bằng hạt tương tự virus (Virus-like particle - VLP) (Bright, 2007; Kang, 2009) Saelens và

cộng sự đã biểu hiện gen ha từ chủng virus cúm A/H3N2 trong nấm men P pastoris, protein tổ hợp có khả năng sinh đáp ứng miễn dịch và khả năng bảo vệ chuột khi công độc với liều 10 x LD50 chủng cúm A/H3N2 (Saelens, 1999) Gen ha

từ chủng virus cúm A/California/04/2009 H1N1 được biểu hiện trong P pastoris GS115 dưới dạng tích hợp nhiều bản copy gen ha vào genome nấm men Số lượng bản copy gen ngoại lai trong genome P pastoris GS115 làm tăng đáng kể hiệu quả biểu hiện gen ha (Athmaram, 2011) Kháng nguyên H5 tái tổ hợp từ chủng virus

cúm A/Hong Kong/156/97/H5N1 và A/Hong Kong/483/97/H5N1 biểu hiện trong

hệ bacculovirus/tế bào côn trùng đảm bảo tính an toàn và tính sinh miễn dịch trên người tình nguyện (Treanor, 2001) Tiểu phần HA1 của chủng A/goose/Guangdong/97 (H5N1) biểu hiện trong hệ bacculovirus/tế bào côn trùng đạt hiệu suất 68 mg/l Với liều gây miễn dịch 50 µg HA1 trên chuột lang, hiệu giá

HI và hiệu giá kháng thể trung hòa sau 2 tuần gây miễn dịch lần 2 đạt 1:160 (Nwe, 2006) HA5 dạng monomer, dimer và trimer được biểu hiện thành công trong hệ

20

biểu hiện bacculovirus/tế bào côn trùng với hiệu suất 20 mg/l Kháng nguyên tái tổ hợp này có khả năng sinh đáp ứng miễn dịch và bảo hộ trên gà với liều gây miễn dịch 20 µg HA5 (Lin, 2008) So với các hệ biểu hiện khác như: hệ biểu hiện vi khuẩn, hệ biểu hiện nấm men, các thao tác đối với baculovirus và tế bào côn trùng khó khăn hơn, giá thành sản xuất protein HA tái tổ hợp cũng cao hơn nên hệ biểu hiện này chủ yếu được sử dụng nghiên cứu tạo vắc xin sử dụng cho người

Sản xuất kháng nguyên HA bằng công nghệ hạt tương tự virus (VLP) là một hướng nghiên cứu mới đầy triển vọng đang được triển khai nghiên cứu tại nhiều phòng thí nghiệm, nhằm thay thế các công nghệ sản xuất vắc xin truyền thống Nhiều công bố gần đây trên mô hình động vật thực nghiệm cho thấy vắc xin cúm sản xuất bằng công nghệ VLP cho đáp ứng miễn dịch phòng vệ tốt, an toàn (Mahmood, 2008; Hu, 2012; Pushko, 2015) Chuột gây miễn dịch với VLP mang protein HA và M1 chủng A/Udorn 72 (H3N2) có khả năng bảo hộ khi công cường độc liều 5xLD50 (chủng H3N2 A/Hong Kong/68), hiệu giá kháng thể trung bình ở nhóm tiêm VLP tương đương với nhóm gây nhiễm bằng virus sống (Galarza, 2005) VLP cấu trúc từ HA, NA, M1 chủng A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) kích thích tạo đáp ứng miễn dịch bảo hộ trên dòng chuột BALB/c và ức chế sự nhân lên của virus khi công cường độc (Pusko, 2015) VLP biểu hiện M1 và HA chủng A/PR/8/34 có mức độ bảo hộ tương đương nhau, chống lại virus đồng chủng và dị chủng A/PR/8/34, A/WSN/33 Tuy nhiên, số lượng virus đồng chủng (A/PR/8/34) trong phổi thấp hơn 100 lần so với dị chủng (Quan, 2009) VLP mang kháng nguyên HA cúm A/H5N1 đã được nghiên cứu và thử nghiệm Dòng chuột BALB/c gây miễn

bằng VLP mang gen ha, na từ chủng A/Viet Nam/1203/2004 (clade 1) và

A/Indonesia/05/2005 (clade 2) có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch dịch thể, miễn dịch trung gian qua tế bào và bảo hộ khi thử thách với chủng H5N1 clade 1 và clade

2 (Bright, 2008) Với liều gây miễn dịch 0,3 μg HA VLP (chủng A/Viet Nam/1203/2004) bằng đường nhỏ mũi, chuột có khả năng bảo hộ khi thử thách với virus đồng chủng ở liều cao sau 30 tuần gây miễn dịch (Kang, 2009) Mặc dù các kết quả nghiên cứu thu được rất khả quan, nhưng đến thời điểm này chưa có vắc xin

21

thương mại VLP phòng cúm được công bố Đây là một hướng nghiên cứu mới đầy triển vọng, đang được triển khai nghiên cứu và thử nghiệm tại nhiều phòng thí nghiệm tiên tiến và các công ty dược phẩm hàng đầu trên thế giới (Crevar, 2008; Shimizu 2013; Nguyễn Thị Hoa, 2015)

1.2.2 Tình hình nghiên cứu vắc xin phòng cúm A/H5N1 trong nước

1.2.2.1 Tình hình dịch cúm A/H5N1 ở Việt Nam

Dịch cúm gia cầm A/H5N1 bùng phát tại Việt Nam vào cuối năm 2003 ở các tỉnh phía Bắc, sau đó nhanh chóng lan tới hầu hết các tỉnh/thành trong cả nước chỉ trong một thời gian ngắn Đây là lần đầu tiên dịch cúm gia cầm A/H5N1 xảy ra tại Việt Nam và có tới hàng chục triệu gia cầm bị tiêu hủy, gây thiệt hại nặng nề đến nền kinh tế quốc dân Có thể phân chia thành các đợt dịch lớn sau (http://www.cucthuy.gov.vn)

Đợt thứ nhất từ tháng 12/2003 đến 30/3/2004, dịch cúm xảy ra ở các tỉnh Hà Tây, Long An và Tiền Giang Dịch bệnh lây lan rất nhanh, chỉ trong vòng hai tháng

đã xuất hiện ở 57/64 thành trong cả nước Tổng số gà và thủy cầm mắc bệnh, chết

và thiêu hủy hơn 43,9 triệu con, chiếm 17% tổng đàn gia cầm Trong đó, gà chiếm 30,4 triệu con, thuỷ cầm 13,5 triệu con Ngoài ra, có ít nhất 14,8 triệu chim cút và các loại khác bị chết hoặc tiêu huỷ Đặc biệt, có 3 người được xác định nhiễm virus cúm A/H5N1 và cả 3 đã tử vong trong đợt dịch này

Đợt dịch thứ 2 từ tháng 4 đến tháng 11/2004: dịch bệnh tái phát tại 17 tỉnh, thời gian cao điểm nhất là trong tháng 7, sau đó giảm dần đến tháng 11/2004 chỉ còn một điểm phát dịch Tổng số gia cầm tiêu hủy được thống kê trong vụ dịch này

là 84.078 con Trong đó, có gần 56.000 gà; 8.132 vịt; và 19.950 con chim cút Và đã

có tới 27 người mắc bệnh virus cúm A/H5N1, trong đó có 9 ca tử vong

Đợt 3 từ tháng 12/2004 cho đến tháng 15/12/2005: dịch cúm gà xảy ra trên

36 tỉnh thành trong cả nước Số gia cầm bị tiêu hủy được Cục Thú y thống kê là 1,846 triệu con (gồm 470.000 gà, 825.000 thủy cầm và 551.000 chim cút) Vào những tháng cuối năm 2005, dịch cúm gia cầm xảy ra trong tháng 10/2005 lan

22

nhanh trong gần 40 tỉnh thành và giảm dần trong tháng 12/2005 Mặc dù, chương trình tiêm chủng rộng rãi được áp dụng trong cả nước suốt thời gian sau đó, nhưng đến cuối năm 2006 dịch cúm gia cầm A/H5N1 đã tái bùng phát ở Cà Mau, sau đó lan sang các tỉnh Bạc Liêu, Hậu Giang, Vĩnh Long và Cần Thơ Trong năm 2007 dịch xảy ra trên 16 tỉnh, thành trong cả nước

Giai đoạn 2008 - 2012, trung bình mỗi năm có khoảng 118 xã tại 58 huyện thuộc 25 tỉnh có dịch Số gia cầm bị chết và tiêu hủy hơn 212 ngàn con, chủ yếu là vịt chiếm 72,30%, gà chiếm 25,03% và ngan 2,67% (Nguyễn Ngọc Tiến, 2013) Hiện nay, dịch cúm gia cầm A/H5N1 thường xảy ra nhỏ lẻ ở các địa phương Kết quả giám sát lưu hành virus cúm gia cầm A/H5N1 cho thấy, tại các chợ buôn bán gia cầm sống có tỷ lệ lưu hành virus cúm A/H5N1 khá cao Nghiên cứu giám sát chủ động trên 1280 mẫu thu thập từ gia cầm sống tại các chợ buôn bán, giết mổ gia cầm ở 3 khu vực: miền Bắc (Hà Nội, Quảng Ninh), miền Trung (Nha Trang) và miền Nam (Long An), trong khoảng thời gian 2012 - 2015 cho thấy tỷ lệ dương tính với phân type virus cúm A/H5 là 7,1%, trong đó cúm A/H5N1 là 4,4%, cúm A/H5N6 là 2,6% (Nguyễn Lê Khánh Hằng, 2016)

Trong quá trình tiến hóa, virus cúm A/H5N1 ở Việt Nam xuất hiện các clade chủ yếu sau: Giai đoạn 2003 - 2005: khi dịch cúm gia cầm H5N1 mới xuất hiện vào cuối năm 2003, clade 1 lưu hành phổ biến ở các địa phương trong cả nước Trong năm 2006, chương trình tiêm chủng vắc xin cho gia cầm (vắc xin Re-1) được triển khai rộng khắp cả nước nên không xuất hiện các vụ dịch Giai đoạn 2007 - 2009, clade 2.3.4 phân dòng Phúc Kiến (Trung Quốc) về sau tiến hóa thành các clade 2.3.4.1, 2.3.4.2, 2.3.4.3 xuất hiện và lưu hành chủ yếu ở các tỉnh phía Bắc, sau năm

2010 không ghi nhận sự xuất hiện của clade 2.3.4 (Nguyễn Nam Thắng, 2012) Clade 1 và clade 1.1 lưu hành phổ biến ở tỉnh phía Nam và Đồng bằng sông Cửu Long Vắc xin Re-1 (chủng vắc xin clade 0), Re-5 (chủng vắc xin clade 2.3.4) nhập khẩu từ Trung Quốc được sử dụng để tiêm phòng cho gia cầm Cũng trong giai đoạn này, lần đầu tiên phát hiện clade 7 ở cửa khẩu Lạng Sơn (Le TH, 2014)

23

Clade 2.3.2 xuất hiện từ năm 2005 đến 2007, sau đó biến mất Năm 2010 xuất hiện clade mới 2.3.2.1 thay thế cho nhánh virus cũ 2.3.4 (Okamatsu, 2013), clade này sau đó tiến hóa, phát triển thành clade 2.3.2.1a, 2.3.2.1b Gia cầm tiêm phòng vắc xin cúm gia cầm thuộc clade 1 không bảo hộ được với virus cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1 (Nguyễn Ngọc Tiến, 2011) Ở khu vực phía Nam clade 1.1 tiến hóa thành các clade 1.1.1 và 1.1.2 Giai đoạn 2011- 2014, clade 2.3.2.1 tiếp tục gây bệnh ở các tỉnh miền Bắc, miền Trung và Tây Nguyên, cụ thể: clade 2.3.2.1a xuất hiện ở hầu khắp các tỉnh miền Bắc, miền Trung, Tây Nguyên và Đông Nam

Bộ Vắc xin Re-5 vẫn còn bảo hộ đối với clade 2.3.2.1a Clade 2.3.2.1b xuất hiện ở một số tỉnh miền Bắc, năm 2013 không ghi nhận sự xuất hiện của clade này Vắc xin Re-5 không bảo hộ được với virus cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1b Clade 2.3.2.1c xuất hiện năm 2012, gây bệnh khắp các tỉnh miền Bắc, Bắc Trung bộ và duyên hải miền Trung, gây bệnh và làm chết nhiều vịt, ngan Hiện nay clade 2.3.2.1a, c lưu hành khắp cả nước vắc xin đang sử dụng có hiệu lực bảo hộ thấp đối với clade 2.3.2.1c Ở miền Nam chủ yếu lưu hành các clade 1.1.1, 1.1.2, vắc xin Re-1, Re-5 vẫn còn hiệu quả đối với nhánh virus này (Le TH, 2014; Le, 2015; Cuong, 2016; Nguyễn Lê Khánh Hằng 2016)

1.2.2.2 Nghiên cứu sản xuất vắc xin phòng cúm gia cầm H5N1 ở Việt Nam

Từ năm 2003, khi dịch cúm gia cầm xuất hiện ở Việt Nam, Nhà nước đã có chủ trương nhập khẩu vắc xin để phòng chống dịch cúm gia cầm Chi phí cho việc này lên đến hàng trăm tỷ đồng mỗi năm, có những thời điểm dịch cúm gia cầm diễn biến rất phức tạp nên việc nhập khẩu vắc xin phòng cúm gia cầm đã gặp không ít khó khăn Để chủ động hơn trong việc cung cấp vắc xin phòng cúm A/H5N1 cho gia cầm, một số đơn vị nghiên cứu trong nước tiến hành các nghiên cứu để hướng tới việc tự sản xuất vắc xin Năm 2005, Viện Công nghệ sinh học đã tiếp nhận chủng vắc xin NIBRG-14 từ Viện Quốc gia về Tiêu chuẩn và Kiểm định sinh học, Vương Quốc Anh Đây là chủng virus được tạo bằng công nghệ di truyền ngược, tái

tổ hợp trên cơ sở 6 gen làm nền của chủng gốc A/PR/8/34 với các gen ha (H5) đã bị

đột biến mất hẳn 4 amino acid RRRL và đột biến thay thế 3 amino acid tại vùng gây

24

độc) và na (N1) có nguồn gốc từ chủng virus cúm H5N1 phân lập từ bệnh nhân Việt

Nam (A/Vietnam/1194/2004(H5N1)) Chủng này đã được Tổ chức Y tế thế giới công nhận về độ an toàn và khuyến cáo là một trong các chủng dùng cho sản xuất vắc xin trên thế giới (Lê Trần Bình, 2009) Trên cơ sở đề tài: “Đánh giá chất lượng vắc xin phòng bệnh cúm A/H5N1 cho gia cầm được sản xuất tại Việt Nam bằng chủng NIBRG-14” do Viện Công nghệ sinh học chủ trì thực hiện, Công ty Thuốc thú y Trung ương đã thực hiện dự án: “Sản xuất thử nghiệm vắc xin cúm A/H5N1 nhũ dầu để phòng bệnh cho gia cầm” Vắc xin được sản xuất dùng công nghệ nuôi cấy virus trên phôi gà 10-11 ngày tuổi, bất hoạt bằng formalin Đánh giá hiệu lực vắc xin cúm gia cầm H5N1 (chủng NIBRG-14) cho thấy sau khi gây miễn dịch lần

2 khoảng 3 tuần, hiệu giá HI đạt 6,2-6,7 log2 Vắc xin Navet-Vifluvac dựa trên chủng NIBRG-14 chỉ bảo vệ gia cầm chống lại clade 1 và clade 2.3.2.1a, mà không bảo hộ gia cầm khi công cường độc với clade 2.3.2.1b (Trần Xuân Hạnh, 2012) Nghiên cứu của tác giả Lê Thanh Hòa và cộng sự đã tạo được chủng virus tái tổ hợp giữa LasoTa và H5N1 Chủng tái tổ hợp có đáp ứng miễn dịch với cúm A/H5N1 và virus Newcastle ở quy mô phòng thí nghiệm với hiệu giá HI đạt từ 4log2 đến 7log2 (Lê Thanh Hoà, 2011)

Để có thể đáp ứng nhanh nhu cầu về vắc xin cúm gia cầm và phát triển thêm các loại vắc xin mới tiên tiến hơn, hiệu quả và dễ sử dụng hơn, một số nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa cho kháng nguyên HA trong thực vật đang được tiến hành ở

một số phòng thí nghiệm Việc nghiên cứu gen ha đã thành công trên cây thuốc lá,

đậu tương và bèo tấm Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng sinh đáp ứng miễn dịch trên động vật khi ăn thực vật chuyển gen này còn ở mức thấp Huyết

thanh gà ăn bèo tấm Lemma bibba và Lemna minor chuyển gen H5 có chứa kháng

thể kháng H5 với hiệu giá HI 2-3log2 (Lê Văn Sơn, 2009; Lê Huy Hàm, 2011)

Cùng với việc nghiên cứu vắc xin phòng cúm A/H5N1 cho gia cầm, các nghiên cứu sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 cho người được triển khai tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế, Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh Nguyễn Thu Vân và cộng sự đã nghiên cứu thành công quy trình công nghệ

25

sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 (FLUVAC) trên tế bào thận khỉ tiên phát ở quy mô phòng thí nghiệm từ chủng di truyền ngược rgH5N1 Vắc xin đã được tiến hành thử nghiệm lâm sàng trên người ở giai đoạn 3 (Nguyễn Thị Thu Vân, 2007) Nghiên cứu sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 cho người trên trứng gà có phôi từ chủng NIBRG-14 cũng được tiến hành tại viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế (Nguyễn Thị Minh Hiền, 2009; Dương Hữu Thái, 2013; Nguyễn Thị Lan Phương, 2015) Một số nghiên cứu sản xuất kháng nguyên HA bằng hệ biểu hiện baculovirus và công nghệ hạt tương tự virus đã được tiến hành ở một số phòng thí nghiệm (Nguyễn Thị Hoa, 2015; Phạm Thanh Hồng, 2015)

1.3 HỆ BIỂU HIỆN VI KHUẨN E COLI VÀ NẤM MEN P PASTORIS

1.3.1 Hệ biểu hiện E coli

E coli thuộc loại vi khuẩn Gram âm, có khả năng sinh sản nhanh với tốc độ

cao trên những môi trường nuôi cấy đơn giản và điều đặc biệt là chúng có khả năng thu nhận rất nhiều các yếu tố di truyền vận động từ môi trường ngoài như plasmid, phage,… Các yếu tố này có thể tồn tại và tái bản nhiều lần trong tế

bào E coli Vì vậy, E coli đã được cải biến để sử dụng như một vật chủ hữu

hiệu trong kỹ thuật tách dòng cũng như trong việc biểu hiện gen Nhiều nghiên cứu cho thấy, hiệu suất tổng hợp đạt được là rất cao đối với nhiều loại protein ngoại

lai trong tế bào E coli bằng các plasmid được thiết kế phù hợp Các plasmid được

chọn thường chứa promoter mạnh, được điều khiển chặt chẽ trong quá trình tổng hợp protein ngoại lai Ngoài ra, plasmid phải có số lượng bản sao lớn và tồn tại ổn định trong tế bào chủ (Gopal, 2013)

Bên cạnh những đặc điểm có lợi cho quá trình biểu hiện gen ngoại lai, hệ

biểu hiện E coli còn tồn tại một số khó khăn sau: (1) một số protein quan tâm được

tạo ra không chứa metionin hoặc formyl metionin ở tận cùng đầu N làm mất một số tính chất quan trọng của phân tử protein; (2) một số protein có nguồn gốc từ

eukaryot không được biểu hiện tốt trong E coli là do các phân tử protein này sau khi được tạo ra sẽ tiếp tục được glycosyl hóa, phosphoryl hóa, mà tế bào E coli

26

hoàn toàn không có khả năng này Do đó, rất khó biểu hiện gen có nguồn gốc từ

eukaryot trong tế bào E coli Mặc dù, còn tồn tại một số khó khăn nhưng E coli

vẫn là một trong những chủng được sử dụng rộng rãi nhất trong việc tạo ra những phân tử protein tái tổ hợp (Sahdev, 2008; Rosano, 2014)

Vector biểu hiện trong E coli là một phân tử DNA chứa tập hợp các nhân tố

di truyền được sắp xếp phù hợp cho việc điều khiển quá trình phiên mã, dịch mã

tổng hợp protein ngoại lai Trong E coli, vector biểu hiện thường gặp nhất là các

phân tử DNA plasmid Những plasmid được sử dụng trong công nghệ sinh học đều

là các phân tử DNA đã được biến đổi phù hợp cho việc biểu hiện những đoạn gen ngoại lai Một vector biểu hiện hoàn chỉnh phải bao gồm những thành phần sau: (1) vùng khởi đầu sao chép, là vị trí gắn của DNA polymerase và quyết định số lượng bản sao của plasmid trong tế bào; (2) các dấu chuẩn, thường là các gen kháng chất kháng sinh, có vai trò trong việc nhận biết các dòng tế bào mang plasmid; (3) vùng

đa nối là vùng chứa điểm cắt của một số enzyme hạn chế (có tần số xuất hiện thấp trên gen cấu trúc) để đưa đoạn gen ngoại lai vào vector; (4) vùng khởi đầu phiên mã

là vùng có trình tự DNA đặc biệt cho sự nhận biết tín hiệu khởi đầu phiên mã (Casali, 2003) Tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu, người ta còn thiết kế thêm một

số vùng khác nữa như vùng mã hóa cho đoạn peptide tín hiệu, vùng mã hóa cho đuôi His-Tag …

1.3.2 Chủng biểu hiện E coli BL21

Trong quá trình biểu hiện protein ngoại lai, người ta thường gặp phải một số vấn đề về chủng biểu hiện đó là các protein sau khi được biểu hiện bị các protease nội bào phân giải Để bảo vệ protein ngoại lai người ta sử dụng đoạn peptid tín hiệu

để đưa các protein này ra ngoài khoang chu chất, tuy nhiên không phải lúc nào cũng thực hiện được Do vậy, hiện nay người ta sử dụng biện pháp phổ biến là tạo các chủng biểu hiện mang các gen đột biến làm mất khả năng tổng hợp các protease

Chủng biểu hiện E coli BL21 là một chủng đột biến như vậy Tế bào E coli BL21 chứa đột biến lon protease (protease nội bào) và ompT protease (protease ngoại bào) Đây là các protease chủ yếu trong số hơn 40 protease của E coli, chủng đột

27

biến mất hai loại protease này đã hạn chế phân cắt protein tái tổ hợp (Phue, 2008;

Jeong H, 2015) Ngoài những đặc điểm trên, trong DNA hệ gen của E coli BL21 có

chứa gen mã hoá cho T7 RNA polymerase Đây là gen có nguồn gốc từ

bacteriophage T7 được đưa vào hệ gen của E coli BL21 đặt dưới sự điều khiển của promoter lac Chính nhờ những cải biến này mà E coli BL21 đã trở thành vật chủ

hữu hiệu trong việc biểu hiện gen ngoại lai, đặc biệt là những gen được đưa vào hệ vector pET (plasmid for Expression by T7 RNA polymerase) (Wagner, 2008)

1.3.3 Hệ biểu hiện P pastoris

Nấm men được xem là hệ biểu hiện hiệu quả trong việc biểu hiện các protein

có nguồn gốc từ eukaryot Nấm men có tốc độ sinh trưởng nhanh và lợi thế về thao

tác di truyền thuận tiện như E coli đồng thời lại có môi trường nhân chuẩn, thực

hiện được rất nhiều cải biến protein sau dịch mã như cắt bỏ các trình tự tín hiệu, bao gói, cuộn xoắn, tạo cầu disulfide, glycosyl hóa khiến protein ngoại lai có tính tan tốt, giữ được trạng thái tự nhiên và đảm bảo hoạt tính sinh học, vấn đề thường bị

hạn chế khi biểu hiện trong E coli Lợi thế của nấm men so với hệ biểu hiện tế bào

động vật là sinh trưởng rất nhanh, các trang thiết bị, môi trường nuôi cấy, kỹ thuật

xử lý, đặc biệt là quá trình tinh sạch protein tái tổ hợp đơn giản và kinh tế hơn (Gellissen, 2000; Li, 2007; Balamurugan, 2007)

1.3.3.1 Vector biểu hiện

Vector biểu hiện pPIC9

Vector biểu hiện pPIC9 được thiết kế có chứa gen kháng ampicillin dùng cho

chọn lọc trong tế bào E coli và gen his4 (histidinol dehydrogenase) dùng làm dấu chuẩn chọn lọc trong tế bào nấm men P pastoris Plasmid pPIC9 là một vector biểu hiện protein ngoại lai mạnh Trên vector có một số điểm của enzyme hạn chế như XhoI, EcoRI, NotI, SnaBI, AvrII nằm trong vùng đa nối để tạo điều kiện thuận lợi cho việc đưa gen ngoại lai vào vector Ngoài ra, vector này còn chứa một trình tự tiết α-MF prepro được gắn với promoter AOX1 để protein ngoại lai được tiết ra môi trường nuôi

cấy (Hình 1.4)

28

Gen ngoại lai

* đột biến

Hình 1.4: Sơ đồ cấu trúc plasmid pPIC9

(Nguồn: Invitrogen, 2010a)

Để gen ngoại lai có thể hoạt động và tồn tại bền vững trong chủng biểu hiện, vector biểu hiện được tích hợp vào hệ gen của vật chủ nhờ trao đổi chéo giữa các vùng tương đồng của vector biểu hiện và hệ gen của nấm men Thông thường,

vector được mở vòng bằng một số enzyme hạn chế như SalI, StuI nằm trong trình tự gen HIS4 để định hướng vector tích hợp hiệu quả vào gen his4 bị đột biến trong hệ gen chủng biểu hiện, đồng thời gen his4 được sử dụng như là dấu chuẩn chọn lọc

các thể tái tổ hợp Cơ chế tích hợp của vector pPIC9 vào hệ gen nấm men được thể

hiện trên Hình 1.5 (Invitrogen, 2010c)

Hình 1.5: Cơ chế tích hợp vector pPIC9 vào hệ gen P pastoris

(Nguồn: Invitrogen, 2010c)

29

Vector biểu hiện pPICZA

Với thiết kế tương tự như plasmid pPIC9 nhưng gọn nhẹ hơn, vector pPICZA có chứa gen kháng kháng sinh zeocin sử dụng làm dấu chuẩn cho chọn

lọc trong cả tế bào E coli và tế bào nấm men P pastoris Các thành phần khác như

trình tự một số enzyme hạn chế trong vùng đa nối, trình tự tín hiệu tiết, vùng khởi đầu phiên mã hoàn toàn tương tự như ở plasmid pPIC9 (Hình 1.6)

30

Để có thể hoạt động và tồn tại bền vững trong chủng biểu hiện, vector pPICZA cũng cần được tích hợp vào hệ gen của tế bào nấm men nhờ trao đổi chéo giữa vùng 5’AOX1 của vector với 5’AOX1 trên hệ gen và cài vào vị trí sau promoter AOX1 Thông thường, để định hướng vector tích hợp hiệu quả vào hệ gen

của nấm men P pastoris, vector biểu hiện được cắt mở vòng bằng enzyme hạn chế SacI hoặc PmeI hoặc BstI nằm trong trình tự 5’ AOX1 Hình 1.7 mô tả cơ chế tích

hợp của vector pPICZA vào hệ gen nấm men (Invitrogen, 2010b)

1.3.3.2 Chủng nấm men biểu hiện P pastoris

Nấm men P pastoris đã trở thành công cụ hữu hiệu cho biểu hiện các protein ngoại lai (Zhang, 2000; Daly, 2005; Ciarkowska, 2013) Nấm men P pastoris có

một promoter mạnh lấy từ promoter điều khiển phiên mã gen alcohol oxidase (AOX1) dùng cho phiên mã gen ngoại lai Gen này được điều khiển chặt chẽ và bị

ức chế trong điều kiện sinh trưởng không có methanol Trong môi trường có methanol, promoter được cảm ứng để khởi đầu phiên mã gen ngoại lai, đồng thời nấm men sử dụng methanol làm nguồn carbon cho sinh trưởng Vì vậy, có thể dễ dàng điều khiển sự tổng hợp gen ngoại lai trong nấm men (Cereghino, 2002; Ahmad, 2014)

Phần lớn các chủng P pastoris được sử dụng để biểu hiện protein tái tổ hợp đều bị gây đột biến gen his4 và đều có nguồn gốc từ chủng dại NRRL-Y 11430 Những chủng này không có khả năng tổng hợp histidinol dehydrogenase Chúng

sinh trưởng được trên môi trường giàu chất dinh dưỡng, nhưng trong môi trường cơ

bản cần phải bổ sung thêm histidine Do vậy, gen his4 của P pastoris được xem là

một chỉ thị nhận biết chủng chứa vector biểu hiện sau biến nạp do vector biểu hiện

chứa gen his4 bình thường Xét về khả năng sinh trưởng trên môi trường methanol thì các chủng P pastoris có 3 kiểu hình là Mut+, MutS vả Mut- (Cereghino 2000;

Balamurugan, 2007) Chủng có cả 2 gen aox1 và aox2 có khả năng sinh trưởng trên

môi trường methanol mạnh như chủng dại có kiểu hình Mut+

, chủng GS115 (his4 - không có hoạt tính histidinol dehydrogenase) Chủng bị loại bỏ phần lớn gen aox1

sinh trưởng chậm trên môi trường methanol có kiểu hình MutS (Methanol utilization

31

slow), ví dụ chủng KM71 (his4 aox1 :: ARG4) Chủng bị loại bỏ hoàn toàn cả 2 gen aox1 và aox2 không có khả năng sinh trưởng trên môi trưởng methanol có kiểu

hình là Mut-, ví dụ chủng MC 100-3 (his4 arg4 aox1 :: ARG4 aopx2::Phis4) Tất

cả các chủng này vẫn có khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp tốt nhờ có promoter

AOX1 Tuy nhiên, các chủng Mut- rất mẫn cảm với nồng độ methanol dư thừa cao

Do vậy, sự thay đổi đột ngột các mức độ methanol dư thừa thường dẫn đến mất hoạt tính AOX và thậm chí tế bào có thể chết Để khắc phục nhược điểm này, các chủng Mut- có thể được nuôi cấy theo mẻ (fed-batch), hoặc sử dụng chủng MutS không mẫn cảm với nồng độ methanol dư thừa cao bởi vì tốc độ tiêu thụ methanol của chúng thấp Chủng X33 là chủng nấm men dạng dại, có sức sống tốt, thường được

sử dụng cùng dòng các vector biểu hiện pPICZ và pPICZ Các dòng tái tổ hợp được chọn lọc dựa trên khả năng sinh trưởng trên môi trường có chứa kháng sinh zeocin giúp giảm thiểu tối đa hiện tượng tạp nhiễm, chủng X33 có chứa gen alcohol oxidase 1, chịu trách nhiệm chuyển hóa 85% methanol tiêu dùng bằng enzyme alcohol oxidase và vì vậy có kiểu hình dạng dại (methanol utilization – Mut+

) Ngoài ra, nồng độ các chất khác của tế bào như proteinase cũng sẽ tăng theo mật độ

tế bào Điều này đặc biệt ảnh hưởng đến các protein tiết trong nuôi cấy tế bào mật

độ cao, bởi vì sự phân hủy tế bào sẽ giải phóng protease vào môi trường nuôi cấy dẫn đến các protein tiết sẽ bị phân hủy nhanh chóng (Ahmad, 2014) Do vậy, sử dụng chủng biểu hiện bị loại bỏ bớt các gen mã hóa các proteinase sẽ giảm sự phân hủy protein tiết

P pastoris SMD1165 và SMD1168 là các chủng khuyết protease có thể

được dùng để biểu hiện nhiều loại protein ngoại lai nhất định Các gen bị gây đột

biến trong chủng khuyết protease là gen pep4 và prb1 Gen pep4 mã hóa cho

enzyme proteinase A là enzyme cần thiết cho sự kích hoạt các protease khác như

carboxypeptidase Y và proteinase B Gen prb1 mã hóa cho enzyme proteinase B Chủng SMD1165 bị đột biến gen prb1 chỉ bị mất hoạt động của proteinase B Chủng đột biến gen pep4 (SMD1168) có hoạt động của carboxypeptidase Y và

proteinase A bị giảm đáng kể hoặc bị loại bỏ hoàn toàn và hoạt động của proteinase

B bị giảm một phần (Gleeson, 1998)

32

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ

2.1.1 Chủng vi sinh vật

Chủng vi khuẩn E coli DH5 [end A1 rec A1 hsd R17 sup E44 gyp A96

thi-1 relAthi-1 lac U169 (80 lacZM15)], E coli DH10b [F-gyrA462 endA1 (sr1-recA) mcrB mrr hsdS20(rB-, mB-) supE44 ara14 galK2 lacY1 proA2 rpsL20(Smr) xyl5

leu mtl1] (Invitrogen) được sử dụng để nhân dòng gen; chủng E coli BL21 omp hsd SB (rBmB) gel dem (DE3) plysS (Caml)], P pastoris SMD1168 (his4

[F-pep4) và P pastoris X33 (Invitrogen) được sử dụng để biểu hiện gen ha1, ha1-2

2.1.2 Plasmid

- pCRH5 mang gen ha0 có nguồn gốc từ chủng A/chicken/Hatay/2004(H5N1) thuộc clade 1 do Phòng Vi sinh phân tử/Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cung cấp

- Plasmid pCR2.1 (Novagen) được sử dụng làm vector tách dòng; pET22trx (pET22b(+) mang gen mã hóa thioredoxin do Phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công

nghệ sinh học thiết kế) được sử dụng làm vector biểu hiện gen trong tế bào E coli

BL21 Plasmid pPIC9 và pPICZA (Invitrogen) được sử dụng làm vector tách dòng

và biểu hiện trong nấm men

2.1.3 Kháng nguyên HA, huyết thanh kháng HA, động vật thí nghiệm

Kháng nguyên HA chủng A/Hong kong/213/2003(H5N1) (Sino Biological Inc) dùng làm kháng nguyên chuẩn để định lượng protein HA; chủng virus H5N1 phân cắt do Cơ quan Nghiên cứu thú y (Anh) cung cấp được sử dụng đề xác định hiệu giá HI; huyết thanh thỏ kháng HA virus cúm A/H5N1 do Phòng Vi sinh vật học phân tử, Viện Công nghệ sinh học cung cấp Huyết thanh thỏ được bảo quản ở -

20oC Gà giống Lương Phượng; hồng cầu gà do Trung tâm gia cầm Thụy Phương/Viện Chăn nuôi cung cấp

2.1.4 Thiết kế mồi nhân gen

Các cặp mồi dùng trong nghiên cứu được thiết kế dựa trên trình tự gen ha,

trình tự plasmid pET22b(+) và pPIC9 Các cặp mồi được tổng hợp tại hãng Invitrogen có trình tự như trong Bảng 2.1

33

Bảng 2.1: Trình tự các cặp mồi nhân gen trx, ha1 và ha1-2

trxha1-F/ SnaBI ttacgtaatgagcgataaaattattcacc Khuếch đại

trxha1, trxha1-2

từ plasmid pET22ha1,

pET22ha1-2

1,4 kb 1,8 kb

trxha1-R/ NotI tgcggccgctcagtggtggtggtggtggt

trx-F/ SnaBI ttacgtaatgagcgataaaattattcacc Khuếch đại gen

trx từ pET22ha1 0,4 kb trx-R/ NotI ggccatggcagaatgatgatgatg

5’ AOX1 gactggttccaattgacaac Nhân đoạn gen

vùng AOX1

0,4 và 2,2 kb 3’ AOX1 gcaaatggcattctgacatcc

2.1.5 Hóa chất và thiết bị

Hóa chất

- Thang DNA, thang protein (Fermentas), dNTPs SDS, Tris-HCl, glycine, phenol, ethidium bromide, glycerol, agarose, ampicillin, methanol, ethanol, isoamylalcohol, chloroform, sorbitol, dextrose, MgSO4, MgCl2, CaCl2, NaOH, NaCl, glucose, cao nấm men, peptone, d-NTPs, bộ kit tinh sạch DNA, zeocin, yeast nitrogen base, biotin, IPTG, polyacrylamide, lysozyme, triton X-100, urea, 1,4-Dithiothreitol, ammonium sulfate và các hóa chất thông dụng khác được cung cấp

từ các hãng Merk, Biolab, Invitrogen

- Các enzyme: NcoI, NdeI, SnaBI, NotI, StuI, XbaI ; Taq-DNA polymerase,

T4-DNA ligase (Biolabs, Fermentas); kháng thể kháng IgG thỏ cộng hợp HRP (Thermo Scientific)

- Màng PVDF (Bio-Rad), cột sắc ký ái lực HiTrap (XK 16, Amersham Bioscience)

Thiết bị máy móc

Máy PCR (MJ Research, Mỹ), máy ly tâm Eppendorf; hệ thống điện di

34

DNA, máy biến nạp bằng xung điện, hệ thống điện di protein, chuyển màng Rad, Mỹ), tủ cấy vô trùng, máy lắc ổn nhiệt (New Jersey, Mỹ), máy ly tâm lạnh cỡ lớn (Sorvall RC5B, Mỹ), máy đo pH (Metler, Thụy Sỹ), hệ thống lên men đa bình Greta (Belanch Bioteknik, Thụy Điển)

(Bio-2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu, bố trí thí nghiệm

E coli là hệ biểu hiện có khả năng sinh trưởng nhanh, dễ thao tác, dễ nuôi

cấy nên được lựa chọn để biểu hiện kháng nguyên HA Với các ưu điểm như biểu hiện các protein ngoại lại ở dạng tiết ra môi trường nuôi cấy, thực hiện sửa đổi sau phiên mã tương tự như các tế bào bậc cao, môi trường nuôi cấy đơn giản nên nấm

men P pastoris cũng được lựa chọn để biểu hiện kháng nguyên HA Các cấu trúc gen được biểu hiện trong E coli và P pastoris được thể hiện trong Bảng 2.2

Bảng 2.2: Các cấu trúc gen được biểu hiện trong E coli và P pastoris

Kích thước gen

trx-te-ha1;

trx-te-ha1-2

Tiểu phần HA1, HA1 nối với

HA2 trong đó chuỗi amino acid

kiềm tính vùng phân cắt protein

HA được thay thế bởi peptide nối

có cấu trúc GGGSGGGS được

biểu hiện trong pET22b(+) dưới

dạng dung hợp với thioredoxin

trx-te-ha1-P pastoris

SMD1168

pPIC9

mha1 Trình tự gen ha1 được cải biến

toàn bộ để phù hợp với hệ biểu

hiện ở nấm men P pastoris

P pastoris X33 pPICZα 1 kb

trxha1;

trxha1-2

Tiểu phần HA1, HA1-2 được

biểu hiện dưới dạng dung hợp

với Trx nhưng không mang vùng

nhận biết cắt bởi thrombin và

35

Sau khi biểu hiện trong tế bào E coli và nấm men P pastoris, protein tái tổ

hợp được tinh chế và kiểm tra sơ bộ tính sinh miễn dịch Từ các kết quả sơ bộ tính sinh miễn dịch của các protein HA tái tổ hợp, chúng tôi lựa chọn cấu trúc protein

HA tái tổ hợp có tính sinh miễn dịch cao, tối ưu các điều kiện thích hợp cho quá trình biểu hiện gen và lên men các chủng này trong thiết bị lên men nhằm thu được lượng lớn protein tái tổ hợp Protein tái tổ hợp được thu hồi từ dịch lên men và sử dụng để đánh giá tính sinh miễn dịch trên gà làm cơ sở cho việc phát triển vắc xin tái tổ hợp dưới đơn vị phòng cúm A/H5N1 Toàn bộ quá trình nghiên cứu được trình bày trên Hình 2.1

Hình 2.1: Sơ đồ tổng quát nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên HA

Biểu hiện TrxHA1E

TrxHA1-2E trong E coli BL21

Biểu hiện HA1, HA1-2; MHA1; TrxHA1, TrxHA1-2

Trx-TE-trong nấm men P pastoris

Tinh chế

Tối ưu các điều kiện môi trường nuôi cấy, nồng độ chất cảm ứng,

pH, thu hồi protein tái tổ hợp lớn nhất

Lựa chọn chủng nấm men có khả năng biểu hiện protein

HA năng suất cao

Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ, nồng

độ chất cảm ứng, thời gian đến khả

năng biểu hiện TrxHA1E, TrxHA1-2E

Kiểm tra sơ bộ tính sinh miễn dịch;

lựa chọn cấu trúc protein HA tái tổ hợp có tính sinh miễn dịch cao

Đánh giá tính sinh miễn dịch của protein HA tái tổ hợp

Tinh chế

Khảo sát liều protein HA tái tổ hợp gây miễn dịch

36

2.2.2 Các phương pháp sinh học phân tử

Các phương pháp sinh học phân tử sử dụng trong nghiên cứu được tiến hành

theo Sambrook; Ausubel và cộng sự (Sambrook, 2001; Ausubel, 2003)

2.2.2.1 Tách chiết plasmid

Lấy một khuẩn lạc E coli tái tổ hợp cấy vào 2 ml môi trường LBA (cao nấm

men 0,5%, bactor peptone 1%, NaCl 1%) có bổ sung Amp nồng độ 100 g/ml, nuôi cấy lắc 200 vòng/phút qua đêm ở 37oC Tế bào được thu lại bằng cách ly tâm 5000

vòng/phút trong 5 phút và hòa vào 100 µl dung dịch I (50 mM glucose; 25 mM Tris-HCl, pH 8,0; 10 mM EDTA, pH 8,0) Mẫu được làm huyền phù bằng vortex và

để yên ở nhiệt độ phòng 5 phút

Bổ sung 200 µl dung dịch II (0,2 M NaOH; 1% SDS), đảo đều nhẹ nhàng và đặt trên đá khoảng 10 phút Thêm 150 µl dung dịch III lạnh (3 M potassium acetate;

11,5% acetic acid), đảo đều nhẹ nhàng và đặt trên đá khoảng 5 phút Bổ sung 450 µl

phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1), lắc nhẹ để các protein nhỏ hòa tan vào dịch có phenol Ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút Hút nhẹ nhàng dung dịch lớp trên và chuyển sang ống Eppendorf mới, sau đó dùng 2 lần thể tích ethanol 100% để tủa plasmid DNA ở -20oC trong 30 phút Ly tâm thu DNA ở 13000 vòng/phút trong

15 phút Tủa được rửa lại bằng ethanol 70%, làm khô bằng máy Speed Vac và hòa tan trong 40 µl TE (Tris HCl 10 mM, pH 7,4; EDTA 1 mM, pH 8) DNA plasmid được kiểm tra trên gel agarose 0,8% và giữ ở -20oC (Ausubel, 2003)

2.2.2.2 Kỹ thuật PCR khuếch đại gen trxha1, trxha1-2

7 Plasmid khuôn (20 µg/ml) 1

8 H2O (khử ion, khử trùng) 14,5

37

Các đoạn gen ha1, ha2, trxha1, trxha1-2 được khuếch đại bằng các cặp mồi

tương ứng như được chỉ ra ở Bảng 2.1 Một phản ứng PCR được tiến hành trong tổng thể tích 25 l gồm các thành phần như ở Bảng 2.3

2.2.2.3 Xử lý DNA bằng enzyme hạn chế

Phản ứng cắt với enzyme hạn chế được tiến hành trong tổng thể tích 10 l gồm các thành phần sau: Nước cất khử ion vô trùng: 6,8 l, DNA: 2 l (khoảng 20 ng), dung dịch đệm (10X): 1 l, enzyme hạn chế (2 U/l): 0,2 l Hỗn hợp phản ứng được trộn đều, ủ ở nhiệt độ 37oC trong thời gian thích hợp với từng loại enzyme Sản phẩm của phản ứng cắt được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose

2.2.2.4 Phản ứng ghép nối gen

Đây là phản ứng gắn các đoạn DNA nhờ hoạt động của enzyme T4 DNA ligase Thành phần phản ứng gồm: DNA tinh sạch: 4 l (50 – 100 ng), vector đã mở vòng: 1 l (50 ng), đệm cho T4 DNA ligase (10X): 1 l, T4 DNA ligase (5 U/l): 1

l, nước cất khử ion vô trùng: 3 l Hỗn hợp phản ứng được trộn đều và ủ ở 16o C trong 3 giờ

2.2.2.5 Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E coli

Chuẩn bị tế bào E coli khả biến:

Một khuẩn lạc đơn E coli được chuyển vào 5 ml môi trường LB lỏng, lắc

200 vòng/phút qua đêm ở 37oC Hút 0,5 ml dịch nuôi cấy chuyển sang 50 ml môi trường LB lỏng, tiếp tục cấy lắc 200 vòng/phút ở 37oC cho tới khi đạt OD600đạt 0,4 đến 0,6 Tế bào được lấy ra và đặt lên đá khoảng 1 giờ Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút và thu tế bào Hòa tế bào thu được trong 50 ml CaCl2 100 mM (vô trùng) Ủ mẫu 15 phút và ly tâm thu tế bào ở 4000 vòng/phút trong 10 phút Sinh khối tế bào được hòa lại trong 25 ml CaCl2 100 mM, ủ mẫu 60 phút trên đá, ly tâm

4000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC và thu tế bào Hòa tế bào trong 0,5 ml CaCl2

100 mM và bổ sung 15% glycerol Tế bào trong dung dịch lúc này đã trở nên khả biến, dễ dàng cho các phân tử DNA đi qua lỗ màng vào tế bào Để tiện sử dụng, mẫu được chia vào các ống Eppendorf và bảo quản ở -80oC cho tới khi sử dụng (Sambrook, 2001)

38

Biến nạp DNA plasmid vào tế bào vi khuẩn:

Tế bào khả biến được lấy ra từ tủ -80oC và được làm tan dần trên đá trong khoảng 30 phút để tránh hiện tượng sốc nhiệt Bổ sung 20-50 ng DNA vào 100 µl tế bào khả biến và đảo nhẹ nhàng để DNA phân bố đều trong hỗn hợp tế bào Sau đó, mẫu được để trên đá trong 15 phút Sốc nhiệt bằng cách mẫu được chuyển sang bể

ổn nhiệt với nhiệt độ là 42oC và ủ trong 1 phút 30 giây, lấy mẫu ra khỏi bể ổn nhiệt rồi đặt trên đá trong 2 phút Bổ sung 0,9 ml LB lỏng, lắc 200 vòng/phút ở 37oC trong 45 đến 50 phút Hút 50 µl dịch tế bào và cấy trải trên đĩa môi trường LB đặc

có bổ sung ampicilin 100 µg/ml và ủ đĩa ở 37oC qua đêm (Sambrook, 2001)

2.2.2.6 Tách chiết DNA nấm men P pastoris

Quá trình tách chiết DNA nấm men được thực hiện theo tài liệu hướng dẫn

của hãng Invitrogen (Invitrogen, Catalog no K1710-01) Chủng nấm men P pastoris tái tổ hợp được nuôi cấy lắc 200 vòng/phút trên 10 ml trong môi trường

MD (YNB 1,34%; dextrose 1%; biotin 4x10-5 %) ở 30oC cho đến khi OD600 đạt từ 5 đến 10 Tế bào được thu lại bằng ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút thu tế bào và rửa lại bằng 200 ml H2O cất vô trùng Tiếp theo tế bào được hòa vào 2 ml đệm SCED, pH 7,5 (1 M sorbitol; 10 mM sodium citrate pH 7,5; 10 mM EDTA; 10 mM dithiotheitol), bổ sung 3 mg/ml zymolyase và ủ ở 37o

C trong 50 phút, bổ sung 400

µl dung dịch SDS 1%, trộn đều nhẹ nhàng và đặt trên đá trong 5 phút Bổ sung 300

µl potassium acetate 5 M, pH 8,9 và trộn đều nhẹ nhàng, ly tâm 13000 vòng/phút

10 phút ở 4oC, thu dịch ở pha trên

Bổ sung 2 lần thể tích ethanol 100% và ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút Ly tâm

13000 vòng/phút trong 10 phút, thu tủa, hòa tan tủa vào 400 µl đệm TE, pH 7,4 Bổ sung 400 µl hỗn hợp 1 phenol: 1 chloroform trộn đều, ly tâm 13000 vòng/phút, thu dịch trên Bổ sung 1/2 thể tích dung dịch ammonium acetate 7,5 M, pH 7,5 và 2 lần thể tích ethanol 100% và ủ ở -20oC trong 60 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút và thu tủa Tủa được rửa bằng 1 ml ethanol 70%, ly tâm 13000 vòng/phút trong

5 phút Hòa tan tủa vào 30 µl đệm TE, pH 7,5 và bảo quản ở -20o

C

39

2.2.2.7 Biến nạp DNA plasmid vào hệ gen nấm men P pastoris

Chuẩn bị tế bào khả biến: tế bào nấm men P pastoris được chuẩn bị theo

quy trình sau: cấy chuyển 1 khuẩn lạc tế bào nấm men vào 5 ml môi trường YPD (cao nấm men 1%; peptone 2%; glucose 2%), lắc 200 vòng/phút ở 28oC qua đêm Hút 30 µl dịch nuôi cấy cho vào 100 ml môi trường YPD, lắc ở cùng điều kiện trong thời gian từ 14 đến 16 giờ cho đến khi OD600 đạt từ 1,2 đến 1,5 Mẫu được lấy

ra và đặt trên đá từ 5 đến 10 phút Bắt đầu từ bước này tất cả các thao tác tiếp theo đều phải tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thấp Ly tâm 5000 vòng/phút trong 4 phút để thu tế bào Sau đó tế bào được hòa vào 100 ml nước khử ion lạnh đã vô trùng và ly tâm ở cùng điều kiện Tế bào thu được hòa lại trong 20 ml sorbitol 1M,

ly tâm thu tế bào ở tốc độ 4500 vòng/phút trong 5 phút Tế bào được hòa lại bằng một lượng tối thiểu sorbitol 1M và chia đều vào các ống Eppendorf, mỗi ống chứa

40 µl dịch tế bào dùng cho xung điện

Biến nạp DNA plasmid vào tế bào bằng xung điện: Bổ sung 1 đến 5 µl plasmid DNA vào 40 µl dịch tế bào và đảo nhẹ để plasmid DNA phân bố đều Chuyển dịch tế bào mang plasmid DNA vào trong cuvet kích thước 0,2 cm (đã đặt ở trong điều kiện lạnh) Xung điện được tiến hành ở điều kiện 25 µF, 200 Ω, 1,5 kV trong 4 đến 5 micro giây Sau đó bổ sung ngay 1 ml sorbitol 1 M lạnh vào mẫu, dùng pipet đảo đều và chuyển mẫu vào ống Eppendorf Trải khoảng 100 µl sản phẩm biến nạp lên môi trường MD và nuôi ở 28o

C trong 2 ngày (Invitrogen, Catalog no K1710-01)

2.2.2.8 Cải biến mã bộ ba gen ha1

Sử dụng công cụ phân tích mã bộ ba hiếm (Rare Codon Analysis Tool) của

hãng Genscript để kiểm tra sự phù hợp của trình tự gen ha1 với hệ biểu hiện P pastoris (https://www.genscript.com/tools/rare-codon-analysis) Sự phân tích dựa

trên các tiêu chí sau: CAI (Codon Adaption Index – Chỉ số phù hợp mã bộ ba); hàm lượng G + C và sự phân bố của GC dọc theo chiều dài của gen; sự phân bố tỷ lệ phần trăm các mã bộ ba

40

Nguyên tắc của cải biến gen là thay đổi codon sử dụng cho phù hợp với tRNA chủng biểu hiện nhưng vẫn mã hóa cho amino acid đó, cải biến để cân bằng

tỷ lệ sử dụng codon phù hợp với chủng biểu hiện P pastoris (nâng cao chỉ số CAI)

và điều chỉnh hàm lượng GC ở mức thấp hơn và phân bố đều hơn trên gen Gen ha1

sau khi cải biến được đem phân tích sử dụng công cụ phân tích codon hiếm và đặt hãng Genscript tổng hợp và đưa vào vector pPICZαA

2.2.3 Phương pháp biểu hiện gen ha

2.2.3.1 Biểu hiện gen ha trong E coli

Khuẩn lạc chủng E coli BL21 mang pET22ha1, pET22ha1-2 và chủng E coli BL21 chứa plasmid pET22b(+) (chủng đối chứng) được cấy vào 2 ml môi

trường LB lỏng chứa ampicillin nuôi cấy ở nhiệt độ 30oC, 200 vòng/phút qua đêm

Sinh khối tế bào E coli được chuyển sang môi trường LB mới, tiếp tục nuôi cấy ở

nhiệt độ 30o

C, 200 vòng/phút Khi OD600nm của dịch nuôi cấy đạt 0,6-0,8, bổ sung IPTG đến nồng độ 0,5 mM và nuôi cấy tiếp ở 30oC trong 4 giờ Sinh khối tế bào được thu lại bằng ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút, hòa tan tủa trong nước cất sao cho OD600nm = 20, bảo quản mẫu ở nhiệt độ - 20oC

Sinh khối tế bào E coli thu nhận ở trên được sốc nhiệt ở 55oC, sau đó tiến hành siêu âm trên đá, ly tâm 10.000 vòng/phút để loại bỏ pha tan Rửa tủa 3 lần bằng nước cất và rửa lại bằng đệm B1 (Tris 20 mM, EDTA 1 mM, NaCl 500 mM,

pH 7) Thu phân đoạn chứa protein HA bằng đệm B2 (đệm B1 + urea 2 M + DTT

10 mM) Protein tái tổ hợp bảo quản ở - 20o

C (Ausubel, 2003)

2.2.3.2 Biểu hiện gen ha trong nấm men P pastoris

Khuẩn lạc chủng nấm men P pastoris SMD1168 mang gen ha1, ha1-2, trxha1, trxha1-2, mha1 và chủng P pastoris SMD1168 mang plasmid pPIC9 (đối

chứng âm) được cấy vào trường MD lỏng (1,34% YNB; 4 x 10-5% biotin; 2% dextrose) và nuôi lắc 200 vòng/phút ở 28oC trong 24 giờ OD600 đạt 2 đến 6 Chuyển 1% dịch nuôi cấy sang môi trường BMGY (100 mM potassium phosphate, pH 6,0; 1,34% YNB; 4 x 10-5% biotin; 1% glycerol; 1% cao nấm men; 1% peptone), tiếp tục nuôi cấy khoảng 16h đến 18h để OD600 đạt 2 đến 6 Tế bào được thu lại bằng ly