Nghiên cứu phân lập và tinh chế notoginsennosid r1 từ nguyên liệu saponin toàn phần của tam thất làm chất chuẩn phục vụ công tác kiểm nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN VIỆT THÚY NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ NOTOGINSENOSID R1 TỪ NGUYÊN LIỆU SAPONIN TOÀN PHẦN CỦA TAM THẤT LÀM CHẤT C

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN VIỆT THÚY

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ

NOTOGINSENOSID R1 TỪ NGUYÊN LIỆU

SAPONIN TOÀN PHẦN CỦA TAM THẤT LÀM

CHẤT CHUẨN PHỤC VỤ CÔNG TÁC

KIỂM NGHIỆM

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN VIỆT THÚY

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ

NOTOGINSENOSID R1 TỪ NGUYÊN LIỆU SAPONIN TOÀN PHẦN CỦA TAM THẤT LÀM

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin cảm ơn PGS.TS Đoàn

Cao Sơn- Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Bộ Y tế, người

thầy đã trực tiếp hướng dẫn, dành nhiều thời gian và tâm huyết giúp tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám hiệu, phòng Quản

lý đào tạo sau đại học, bộ môn Hóa phân tích trường Đại học Dược Hà Nội cùng các thầy cô đã trực tiếp giảng dạy và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại trường cũng như trong quá trình thực hiện luận văn

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn ThS Nguyễn Tuấn Anh, ThS Trần Thị Thu Trang là những người đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc và các đồng nghiệp tại Khoa Kiểm nghiệm Đông dược Dược liệu - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương

đã hết sức giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có thể thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp một cách thuận lợi

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã ủng hộ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập vừa qua

Hà Nội, ngày 30 tháng 3 năm 2017

Học viên Nguyễn Việt Thúy

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ACN Acetonitril

13

C-NMR 13-Carbon nuclear magnetic resonance

C18 Octadecyl silance silica

Detector chuỗi (dãy) diốt phát quang

Ion phun hóa điện tử

Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier

1

H-NMR Proton nuclear magnetic resonance

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Độ lệch chuẩn tương đối

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng USP Dược điển Mỹ

VKNT TP.HCM Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp Hồ Chí Minh

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3

1.1 Vài nét về chất đối chiếu 3

1.1.1 Vài nét về chất chuẩn 3

1.1.2 Khái quát về thiết lập chất chuẩn từ dược liệu 4

1.2 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu 5

1.2.1 Dược liệu Tam thất 5

1.2.2 Nguyên liệu Saponin toàn phần của tam thất: 6

1.2.3 Tổng quan về nhóm hoạt chất saponin triterpenoid nhóm Damaran 7

1.2.4 Tổng quan về notoginsengnosid R1 7

1.2.4.1 Đặc điểm và tính chất 7

1.2.4.2 Tác dụng dược lý của notoginsenosid R1: 8

1.2.5 Vài nét về Rg1 8

1.2.6 Vài nét về Rb1 9

1.3 Tổng quan về phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế 11

1.3.1 Vài nét về chiết xuất dược liệu 11

1.3.2 Vài nét về phân lập và tinh chế 11

1.4 Tổng quan một số phương pháp hoá lý sử dụng trong nghiên cứu đề tài 12

1.4.1 Sắc ký lớp mỏng 12

1.4.1.1 Nguyên tắc 12

1.4.1.2 Các đại lượng đặc trưng 12

1.4.1.3 Ứng dụng 13

1.4.2 Sắc ký lỏng hiệu năng cao 14

1.4.2.1 Nguyên tắc 14

1.4.2.2 Một số đại lượng đặc trưng của quá trình sắc ký 14

1.4.2.3 Ứng dụng 15

1.4.3 Phổ khối) 16

1.4.3.1 Nguyên tắc 16

1.4.3.2 Ứng dụng 16

1.4.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 17

1.4.4.1 Nguyên tắc 17

1.4.4.2 Các đại lượng đặc trưng 17

1.4.4.3 Ứng dụng 18

1.4.5 Sắc ký cột 18

1.4.5.1 Cột 18

1.4.5.2 Hóa chất dùng làm cột 18

1.4.5.3 Dung môi 19

1.4.5.4 Ứng dụng: 19

1.4.6 Đo nhiệt độ nóng chảy 19

1.4.7 Quang phổ tử ngoại khả kiến 20

1.4.8 Phương pháp đo phổ hồng ngoại 20

1.4.8.1 Nguyên tắc 20

1.4.8.2 Ứng dụng 21

1.5 Tình hình chiết xuất, phân lập và tinh chế notoginsenosid R1 21

1.5.1 Tình hình nghiên cứu ở trong nước 21

1.5.2 Tình hình nghiên cứu ở ngoài nước: 22

1.6.Vài nét về phân tích định lượng notoginsenosid R1: 26

CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG TIỆN, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.1 Nguyên liệu 30

2.2 Phương tiện 30

2.2.1 Thiết bị, dụng cụ 30

2.2.2 Dung môi, hóa chất, chất chuẩn 31

2.3 Nội dung nghiên cứu 31

2.3.1 Phân lập và tinh chế notoginsenosid R1 từ nguyên liệu saponin toàn phần của tam thất 31

2.3.2 Xác định cấu trúc, nhận dạng và đánh giá độ tinh khiết của chất chiết được 32

2.3.3 Xây dựng và thẩm định phương pháp HPLC định lượng notoginsenosid R1 tinh chế được 32

2.3.4 Xây dựng và thẩm định phương pháp HPLC xác định giới hạn tạp chất liên quan của notoginsenosid R1 tinh chế được 32

2.3.5 Đưa ra dự thảo tiêu chuẩn cho chất chuẩn phòng thí nghiệm

notoginsenosid R1 32

2.3.6 Áp dụng định tính, định lượng notoginsenosid R1 trong dược liệu tam thất lưu hành trên thị trường 32

2.4 Phương pháp nghiên cứu 32

2.4.1 Phương pháp phân lập và tinh chế notoginsenosid R1từ nguyên liệu Saponin toàn phần của tam thất 32

2.4.1.1.Phân lập:……….30

2.4.1.2 Tinh chế: 33

2.4.2 Xác định cấu trúc của chất notoginsenosid R1 tinh chế được 34

2.4.3 Định tính và đánh giá độ tinh khiết của chất notoginsenosid R1 tinh chế được 34

2.4.4 Xác định hàm lượng của notoginsenosid R1 tinh chế được 34

2.4.4.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 34

2.4.4.2 Thẩm định phương pháp phân tích 34

2.4.5 Sử dụng notoginsenosid R1 tinh chế được làm chuẩn làm việc tiến hành định tính định lượng notoginsenosid R1 trong dược liệu tam thất theo DĐTQ 2010 36

2.4.5.1 Định tính notoginsenosid R1 trong dược liệu tam thất 36

2.4.5.2 Định lượng notoginsenosid R1 trong dược liệu tam thất bằng phương pháp HPLC 37

2.4.6 Phương pháp xử lý số liệu 37

2.4.7 Phương pháp đánh giá kết quả 37

CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 38

3.1 Xây dựng qui trình phân lập và tinh chế notoginsenosid R1 từ nguyên liệu Saponin toàn phần của tam thất 38

3.1.1 Định lượng hàm lượng notoginsenosid R1 trong nguyên liệu Saponin toàn phần của tam thất 38

3.1.2 Xây dựng quy trình phân lập notoginsenosid R1 39

3.1.2.1 Nghiên cứu lựa chọn phương pháp phân lập 39

3.1.2.2 Quy trình phân lập notoginsenosid R1 trên cột silicagel 42

3.1.2.3 Kiểm tra độ lặp lại trên quy trình phân lập 51

3.1.3 Tinh chế 51

3.1.3.1 Nghiên cứu lựa chọn phương pháp tinh chế 51

3.1.3.2 Quy trình tinh chế 52

3.2 Xác định cấu trúc, nhận dạng chất tinh chế đƣợc 57

3.2.1 Tính chất: Sản phẩm là dạng bột vô định hình, màu trắng 57

3.2.2 Nhiệt độ nóng chảy: Chất tinh chế được sấy khô ở 50C đến khối lượng 63

3.2.3 Phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến: 57

3.2.4 Phổ hồng ngoại 57

3.2.5 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 59

3.2.6 Phổ khối 62

3.3 Đánh giá độ tinh khiết của notoginsenoside R1 tinh chế đƣợc 63

3.3.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp để định tính, định lượng otoginsenosid R1 tinh chế được bằng HPLC với detector DAD 63

3.3.1.1 Lựa chọn phương pháp 63

3.3.1.2.Thẩm định phương pháp phân tích 64

3.3.1.3 Định tính, định lượng notoginsenosid R1 trong chất tinh chế được bằng phương pháp HPLC đã thẩm định 70

3.4 Xác định giới hạn tổng cộng các tạp chất liên quan của notoginsenosid R1 tinh chế đƣợc 72

3.4.1 Xây dựng phương pháp 72

3.4.2 Thẩm định phương pháp 73

3.4.3 Kết quả 77

3.5 Áp dụng định tính, định lƣợng notoginsenosid R1 trong dƣợc liệu tam thất 78

3.5.1 Định tính bằng phương pháp SKLM 78

3.5.1.1 Điều kiện sắc ký 78

3.5.1.2 Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch thử 78

3.5.1.3 Tiến hành 78

3.5.1.4 Kết quả 79

3.5.2 Định tính, định lượng bằng phương pháp HPLC với detector DAD 79

3.5.2.2 Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch thử 80

3.5.2.3 Kết quả 80

3.6.1 Phân lập và tinh chế ginsenosid Rg1 83

3.6.1.1.Quá trình phân lập và tinh chế ginsenosid Rg1 84

3.6.1.2.Xác định hàm lượng G-Rg1 của cắn E 85

3.6.2 Phân lập và tinh chế ginsenosid Rb1 86

3.6.2.1.Quá trình phân lập và tinh chế G-Rg1 86

3.6.2.2.Xác định hàm lượng G-Rg1 của cắn F 87

CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN 89

4.1 Về quy trình phân lập và tinh chế notoginsenosid R1 từ nguyên liệu Saponin toàn phần của tam thất 89

4.2 Về xác định cấu trúc và nhận dạng chất tinh chế được 89

4.3 Về định tính, định lượng, giới hạn tạp chất liên quan của notoginsenosid R1 tinh chế được bằng phương pháp HPLC 89

4.4 Về việc sử dụng notoginsenosid R1 tinh chế được làm chất chuẩn phòng thí nghiệm để định tính, định lượng notoginsenosid R1 trong dược liệu tam thất 90 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 91 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC BÀNG

Bảng 1.1: Một số điều kiện phân tích N-R1 27

Bảng 2.1: Các dung môi hóa chất sử dụng trong đề tài 31

Bảng 2.2: Các phương pháp phân tích N-R1 sử dụng trong đề tài 33

Bảng 2.3: Chương trình pha động phân tích N-R1 trong dược liệu tam thất 37

Bảng 3.1: Kết quả định lượng N-R1 trong nguyên liệu 39

Bảng 3.2: Kết quả định lượng N-R1 trong mẫu thử (cắn B) 47

Bảng 3.3: Kết quả định lượng N-R1 trong mẫu thử (cắn C) 51

Bảng 3.4: Kết quả kiểm tra độ lặp lại của quy trình phân lập 51

Bảng 3.5: Độ lặp lại của quá trình tinh chế 54

Hình 3.17: Sơ đồ tóm tắt quá trình phân lập và tinh chế N-R1 của đề tài 56

Bảng 3.6: Dữ liệu đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 60

Bảng 3.7: Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký 64

Bảng 3.9: Kết quả khảo sát độ lặp lại 67

Bảng 3.10: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp 68

Bảng 3.11: Kết quả khảo sát LOD của phương pháp 69

Bảng 3.12: Kết quả các giá trị đáp ứng của mẫu thử nồng độ 0,00438 mg/ml 70

Bảng 3.13: Chương trình pha động xác định giới hạn tạp liên quan 72

Bảng 3.14: Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký 73

Bảng 3.15: Kết quả xác định LOD 76

Bảng 3.16: Kết quả các giá trị đáp ứng của mẫu thử nồng độ 0,002924 mg/ml 77

Bảng 3.17: Kết quả xác định hàm lượng tạp chất 77

Bảng 3.18: Chương trình pha động định lượng N-R1 trong dược liệu tam thất 80

Bảng 3.19: Kết quả định lượng N-R1 trong các mẫu dược liệu tam thất 82

Bảng 3.20: Kết quả xác định hàm lượng Rg1 trong cắn E 85

Bảng 3.21: Kết quả định lượng G-Rb1 trong cắn F 87

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của 2 genin 7

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của notoginsenosid R1 8

Hình 1.3: Công thức cấu tạo của Rg1 9

Hình 1.4: Công thức cấu tạo của Rb1 10

Hình 1.5: Sơ đồ cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao 14

Hình 1.6: Sơ đồ chiết xuất notoginsenosid R1 24

Hình 1.7: Sơ đồ dự kiến phân lập và tinh chế N-R1 từ Saponin toàn phần của tam thất 26

Hình 3.1: Sắc ký đồ mẫu chuẩn và mẫu thử phân tích N-R1 trong nguyên liệu 39

Hình 3.2: Sắc ký đồ bản mỏng phân tích nguyên liệu ban đầu 40

Hình 3.3: Sắc ký đồ bản mỏng pha thuận ở các tỉ lệ dung môi 41

Hình 3.4: Sắc ký đồ bản mỏng pha đảo ở các tỉ lệ dung môi MeOH-H20 khác nhau 42

Hình 3.5: Sắc ký đồ phát hiện sự có mặt của N-R1 trong các bình hứng ở giai đoạn 143 Hình 3.6: Sắc ký đồ so sánh nguyên liệu ban đầu và cắn A sau phân lập 44

Hình 3.7: Sắc ký đồ phát hiện sự có mặt của N-R1 trong các bình hứng giai đoạn 2 45

Hình 3.8: Sắc ký đồ so sánh nguyên liệu ban đầu và cắn B sau phân lập thô 46

Hình 3.9: Sắc ký đồ mẫu chuẩn N-R1 và mẫu thử (cắn B) 46

Hình 3.10: Sắc ký đồ phát hiện sự có mặt của N-R1 trong các bình hứng phân lập tinh 48

Hình 3.11: Sắc ký đồ bản mỏng sắc ký pha thuận so sánh nguyên liệu ban đầu và cắn C sau phân lập tinh 49

Hình 3.12: Sắc ký đồ bản mỏng sắc ký pha đảo so sánh nguyên liệu ban đầu và cắn C sau phân lập tinh 50

Hình 3.13: Sắc ký đồ mẫu chuẩn và mẫu thử (cắn C) 50

Hình 3.14: Sắc ký đồ bản mỏng mẫu thử (cắn C) ở các tỷ lệ dung môi aceton - nước khác nhau 52

Hình 3.15: Sắc ký đồ phát hiện sự có mặt của N-R1 trong các bình hứng giai đoạn tinh chế 53

Hình 3.16: Sắc ký đồ bản mỏng pha thuận mẫu thử (cắn D) ở hai hệ dung môi khác nhau 54

Hình 3.18: Phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến của cắn D chiết được và N-R1 chuẩn 57

Hình 3.19: Phổ hồng ngoại của cắn D (N-R1 tinh chế được) 58

Hình 3.20: Phổ hồng ngoại của N- R1 chuẩn 58

Hình 3.21: So phổ hồng ngoại của mẫu thử (cắn D) với N-R1 chuẩn 59

Hình 3.22 : Phổ 13C-NMR của chất cắn D 59

Hình 3.23: Phổ 1H-NMR của chất cắn D 60

Hình 3.24: Công thức cấu tạo phân tử Notoginsenosid R1 62

Hình 3.25: Phổ khối của mẫu thử (cắn D) và mẫu chuẩn N-R1 63

Hình 3.26: Sắc ký đồ độ đặc hiệu của phương pháp 65

Hình 3.27: Đồ thị thể hiện sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích 66

Hình 3.28: Đồ thị biểu diễn sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic N-R1(xác định LOD) 69

Hình 3.29: Sắc ký đồ mẫu chuẩn và mẫu thử định lượng N-R1 71

Hình 3.30: Chồng phổ UV-VIS pic N-R1 của mẫu chuẩn và mẫu thử 71

Hình 3.31: Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu của phương pháp 75

Hình 3.32: Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữ nồng độ và diện tích píc N-R1 76

Hình 3.33: Hình ảnh SKLM dược liệu tam thất ở ánh sáng thường 79

Hình 3.34: Hình ảnh SKLM dược liệu tam thất ở ánh sáng tử ngoại 366 nm 79

Hình 3.35: Các sắc ký đồ định lượng N-R1 trong dược liệu tam thất 81

Hình 3.36: So phổ UV -VIS, hệ số march 0,9996 82

Hình 3.37: Sơ đồ phân lập và tinh chế ginsenosid Rg1 của đề tài 84

Hình 3.38: Sắc ký đồ xác định sự có mặt của G-Rg1 trong các bình hứng trong quá trình tinh chế 85

Hình 3.39: Sắc ký đồ định lượng Rg1 trong cắn E 86

Hình 3.40: Sơ đồ phân lập và tinh chế ginsenosid Rb1 của đề tài 86

Hình 3.41: Sắc ký đồ xác định sự có mặt của G-Rb1 trong các bình hứng trong giai đoạn tinh chế 87

Hình 3.42: Sắc ký đồ định lượng Rb1 trong cắn F 88

ĐẶT VẤN ĐỀ

Từ xưa đến nay, con người luôn có xu hướng sử dụng dược liệu và các thuốc có nguồn gốc thảo dược để bảo vệ và chăm sóc sức khỏe Hầu hết các vị thuốc trong y học cổ truyền đã được sử dụng từ rất lâu, được trải nghiệm lâu đời Vì có nguồn gốc

từ thiên nhiên nên các vị thuốc này có tác hại rất thấp hoặc không có, có tác dụng tương đối bình hòa: chỉ cần sử dụng đúng quy cách thì sẽ đạt được hiệu quả rõ rệt Nhiều vị thuốc có thể sử dụng trong một thời gian dài mà không gây độc hại cho cơ thể và không xuất hiện hiện tượng kháng thuốc Đây chính là một trong những ưu điểm nổi bật của những vị thuốc có nguồn gốc thảo dược tự nhiên Với nền hóa dược phát triển như hiện nay, đi kèm với những thành tựu lớn lao, nhưng cũng tồn tại song song nhiều bất cập, khiến cho mọi người có xu hướng quay lại với các bài thuốc từ nguồn thảo dược thiên nhiên Ngay tại Việt Nam, trong những năm gần đây việc sử dụng các chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu đã và đang gia tăng Thị trường dược liệu và các sản phẩm từ dược liệu vì thế rất đa dạng và phong phú về nguồn gốc và chủng loại Ngoài ra, các sản phẩm thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ dược liệu đã và đang phát triển mạnh mẽ

Nguồn cung cấp dược liệu ở nước ta chủ yếu là thu hái tự nhiên, trồng trọt và nhập khẩu Với số lượng dược liệu lưu thông trên thị trường là rất lớn, nguồn gốc không rõ ràng khiến cho việc kiểm soát chất lượng dược liệu còn khó khăn Có những dược liệu là giả, hoặc dễ gây nhẫm lẫn vẫn song song tồn tại ảnh hưởng đến

sự an toàn và chất lượng của thuốc đông dược.Trong khi đó công tác kiểm tra, giám sát chất lượng dược liệu cần nhất hiện nay là các chất chuẩn với vai trò là hoạt chất hoặc chất đặc trưng cho dược liệu Chất chuẩn dùng cho dược liệu hiện nay thường được nhập từ Trung Quốc với giá thành tương đối cao và nguồn hàng thường không

ổn định, ảnh hưởng đến công tác nghiên cứu và công tác kiểm tra chất lượng thuốc thảo dược, do đó việc tạo lập chất chuẩn là cần thiết

Tam thất (Radix notoginseng) là một vị thuốc rất quý, vốn nổi tiếng trong dân gian với tác dụng giảm viêm, giảm đau, cầm máu, bổ máu đặc biệt là cho phụ nữ sau sinh Tuy nhiên, dược liệu Tam thất trên thị trường hiện nay có giá đắt và có nguy cơ bị giả mạo rất cao, nếu không phải là các nhà chuyên môn với các công cụ phân tích hiện đại thì rất khó phân biệt được Tam thất với các cây khác có hình dáng giống Tam thất (mà không có tác dụng điều trị hoặc tác dụng yếu hơn rất

nhiều) Mặt khác nếu gặp đúng dược liệu Tam thất thì vẫn còn có nguy cơ dược liệu

đó đã bị chiết xuất hết hoạt chất và tẩm vào đó các phụ gia cải thiện cảm quan của dược liệu đánh lừa người mua

Thành phần hóa học chính của Tam thất là các saponin thuộc nhóm dammaran

mà phần aglycon là hai chất: 20(S) protopanaxadiol và 20(S) protopanaxatriol, đã xác định được các chất như ginsenosid-Rg1, Rb1, Re, Rd, notoginsenosid R1… là các chất chiếm tỷ lệ lớn Tuy nhiên, hiện nay chúng ta chưa sẵn có các chất chuẩn đặc trưng cho Tam thất trong đó có notoginsenoside R1 để kiểm tra chất lượng dược liệu đang sử dụng và lưu hành trên thị trường Các chất chuẩn này thường được nhập từ nước ngoài với giá cao, thời gian chờ đợi dài gây khó khăn cho công tác kiểm nghiệm

Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đòi hỏi phải có chất chuẩn nhằm bổ sung vào quỹ chất chuẩn quốc gia phục vụ công tác kiểm tra và quản lí chất lượng dược liệu

Tam thất, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phân lập và tinh chế

notoginsenosid R1 từ nguyên liệu saponin toàn phần của tam thất để làm chất chuẩn phục vụ công tác kiểm nghiệm” với các mục tiêu:

- Phân lập và tinh chế notoginsenosid R1 từ nguyên liệu cao tam thất Xác định cấu trúc, nhận dạng chất tinh chế được Đánh giá độ tinh khiết của chất chiết được, đảm bảo độ tinh khiết lớn hơn 95%

- Xây dựng quy trình định tính, định lượng notoginsenosid R1

- Kiểm nghiệm hoạt chất notoginsenosid R1 có mặt trong dược liệu Tam thất lưu hành trên thị trường, dùng chuẩn notoginsenosid R1 tinh chế được

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Vài nét về chất đối chiếu (chất chuẩn)

1.1.1 Vài nét về chất chuẩn

Các chất chuẩn (chất đối chiếu) là chất đồng nhất đã được xác định là đúng để dùng trong các phép thử đã được qui định về hóa học, vật lý, sinh học Trong các phép thử đó, các tính chất của chất đối chiếu được so sánh với các tính chất của chất cần thử Chất đối chiếu phải có độ tinh khiết phù hợp với mục đích sử dụng Chất đối chiếu được dùng trong các phép thử sau [7]:

- Định tính bằng phương pháp quang phổ hấp thụ hồng ngoại

- Định tính, định lượng bằng phương pháp quang phổ tử ngoại - khả kiến, quang phổ huỳnh quang

- Các phép thử định tính, tạp chất và định lượng bằng phương pháp sắc ký

- Định lượng bằng phương pháp vi sinh vật

- Các phép chuẩn độ thể tích, phân tích trọng lượng

- Các phép thử sinh học

- Một số phép thử khác có hướng dẫn trong các chuyên luận riêng

Ngoài ra, các chất đối chiếu còn được dùng để [1]:

- Thẩm định một phương pháp mới

- Chuẩn hóa các chất đối chiếu khác

- Khẳng định giá trị pháp lý của một phương pháp đã chuẩn hóa

Các chất chuẩn theo Dược điển Mỹ (USPRS), Dược điển Châu Âu (EPRS), Dược điển Quốc tế (ICRS) và chất chuẩn khu vực ASEAN (ARS) được thiết lập với

sự hợp tác của nhiều phòng thí nghiệm độc lập trên thế giới và được sản xuất tại các trung tâm như:

- Hội đồng chất đối chiếu Dược điển Mỹ (USP Reference Standard Committee);

- Ban thư ký Kỹ thuật thuộc Hội đồng Dược điển Châu Âu (Technical Secretariat of the European Pharmacopoeia Commission);

- Trung tâm hợp tác về các chất chuẩn hoá học của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO Collaborating Centre for Chemical Reference Substances)

- Chất chuẩn khu vực ASEAN (ARS) được thiết lập với sự đánh giá hợp tác của các nước trong khối ASEAN theo chương trình Hợp tác kỹ thuật giữa các nước ASEAN về lĩnh vực Dược phẩm; và Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung Ương – Bộ

Y tế là thành viên chính thức đánh giá, thiết lập chất chuẩn

Thông thường một chất đối chiếu được đánh giá bởi các nội dung chính [15]:

1.1.2 Khái quát về thiết lập chất chuẩn từ dược liệu

Chất đối chiếu hóa học hiện nay ở bất kỳ quốc gia nào cũng đều được thiết lập

và sản xuất để phục vụ cho công tác kiểm tra giám sát chất lượng thuốc Trong những năm gần đây, có một số chất chuẩn là những hoạt chất của dược liệu được sản xuất đạt mức độ tinh khiết nhất định, nhưng thường có giá rất đắt, càng có độ tinh khiết càng cao thì giá càng đắt và nguồn cung cấp thường không ổn định

Dược điển Mỹ hiện đang duy trì một số chất chuẩn đối chiếu hóa học của các hợp chất chiết xuất từ thực vật như quercetin USP CRS, rutin USP CRS, silybin USP CRS… Viện Kiểm nghiệm Dược phẩm và Sinh phẩm Trung Quốc (NICBPB), Viện Kiểm nghiệm thuốc Hàn Quốc và Viện kiểm nghiệm thuốc Nhật Bản cũng đã thiết lập được nhiều chất chuẩn đối chiếu hóa học chiết ra từ dược liệu dùng cho kiểm nghiệm dược liệu, thuốc có nguồn gốc dược liệu và thuốc đông dược Tại Việt nam, cung cấp chất chuẩn chính thức gồm:

- Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương (VKNTTW) đã cung cấp hơn 300 chất

chuẩn tân dược và 10 chất chuẩn từ dược liệu gồm acid chlorogenic, conessin, holothurin B, kaemferol, malloapeita, myricetin, nuciferin, phyllanthin và sylibin [16]

- Viện Kiểm nghiệm Thuốc TP HCM (VKNT TP.HCM) cung cấp 213 chất

chuẩn tân dược và 18 chất chuẩn từ dược liệu gồm acid aristolochic, acid gallic, acid oleanolic, asiaticosid, berberin HCl, colchicin, curcumin, damnacanthal, diacerein, diosgenin, epigallocatechin (ECGC), ginsenosid-Rb1, ginsenosid-Rg1, hesperidin, majonosid-R2, quercetin, rutin, syllibin [17]

Hiện nay, nếu VKNTTW và VKNT TP.HCM không chủ động được nguồn chất chuẩn, đặt biệt là chất chuẩn chiết từ dược liệu thì ngành Dược nói chung và công tác kiểm tra, giám sát chất lượng thuốc nói riêng sẽ gặp nhiều khó khăn, có thể kể đến như:

- Không kiểm nghiệm được chất lượng dược liệu một cách đầy đủ và toàn diện

- Không kiểm tra giám sát chất lượng các dạng bào chế có nguồn gốc từ dược liệu đang lưu hành trên thị trường một cách đầy đủ

- Không tiêu chuẩn hóa được các thuốc sản xuất trong nước bào chế từ dược liệu hoặc chiết xuất từ dược liệu về mặt hàm lượng dược chất, do đó không giúp được ngành dược bào chế ra các thuốc có chất lượng cao phục vụ nhu cầu phòng và chữa bệnh

Từ những lý do trên cho thấy ngành Dược đứng trước nhiệm vụ cấp bách phải chủ động nguồn chất chuẩn và xây dựng được Quỹ chất chuẩn quốc gia trong đó có các chất chuẩn chiết ra từ dược liệu nhằm đáp ứng kịp thời công tác đảm bảo chất lượng thuốc, phục vụ bảo vệ, chăm sóc và nâng cao sức khỏe nhân dân

1.2 Tổng quan về đối tƣợng nghiên cứu

1.2.1 Dược liệu Tam thất [5,8,10,13,14]

Tam thất có tên khoa học là Panax notoginseng (Burk) F.H Chen, họ Nhân sâm (Araliaceae) Dược liệu tam thất là rễ củ đã phơi khô của cây tam thất

Phân bố:Tam thất là cây thuốc đã được trồng lâu đời ở Trung quốc, chủ yếu

ở tỉnh Vân Nam Hiện nay người ta biết khoảng 14 loài panax trồng và mọc hoang

Ở nước ta cây Tam thất được trồng ở các tỉnh giáp giới Vân Nam như Lào cai (huyện Mườn Khương, Bát sát), Cao Bằng (Thông nông), Hà Giang (Đồng Văn) có thể cũng xuất xứ từ Vân nam

Đặc điểm thực vật: Cây thảo sống nhiều năm, cao khoảng 0,5m Thân đơn, lá

kép hình chân vịt, cuống lá dài, mỗi lá thường có 3-5 lá chét, mép lá có khía răng cưa nhỏ, trên gân chính có rải rác gân cứng thành gai Cụm hoa tán đơn, có màu xanh nhạt Quả khi chín màu đỏ, có hạt hình cầu

Bộ phận dùng: Rễ (Radix)

Thu hoạch, Chế biến: Cây thường 4 -5 năm trở lên mới thu hoạch rễ Vào mùa

thu trước khi cây ra hoa , đào về rửa sạch, cắt rễ nhánh và thân rễ để riêng, rửa sạch,

phơi sấy khô

Tính vị, quy kinh: Theo Đông y, Tam thất có vị ngọt hơi đắng, tính ôn, có tác

dụng hóa ứ, cầm máu, tiêu sưng, giảm đau Theo DĐVN, tam thất dùng trị thổ huyết, băng huyết, rong kinh, sau khi sinh nở huyết hôi không ra, ứ trệ , đau bụng, kiết lỵ ra máu, lưu huyết, tan ứ huyết, sưng tấy, thiếu máu nặng, người mệt mỏi, hoa mắt, chóng mặt, nhức đầu, ít ngủ

Thành phần hóa học chính: Thành phần hoá học chính của Tam thất là các

saponin thuộc nhóm dammaran mà phần aglycon là 2 chất 20(S) protopanaxadiol và 20(S) protopanaxatriol như ở Nhân sâm Các saponin thường gặp trong rễ củ là:

a Các saponin có phần aglycon là 20(S) protopanaxadiol: Rb1, Rb2,

(Chú thích: G= Gingsenosid, Gy: gypenosid, N= notoginsenosid)

Các bộ phận khác của cây như rễ con, lá hoa đều có saponin nhóm dammaran Tam thất có tinh dầu ở rễ (trong đó α- guaien, β- guaien, stigmasterol, daucosterol), polysaccharide (arabinogalactan: sanchinan A), muối vô cơ

1.2.2 Nguyên liệu Saponin toàn phần của tam thất [40]:

Saponin toàn phần của tam thất chiết xuất từ nguyên liệu là rễ và thân rễ của

loài Panax notoginseng (Burk) F.H Chen, được quy định trong dược điển Trung

quốc 2010 như sau: Dược liệu được nghiền nhỏ, đun hồi lưu với ethanol 70%, lọc lấy dịch chiết và thu hồi dung môi trong chân không lấy cắn Cắn được đưa lên lên cột đã nhồi sẵn chất hấp phụ không phân cực hoặc phân cực yếu với chất mang là styrene đồng trùng hợp, rửa giải với nước và ethanol 80% Loại bỏ nước, giữ lại dịch rửa giải ethanol 80%, bốc hơi trong chân không đến khô

Về cảm quan, nguyên liệu có màu gần trắng hoặc vàng nhạt, vị đắng nhẹ và hơi ngọt Thành phần của Saponin toàn phần của tam thất bao gồm: N-R1 khoảng 5%, ngoài ra còn có 4 hoạt chất khác đó là ginsenosid (G) Rg1, Re, Rb1, Rd Hàm lượng saponin toàn phần khoảng 75% (đối với dạng uống) đến 85% (đối với dạng tiêm truyền)

1.2.3 Tổng quan về nhóm hoạt chất saponin triterpenoid nhóm Damaran [5,8,10,13,14]

Đây là nhóm Saponin triterpenoid tetrayclic: phần aglycon gồm 4 vòng và 1 mạch nhánh (khung cyclopentanoperhydrophenantren) Khi tác dụng bởi acid thì mạch nhánh đóng vòng tạo thành vòng tetrahydrofuran Bằng các phương pháp đặc biệt để cắt phần đường, người ta đã thu được các genin thật Hai genin chính là 20(S) protopanaxadiol và 20(S) protopanaxatriol

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của 2 genin

Các saponin điển hình của nhóm này là các saponin phân lập được trong nhân sâm (Panax ginseng), tam thất (Panax notoginseng)

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của notoginsenosid R1

- Tính chất:

+ Bột kết tinh màu trắng hoặc trắng ngà

+Tan tốt trong nước và các dung môi phân cực như butanol, ethanol và methanol Độ tan trong nước là 1 mg/ml Tan trong DMSO

+ Hấp thụ UV ở bước sóng thấp 208 nm

+ Nhiệt độ nóng chảy khoảng 215-2170C [30]

+ [α]D25= +150 (Dung dịch 1,0 mg/ml trong methanol) [30]

1.2.4.2 Tác dụng dược lý của notoginsenosid R1:

Tác dụng dược lý của N-R1 hiện nay vẫn chưa hoàn chỉnh và đang được tiếp tục nghiên cứu trên thế giới Một số tác dụng đã được công bố bao gồm:

+ Thúc đẩy sự gia tăng hoạt động của ALP tiền nguyên bào xương, tăng biểu hiện của osteocalcin và chất khoáng, giúp ích cho quá trình tái tạo và khoáng hóa xương [47]

+ Tác động lên các thụ thể estrogen, kích thích hoạt động sao chép của yếu

tố đáp ứng estrogen phosphorylated-luciferase và gây ra sự phosphoryl hóa trong hBMSC, tác động lên quá trình phân hoá và khoáng hóa osteoblast [43]

+ Ức chế oxy hóa lipoprotein mật độ thấp sản xuất ra các cytokine gây viêm trong tế bào nội mô người EAhy926, ức chế sản xuất TNF-α và interleukin (IL) làm giảm đáng kể sự xuất hiện của khối u [21,22,36]

+ Giảm sự phá hủy của amyloid-β gây ra trong tế bào thần kinh bằng cách ức chế các dạng oxy phản ứng và điều chỉnh MAPK kích hoạt Có tác dụng rõ rệt trong điều trị bệnh lý Alzheimer và các bệnh thuộc hệ thần kinh [18]

+ Ảnh hưởng đến sự tổng hợp các thành phần của hệ thống tiêu sợi huyết

hợp loại plasminogen kích thích (t-PA) và giảm loại plasminogen ức chế (PAI-1) trong tĩnh mạch rốn nội mô người [45]

[[(3S,5R,6S,8R,9R,10R,12R,13R,14R,17S)-3,12-dihydroxy-4,4,8,10,14-

2,3,5,6,7,9,11,12,13,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-6-yl]oxy]-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol

- Rg1 có công thức hóa học như sau:

Hình 1.3: Công thức cấu tạo của Rg1

- Tính chất:

+ Bột kết tinh màu trắng hoặc trắng ngà

+ Tan tốt trong nước và các dung môi phân cực như butanol, ethanol

và methanol Tan trong DMSO Tan trong hỗn hợp CHCl3-MeOH-H2O (100/25/10, v/v/v)

(2R,3R,4S,5S,6R)-2-[[(2R,3S,4S,5R,6S)-6-[(2S)-2- 1H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-6-methylhept-5-en-2-yl]oxy- 3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl]methoxy]-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5- triol

4,4,8,10,14-pentamethyl-2,3,5,6,7,9,11,12,13,15,16,17-dodecahydro Rb1 có công thức hóa học như sau:

Hình 1.4: Công thức cấu tạo của Rb1

- Tính chất:

+ Bột kết tinh màu trắng hoặc trắng ngà

+ Tan tốt trong nước và các dung môi phân cực như ethanol và methanol (0,8-1,2 mg/ml) Tan trong DMSO

+ Hấp thụ UV ở bước sóng thấp 203nm

1.3 Tổng quan về phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế

1.3.1 Vài nét về chiết xuất dược liệu [2,14]

Chiết xuất dược liệu có vai trò rất quan trọng trước hết là để lấy được các chất

có trong dược liệu dưới dạng cần thiết (dung dịch, bột) toàn phần hoặc tinh khiết hơn cho mục đích nghiên cứu hoặc điều trị

Phương pháp chiết xuất dược liệu bao gồm cả việc chọn dung môi, dụng cụ chiết và phương pháp chiết

Có nhiều cách phân loại phương pháp chiết xuất dựa vào các yếu tố khác nhau:

- Căn cứ vào nhiệt độ: Chiết nóng, Chiết nguội

- Căn cứ vào chế độ làm việc: Phương pháp chiết gián đoạn; Phương pháp chiết bán liên tục; Phương pháp chiết liên tục

- Căn cứ vào chuyển động tương hỗ giữa 2 pha: Phương pháp chiết ngược dòng; Phương pháp chiết xuôi dòng; Phương pháp chiết chéo dòng

- Căn cứ vào áp suất làm việc: Phương pháp chiết ở áp suất thường (áp suất khí quyển); Phương pháp chiết ở áp suất giảm (áp suất chân không); Phương pháp chiết ở áp suất cao (chế độ làm việc có áp lực)

- Căn cứ vào trạng thái làm việc của 2 pha: Phương pháp ngâm; Phương pháp ngấm kiệt

- Dựa vào những biện pháp kỹ thuật đặc biệt: Phương pháp dùng siêu âm; Phương pháp khí hoá lỏng; Phương pháp tạo dòng xoáy

1.3.2 Vài nét về phân lập và tinh chế [6,9,39,48]

Để phân lập và tinh chế ta có thể dùng các phương pháp sau:

- Tách phân đoạn bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau và không hòa lẫn nhau

1.4 Tổng quan một số phương pháp hoá lý sử dụng trong nghiên cứu đề tài

1.4.1 Sắc ký lớp mỏng

1.4.1.1 Nguyên tắc

SKLM là một kỹ thuật sắc ký, trong đó pha tĩnh chứa chất hấp phụ được trải thành lớp mỏng, mịn và đồng nhất, được cố định trên phiến kính hoặc phiến kim loại, nhựa; pha động là một hệ gồm một dung môi đơn thuần hoặc hỗn hợp nhiều dung môi phối hợp với nhau theo tỷ lệ quy định Sắc ký được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt các chất cần tách Trong quá trình di chuyển qua chất hấp phụ, các cấu tử (thành phần trong hỗn hợp mẫu thử) di chuyển trên lớp mỏng theo hướng pha động với những tốc độ khác nhau dẫn đến việc tách

và phân bố khác nhau trên lớp mỏng Kết quả thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng, ở đó, các thành phần của mẫu thử phân bố rải rác dọc theo đường đi của dung môi động Cơ chế của sự tách có thể là hấp phụ phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay phối hợp nhiều cơ chế, trong đó một loại nào đó trội lên ít hoặc nhiều, tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi pha động [7,14]

Sau đó có thể nhận biết chất cần phân tích bằng ánh sáng thường (nếu các chất phân tích có màu) hoặc soi tử ngoại ở các bước sóng 254 nm, 366 nm hoặc phun thuốc thử hiện màu, hoặc quét lên bề mặt bản mỏng (thiết bị densitometer, một thiết

bị đo cường độ phản xạ ánh sáng tử ngoại hoặc khả kiến của chất cần phân tích) Tuỳ thuộc bản chất của chất cần phân tích ta có thể sử dụng một trong các phương pháp trên để phát hiện vết chất trong hỗn hợp cần phân tích [9]

1.4.1.2 Các đại lượng đặc trưng

* Hệ số lưu giữ R f

Hệ số lưu giữ Rf là đại lượng đặc trưng cho mức độ dịch chuyển của các chất, được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của chất phân tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động

d

d R

M

R

trong đó:

dR là khoảng cách từ điểm xuất phát tới tâm vết phân tích (tính bằng cm)

dM là khoảng cách từ điểm xuất phát tới mức dung môi pha động (đo trên

Rf có giá trị từ 0 đến 1

Việc ổn định giá trị Rf thường phụ thuộc nhiều yếu tố và gặp nhiều khó khăn

về mặt kĩ thuật nên quá trình phân tích thường tiến hành song song với chất chuẩn trong cùng điều kiện sắc ký

* Định lượng

Bằng các biện pháp chính xác hoá lượng mẫu đưa lên bản mỏng có thể áp dụng SKLM để định lượng

Một số phương pháp dùng để định lượng bằng SKLM [9]:

- Phương pháp định lượng sau khi tách các chất ra khỏi bản mỏng: Chuyển tất cả

vết cần phân tích trên bản mỏng vào một dung môi thích hợp Sau khi tinh khiết hoá mẫu đo bằng các cách khác nhau, tiến hành thực hiện các phép đo thích hợp như đo quang, đo huỳnh quang, cực phổ… Tuy nhiên phương pháp hiện nay ít dùng vì có nhiều trở ngại, sai số lớn, lại mất nhiều thời gian

- Phương pháp định lượng trực tiếp trên bản mỏng:

Dựa trên nguyên tắc đo diện tích hay cường độ màu của vết sắc ký Hiện nay dùng hai kỹ thuật:

+ Đo mật độ vết bằng densitometer: nguyên tắc của phương pháp này là chiếu chùm tia sáng vào vết sắc ký trên bản mỏng và đo cường độ ánh sáng truyền qua; cường độ ánh sáng phản xạ; cường độ huỳnh quang

+ Xử lý hình ảnh với camera kĩ thuật số: Quét bản mỏng với các hệ thống phân tích hình ảnh, đặc biệt camera kĩ thuật số có độ phân giải cao để thu nhận hình ảnh của vết sắc ký Sau đó các dữ liệu ảnh được xử lý bằng máy tính

1.4.2 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

1.4.2.1 Nguyên tắc

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là phương pháp chia tách trong đó pha động là một chất lỏng còn pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn đã phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc là một chất lỏng phủ trên một chất mang dạng rắn hay một chất mang rắn

đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc phân loại theo kích cỡ [6,7]

Hình 1.5: Sơ đồ cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao

1.4.2.2 Một số đại lượng đặc trưng của quá trình sắc ký

* Thời gian lưu

- Thời gian lưu (tR): là thời gian tính từ khi chất phân tích được tiêm vào hệ thống sắc ký đến khi được phát hiện ở nồng độ cực đại của nó Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính trên sắc ký đồ của một chất tan trong điều kiện sắc ký nhất định

)(

18,1)(

2

'

'

2 / 1 2

/ 1

, , ,

,

k

k W

W

t t W

W

t t R

B B A

B

A R B R A

B

A R B R s

Trong thực tế nếu các pic cân đối thì độ phân giải để 2 pic tách tối thiểu là



trong đó:

W1/20 là độ rộng pic ở chiều cao 1/20

a: khoảng cách từ đường cao hạ từ đỉnh pic tới đường cong phía trước của pic

ở 1/20 chiều cao

Hệ số bất đối AF cho biết mức độ cân đối của pic trên sắc ký đồ Trong phép

định lượng thì yêu cầu AF nằm trong khoảng 0,8-2

N

2 / 1

54 , 5 16

2 2

h

N

2 2

28 , 6

2 

trong đó: h: chiều cao pic A: diện tích của pic

1.4.2.3 Ứng dụng

* Định tính

Sự giống nhau về thời gian lưu trên sắc ký đồ của chuẩn và thử là cơ sở của

phép thử định tính Trên các máy HPLC hiện đại với detector diod array (DAD) ta

có thể vẽ phổ UV-VIS của pic chuẩn và pic thử rồi chồng 2 phổ với nhau để thấy sự

giống nhau về dạng phổ thông qua hệ số Match:

- Hệ số Match xấp xỉ 1,000 chỉ ra một phổ định tính giống nhau hoàn toàn

- Hệ số Match càng gần 1,000 thì sự tương tự của phổ càng cao

- Hệ số Match > 0,900 thì chỉ ra 2 phổ tương tự

- Hệ số Match < 0,900 thì chỉ ra 2 phổ khác nhau

Hơn thế nữa, với detector khối phổ (MS) nhờ thư viện phổ mà không cần chất

chuẩn ta cũng có thể định tính được nếu như chất thử có mặt trong thư viện phổ này

+ Phương pháp dùng chuẩn ngoại

+ Phương pháp dùng chuẩn nội

+ Phương pháp thêm chất chuẩn

+ Phương pháp chuẩn hoá diện tích

* Thử tạp chất

Về cơ sở của cách thử tạp chất cũng giống như định lượng Ngoài ra, đối với phép thử tạp chất liên quan, khi không biết tên tạp chất hoặc không có tạp chất chuẩn thì có thể tính tỉ lệ tạp chất dựa vào % diện tích pic của tạp so với hoạt chất

1.4.3 Phổ khối (MS) [1,3]

1.4.3.1 Nguyên tắc

Khối phổ được thực hiện dựa trên cơ sở xác định khối lượng (thường là trị số m/e) và số lượng tương đối của các ion tạo ra từ phân tử bị ion hóa và bị phá vỡ thành mảnh

Nguyên tắc: Dùng chùm điện tử có năng lượng trung bình (50-100eV) để bắn phá phân tử hữu cơ ở chân không cao (10-6mmHg) Trong quá trình đó, chất hữu cơ

bị ion hóa và bị phá vỡ thành mảnh Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số vạch có cường độ khác nhau tập hợp thành một khối phổ đồ hoặc phổ khối

1.4.3.2 Ứng dụng

* Xác định đồng vị

Các nguyên tử đồng vị của cùng một nguyên tố có cùng số điện tích hạt nhân chỉ khác nhau số neutron nên khối lượng nguyên tử khác nhau Có thể dùng MS để xác định thành phần đồng vị của các nguyên tố trong mẫu

* Định tính

- Phân tích khối phổ có thể cho rất chính xác khối lượng các ion phân tử M+, (M+1)+, (M+2)+ Bên cạnh đó xem xét thêm các pic đồng vị, tỷ số cường độ của

chúng cùng với khối lượng của vài mảnh ion có thể xác định được công thức nguyên của chất phân tích

- Trong phân tích dược thường sử dụng kết nối GC/MS hoặc LC/MS Có thể

so sánh phổ nghiên cứu với thư viện phổ có trong máy hoặc phổ chất đối chiếu để khẳng định thành phần định tính của mẫu

* Xác định công thức cấu tạo

Để xác định công thức cấu tạo của chất nghiên cứu cần dùng kỹ thuật ion hóa thích hợp phân tách chất nghiên cứu thành nhiều mảnh ion để làm rõ cấu tạo ghép nối của chúng Việc biện giải phổ nên phối hợp với phổ NMR, phổ IR

1.4.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) [3]

1.4.4.1 Nguyên tắc

Nếu hạt nhân nguyên tử có từ tính được đặt trong một từ trường, khi thay đổi

từ trường sẽ dẫn tới hấp thu năng lượng của sóng vô tuyến và xuất hiện phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Những hạt nhân nguyên tử có khối lượng là số lẻ và những hạt nhân có khối lượng nguyên tử là số chẵn nhưng số thứ tự nguyên tử là số lẻ thì có momen từ và cho tín hiệu NMR Các hạt nhân có khối lượng và số thứ tự nguyên tử là số chẵn thì không có momen từ và không cho tín hiệu NMR Vị trí của tín hiệu cộng hưởng từ proton trong phổ NMR phụ thuộc vào mật độ điện tử ở vùng lân cận quanh proton đó

1.4.4.2 Các đại lượng đặc trưng

* Độ dịch chuyển hóa học δ:

Độ dịch chuyển hóa học δ là sự khác nhau giữa vị trí hấp thụ của hạt nhân

hydro trên phổ NMR của mẫu phân tích và của chất chuẩn

với: νmau: tần số cộng hưởng của proton của mẫu

νTMS: tần số cộng hưởng của proton của chất chuẩn nội tetramethylsilan

νmay: tần số của phổ kế

* Hằng số tương tác spin-spin (J):

Hằng số tương tác spin-spin (J) là khoảng cách giữa các vạch của tín hiệu bội được biểu hiện bằng Hz, đặc trưng cho sự tương tác spin Trị số J phụ thuộc vào tương quan không gian và mật độ e ở vùng lân cận của 2 proton tương tác

* Diện tích dưới tín hiệu

Diện tích dưới tín hiệu tỷ lệ với số lượng proton cho tín hiệu đó Đường cong tích phân diện tích dưới tín hiệu cho biết số lượng tương đối của proton cho tín hiệu

Tùy theo tính chất của chất được sử dụng làm cột mà sự tách trong cột sẽ xảy

ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ (cột hấp phụ) hoặc theo cơ chế phân bố (cột phân bố) [9]

+ Cột hấp phụ: Các chất thường dùng là: oxid nhôm, silica gel, polyamid, CaCO3, MgO, than hoạt

Các hóa chất dùng cho sắc ký cột đều phải được tiêu chuẩn hóa để việc sử dụng dễ dàng, thuận lợi (Ví dụ: Silica gel 60 Merck: quy định cỡ hạt 0,063 - 0,200 mm)

Yêu cầu của cột sắc ký là chất rắn dùng làm cột phải phân tán đồng đều ở mọi điểm trong cột thành một khối đồng nhất

1.4.5.3 Dung môi

Nói chung các hệ dung môi dùng cho SKLM và sắc ký giấy đều có thể ứng dụng vào sắc ký cột Tuy vậy đối với các dung môi có độ sôi quá thấp (ether), hoặc

có mùi khó chịu, hoặc độc thì không dùng làm dung môi rửa trong sắc ký cột

Các dung môi thường dùng trong sắc ký cột là: n-hexan, cloroform, aceton, ethanol, methanol, butanol, nước

Sau khi rửa giải, dụng cụ dùng để hứng là ống nghiệm (thường là 20ml) Các ống nghiệm đều được đánh số từ 1 trở đi, và sắp xếp sẵn trong các giá theo thứ tự

để khỏi nhầm lẫn trong quá trình tập hợp Các phân đoạn sau khi phân tích và tập hợp chung, tùy theo thể tích mỗi phân đoạn mà xử lý bằng cách cất thu hồi trong bình cầu ở áp suất giảm hoặc cho bốc hơi tự nhiên trên nồi cách thủy

1.4.5.4 Ứng dụng:

Ứng dụng chủ yếu của phương pháp sắc ký cột là tách các chất ra khỏi hỗn hợp Tùy thuộc bản chất của chất phân tích để lựa chọn cột tách và pha động rửa giải thích hợp với mục đích thu được chất phân tích có độ tinh khiết cao

1.4.6 Đo nhiệt độ nóng chảy [6]

Nguyên tắc: Mỗi chất khác nhau có nhiệt độ nóng chảy khác nhau

Đối với chất rắn kết tinh, điểm chảy là một tiêu chuẩn lý học rất quan trọng Điểm chảy là tiêu chuẩn để kiểm tra mức độ tinh khiết của một chất Nếu điểm chảy của 2 loại tinh thể thu được qua 2 lần kết tinh chỉ chênh lệch nhau 0,50C thì có thể xem sản phẩm kết tinh đã tinh khiết

Nếu một hợp chất kết tinh có điểm chảy còn thấp xa hơn so với điểm chảy lý thuyết chứng tỏ sản phẩm thu được chưa tinh khiết còn phải tiếp tục kết tinh và tinh chế lại [2,14]

1.4.7 Quang phổ tử ngoại khả kiến (UV- VIS) [1,3,6,14]

Nguyên tắc: Sử dụng đặc tính hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại khả kiến

(bước sóng khoảng 185 - 760 nm) của các hợp chất hoá học Mỗi chất khác nhau có khả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại khả kiến (UV - VIS) khác nhau đặc trưng riêng cho chất đó

Phương pháp quang phổ tử ngoại dựa trên định luật Lambert - Beer: Mật độ quang của dung dịch một chất ở bước sóng xác định tỷ lệ thuận với nồng độ và bề dày lớp dung dịch đem đo

D = K.l.C

Trong đó: D: Mật độ quang của một chất

C: Nồng độ dung dịch

K: Hệ số hấp thụ

L: Bề dày lớp dung dịch đem đo

Để đặc trưng cho khả năng hấp thụ UV - VIS của phân tử người ta dùng hệ số hấp thụ phân tử  và hệ số hấp thụ riêng E1cm1% Như vậy mỗi chất khác nhau có hệ số

 và E1cm1% khác nhau đặc trưng cho phân tử chất đó

Sự hấp thụ ánh sáng của các chất được ghi lại thành dạng phổ và được gọi là phổ UV - VIS đặc trưng riêng của mỗi chất Trên mỗi phổ có các đỉnh hấp thụ ánh sáng ở các bước sóng cực đại và cực tiểu [5,14]

1.4.8 Phương pháp đo phổ hồng ngoại (phổ IR) [1,3,6,14]

1.4.8.1 Nguyên tắc

Ở nhiệt độ bình thường các liên kết của các hợp chất đã có sự dao động (bao gồm dao động hóa trị và dao động biến dạng) như là sự chuyển dạng của phân tử Hấp thụ bức xạ hồng ngoại làm tăng các dao động này và làm xuất hiện phổ IR Mỗi kiểu liên kết sẽ đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau Vì vậy dựa vào kết quả phổ hồng ngoại, người ta có thể xác định được các nhóm chức đặc trưng Đối với hầu hết các hợp chất dạng của phổ IR là đơn nhất và đặc trưng trong vùng

1350 – 750cm-1 được gọi là “vùng vân tay” Ngoài ra vùng 4000 – 2500 cm-1 và

2000 – 1500cm-1 cũng là những vùng quan trọng được chú ý trong khi biện luận phổ IR

1.4.8.2 Ứng dụng

Phổ IR chủ yếu được ứng dụng cho định tính, ít sử dụng cho định lượng do cường độ các đỉnh trên phổ hồng ngoại không chi tiết như trong phổ UV-VIS mà chỉ có tính chất tương đối Phổ IR có 2 ứng dụng chính:

- Định tính các chất bằng cách so sánh với chất chuẩn

- Nhận ra các nhóm chức đặc biệt trong phân tử Phối hợp với phổ UV, NMR, MS

để xác định cấu trúc hóa học của hợp chất hữu cơ (bộ khung của phân tử, nhóm chức,

vị trí của nhóm thế trên nhân thơm, phân biệt các đồng phân)

Tuy nhiên với sự phát triển của kỹ thuật chuyển dạng Fourier, quang phổ hồng ngoại FTIR ngày càng được ứng dụng để định lượng nhiều hơn

1.5 Tình hình chiết xuất, phân lập và tinh chế notoginsenosid R1

N- R1 dễ tan trong dung môi phân cực như ethanol, methanol, butanol… nên thường dùng ethanol hoặc methanol làm dung môi chiết xuất kết hợp các phương pháp chiết lỏng - lỏng, siêu âm, cô đặc, kết tinh, sắc ký…

Để phân lập N-R1, thường sử sụng phương pháp sắc ký cột với các pha tĩnh khác nhau như silicagel pha thường và silicagel pha đảo

1.5.1 Tình hình nghiên cứu ở trong nước

Theo Dược điển Việt Nam [6], chuyên luận Tam thất (Radix Panacis notoginseng) còn rất đơn giản, với các chỉ tiêu như Mô tả, Vi phẫu, Bột, Định tính (phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng), Độ ẩm, Tro toàn phần, Chất chiết được trong dược liệu

Trong một nghiên cứu của Trần Thị Thu Uyên và cộng sự năm 2014, đã chiết xuất thành công chất chuẩn N-R1 từ nguyên liệu là sâm Việt Nam hay còn gọi là Sâm Ngọc Linh (Panax Vietnamensis Ha et Grushv) [12]

Một nghiên cứu khác của Nguyễn Thị Thúy và cộng sự năm 2016, đã tiến hành phân lập các thành phần hoạt chất của củ cây tam thất (Panax notoginseng) trồng ở Tây Bắc Việt Nam tuy nhiên chưa phân lập N-R1 [11]

Qua tham khảo các tài liệu cho thấy đến nay, trong nước chưa có công trình nào nghiên cứu về phân lập và tinh chế N-R1 từ nguyên liệu Saponin toàn phần của tam thất làm chất chuẩn

1.5.2 Tình hình nghiên cứu ở ngoài nước:

Các Saponin nhóm dammaran có mặt trong tam thất đã được nghiên cứu và chiết tách khá nhiều và từ rất sớm

Năm 1981, tác giả Jun Zhou và cộng sự đã chỉ ra cách chiết xuất và phân lập notoginsenosid R1 từ dược liệu tam thất Dược liệu sau khi nghiền nhỏ được chiết nóng với methanol sau đó dịch chiết được đem cô bốc hơi dung môi thu cắn Cắn đem hòa với nước , lắc loại tạp với diethyl ether rồi chiết bằng butanol Dịch chiết butanol đem bốc hơi dung môi thu cắn, cắn này hòa tan trong nước và được thẩm tách bằng một màng phim cellulose chống nước thu được phân đoạn thẩm tách và phân đoạn không thẩm tách Phân đoạn thẩm tách được chuyển lên cột silicagel CC, rửa giải bằng hỗn hợp dung môi chloroform-methanol-nước (13:7:2) Kết quả được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng để tách lấy phân đoạn có chứa hỗn hợp N-R1 và G-

Re Hỗn hợp này sau đó được phân tách bằng sắc ký điều chế thu N-R1 [30]

Năm 1983, nhóm chuyên gia Hiromichi Matsuura và cộng sự cũng đã tiến hành phân lập được một số hoạt chất trong tam thất Dược liệu được xay nhỏ và chiết bằng methanol, sau đó cô lấy cắn Hòa cắn với nước rồi lắc với butanol thu dịch chiết butanol Dịch chiết này đem bốc hơi dung môi lấy cắn được phân đoạn saponin Cắn này được chuyển lên cột có nhồi chất hấp phụ là silicagel rồi được rửa giải với hỗn hợp dung môi Cloroform-methanol-nước tỉ lệ thay đổi từ 50:10:1 ; 7:3:0,5 và 13:7:2 để hứng lấy các phân đoạn khác nhau Các phân đoạn này sau đó được tinh chế trên cột silicagel pha thuận, pha đảo và sắc ký điều chế để phân lập ra các chất mới, đồng thời cũng phân lập được N-R1 Hoặc từ dược liệu là thân (48g), đem chiết nóng với MeOH, thu được cắn (19g) Cắn này đem chuyển lên cột nhồi chất hấp phụ là silica gel đã được silane hóa và rửa giải với dung môi là MeOH 10%, tiếp theo là MeOH Phân đoạn rửa giải bằng MeOH đem cô lấy cắn, chuyển lên cột nhồi silicagel, rửa giải với hỗn hợp dung môi Cloroform-methanol-nước tỉ lệ 7:3:0,5 thu 6 phân đoạn Phân đoạn thứ 3 đem chuyển lên cột nhồi chất hấp phụ là silica gel đã được silane hóa và rửa giải với MeOH 40%, tiếp theo là MeOH Phân đoạn rửa giải bằng MeOH 40% được chuyển lên cột nhồi hạt polyme cao phân tử có

lỗ xốp, rửa giải bằng MeOH 55% thu được N-R1 [20]

Tham khảo tài liệu [37], tác giả Peng Ying Liao và cộng sự đã phân lập được

được nghiền nhỏ rồi chiết với ethanol, dịch chiết đem bốc hơi dưới áp suất giảm thu lấy cắn Cắn này lần lượt được chạy sắc ký cột với pha tĩnh là Diaion 101 (rửa giải bằng hỗn hợp methanol-nước), silicagel pha thuận với đường kính lỗ xốp 200 – 300 mesh (rửa giải với hỗn hợp Cloroform-methanol-nước tỉ lệ 85-15-1), silicagel pha đảo Rp-8 và Rp-18 (rửa giải bằng hỗn hợp methanol-nước) để thu được một loạt các chất khác nhau Kết quả của nghiên cứu là đã phân lập được 4 saponin nhóm dammaran mới là notoginsenoside ST-1, notoginsenoside ST-2, notoginsenoside ST-3, notoginsenoside ST-5 và phân lập được 26 chất đã biết trong tam thất trong

đó có N-R1

Tương tự trong một nghiên cứu khác [33], Li-feng Han và cộng sự cũng đã đưa ra quá trình phân tách và tinh chế các saponin trong tam thất Rễ khô (5 kg) đem chiết hồi lưu với ethanol 70% thu cắn (480,2 g) Cắn này hòa tan vào nước, cho qua cột D 101 CC, rửa giải với hỗ hợp dung môi lần lượt là nước sau đó là ethanol 50% và cuối cùng là ethanol, hứng lấy dịch ethanol đem cô cạn được cắn (120g) Cắn thu được cho qua cột silicagel, rửa bằng CHCl3 → CHCl3-MeOH(100:3→100:7) → CHCl3-MeOH-H2O (10:3:1→7:3:1→6:4:1, lớp dưới), thu

10 phân đoạn Lần lượt từng phân đoạn được tách bằng silicagel pha đảo C18 CC, Silica gel CC và sắc ký điều chế, đã thu được 20 saponin khác nhau Phân đoạn 10 (3,6 g) sau khi cho qua cột bằng silicagel pha đảo C18 CC, Silica gel CC và sắc ký điều chế thu được N-R1 (992,2 mg)

Trong một nghiên cứu khác, Qzhen Du và cộng sự đã tiến hành phân lập được 4 chất saponin nhóm dammaran trong tam thất bằng phương pháp sắc ký cột ngược dòng tốc độ nhanh sử dụng hệ dung môi n-hexan - butanol - nước (tỉ lệ 3:4:7) Kết quả được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng để tách riêng các phân đoạn Các phân đoạn có chứa 4 chất trên được tập trung lại, tinh chế bằng sắc ký lớp mỏng pha đảo với pha tĩnh là C-18 Kết quả thu được 4 chất là G-Rb1, N-R1, G-Re, G-Rg1 [38] Cũng cùng thiết bị sắc ký ngược dòng tốc độ nhanh này cùng với thiết

bị phát hiện là detector tán xạ bay hơi (ELSD) , Xue Li Cao và cộng sự cũng đã phân lập được 5 hoạt chất saponin chủ yếu của tam thất trong đó có N-R1 với hỗn

hợp dung môi rửa giải là CHCl3/MeOH/2-BuOH/H2O (5:6:1:4, v/v/v/v) và Ethyl acetat/1-BuOH/H2O (1:1:2, v/v/v) [46]

Năm 2006, Hongxiang Sun, Zhigang Yang và cộng sự cũng đã nghiên cứu cách chiết xuất và phân lập các saponin nhóm protopanaxatriol có mặt trong dược liệu Tam thất, đồng thời nghiên cứu cấu trúc và tác dụng sinh học của các chất này, trong đó có N-R1 [23] Nghiên cứu này đã đưa ra 1 sơ đồ tổng quát cho việc chiết xuất, phân lập và tinh chế như sau:

Hình 1.6: Sơ đồ chiết xuất notoginsenosid R1

Theo nghiên cứu của Wei Guang Ma, Masanori Mizutani và cộng sự [44], từ dược liệu tam thất (115g rễ khô) được nghiền mịn, chiết nóng với MeOH được cắn Cắn này hòa tan trong nước tạo hỗn dịch, loại tạp với n-hexan, chiết lỏng-lỏng với n-Butanol thu được cắn (8 g) Cắn thu được cho qua cột Diaion HP-20, rửa giải lần lượt với Me 10%, 30%, 60%, 100% thu được 4 phân đoạn Ở phân đoạn 3 (Me 60%) (4g), cắn cho qua cột silicagel, rửa giải bằng hỗn hợp CHCl3-MeOH-nước (7:3:0,5), thu được 7 phân đoạn (từ B1 đến B7) Đem B2 cho qua cột RP-18 (cỡ hạt

Rễ cây tam thất

Chiết bằng ethanol 70%, lọc lấy dịch và cô cạn

Lớp nước chất chiết được trong ethanol

Chất chiết được trong n-butanol

Saponin nguyên chất

Sáu phân đoạn

qua cột nhồi D101, rửa bằng nước, rửa giải bằng ethanol

Phân lập và tinh chế bằng RP-18 và Sephasex LH-20

7 hoạt chất (trong đó có N-R1)

tạo huyền phù trong nước, loại chất béo bằng ether

Chiết lỏng – lỏng 2pha (H 2 O- BuOH bão hòa nước)

Silica gel CC, rửa giải bằng cloroform/methanol

45-60 µm), rửa giải bằng hỗn hợp MeOH-nước (1:1) thu được R1 (35 mg) Ngoài N-R1, nghiên cứu này còn phân lập được thêm 13 hoạt chất khác của Tam thất

Trong một nghiên cứu sử dụng sắc ký lỏng điều chế, Jian Bowan và các cộng

sự đã sử dụng thiết bị này để phân lập được 5 thành phần trong rễ tam thất trong đó

có N-R1 chỉ với hỗn hợp dung môi đơn giản gồm ethanol và nước trên cột pha đảo C-18, thời gian phân tách hoàn toàn 5 chất này chỉ chưa đầy 1 giờ và các chất có độ tinh khiết lên tới 96% [28]

Bên cạnh các phương pháp tách chiết quen thuộc dùng để tách biệt hai loại saponin nhóm dammarane như chiết lỏng-lỏng, dùng silicagel sắc ký cột, thẩm tách hay kết tủa với natrihydrat, thì hiện nay phương pháp dùng hạt nhựa rỗng (macroporous resin) để phân tách đang là một phương pháp mới với rất nhiều ưu điểm Nhựa Macroporous là polyme ưa nước bền sở hữu khả năng hấp phụ cao với các phân tử hấp phụ, chi phí tương đối thấp và dễ dàng tái sinh Nguyên tắc lọc của

nó được dựa trên sự khác biệt về trọng lượng phân tử, phân cực, hoặc hình dạng phân tử khác nhau từ đó sàng lọc và tách rời Trong bài báo [27] đã nghiên cứu sự hấp phụ và phản hấp phụ của saponin 20(S) -propanaxadiol và 20(S)–protopanaxadiol từ Tam thất trên bốn loại nhựa macroporous,bao gồm D-101, DA-

201, DM-301 và DS-401 Kết quả là quá trình phân tách xảy ra khá thuận lợi và DS-401 có khả năng phân tách tốt nhất

Qua các tài liệu tham khảo được, chúng tôi dự kiến đưa ra quy trình phân lập và tinh chế R1 như sau:

Hình 1.7: Sơ đồ dự kiến phân lập và tinh chế N-R1 từ Saponin toàn phần của tam thất 1.6.Vài nét về phân tích định lƣợng notoginsenosid R1:

Hiện nay có nhiều bài báo cũng như dược điển đưa ra phương pháp phân tích xác định sự có mặt của N- R1 trong dược liệu, các chế phẩm đông dược cũng như trong các dịch sinh học Các kỹ thuật phân tích đã được áp dụng để xác định sự có mặt của R1 cũng rất đa dạng từ những kỹ thuật đơn giản như sắc ký lớp mỏng đến các kỹ thuật phức tạp hơn như HPLC-DAD, UPLC-MS, HPCE, HPLC-huỳnh quang, LC-MS… Tuy nhiên một trong những phương pháp được sử dụng phổ biến hiện nay là phương pháp HPLC Đây là kỹ thuật phân tích cho phép xác định sự có mặt của N-R1 một cách chính xác, lượng mẫu phân tích không cần nhiều và đặc biệt có thể áp dụng ở hầu hết các phòng kiểm nghiệm Sau đây là một số chương trình sắc ký để phân tích N-R1 mà chúng tôi tham khảo được:

Nguyên liệu saponin toàn phần của tam thất

qua cột nhồi silicagel, rửa giải bằng dung môi thích hợp

Bảng 1.1: Một số điều kiện phân tích N-R1

(125mm×4,6mm i.d., 5µm)

Nước (A) and acetonitrile (B) với chương trình gradient như sau: