LUAN VAN TOT NGHIEP HOAN CHINH BUI DUY NHAN

Nguồn nước giàu ammonium và orthophosphate từ ao nuôi cá tra công nghiệp khi thải ra sông rạch có nguy cơ gây ô nhiễm môi trường cao. Đề tài được thực hiện trong 6 tháng nhằm nghiên cứu khả năng loại bỏ ammonium và orthophosphate trong nguồn nước này bằng việc kết hợp giữa vi khuẩn chuyển hóa nitơ, vi khuẩn tích lũy polyphosphate và thực vật thủy sinh trong quy trình xử lý. Nghiên cứu gồm có 4 thí nghiệm với vi khuẩn chuyển hóa nitơ Bacillus sp. dòng AGT.077.O3 và vi khuẩn tích lũy polyphosphate Bacillus subtilis dòng DTT.001L được khảo sát trong môi trường nước ao cá tra sục khí liên tục và thay 50% nước sau mỗi 24 giờ xử lý. Nghiệm thức đối chứng được bố trí cùng các nghiệm thức: 5% vi khuẩn (50 mLL nước ao); 5% vi khuẩn kết hợp với giá thể; 5% vi khuẩn, bổ sung glucose (1 gL nước ao); 5% vi khuẩn kết hợp với giá thể, bổ sung glucose (1 gL nước ao) trong thí nghiệm 1 với quy mô 8 lít nước aođơn vị thí nghiệm. Thí nghiệm 2 gồm 3 nghiệm thức: đối chứng; 5% vi khuẩn (50 mLL nước ao); 5% vi khuẩn kết hợp với giá thể, bổ sung glucose (1 gL nước ao), được bố trí với quy mô 80 lít nước aođơn vị thí nghiệm. Thí nghiệm 3 gồm nghiệm thức đối chứng và nghiệm thức 5% vi khuẩn (50 mLL nước ao) kết hợp giá thể, bổ sung glucose (1 gL nước ao) tiến hành trên quy mô 800 lít nước aođơn vị thí nghiệm. Kết quả 3 thí nghiệm cho thấy nghiệm thức kết hợp giữa 5% vi khuẩn, giá thể và bổ sung glucose (1 gL) làm giảm lượng ammonium và orthophosphate trong nước ao nuôi cá tra tốt nhất. Thí nghiệm 4 tiến hành xây dựng quy trình xử lý nước ao cá tại nông hộ, mô hình kết hợp giữa phương pháp xử lý bằng vi khuẩn, giá thể, bổ sung glucose và phương pháp xử lý bổ sung bằng thực vật thủy sinh đã loại bỏ được ammonium và orthophosphate đồng thời cải thiện được các chỉ tiêu COD, TSS, TN, TP, nitrit, nitrate trong nước ao cá. Nước sau xử lý đạt chuẩn loại A theo QCVN 40:2011BTNMT và không gây hại cho động vật thủy sinh.

BÙI DUY NHÂN

ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC

XỬ LÝ ĐẠM, LÂN TRONG

NƯỚC AO NUÔI CÁ TRA CÔNG NGHIỆP

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CAO HỌC

NGÀNH SINH THÁI HỌC

2013

BÙI DUY NHÂN

ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC

XỬ LÝ ĐẠM, LÂN TRONG

NƯỚC AO NUÔI CÁ TRA CÔNG NGHIỆP

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CAO HỌC

NGÀNH SINH THÁI HỌC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS.TS CAO NGỌC ĐIỆP

2013

Năm học 2011-2013

ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC

XỬ LÝ ĐẠM, LÂN TRONG NƯỚC AO NUÔI CÁ TRA CÔNG NGHIỆP

LỜI CAM ĐOAN

Tôi tên là Bùi Duy Nhân, tác giả của luận văn, xin cam đoan Luận văn

đã được chỉnh sửa hoàn chỉnh theo những ý kiến và góp ý của các phản biện

và các thành viên Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn Thạc Sĩ

Cần Thơ, ngày 06 tháng 08 năm 2013

Bùi Duy Nhân

Luận văn Thạc sĩ ngành SINH THÁI HỌC

Chuyên ngành SINH THÁI HỌC

PGs Ts Cao Ngọc Điệp Ts Đái Thị Xuân Trang

Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến:

 PGS.TS Cao Ngọc Điệp đã tận tâm hướng dẫn, tạo điều kiện tốt nhất

để tôi có thể hoàn thành luận văn

 Ban Chủ nhiệm Khoa Khoa Học Tự Nhiên, Ban Chủ nhiệm Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã nhiệt tình hỗ trợ để tôi hoàn thành luận văn này

 Quý Thầy, Cô và Cán bộ công tác tại khoa Khoa Khoa Học Tự Nhiên, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm để tôi hoàn thành khóa học cũng như thực hiện luận văn

 Các anh, chị Nghiên cứu sinh, học viên Cao học và các em sinh viên đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

 Gia đình nông hộ nuôi cá tra tại Thành phố Cần Thơ và tỉnh Vĩnh Long

đã hỗ trợ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

 Các anh, chị cán bộ Trung tâm Kỹ thuật và Ứng dụng Công nghệ Thành phố Cần Thơ đã hỗ trợ tích cực trong việc phân tích các kết quả thí nghiệm

 Gia đình, người thân và bạn bè đã làm điểm tựa, cho tôi niềm tin để hoàn thành luận văn

Xin chân thành cảm ơn

Cần Thơ, ngày 11 tháng 06 năm 2013

Bùi Duy Nhân

Đề tài: Ứng dụng Công nghệ Sinh học xử lý đạm, lân trong nước ao nuôi cá tra công nghiệp

Nguồn nước giàu ammonium và orthophosphate từ ao nuôi cá tra công nghiệp khi thải ra sông rạch có nguy cơ gây ô nhiễm môi trường cao Đề tài được thực hiện trong 6 tháng nhằm nghiên cứu khả năng loại bỏ ammonium

và orthophosphate trong nguồn nước này bằng việc kết hợp giữa vi khuẩn chuyển hóa nitơ, vi khuẩn tích lũy polyphosphate và thực vật thủy sinh trong quy trình xử lý Nghiên cứu gồm có 4 thí nghiệm với vi khuẩn chuyển hóa nitơ

Bacillus sp dòng AGT.077.O3 và vi khuẩn tích lũy polyphosphate Bacillus subtilis dòng DTT.001L được khảo sát trong môi trường nước ao cá tra sục

khí liên tục và thay 50% nước sau mỗi 24 giờ xử lý Nghiệm thức đối chứng được bố trí cùng các nghiệm thức: 5% vi khuẩn (50 mL/L nước ao); 5% vi khuẩn kết hợp với giá thể; 5% vi khuẩn, bổ sung glucose (1 g/L nước ao); 5%

vi khuẩn kết hợp với giá thể, bổ sung glucose (1 g/L nước ao) trong thí nghiệm

1 với quy mô 8 lít nước ao/đơn vị thí nghiệm Thí nghiệm 2 gồm 3 nghiệm thức: đối chứng; 5% vi khuẩn (50 mL/L nước ao); 5% vi khuẩn kết hợp với giá thể, bổ sung glucose (1 g/L nước ao), được bố trí với quy mô 80 lít nước ao/đơn vị thí nghiệm Thí nghiệm 3 gồm nghiệm thức đối chứng và nghiệm thức 5% vi khuẩn (50 mL/L nước ao) kết hợp giá thể, bổ sung glucose (1 g/L nước ao) tiến hành trên quy mô 800 lít nước ao/đơn vị thí nghiệm Kết quả 3 thí nghiệm cho thấy nghiệm thức kết hợp giữa 5% vi khuẩn, giá thể và bổ sung glucose (1 g/L) làm giảm lượng ammonium và orthophosphate trong nước ao nuôi cá tra tốt nhất Thí nghiệm 4 tiến hành xây dựng quy trình xử lý nước ao

cá tại nông hộ, mô hình kết hợp giữa phương pháp xử lý bằng vi khuẩn, giá thể, bổ sung glucose và phương pháp xử lý bổ sung bằng thực vật thủy sinh đã loại bỏ được ammonium và orthophosphate đồng thời cải thiện được các chỉ tiêu COD, TSS, TN, TP, nitrit, nitrate trong nước ao cá Nước sau xử lý đạt chuẩn loại A theo QCVN 40:2011/BTNMT và không gây hại cho động vật thủy sinh

Từ khóa: ammonium, chế phẩm sinh học, giá thể, glucose, nước ao cá tra,

orthophosphate

orthophosphate in intensive tra-fish pond water treatment

The water from intensive tra-fish ponds with high concentration of ammonium and orthophosphate compounds may become a serious pollution source when being released to rivers and canals This study was carried out in

6 months with the objective to examine the ability of removing ammonium and orthophosphate in the water of tra-fish ponds by the combination of heterotrophic nitrogen removal bacteria, polyphosphate-accumulating bacteria and aquatic plants There were four experiments with the application of

heterotrophic nitrogen removal bacteria Bacillus sp strain AGT.077.O3 and polyphosphate-accumulating bacteria Bacillus subtilis strain DTT.001L in tra-

fish pond water together with aerobic condition and changed 50% of water after every 24 hours The experiment 1 included 5 treatments: 5% of bacteria (50 mL/L of pond water), 5% of bacteria with biological fixed contact material (BFCM), 5% of bacteria and glucose (1 g/L of pond water), 5% of bacteria with BFCM and glucose (1 g/L of pond water), and the control; each treatment was carried out in bioreactor 10-L with 8 litres of pond water In experiment 2, there were three treatments with 80 liters of pond water for each treatment, including 5% of bacteria (50 mL/L of pond water), 5% of bacteria with BFCM and glucose (1 g/L of pond water), and the control The experiment 3 was designed with two treatments (800 liters of pond water for each unit), namely 5% of bacteria (50 mL/L of pond water) with BFCM and glucose (1 g/L of pond water) together with the control The results showed that the treatment 5% of bacteria with BFCM and glucose (1 g/L of pond water) had high efficiency in reducing ammonium and orthophosphate concentration in tra-fish pond water The experiment 4 was to examine the water treatment process at home-scale tra-fish farming which combined two methods: treatment with bacteria, BFCM and glucose and then treatment with aquatic plants It was resulted that this process could remove ammonium and orthophosphate concentration in tra-fish pond water and decreased important indicator values including COD, TSS, TN, TP, Nitrite, and Nitrate in tra-fish pond water The tra-fish pond water after nitrogen removal bacteria, polyphosphate-accumulating bacteria, BFCM, glucose together with aquatic plants treatment reached to A standard of QCVN 40:2011/BTNMT and did not affect to health

of aquatic animals

Key words: ammonium, biological fixed contact material, bioproducts,

glucose, orthophosphate, tra-fish pond water

Tôi xin cam kết luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quả

nghiên cứu của tôi trong khuôn khổ của đề tài: “Khảo sát đa dạng di truyền vi

khuẩn ở đồng bằng sông Cửu Long và tuyển chọn vi khuẩn kết tụ sinh học, chuyển hóa nitơ, photpho dung trong xử lý nước thải” Đề tài có quyền sử

dụng kết quả của luận văn này để phục vụ cho đề tài

Cần Thơ, ngày 11 tháng 06 năm 2013

Người hướng dẫn Tác giả luận văn

Astract iv

Trang cam kết v

Mục lục vi

Danh sách bảng viii

Danh sách hình x

Chữ viết tắt xi

Chương 1: Giới thiệu 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

Chương 2: Tổng quan tài liệu 3

2.1 Sơ lược về đạm, lân 3

2.1.1 Đạm trong tự nhiên 3

2.1.2 Phospho trong tự nhiên 6

2.2 Đạm, lân trong nước ao nuôi cá tra công nghiệp 8

2.3 Ứng dụng công nghệ sinh học xử lý đạm, lân trong nước thải 10

2.3.1 Vi khuẩn chuyển hóa nitơ 10

2.3.2 Vi khuẩn tích lũy polyphosphate 11

2.4 Các nghiên cứu trong xử lý nước ao nuôi cá tra công nghiệp 13

Chương 3: Phương tiện và phương pháp 17

3.1 Thời gian và địa điểm 17

3.1.1 Thời gian nghiên cứu 17

3.1.2 Địa điểm nghiên cứu 17

3.2 Phương tiện thí nghiệm 17

3.2.1 Vật liệu 17

3.2.2 Dụng cụ, trang thiết bị 17

3.2.3 Hóa chất 18

3.3 Phương pháp nghiên cứu 18

3.3.1 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn 18

3.3.2 Tiến hành thí nghiệm 20

3.3.3 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu hóa lý 22

3.3.4 Đánh giá chất lượng nước ao nuôi cá tra 29

3.3.5 Phân tích mẫu và xử lý số liệu 30

Chương 4: Kết quả - Thảo luận 31

4.1 Thí nghiệm 1: Hiệu quả xử lý nitơ, phospho trong nước ao nuôi cá tra với vi khuẩn chuyển hóa nitơ Bacillus sp dòng AGT.077.O3, vi khuẩn tích lũy polyphosphate Bacillus subtilis dòng DTT.001L, glucose và giá thể trên mô hình 8 lít 31

4.1.1 Hiệu quả của hai dòng vi khuẩn, giá thể và glucose lên hàm lượng ammonium trong nước ao 31

4.1.3 Hiệu quả của hai dòng vi khuẩn, giá thể và glucose

lên giá trị pH của nước ao 38

4.1.4 Hiệu quả của hai dòng vi khuẩn, giá thể và glucose lên các chỉ số COD, TSS, TN, TP của nước ao 39

4.2 Thí nghiệm 2: Hiệu quả xử lý nitơ, photpho trong nước ao nuôi cá tra với vi khuẩn chuyển hóa nitơ Bacillus sp dòng AGT.077.O3, vi khuẩn tích lũy polyphosphate Bacillus subtilis dòng DTT.001L, glucose và giá thể trên mô hình 80 lít 41

4.2.1 Hiệu quả của hai dòng vi khuẩn, giá thể và glucose lên hàm lượng ammonium trong nước ao 42

4.2.2 Hiệu quả của hai dòng vi khuẩn, giá thể và glucose lên hàm lượng orthophosphate trong nước ao 44

4.2.3 Hiệu quả của hai dòng vi khuẩn, giá thể và glucose lên giá trị pH trong nước ao 45

4.2.4 Hiệu quả của hai dòng vi khuẩn, glucose và giá thể lên các chỉ số COD, TSS, TN, TP, Nitrit, Nitrate của nước ao 46

4.3 Thí nghiệm 3: Hiệu quả loại bỏ nitơ, phospho trong nước ao nuôi cá tra với vi khuẩn chuyển hóa nitơ Bacillus sp dòng AGT.077.O3, vi khuẩn tích lũy polyphosphate Bacillus subtilis dòng DTT.001L, giá thể và glucose trên mô hình 800 lít 48

4.3.1 Hiệu quả của hai dòng vi khuẩn, giá thể và glucose lên hàm lượng ammonium trong nước ao 48

4.3.2 Hiệu quả của hai dòng vi khuẩn, giá thể và glucose lên hàm lượng orthophosphate trong nước ao 50

4.3.3 Hiệu quả của hai dòng vi khuẩn, glucose và giá thể lên giá trị pH trong nước ao 52

4.3.4 Hiệu quả của hai dòng vi khuẩn, glucose và giá thể lên các chỉ số COD, TSS, TN, TP, Nitrit, Nitrate trong nước ao 53

4.4 Thí nghiệm 4: Hiệu quả của vi khuẩn chuyển hóa nitơ Bacillus sp dòng AGT.077.O3, vi khuẩn tích lũy polyphosphate Bacillus subtilis dòng DTT.001L, glucose và giá thể lên nồng độ nitơ, phospho trong nước ao nuôi cá tra công nghiệp tại nông hộ với quy trình đề xuất 56

Chương 5: Kết luận và đề nghị 60

5.1 Kết luận 60

5.2 Đề nghị 60

Bảng 3.1: Bố trí giá thể, glucose và vi khuẩn trong các nghiệm thức 20

Bảng 3.2: Thành phần hóa chất trong dãy đường chuẩn đo đạm NH4+ 23

Bảng 3.3: Phương trình đường chuẩn NH4+ 24

Bảng 3.4: Thành phần hóa chất trong dãy đường chuẩn đo lân PO43- 24

Bảng 3.5: Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về chất lượng nước mặt theo QCVN 08:2008/BTNMT 29

Bảng 3.6: Giá trị giới hạn các thông số và nồng độ chất ô nhiễm theo QCVN 40:2011/BTNMT 30

Bảng 4.1: Ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus sp (AGT.077.O3), Bacillus subtilis (DTT.001L), giá thể và glucose lên hàm lượng ammonium cuối ngày thứ nhất trong keo nhựa 8 lít 31

Bảng 4.2: Ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus sp (AGT.077.O3), Bacillus subtilis (DTT.001L), glucose, giá thể lên mật số vi khuẩn khử đạm trong mô hình 8 lít 34

Bảng 4.3: Hiệu quả của vi khuẩn Bacillus sp (AGT.077.O3), Bacillus subtilis (DTT.001L), glucose và giá thể lên lượng orthophosphate sụt giảm ở các nghiệm thức theo thời gian trong mô hình 8 lít 36

Bảng 4.4: Ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus sp (AGT.077.O3), Bacillus subtilis (DTT.001L), glucose và giá thể lên mật số vi khuẩn tích lũy polyphosphate trong mô hình 8 lít 37

Bảng 4.5: Hiệu quả của vi khuẩn Bacillus sp (AGT.077.O3), Bacillus subtilis (DTT.001L), giá thể và glucose lên các chỉ số COD, TSS, TN,TP của nước ao trong mô hình 8 lít 40

Bảng 4.6: Ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus sp (AGT.077.O3), Bacillus subtilis (DTT.001L), glucose, giá thể lên mật số vi khuẩn khử đạm trong mô hình 80 lít 42

Bảng 4.7: Ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus sp (AGT.077.O3), Bacillus subtilis (DTT.001L), giá thể và glucose lên hàm lượng ammonium trong nước ao trên mô hình 80 lít 43

Bảng 4.8: Ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus sp (AGT.077.O3), Bacillus subtilis (DTT.001L), giá thể và glucose lên hàm lượng orthophosphate (mg/L) trong nước ao cá ở mô hình 80 lít 44

Bảng 4.9: Ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus sp (AGT.077.O3), Bacillus subtilis (DTT.001L), glucose và giá thể lên các chỉ số COD, TSS, TN,TP, Nitrit, Nitrate của nước ao trong mô hình 80 lít 46

vi khuẩn khử đạm trong nước ao 50

Bảng 4.11: Ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus sp (AGT.077.O3),

Bacillus subtilis (DTT.001L), glucose và giá thể lên hàm

lượng orthophosphate trong nước ao trên mô hình 800 lít 51

Bảng 4.12: Ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus sp (AGT.077.O3),

Bacillus subtilis (DTT.001L), glucose và giá thể lên các chỉ

số COD, TSS, TN, TP, Nitrit, Nitrate trong nước ao trên mô

hình 800 lít 53 Bảng 4.13: Ảnh hưởng của bèo tấm lên các chỉ số COD, TSS, TN, TP,

Nitrit, Nitrate sau 24 giờ trong nước ao đã qua xử lý vi

khuẩn 55 Bảng 4.14: Ảnh hưởng của hệ thống xử lý Vi khuẩn+glucose+giá thể

kết hợp dùng thủy sinh thực vật lên nước ao nuôi cá tra 58

Hình 3.1: Máy cất đạm Parnas – Wargner 28

Hình 4.1: Hiệu quả của vi khuẩn Bacillus sp (AGT.077.O3), Bacillus

subtilis (DTT.001L), giá thể và glucose lên lên lượng

ammonium sụt giảm ở các nghiệm thức theo thời gian trong

keo nhựa 8 lít 32 Hình 4.2: Hiệu quả của giá thể và glucose trong nghiệm thức 5% vi

khuẩn + glucose + giá thể (VK_glu+GT) và nghiệm thức 5% vi khuẩn + glucose (VK_glu.) 35

Hình 4.3: Hiệu quả của vi khuẩn Bacillus sp (AGT.077.O3), Bacillus

subtilis (DTT.001L), giá thể và glucose lên giá trị pH của

nước ao trong mô hình 8 lít 38

Hình 4.4: Ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus sp (AGT.077.O3),

Bacillus subtilis (DTT.001L), glucose và giá thể lên giá trị

pH của nước ao trong mô hình 80 lít 45

Hình 4.5: Ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus sp (AGT.077.O3),

Bacillus subtilis (DTT.001L), giá thể và glucose lên hàm

lượng NH4+ (mg/L) trong nước ao 49

Hình 4.6: Ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus sp (AGT.077.O3),

Bacillus subtilis (DTT.001L), glucose và giá thể lên giá trị

pH trong nước ao trên qui mô 800 lít 52 Hình 4.7: Mô hình xử lý nước ao cá tra tại nông hộ 57 Hình 4.8: Các bước trong quy trình xử lý nước ao cá tra ở nông hộ 59

ANOVA : Analysic of Variance (Phân tích phương sai)

CFU : Colony Forming Unit (Số khuẩn lạc trên một đơn vị)

COD : Chemical Oxygen Demand (Nhu cầu oxy hóa học)

CV : Coefficient Variation (Hệ số biến động)

TSS : Total Suspended Solids (Tổng hàm lượng chất rắn lơ lửng)

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Theo số liệu của Tổ chức Lương Nông Liên hợp quốc, Việt Nam là một trong 5 nước có sản lượng nuôi trồng thủy sản lớn nhất thế giới, nhóm 10 nước xuất khẩu thủy sản và trong nhóm 20 nước cung cấp sản lượng thủy sản khai thác cao nhất trên thế giới Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu thủy sản Việt Nam vừa đúc kết cho thấy chỉ trong 12 năm (2001 - 2012) vùng nuôi cá tra mở rộng đạt gần 6.000 ha, tăng gấp 5 lần; sản lượng cá nguyên liệu từ 37.500 tấn/năm tăng lên 1.350.000 tấn, tăng gấp 36 lần.(1)

Thế nhưng trong những năm trở lại đây, việc xuất khẩu cá tra gặp trở ngại bởi nhiều tiêu chuẩn quốc tế khác nhau Với 23 chứng chỉ không đồng bộ

và cần đầu tư chi phí cao để đạt được chứng nhận, doanh nghiệp và người nuôi

cá tra đang đứng trước “bài toán nan giải” trong quá trình phát triển nghề nuôi thủy sản bền vững Trước tình hình đó, tiêu chuẩn VietGAP (Tiêu chuẩn thực hành sản xuất an toàn) đang được kỳ vọng là nền tảng để doanh nghiệp và người nuôi cá tra yên tâm phát triển và tiến sâu hơn vào thị trường kinh tế thế giới Để đạt được chứng nhận này, một trong những điều kiện phải đạt được là

“hệ thống cấp và thải nước phải độc lập với nhau và được quản lý để tránh làm

ô nhiễm nguồn nước cấp”(2) Vì vậy, muốn phát triển bền vững thì song song với việc phát triển kinh tế, doanh nghiệp và người nuôi cá tra cũng cần quan tâm bảo vệ môi trường đặc biệt là môi trường nước

Thực tế cho thấy nuôi cá theo hình thức thâm canh với quy mô công nghiệp đã có tác động rất lớn đến môi trường do thức ăn dư thừa, chất thải dạng phân và chất bài tiết bị tích góp lại trong nước và nền đáy Dưới hoạt động của vi sinh vật và các quá trình phân huỷ, chất thải chuyển thành amoni, nitrate, photphat,… Các chất khoáng đã kích thích sự phát triển của tảo dẫn đến hiện tượng nở hoa trong ao Việc thải bỏ lượng nước ao giàu đạm, lân mà không được quản lý và kiểm soát trong điều kiện cơ sở hạ tầng khu nuôi không được đảm bảo thì chất thải từ khu nuôi này sẽ theo nguồn nước cấp vào các khu nuôi khác Trên cơ sở đó để bảo vệ môi trường, hạn chế tác động từ bên ngoài biện pháp duy nhất là nguồn nước từ các khu nuôi thâm canh đều phải được xử lý trước khi tuần hoàn trở lại môi trường

1

http://nongnghiep.vn/nongnghiepvn/72/2/2/95994/suc-song-ca-tra.aspx

(VietGAP), ngày 05 tháng 07 năm 2011

Với đặc tính lượng nước nhiều và chủ yếu dạng dễ phân hủy sinh học, điều kiện các khu vực nuôi cá đều nằm trong các vùng nông thôn, gần các khu sản xuất nông nghiệp nên các giải pháp áp dụng để xử lý nước giàu đạm, lân

từ quá trình nuôi cá đều thiên về hướng sử dụng công nghệ sinh học tự nhiên

và đơn giản

Trên cơ sở nghiên cứu của các luận văn thạc sĩ được thực hiện từ năm

2008 - 2012 về phân lập, nhận diện các dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ, tích lũy polyphosphate cũng như bước đầu ứng dụng vi khuẩn và thực vật thủy sinh xử lý nước phú dưỡng trong điều kiện in-vitro, đề tài thực hiện bước tiếp trong quá trình ứng dụng và hoàn thiện quy trình xử lý nước ao nuôi cá tra

công nghiệp Mục tiêu của đề tài nhằm “ Ứng dụng công nghệ sinh học để

xử lý đạm, lân trong nước ao nuôi cá tra công nghiệp” đạt tiêu chuẩn loại A

theo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về nước thải công nghiệp - QCVN 40:2011/BTNMT do Bộ Tài nguyên và Môi trường Việt Nam quy định [1]

1.2 Mục tiêu đề tài

- Xác định ảnh hưởng của glucose và giá thể lên quá trình xử lý đạm, lân

trong nước ao nuôi cá tra của vi khuẩn chuyển hóa nitơ Bacillus sp dòng AGT.077.O3 và vi khuẩn tích lũy polyphosphate Bacillus subtilis dòng

DTT.001L

- Xây dựng quy trình xử lý đạm, lân trong nước ao nuôi cá tra công nghiệp để nguồn nước sau xử lý đạt tiêu chuẩn cho phép Khảo sát hiệu quả của quy trình trên điều kiện thực tế ở nông hộ

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về đạm, lân

2.1.1 Đạm trong tự nhiên

Nitrogen rất cần thiết cho sự sống, chúng là thành phần cấu tạo của protein và acid nucleic trong tế bào vi khuẩn, động vật và thực vật Hầu hết sinh vật sẽ không sử dụng nitrogen nếu khí này không bị biến đổi thành amoni bởi vì nitrogen là một phân tử bền vững và không bị biến đổi ở những điều kiện nhất định (sóng điện tử, nhiệt độ và áp suất cao,…)[2] Nitơ là nguyên tố thiết yếu cho các tiến trình sinh học, có mặt trong thành phần của các acid amin (hợp phần bắt buộc của protein trong tế bào chất đặc trưng cho sự sống), hiện diện trong DNA, RNA (vật chất di truyền của tế bào ở cấp độ phân tử), trong các enzyme, trong màng tế bào, mang chức năng cấu trúc hoặc giữ chức năng cử động, cung cấp năng lượng cho cơ thể, tham gia cấu tạo ATP và ADP Mặc dù khoảng 80% khí quyển là nitơ [3] nhưng không có một động vật nào, chỉ có một vài thực vật (tảo lam), vi khuẩn thuộc nhóm vi sinh vật tiền nhân là

có khả năng dùng được nitơ phân tử

Nitơ phân tử (N2) hòa tan trong nước thiên nhiên khoảng 12 mg/L ở

25oC Cũng như trong đất, quá trình cố định nitơ trong thủy vực được thực hiện bởi tảo xanh, các loài vi khuẩn quang hợp, các vi sinh vật dị dưỡng

Azotobacter, Clostridium,… [2]

Amoniac trong các thủy vực được cung cấp từ quá trình phân hủy bình thường các protein xác bã động vật, thực vật phù du, sản phẩm bài tiết của động vật hay từ phân bón vô cơ, hữu cơ Amoniac là loại khí độc, khi được tạo thành sẽ phản ứng với nước sinh ra ion NH4+ Amoniac là yếu tố quan trọng có ảnh hưởng đến tỷ lệ sống, sinh trưởng đối với thủy sinh vật [4]

Ammonium hết sức độc hại và nguy hiểm, NH4+ ở hàm lượng từ 0,6 - 2 mg/L có thể ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của cá Hàm lượng ammoniac thích hợp nhất cho ao nuôi thủy sản là <0,1 mg/L và ammonium là 0,2 - 2 mg/L Trong môi trường thủy sản, ammoniac tồn tại dưới dạng NH3 hoặc NH4+tùy thuộc vào pH của môi trường Trong môi trường có pH cao thì ammoniac

dễ chuyển thành NH3, có độc tính cao NH3 có độc tính cao hơn NH4+ vì NH3không mang điện tích nên dễ dàng thấm qua màng tế bào mang cá, đồng thời

có khả năng hòa tan trong chất béo, còn NH4+ là ion có kích thước lớn hơn, có thể kết hợp và mang điện tích nên khó thấm qua tế bào mang cá Chỉ số NH3

cho phép trong môi trường nuôi tôm, không được lớn hơn 3 mg/L Do đó, nếu nước ao có hàm lượng ammoniac cao thải vào môi trường sẽ gây độc cấp tính

và làm cho tôm cá chết trong thời gian ngắn Ammoniac sẽ chuyển thành nitrite nhờ vi khuẩn oxy hóa amon khi kết hợp với oxy trong nước [5]

Hợp chất chứa nitơ dạng oxy hóa gồm nitrite (NO2-) và nitrate (NO3-) Hàm lượng nitrite cho phép trong nuôi trồng thủy sản là dưới 0,3 mg/L Nếu vượt quá sẽ gây độc Nitrate được tạo thành nhờ vi khuẩn oxy hóa nitrite Hàm lượng nitrate cho phép trong môi trường nuôi trồng thủy hải sản <10 mg/L Ở hàm lượng 10 mg/L sẽ làm cho tảo phát triển Khi tảo quá nhiều sẽ kết nối thành khối nổi lên mặt nước, khi bị phân hủy sẽ gây ô nhiễm nước, làm nước

bị đục và thối, giảm độ oxy hòa tan Khi hàm lượng nitrate >50 mg/L sẽ gây sốc nghiêm trọng cho tôm cá [5]

Chu trình nitrogen gồm 5 quá trình: cố định nitrogen, sự đồng hóa nitrogen, sự amoni hóa, sự nitrate hóa và sự khử nitrate [2] Trong tự nhiên, nitơ được chuyển hóa qua nhiều dạng khác nhau trong một chu trình khép kín gồm các quá trình cơ bản sau:

 Quá trình cố định nitơ: Quá trình này nitơ phân tử (N2) được chuyển hóa thành nitơ hợp chất Hàng năm trên thế giới có 2,4 x 108

tấn đạm được cố định, 2/3 trong số đó là do vi sinh vật cố định đạm, 1/4 là do sản xuất công

nghiệp, còn lại là ngẫu nhiên [6]

Vi khuẩn cố định đạm, với bộ máy enzyme có khả năng cắt liên kết ba giữa hai nguyên tử nitơ của phân tử nitơ trong không khí chuyển về dạng ammonia cây trồng hấp thu được Vi khuẩn cố định đạm thuộc các giống:

Acetobacter, Bacillus, Pseudomonas, Azotobacter, Azospirilum,…

Các loài vi khuẩn và tảo xanh thực hiện được quá trình này là do trong tế bào chúng có hệ thống xúc tác enzyme nitrogenase Enzyme này thường gồm hai thành phần: một thành phần gọi là Fe-Protein và một thành phần khác gọi

là Mo-Fe-Protein Mo-Fe-Protein có chứa 2 nguyên tử Mo, 32 nguyên tử Fe và

25 - 31 nguyên tử lưu huỳnh Loại Fe-Protein có trọng lượng phân tử khoảng 60.000 [7] Mo-Fe-Protein có trọng lượng phân tử khoảng 220.000 và gồm 2 tiểu phần tử (subunits) đã được kết tinh tinh khiết

 Quá trình nitrate hóa: Nitrate hóa là quá trình oxy hóa amonia và

muối amonium hình thành acid nitrous (HNO2) và acid nitric (HNO3) Qua đó,

vi sinh vật thu năng lượng cần thiết cho hoạt động sống của mình Vi sinh vật thực hiện quá trình oxy hóa này kèm theo sự đồng hóa CO2 xây dựng các hợp chất hữu cơ của cơ thể chúng, chúng là vi khuẩn hóa tự dưỡng và là những cơ

thể hiếu khí bắt buộc Quá trình này gồm 2 giai đoạn:

* Quá trình nitrite hóa

Quá trình oxy hóa NH4+ thành NO2- được tiến hành bởi nhóm vi khuẩn nitrite hóa Chúng thuộc nhóm vi sinh vật tự dưỡng hóa năng có khả năng oxy hóa NH4+ bằng oxy không khí và tạo ra năng lượng

NH4+ + 3/2 O2 → NO2- + H2O + 2H + năng lượng

Năng lượng này được dùng để đồng hóa CO2 thành carbon hữu cơ Enzyme xúc tác cho quá trình này là các enzyme của quá trình hô hấp hiếu khí

Nhóm vi khuẩn nitrite hóa thuộc 4 giống khác nhau: Nitrosomonas,

Nitrosocystic, Nitrosolobus, Nitrosospira Chúng đều thuộc loại tự dưỡng bắt

buộc [8]

* Quá trình nitrate hóa

Quá trình oxy hóa NO2- thành NO3- được thực hiện bởi nhóm vi khuẩn nitrate hóa Chúng cũng là những vi sinh vật tự dưỡng hóa năng có khả năng oxy hóa NO2- tạo thành năng lượng Năng lượng này được dùng để đồng hóa

CO2 tạo thành đường

NO2- + 1/2 O2 → NO3- + năng lượng

Nhóm vi khuẩn tiến hành oxy hóa NO2- thành NO3- thuộc 3 giống khác

nhau: Nitrobacter, Nitrospira, Nitrococcus

Ngoài nhóm vi khuẩn tự dưỡng hóa năng nói trên, trong đất còn một số loài vi sinh vật dị dưỡng cũng tiến hành quá trình nitrate hóa Đó là các loài vi

khuẩn và xạ khuẩn thuộc các giống: Pseudomonas, Corybacterium,

Streptomyces [8]

 Quá trình phản nitrate hóa

Schloesing là người đầu tiên phát hiện ra hiện tượng khử nitrate và nitrite thành nitơ phân tử vào năm 1868 [9] Trong điều kiện không có oxy, các dạng nitơ hợp chất (NO3-, NO2-) bị phân hủy để tạo thành nitơ phân tử bởi các vi khuẩn khử nitrate (denitrifying bacteria), được gọi là quá trình phản nitrate hóa (quá trình khử nitrate) làm giảm lượng nitrate, khép kín và hoàn thiện vòng tuần hoàn nitơ

Vi khuẩn phản nitrate là nhóm vi khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên

[10] Thuộc nhóm tự dưỡng hóa năng có Thibacillus denitrificans,

Hydrogenomonas agilis, Thuộc nhóm dị dưỡng có Pseudomonas denitrificans, Micrococcus denitrificans, Bacillus licheniformis, sống trong

điều kiện kỵ khí [8]

Quá trình phản nitrate được coi là một tiến trình then chốt trong chu trình nitơ [11] Quá trình này được xem là tập hợp của sự hô hấp nitrate, nitrite kết hợp với sự khử nitrite oxide và sự hô hấp nitrous oxide [12]

Nitrate (NO3-) → Nitrite (NO2-) → Nitrite oxide (NO) → Nitrous oxide (N2O) → Dinitrogen gas (N2)

Đối với nông nghiệp, quá trình phản nitrate hóa là quá trình bất lợi vì nó làm cho đất mất đạm, nhưng quá trình này rất có lợi trong quá trình xử lý ô nhiễm nitrate và loại bỏ nitơ đã được nitrate hóa ở nước thải [10]

Đặc biệt trong tự nhiên còn có quá trình ANAMMOX (Anaerobic Ammonium Oxidation - oxy hóa ammonium trong điều kiện kỵ khí), nitrite và ammonium sẽ được chuyển đổi trực tiếp thành nitơ phân tử dưới điều kiện thiếu oxy

Toàn bộ phản ứng dị hóa này là:

NH4+ + NO2- → N2 + 2H2O

3NH4+ + 2NO3- → 5/2 N2 + 6H2O

Một số giống vi khuẩn ANAMMOX như: Brocadia, Kuenenia,

Anammoxglobus (các loài nước ngọt) và Scalindua (các loài ở biển) Có thể

ứng dụng tiến trình ANAMMOX vào xử lý nguồn nước thải giàu nitơ [13] Những sinh vật tự dưỡng và dị dưỡng hấp thu và đồng hóa NH4+, NO3-

Tế bào của thực vật và tảo hấp thu nitrogen tốt nhất ở hình thức NH4+

Sau khi hấp thụ, những tế bào này sẽ biến đổi NH4+

, NO3- thành protein Để đồng hóa được 100 ĐVC, tế bào cần 10 đơn vị nitrogen (tỷ lệ C/N = 10) [14]

2.1.2 Phospho trong tự nhiên

Phospho là chất dinh dưỡng chủ yếu cần cho tất cả các tế bào sống, phospho cấu tạo nên adenosine triphosphate (ATP), acid nucleic (DNA và ARN), phospholipids, acid teichoic, acid teichuronic ATP là phân tử giàu năng lượng, được dùng để vận chuyển năng lượng trong tế bào Phospholipids

là thành phần quan trọng trong cấu trúc của màng tế bào Acid teichoic, acid teichuronic là thành phần quan trọng trong cấu trúc vách tế bào vi khuẩn gram dương Phospho còn được dự trữ trong tế bào như là hạt nhỏ volutin hay polyphosphates

Phospho có thể tồn tại ở dạng hữu cơ hoặc vô cơ

Phosphate được cây hấp thu từ đất, được động vật sử dụng khi chúng tiêu hóa thực vật và được trả lại đất như một dạng cặn bã hữu cơ, sau đó sẽ được

phân rã vào trong đất Hầu hết phosphate được sử dụng bởi những sinh vật sống và chúng trở thành những liên kết chặt chẽ trong những liên kết hữu cơ Khi những vật liệu hữu cơ từ thực vật trả lại đất thì những phosphate hữu cơ này sẽ được phóng thích một cách chậm chạp như là phosphate vô cơ hoặc được liên kết chặt chẽ vào những vật liệu hữu cơ ổn định hơn và trở thành một thành phần hữu cơ của đất Sự phóng thích của những phosphate vô cơ từ những phosphate hữu cơ được gọi là sự khoáng hóa (mineralization) và được

vi sinh vật bẻ gãy những liên kết hữu cơ Hoạt động của vi sinh vật có hiệu quả cao là tùy thuộc vào nhiệt độ và độ ẩm của đất

Vi khuẩn có vai trò trung tâm trong chu trình phospho diễn ra trong tự nhiên Chu trình oxi hóa và sự làm giảm hợp chất lân xảy ra thông qua sự dịch chuyển electron một cách liên tục trong quá trình chuyển đổi số oxi hóa từ P(-3) sang P(+5) trong tự nhiên Mặc dù vi sinh vật tham gia vào quá trình oxi hóa khử của lân nhưng những cơ chế sinh hóa và di truyền học của quá trình biến đổi đó hiện nay chưa được tìm hiểu một cách rõ ràng [15]

Dạng vô cơ của phospho gồm orthophosphates và polyphosphates Orthophosphates có giá trị đối với sự chuyển hóa sinh học mà không cần có thêm sự bẻ gãy, được coi như là chất dinh dưỡng phospho có giá trị cho vi khuẩn sử dụng trong các hệ thống xử lí nước thải và cho thực vật thủy sinh trong nước tự nhiên Orthophosphates bao gồm PO43-, HPO42-, H2PO4- và

H3PO4 Dạng orthophosphates phổ biến nhất trong các hệ thống xử lí nước thải

là HPO42-, H2PO4- Số lượng của mỗi dạng là tùy thuộc vào pH Trong hầu hết các hệ thống xử lí nước thải, HPO42-, H2PO4- là dạng nổi trội ở giá trị pH lớn hơn 7 Dạng polyphosphates là phân tử phức hợp với hai hay nhiều nguyên tử phospho, nguyên tử oxi và có thể có nguyên tử hydro, polyphosphates được thể hiện bằng công thức hóa học của ion pyrophosphate (P2O73-), pyrophosphate là thành phần đầu tiên trong chuỗi polyphosphates không phân nhánh ( P2O73-, P3O105-,…) Polyphosphates trải qua sự thủy phân rất chậm và phóng thích orthophosphates, sự thủy phân có thể được thực hiện bằng phương pháp hóa học hoặc bằng sinh học nhờ vi khuẩn và tảo Sự thủy phân của polyphosphates chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố bao gồm thời gian và pH trong bình phản ứng hiếu khí, dạng chính của orthophosphates đạt được từ sự thủy phân là tùy thuộc vào pH [16]

Phosphate có thể gắn với các hợp chất hữu cơ gọi là phospho hữu cơ Những hợp chất phospho hữu cơ thì ít quan trọng trong nước thải chăn nuôi nhưng nó trở nên đáng lo ngại trong nước thải công nghiệp và bùn, những dạng chất hữu cơ phổ biến của phospho gồm inositol phosphates, acids

nucleic, phospholipids và phytin Phytin là acid hữu cơ tìm thấy ở bắp và đậu nành rất khó để phân hủy

2.2 Đạm, lân trong nước ao nuôi cá tra công nghiệp

Nhìn chung, NH4+ là dạng N vô cơ chủ yếu trong nước ao, dao động trong khoảng 0,02 – 8,2 mg/L Trong ao nuôi cá tra, hàm lượng NH4+ hòa tan tăng theo thời gian nuôi, đạt cao nhất khoảng 8 mg/L vào giai đoạn 3 – 4,5 tháng sau khi nuôi Hàm lượng NH4+ gia tăng theo tuổi cá tương ứng với sự gia tăng lượng thức ăn cung cấp và chất thải của cá Theo Lê Văn Cát [17] động vật thủy sản chỉ hấp thu 40% lượng thức ăn từ thức ăn nhân tạo, phần dư thừa sẽ hòa tan và phân hủy trong môi trường nước Phần lớn lượng thức ăn trong đó khoảng 16% lượng nitơ, 26-30% lượng phospho tích lũy trong trầm tích ao và khoảng 22% nitơ, 54-59% lượng phospho được phát tán vào nước

ao hay còn lại trong thức ăn thừa [18] Các nghiên cứu khác cũng cho thấy cá

da trơn chỉ hấp thu được 27 - 30% đạm, 16 - 30% lân và khoảng 25% chất hữu

cơ được cung cấp từ thức ăn

(http://www.wrd.gov.vn/Noi-dung/Phat-trien-nuoi-ca-tra-o-DBSCL-va-cac-van-de-moi-truong-can-giai-quyet/29796.news)

Khi thử nghiệm nuôi cá da trơn trong 90 ngày cho thấy cá chỉ hấp thu được khoảng 37% hàm lượng đạm và 45% hàm lượng lân trong thức ăn cho vào ao nuôi Qua quá trình phân hủy của vi sinh vật và các tiến trình phân hủy tự nhiên, lượng thức ăn dư thừa và chất thải của cá sẽ chuyển thành các dạng N

vô cơ (ammonium, nitrate) và P vô cơ (phosphate) Hàm lượng N và P vô cơ cao trong môi trường nước sẽ kích thích sự phát triển quá mức của tảo (hiện tượng tảo nở hoa) trong ao và tiến trình phân hủy tảo sẽ làm cho môi trường nước ao bị ô nhiễm, thiếu oxy cung cấp cho hoạt động hô hấp của cá, cá sẽ suy yếu và dễ nhiễm bệnh Mặt khác, nếu nước thải chứa hàm lượng N, P hòa tan cao được thải trực tiếp ra kênh rạch có thể sẽ gây ô nhiễm môi trường và nguồn nước sử dụng cho sinh hoạt Để có 1 kg cá da trơn thành phẩm, người nông dân đã phải sử dụng từ 3 - 5 kg thức ăn Thực tế chỉ khoảng 17% thức ăn được cá hấp thu và phần còn lại hòa lẫn trong môi trường nước trở thành các chất hữu cơ có thể phân hủy Hàm lượng NH4+ hòa tan giảm trong các giai đoạn sau là do ao nuôi đã được vệ sinh, nông dân thường nạo vét lớp bùn đáy

ao vào khoảng 4 tháng sau khi nuôi So với NH4+, hàm lượng N vô cơ hòa tan

ở dạng NO3- chiếm tỷ lệ rất thấp

Các thử nghiệm nuôi thâm canh cá tra với những dạng thức ăn khác nhau cho 4 ao nuôi có diện tích từ 700 - 2.000 m2/ao, mật độ thả nuôi 20 con/m2 Trong 6 tháng nuôi, các yếu tố lý hóa trong môi trường nước ao nuôi dao động trong giới hạn như nhiệt độ: 28 - 30,5oC, độ trong: 10 - 20 cm, pH

nước: 6,5 - 7,0, hàm lượng oxy hòa tan: 2,6 - 6,0 mg/L, NH4+: 0,2 - 0,92 mg/L

và H2S: 0,05 - 0,45 mg/L [19] Hàm lượng N và P vô cơ hòa tan trong 9 mẫu nước lấy từ các ao nuôi cá tra thâm canh ở các địa phương khác nhau ở Đồng bằng Sông Cửu Long đều ở mức cao, biến động trong khoảng 0,5 - 11,6 mg/L đối với N và 0,05 - 7,7 mg/L đối với P So với các thành phần hữu cơ, thành phần N và P vô cơ chiếm tỷ lệ cao trong nước ao và đạt cao nhất vào giai đọan

cá 3 - 4 tháng tuổi Tỷ lệ N/P trong nước ao đạt giá trị <10 trong tất cả các giai đọan phát triển của cá và phù hợp cho sự phát triển của tảo [20] Trong suốt chu kỳ sinh trưởng khoảng 6 tháng của cá, hàm lượng NO3- dao động trong khoảng 0,01 - 1,2 mg/L và không cho thấy xu hướng gia tăng theo giai đoạn sinh trưởng của cá Hàm lượng N hòa tan tổng số dao động từ 0,5 - 11,6 mg/L

và hiện diện cao nhất trong các ao khảo sát vào giai đoạn 3 - 4 tháng sau khi nuôi Hàm lượng N hữu cơ hòa tan trong nước ao thấp hơn N vô cơ có thể là

do các hợp chất hữu cơ từ thức ăn dư thừa và chất thải của cá đã chìm lắng và tích lũy trong lớp bùn đáy ao Hàm lượng P vô cơ hòa tan biến động từ 0,05 - 7,7 mg/L Tương tự N vô cơ, hàm lượng P vô cơ hòa tan trong ao nuôi tăng dần theo thời gian sinh trưởng của cá So sánh về thành phần P hòa tan, P vô

cơ chiếm tỷ lệ rất cao so với P hữu cơ Tại các giai đoạn lấy mẫu trong tất cả các ao khảo sát, tỷ lệ P vô cơ so với P tổng số hòa tan tập trung trong khoảng 91% So với tiêu chuẩn Việt Nam [21] đối với hàm lượng N cho phép hiện diện trong nước mặt sử dụng cho mục đích sinh hoạt vào khoảng 0,1 - 0,2 mg/L đối với NH4+ và 2 - 5 mg/L đối với NO3- thì hàm lượng NH4+ hòa tan trong các ao nuôi cá tra cao hơn gấp nhiều lần ngay cả giai đoạn cá còn nhỏ Đối với P, hàm lượng P vô cơ hòa tan trong nước ao nuôi cá tra từ giai đoạn 2 tháng tuổi đều vượt tiêu chuẩn cho phép (qui định giới hạn trong khoảng 0,1 - 0,2 mg/L - Bộ TNMT, [21])

Tỷ lệ giữa N và P hòa tan cũng là yếu tố quyết định chất lượng môi trường nước Môi trường nước giàu N, P và có sự cân bằng giữa hàm lượng N

và P hòa tan sẽ gây ra hiện tượng phú dưỡng, kích thích sự phát triển của tảo Tảo phát triển quá mức trong môi trường nước làm tiêu hao lượng oxy hòa tan

và tiến trình phân hủy sinh khối tảo chết sẽ gây ô nhiễm nguồn nước Redfield [22] đề nghị rằng tỷ lệ N/P thích hợp cho sự sinh trưởng của tảo trong khoảng N/P = 16 Tương tự, Boyd và Daniel [23] thực hiện các thí nghiệm bón phân cho các ao nuôi tôm và đã kết luận rằng hàm lượng N/P hòa tan < 20 sẽ kích thích sự phát triển của tảo Trong khảo sát này, đa số các ao nuôi cá tra có tỷ lệ N/P hòa tan <10

Kết quả khảo sát trên các ao nuôi cá tra ven sông tại Việt Nam cũng đề cập đến giá trị trung bình của các thông số chất lượng nước nói chung đều

vượt quá các tiêu chuẩn chất lượng nước mặt của Việt Nam Chỉ số pH dao

động từ 6,7 - 9,2; tổng Nitơ: 3,2 - 6,0 mg/L; tổng phospho: 0,4 - 2,21 mg/L;

NH4+: 0,05 - 4,4 mg/L Các ao có nồng độ NH4+ vượt quá 2 mg/L Khi nồng

độ NH4+ vượt quá 2 mg/L, nước giàu nitơ Chỉ số TSS cũng cho thấy một sự thay đổi lớn trong ao và chỉ số này thay đổi theo mùa Vào mùa mưa, các chất rắn lơ lửng trong các con sông cao hơn và nhập vào ao thông qua trao đổi nước hàng ngày (từ 3,5 - 274,2 mg/L) Tương tự như vậy, chỉ số Coli-forms trong các mẫu nước là rất cao nếu so với tiêu chuẩn Điều kiện các ao khảo sát đều trao đổi nước ao với sông hằng ngày và các chỉ tiêu thay đổi theo độ tuổi của cá Điều đó cho thấy rằng một lượng lớn đạm, lân đã được hòa vào nguồn nước cấp chung của khu vực Khi nước ao được lưu trữ lâu hơn trong điều kiện thiếu nước cấp vào mùa khô thì sự tích tụ dinh dưỡng trong ao là rất cao, ảnh hưởng không tốt đến năng suất cá và tác động xấu đến chất lượng môi

trường nước [24]

2.3 Ứng dụng công nghệ sinh học xử lý đạm, lân trong nước thải 2.3.1 Vi khuẩn chuyển hóa nitơ

Nhiều báo cáo cho rằng tiến trình khử nitrate chỉ xảy ra dưới điều kiện

kỵ khí [25] Hệ enzyme khử nitơ bị ức chế dưới điều kiện nồng độ oxy Như

Pseudomonas nautica (dòng 612), hoạt tính enzyme khử nitrate, nitrite và

nitros oxide hoàn toàn bị ức chế với nồng độ oxy vượt quá 5,05, 2,15 và 0,25 mg/L [26] Tuy nhiên một vài vi khuẩn có thể thực hiện quá trình khử nitơ

hiếu khí dưới điều kiện oxy không khí khác nhau [27] như Pseudomonas

denitrificans có thể thực hiện quá trình khử nitơ dưới điều kiện oxy bảo hòa

không khí 90% [28, 27] Quá trình khử nitơ không phải là quá trình kỵ khí

nghiêm ngặt đối với một vài loài khử nitrate dị dưỡng như Pseudomonas

stutzeri [29], Alcaligenes facealis [30]

Kaul và Verstraete [31] quan sát khả năng khử nitơ trong hệ thống nitrate hóa - khử nitrate tự dưỡng giới hạn oxy (OLAND) có sự bổ sung bùn hoạt tính như là chất xúc tác sinh học Trong bể phản ứng vận hành theo chuỗi, nước thải tổng hợp bao gồm 1g NH4+/L bổ sung vào môi trường minimal Oxy được cung cấp vào bể phản ứng Tốc độ tải nạp mẫu là 0,13 g NH4+/L/ngày Khoảng 22% NH4+ biến thành NO2- hoặc NO3-, 40% NH4+ chuyển thành N2, 38% còn lại là NH4+ Vi sinh vật xúc tác cho tiến trình OLAND là các vi khuẩn oxy hóa ammonium chiếm ưu thế trong môi trường Mất nitơ trong hệ thống được cho

là xảy ra theo con đường oxy hóa NH4+ thành N2 với NO2- như là chất nhận điện tử Hydroxylamine kích thích khử NH4+ thành NO2 Enzyme

Hydroxylamine oxidoreductase (HAO) giữa vai trò quan trọng trong quá trình loại bỏ nitơ

Lee [11] nghiên cứu đặc điểm quần xã vi khuẩn trong mẫu bùn hoạt tính khử nitrate và mô tả các đặc tính của một dòng CR-I phân lập từ bùn hoạt tính khử nitrate cao (high nitrate removing activated sludge) và CR-II phân lập từ bùn hoạt tính có khả năng khử nitrate thấp (low nitrate removing activated sludge) Đa số thuộc nhóm Gammaproteobacterium, vi khuẩn gram âm như

Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas azotoformans

Su [32] phân lập vi khuẩn khử đạm dòng NS-2 từ nước thải chăn nuôi Dòng NS-2 có khả năng khử nitrate thành N2 trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí mà không tạo nitrite trung gian Hiệu suất khử của dòng NS-2 là 97% dưới

nồng độ 92% oxy không khí Dòng NS-2 được xác định là Pseudomonas

stutzeri Cũng trong năm 2001, Su [32] so sánh khả năng khử nitrate hiếu khí

của Thiosphaera pantotropha ATCC 35512 và Pseudomonas stutzeri mới được phân lập dòng SU2 Pseudomonas stutzeri dòng SU2, được phân lập từ

hệ thống xử lý nước thải chăn nuôi heo, khử nitrate thành khí nitơ nhanh mà không có sự hình thành nitrite Tốc độ khử nitrate của dòng SU2 là 0,03 mmol

NO3- g/tế bào/giờ sau 44 giờ nuôi cấy vi khuẩn Đồng thời, Su [32] chứng minh ảnh hưởng của nitrite trên sự xác định COD trong nước thải chăn nuôi heo, và khả năng khử nitrate hiếu khí của SU2 thúc đẩy hiệu suất khử nitơ và COD nước thải Nghiên cứu thực hiện trong thùng phản ứng có dung tích 17 lít, kết quả cho thấy tỉ lệ tế bào SU2 được cố định với bùn hoạt tính là 100:1 Tỉ lệ hiếu khí: kỵ khí là 4:1,5 Hiệu quả khử COD là 86.8% Hiệu suất khử BOD và

SS trên 90%, khử NH4+ và TN thì gần 100% Sự can thiệp NO2- có ý nghĩa khi nồng độ của nó trong nước thải chăn nuôi heo vượt 100 mg/L COD trong nước thải chăn nuôi heo khử trực tiếp theo sau sự khử nitrite bởi dòng SU2

Từ năm 2008 đến nay, có nhiều báo cáo luận văn thạc sĩ phân lập và nhận diện vi khuẩn khử đạm được nghiên cứu và lưu trữ ở Viện Nghiên cứu

và Phát triển Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Cần Thơ Có khoảng 278 dòng vi khuẩn khử đạm được phân lập từ các nguồn chất thải khác nhau như chất thải chăn nuôi heo [33]; ao cá tra [34]; ao tôm [35][36], trong đó có nhiều

dòng là Pseudomonas stutzeri, Bacillus sp Các nghiên cứu này chủ yếu là

nhận diện vi khuẩn và kiểm tra khả năng nổi trội của chúng khi nuôi trên môi trường nghèo dinh dưỡng với sự hiện diện của NH4+, NO3-, NO2-

2.3.2 Vi khuẩn tích lũy polyphosphate

Từ nghiên cứu phân lập đầu tiên của Fuhs và Chen [37] cho rằng các loài

vi khuẩn thuộc giống Acinetobacter được xác định như là dòng vi khuẩn tích

lũy polyphosphate Vào những năm 1980, nhiều báo cáo cũng cho rằng sự đa

dạng loài trong giống Acinetobacter trong bùn hoạt tính của các hệ thống xử lý [38] Sau đó, Acinetobacter được xem là nhóm vi khuẩn có vai trò chính trong

quá trình loại bỏ phospho bằng sinh học [39, 40, 41, 42, 43, 44]), nhiều nghiên cứu về các kiểu trao đổi chất phản ánh các đặc tính trao đổi chất của PAOs tập trung vào nhóm vi khuẩn này [45, 46] Trong các loài thuộc giống

Acinetobacter, A Johnsonii cho thấy có khả năng tích lũy lượng lớn

polyphosphate và được xem là loài vi khuẩn kiểu mẫu cho nghiên cứu về quá trình trao đổi năng lượng, các enzyme chuyển hóa polyphosphate và quá trình vận chuyển các hoạt chất qua màng tế bào [47] Bên cạnh đó, thường có sự khác nhau về thành phần các nhóm vi khuẩn chiếm ưu thế trong các hệ thống

xử lý khác nhau Sự thể hiện thành phần và tính chất của từng loại nước thải

mà có sự khác biệt trong thành phần của vi khuẩn tích lũy polyphosphate [48,

49, 50] Trong lớp Actinobacteria các vi khuẩn được xem là vi khuẩn tích lũy

polyphosphate như Arthrobacter sp [51], Mycobacterium sp [52]

Khả năng hấp thu orthophosphate và hình thành polyphosphate xảy ra ở

hầu hết các dòng Tetrasphaera Khả năng hấp thu orthophosphate dưới điều

kiện hiếu khí chỉ xảy ra khi chúng hấp thu nguồn carbon dưới điều kiện kỵ khí Nguồn carbon rất đa dạng như amino axít, glucose và acetate Chúng có hình dạng rất khác nhau như hình que ngắn, que chia nhánh, hình cầu, hình sợi

Ivanov [53] phân tích vi khuẩn loại bỏ phosphate dựa trên khuếch đại và giải trình tự 16S rRNA bằng cặp mồi 27F và 1492R cho thấy

Stenotrophomonas maltophilia LMG 10989 có khả năng loại bỏ phosphate cao

vừa là giảm hàm lượng Fe với tỉ lệ 0.17 g P/g Fe2+

Hesselmann [54] đặt tên nhóm vi sinh vật tích lũy polyphosphate là Candidatus accumulibacter phosphatis hay accumulibacter Chúng được xem

là nhóm có liên quan trực tiếp đến Rhodocyclus Các nghiên cứu sau đó cũng chứng tỏ Accumulibacter rất phổ biến [55] Trong một số nơi Accumulibacter

chiếm khoảng 90% trong bùn hoạt tính có khả năng loại bỏ phosphate cao

Sau đó, một số nghiên cứu cũng cho biết, không chỉ có Accumulibacter chứa

hạt polyphosphate (polyphosphate) và một vài nhóm vi khuẩn khác cũng có

như Actinobacter [49]

Auling [56] sử dụng phương pháp DAP để phân tích quần thể vi sinh vật

tích lũy polyphosphate trong hệ thống xử lý nước thải Bên cạnh Acinetobacter còn có Pseudomonas sp và Xanthobacter sp cũng góp phần quan trọng trong

quá trình EBPR

Sidat [44] phân lập các vi khuẩn tích lũy polyphosphate trong bùn hoạt tính cho thấy có sự đa dạng trong thành phần các chủng vi khuẩn phân lập có

khả năng tích lũy Bên cạnh hai giống Pseudomonas spp (chiếm 58% trên tổng số vi khuẩn phân lập được) và Staphylococcus spp (chiếm 40%), còn có

một số giống cũng có khả năng tích lũy lượng lớn polyphosphate như

Acinetobacter calcoaceticus, Enterobacter spp., Aeromonas spp., Moraxella

spp., Bacillus cereus Trong đó, Enterobacter spp và Pseudomonas spp tích

lũy polyphosphate nhiều nhất (> 5.3 x 10-12

mg/tế bào)

McMahon [52] đã phát hiện ra polyphosphate kinase gense (ppk) từ các

vi khuẩn trong bùn hoạt động quá trình loại bỏ P bằng phương pháp sinh học Bốn gen mới được tìm ra, trong đó có hai kiểu gen (kiểu I và II) có mức độ

tương đồng về trình tự amino axid với gen của vi khuẩn Rhydocyclus tenuis

(86 - 87%) Hoạt tính của gen ppk này sau tinh sạch có hoạt tính đặc hiệu có thể so sánh với các gen ppk khác của vi khuẩn tích lũy Polyphosphate

2.4 Các nghiên cứu trong xử lý nước ao nuôi cá tra công nghiệp

Nghề nuôi cá tra đã và đang phát triển khá mạnh tại vùng đồng bằng sông Cửu Long do điều kiện tự nhiên thuận lợi và kỹ thuật nuôi không quá khó Nuôi cá tra thâm canh trong ao hầm là mô hình đang phát triển mạnh nhất

cả về diện tích và sản lượng Tuy nhiên, thực tế cho thấy trong nuôi trồng thủy sản những vụ đầu nếu sử dụng giống sạch bệnh thường có năng suất thu hoạch khá cao, nhưng sau một thời gian, thậm chí có nơi chỉ sau một vụ môi trường nước đã bị ô nhiễm nghiêm trọng và làm phát sinh dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản Mặt khác, môi trường nước bị ô nhiễm dẫn đến vật nuôi kém ăn, chậm phát triển làm tăng nguy cơ nhiễm bệnh Các nguồn gây ô nhiễm nước chủ yếu là thức ăn tồn đọng, chất thải bài tiết của cá, bùn đáy ao Sự phân giải các chất hữu cơ dư thừa này sẽ làm cho nồng độ NH4+, NO3- vượt quá mức chịu đựng của thủy sản [57]

Nghiên cứu sự biến động các yếu tố môi trường trong các ao nuôi cá tra thâm canh đã được thực hiện trên 64 ao tại tỉnh An Giang từ tháng 3/2005 đến tháng 12/2006 Số liệu được phân tích và so sánh theo mùa và theo tình trạng

cá Kết quả cho thấy pH dao động trong khoảng từ 6,73 - 9,20 và không có sự khác biệt giữa các mùa Nhiệt độ ở các ao nuôi dao động trong khoảng 27 -

34oC Hàm lượng tổng vật chất lơ lửng trong nước biến động rất lớn và ở mức cao (3,5 - 274,2 mg/L) Hàm lượng BOD dao động từ 0,20 - 15,60 mg/L Nồng độ ammonium cũng cao hơn mức cho phép nhiều lần (0,053 - 4,062 mg/L) [58]

Bảng 2.1: Kết quả phân tích của nước ao cá tra trước khi xử lý [59]

Nghiệm thức 0 Giá trị trung bình (mg/L)

Nghiên cứu với 3 loại hóa chất gây keo tụ gồm: phèn nhôm đơn (Al2(SO4)3.18H2O), phèn nhôm kép (KAl(SO4)2.12H2O) và phèn sắt (FeSO4.7H2O) trên nước từ ao nuôi cá tra thâm canh Độ đục, tổng đạm (TN), lân hòa tan và tổng lân (TP) được đo lúc bắt đầu, 2, 12 và 24 giờ sau khi tiến hành thí nghiệm Kết quả thí nghiệm cho thấy cả hai loại phèn nhôm đều có tác dụng làm giảm độ đục, lân hòa tan và tổng lân (TP) trong nước Với hàm lượng xử lý 20 mg/L, phèn nhôm không làm thay đổi lớn pH và hàm lượng Al trong nước Khác với phèn nhôm, phèn sắt có tác dụng làm giảm lân hòa tan

và tổng lân nhưng không làm giảm độ đục của nước Hàm lượng sắt tổng số trong nước tăng khi xử lý phèn sắt Cả 3 loại hóa chất đều không có tác dụng làm giảm tổng đạm trong nước Lượng lân hòa tan cũng giảm ở mức không đáng kể [60]

Trong một nghiên cứu mới nhằm tìm ra giải pháp sinh học hữu hiệu để

xử lý nguồn nước phú dưỡng từ ao nuôi cá tra, Văn Đỗ Tuấn Anh [59] đã so

sánh hiệu quả xử lý nước ao cá tra bằng cây rau Dừa (Jussiaea repens L.) và phiêu sinh động vật (Moina sp.) Mật độ Moina lần lượt là 10, 20, 30 con/L

nước ao và mật độ rau Dừa lần lượt là 100, 200, 300 g/10 lít nước ao Kết quả cho thấy Moina và rau Dừa đều có thể phát triển trong môi trường nước ao cá tra giàu đạm lân Nước ao sau khi xử lý thì BOD, COD, phospho tổng, nitơ tổng dưới mức cho phép ở cột A (BOD < 20 mg/L, COD < 50 mg/L, phospho tổng tổng < 4 mg/L, Nitơ tổng < 30 mg/L), còn TSS dưới mức cho phép ở cột

B (TSS < 100 mg/L) của bảng giá trị giới hạn các thông số và nồng độ chất ô nhiễm theo TCVN 5945: 1995 Trong nghiên cứu, rau Dừa mang lại hiệu quả

hơn trong việc xử lý nước phú dưỡng so với Moina

Lục bình và cỏ vetiver cũng được dùng làm đối tượng nghiên cứu trong

xử lý nước ao cá tra Trong môi trường được cung cấp đầy đủ các thành phần dinh dưỡng khoáng Nghiên cứu dùng Glycine và P-Glucose 1-phosphate để

thay thế khoáng đạm và lân Khả năng giúp giảm thiểu N và P hữu cơ hòa tan của lục bình và cỏ vetiver được đánh giá dựa vào tốc độ giảm N và P hữu cơ hòa tan theo thời gian Kết quả xử lý ô nhiễm N và P hữu cơ của lục bình và

cỏ cũng được kiểm chứng bằng cách trồng các thực vật này trong nước thải được lấy trực tiếp từ ao nuôi cá tra Kết quả thí nghiệm cho thấy cả hai thực vật này đều phát triển tốt trong môi trường dinh dưỡng được thay thế N khoáng bằng Glycine hoặc P khoáng bằng Glucose 1-phosphate Sau 1 tháng trồng, nghiệm thức trồng lục bình giảm 88% N hữu cơ và 100% P hữu cơ Tương tự, trồng cỏ vetiver giảm 85% N hữu cơ và 99% P hữu cơ Khi trồng lục bình và cỏ vetiver trực tiếp trong nước được lấy từ các ao nuôi cá tra cho thấy hàm lượng N và P hữu cơ gần như giảm 100% sau 1 tháng trồng [57]

Sử dụng các dòng vi khuẩn khử đạm, lân cũng là một hướng đi đầy

triển vọng trong vấn đề giảm thiểu lượng đạm, lân trong nước ao nuôi cá tra

Dòng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri được ứng dụng trong phương pháp này

[61] Trong mô hình bể 500 lít, qua 4 ngày xử lý, các dòng vi khuẩn

Pseudomonas stutzeri được chọn từ bộ sưu tập giống của Viện Nghiên cứu và

Phát triển Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Cần Thơ đã cho thấy khả

năng xử lý đạm trong nước từ ao cá tra khá tốt Nghiệm thức sử dụng vi khuẩn

Pseudomonas stutzeri dòng D3b có nồng độ NH4+ là 0,675 mg/L, ở bể sử dụng dòng N1a thì nồng độ NH4+ là 0,975 mg/L ở ngày thứ 4 của thí nghiệm Trong khi đó nồng độ NH4+ ở bể sử dụng BKC (BKC là một loại hóa chất được dùng

để xử lý nước ao nuôi thủy sản, liều lượng sử dụng 1 lít/1.000 m3) là 4,2 mg/L

và bể đối chứng có nồng độ NH4+ là 3,975 mg/L Nồng độ NO2- giảm mạnh

sau 4 ngày xử lý, đạt hiệu quả xử lý cao nhất (99,79%) với dòng D3b

Thí nghiệm trong bồn composite 10 m3 cũng cho kết quả tương tự Vi

khuẩn khử đạm Pseudomonas stutzeri dòng D3b có khả năng làm giảm nồng

độ NH4+ đáng kể Nồng độ NH4+ giảm từ 6,33 mg/L lúc bắt đầu xuống 0,73 mg/L lúc kết thúc, đạt hiệu quả xử lý 88,47% và khác biệt có ý nghĩa (p < 0,05) so với các nghiệm thức trong thí nghiệm Qua thí nghiệm, ảnh hưởng

của vi khuẩn khử đạm Pseudomonas stutzeri dòng D3b lên nồng độ

ammonium trong nước ao là cao nhất và kết quả này cũng chứng tỏ hiệu quả

của việc sử dụng vi khuẩn trong xử lý nước phú dưỡng từ ao nuôi Ảnh hưởng

của vi khuẩn khử đạm lên COD trong nước ao nuôi cá tra ở các nghiệm thức như sau: đối với nghiệm thức dùng vi khuẩn dòng D3b lên COD trong nước ao nuôi giảm từ 58,73 mgO2/L xuống 32,25 mgO2/L, còn nghiệm thức dùng chế phẩm EM thì ảnh hưởng lên COD trong nước ao nuôi cao từ 59,46 mgO2/L, sau 4 ngày thí nghiệm COD trong nước ao nuôi giảm còn 17,00 mgO2/L và nghiệm thức đối chứng COD trong nước cũng giảm mạnh (35,50 mgO2/L) so

với ban đầu thí nghiệm (59,47 mgO2/L) và khác biệt không có ý nghĩa thống

kê (p > 0,05) so với nghiệm thức sử dụng vi khuẩn khử đạm

Sau 4 ngày thí nghiệm TSS đo được nghiệm thức vi khuẩn dòng D3b (22,25 mg/L - hiệu quả xử lý đạt 77,41% [61]

Từ những nghiên cứu trên cho thấy việc xây dựng một mô hình xử lý nước ao nuôi cá tra công nghiệp là một hướng nghiên cứu đang được quan tâm Mô hình cần có tính hiệu quả cao trong việc giảm thiểu các chỉ tiêu đến mức cho phép, đơn giản, dễ vận hành, chi phí thấp và thời gian xử lý ngắn Việc ứng dụng công nghệ sinh học trong vấn đề xử lý là một trong những yếu

tố mang tính khả thi cho mô hình

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Thời gian và địa điểm

3.1.1 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 09 năm 2012 đến tháng 03 năm 2013

3.1.2 Địa điểm nghiên cứu

Phòng Vi sinh vật Đất, Vi sinh vật Môi trường - Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học - Trường Đại học Cần Thơ

Cơ sở nuôi cá tra công nghiệp:

- Địa điểm 1: khu vực 3, Cồn Khương, phường Cái Khế, quận

Ninh Kiều, Thành phố Cần Thơ

- Địa điểm 2: Cù lao An Bình, ấp An Thuận, xã An Bình, huyện

Vi khuẩn chuyển hóa nitơ Bacillus sp dòng AGT.077.O3 (Bộ sưu tập vi

khuẩn - Phòng Vi sinh vật Môi trường, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học – Trường Đại học Cần Thơ) và vi khuẩn tích lũy polyphosphate

Bacillus subtilis dòng DTT.001L [62] được phân lập từ nước ao nuôi cá tra

công nghiệp

Giá thể là các sợi polypropylene (xuất xứ từ Hồng Kông) được kết nối với nhau thành hệ thống với diện tích tiếp xúc là 45 m2/m3 làm tăng bề mặt tiếp xúc với môi trường nước

- Máy ly tâm Eppendorf (Đức)

- Máy đo OD Bekman Coulter DU 640B (Đức)

- Máy vi tính phân tích và lưu trữ số liệu

- Một số dụng cụ khác: đĩa petri, ống nghiệm, que cấy, ống eppendorf, bình tam giác, đèn cồn, đầu cone (xanh, vàng, trắng), găng tay, bọc nylon,…

3.2.3 Hóa chất

- Glucose

- Yeast extract, Urea, L- Acid glutamic

- KH2PO4, K2HPO4, MgSO4.7H2O, NaCl, (NH4)2SO4

- Agar

- NaOH, HCl, H2SO4

- Các hóa chất dùng đo đạm, lân

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn

* Hóa chất pha môi trường nhân sinh khối vi khuẩn vi khuẩn chuyển hóa

nitơ (môi trường Minimal) [63]:

- SW (nước muối nhân tạo) 100 mL/L

(SW gồm: NaHCO3 0,11 g/L; MgSO4.7H2O 10,5 g/L, NaCl 24 g/L) Chỉnh pH bằng KOH đến 6,8 sau đó cho 20 gam agar vào đối với môi trường thạch

* Hóa chất pha môi trường nhân sinh khối vi khuẩn tích lũy

polyphosphate [44], có bổ sung pepton và yeast extract và khoáng vi lượng:

+ Dung dịch khoáng vi lượng 0,5 mL/L

- Dung dịch khoáng vi lượng [64] bao gồm:

* Phương pháp nhân giống vi khuẩn:

 Nuôi cấy làm đồng đều giống: Dùng que cấy chuyển khuẩn lạc

đã làm ròng từ ống nghiệm thạch nghiêng đang được lưu trữ trong tủ lạnh, cấy ria sang ống nghiệm mới Để ống nghiệm trong tủ ấm, nuôi ủ ở

30oC trong 2 ngày

 Nhân giống cấp 1: Hút 1 mL nước cất vô trùng cho vào ống

nghiệm chứa vi khuẩn, lắc đều Hút 100 L dịch huyền phù vi khuẩn cho vào bình tam giác 250 mL chứa 100 mL môi trường nuôi cấy, tạo giống cấp 1

 Nhân giống cấp 2: Xác định mật số trong giống cấp 1 theo thời

gian Ở thời điểm mật số vi khuẩn trong giống cấp 1 ở giai đoạn quân bình, tiến hành cấy chuyển tiếp sang môi trường mới, tạo giống cấp 2 Các bình nuôi cấy vi khuẩn được đặt trên máy lắc, lắc 150 vòng/phút, ở nhiệt độ 30oC Khi nhân giống với khối lượng lớn hơn thì dùng thùng lớn

được vệ sinh sạch và dùng máy sục khí với tốc độ vừa phải để thay cho máy lắc Kiểm tra mật số vi khuẩn đạt 9 log10 cfu/mL thì sử dụng được

3.3.2 Tiến hành thí nghiệm

3.3.2.1 Thí nghiệm 1: Tác động của việc bổ sung glucose và giá thể

đến quá trình xử lý đạm, lân của vi khuẩn chuyển hóa nitơ Bacillus

sp dòng AGT.077.O3 và vi khuẩn tích lũy polyphosphate Bacillus

subtilis dòng DTT.001L trong mô hình 8 lít

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí thành 5 nghiệm thức:

Bảng 3.1: Bố trí giá thể, glucose và vi khuẩn trong các nghiệm thức

m2/m3 (1/3 sợi/keo) Định kỳ mỗi 24 giờ lấy mẫu để phân tích (chỉ tiêu pH,

NH4+, PO43-) và thay 50% thể tích nước trong bình bằng nước ao chưa qua xử

lý (bổ sung glucose với lượng 1 g/L cho 50% lượng nước ao chưa qua xử lý ở các nghiệm thức có bổ sung glucose) Mật số vi khuẩn khử đạm và vi khuẩn tích lũy polyphosphate trong nước ao ở các nghiệm thức được kiểm tra sau mỗi 3 ngày thí nghiệm

Xác định các chỉ số COD, TSS, TN, TP của mẫu nước sau xử lý ở các nghiệm thức

Dùng phương pháp thống kê để so sánh sự khác biệt giá trị trung bình các chỉ tiêu của 5 nghiệm thức Sử dụng Microsoft Excel để vẽ đồ thị

3.3.2.2 Thí nghiệm 2: Xác định hiệu suất loại bỏ nitơ, phospho trong

nước ao nuôi cá tra với vi khuẩn chuyển hóa nitơ Bacillus sp dòng AGT.077.O3 và vi khuẩn tích lũy polyphosphate Bacillus subtilis

dòng DTT.001L trong mô hình 80 lít với nghiệm thức tối ưu được chọn từ Thí nghiệm 1

Từ thí nghiệm 1, chọn nghiệm thức có hiệu suất khử đạm, lân cao nhất từ

3 nghiệm thức NT 3, NT 4, NT 5 để tiếp tục bố trí lại quá trình thí nghiệm cùng với nghiệm thức NT 1 (đối chứng sục khí) và NT 2 (đối chứng có vi khuẩn) trong mô hình 80 lít Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần Mỗi đơn vị thí nghiệm sử dụng 80 lít nước ao cá được chứa trong thùng có dung tích 120 lít (nhằm đảm bảo quá trình sục khí không làm tràn nước ao ra khỏi thùng) Giá thể được bố trí trong các nghiệm thức với diện tích tiếp xúc là 45 m2/m3 (3 sợi/thùng) Định kỳ mỗi 24 giờ lấy mẫu để phân tích (chỉ tiêu pH, NH4+, PO43)

và thay 50% thể tích nước trong các đơn vị thí nghiệm bằng nước ao chưa qua

xử lý (bổ sung glucose với lượng 1 g/L cho 50% lượng nước ao chưa qua xử

lý ở các nghiệm thức có bổ sung glucose) Xác định các chỉ số COD, TSS,

TN, TP, Nitrit, Nitrate của mẫu nước sau xử lý Mật số vi khuẩn khử đạm và

vi khuẩn tích lũy polyphosphate trong nước ao ở các nghiệm thức được kiểm tra sau mỗi 3 ngày thí nghiệm

3.3.2.3 Thí nghiệm 3: Xác định hiệu suất loại bỏ nitơ, phospho trong

nước ao nuôi cá tra với vi khuẩn chuyển hóa nitơ Bacillus sp dòng AGT.077.O3 và vi khuẩn tích lũy polyphosphate Bacillus subtilis

dòng DTT.001L trên mô hình 800 lít với nghiệm thức tối ưu được chọn từ Thí nghiệm 2

Chọn nghiệm thức cho hiệu quả xử lý đạm, lân tốt nhất từ Thí nghiệm 2 tiến hành trên mô hình 800 lít nhằm tiến gần hơn với điều kiện khảo sát thực

tế Mỗi đơn vị thí nghiệm của nghiệm thức được chọn sử dụng 800 lít nước ao

cá được chứa trong bể lớn có dung tích 1000 lít (nhằm đảm bảo quá trình sục khí không làm tràn nước ao ra khỏi thùng); nghiệm thức đối chứng sục khí được bố trí trong thùng có dung tích 120 lít như Thí nghiệm 2; mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần Giá thể được bố trí trong các nghiệm thức với diện tích tiếp xúc là 45 m2/m3 (3 sợi/thùng, 30 sợi/ bể) Quá trình thay nước, bổ sung glucose và theo dõi các chỉ tiêu pH, NH4+, PO43-COD, TSS, TN, TP, Nitrit, Nitrate, mật số vi khuẩn như đã thực hiện ở Thí nghiệm 2 Từ kết quả thí nghiệm, đề xuất quy trình xử lý đạm, lân trong nước ao nuôi cá tra công nghiệp

3.3.2.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát hiệu suất loại bỏ nitơ, phospho trong nước ao nuôi cá tra công nghiệp tại nông hộ với quy trình đề xuất

Từ kết quả thí nghiệm 3, tiến hành xây dựng quy trình xử lý nước ao nuôi cá tra công nghiệp tại cơ sở liên kết được Khảo sát các chỉ tiêu pH,

NH4+, PO43- sau mỗi 24 giờ Xác định các chỉ số COD, TSS, TN, TP, Nitrit, Nitrate của mẫu nước sau xử lý Hoàn thiện quy trình để nước ao sau xử lý đạt tiêu chuẩn nước thải loại A theo QCVN 40:2011/BTNMT – Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về nước thải công nghiệp

3.3.3 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu hóa lý

3.3.3.1 Đo đạm NH 4 +

Quy trình thực hiện đo đạm dựa vào phương pháp Indophenol Blue [65] bằng cách đo hàm lượng NH4+ trong môi trường để đánh giá khả năng khử đạm của chủng vi khuẩn

Trong phương pháp Indophenol Blue, phenol và hypochlorite phản ứng trong môi trường kiềm hình thành phenylquinone - monoimine, rồi trở lại phản ứng với ammonia tạo thành indophenol có màu xanh Cường độ màu tùy thuộc vào nồng độ hiện diện của ammonium; và sodium nitroprusside được thêm vào để làm tăng cường độ hiện màu trong dung dịch

xanh)

Hóa chất dùng để đo đạm

- Dung dịch Phenol Sodium Nitroprusside: 10 g phenol (C6H5OH) + 0,05

g Sodium Nitroprusside (Na2(Fe(CN)5NO(.2H2O)), thêm nước khử khoáng cho đủ 100 mL dung dịch Hóa chất trữ trong chai thủy tinh màu tối ở nhiệt độ lạnh (4oC)

- Dung dịch Sodium Hypochoride: 4,98 g Na2HPO4 + 1,48 g NaOH + 10

mL NaOCl 5,25%, thêm nước khử khoáng cho đủ 100 mL dung dịch Hóa chất trữ trong chai thủy tinh màu tối ở nhiệt độ phòng

Hypochloride ion (môi trường kiềm)

hiện tượng trên, phải dùng muối Seignett (KNaC4H4O6), hay EDTA (Ethylenediamine Tetraacetic Acid) cho vào mẫu nước phân tích để kết hợp với các ion Ca2+ và Mg2+ hình thành các hợp chất hòa tan, không màu

M2+ + KNaC4H4O6 = K+ + Na+ + MCH4O6

M2+ + Na2H2I = Na2MI + 2H+

Bước 1: Xây dựng đường chuẩn NH4+

Dựng dãy đường chuẩn (gồm 6 ống nghiệm 20 mL): hút lần lượt 5; 4; 3; 2; 1; 0 mL nước cho vào 6 ống nghiệm được đánh số từ 0 đến 5 Cho lần lượt 0; 1; 2; 3; 4; 5 mL dung dịch đạm chuẩn có hàm lượng 1 mg/L NH4+

Thêm 1

mL dung dịch EDTA, 5 mL dung dịch Phenol Sodium Nitroprusside và 5 mL dung dịch Sodium Hypochloride vào mỗi ống, trộn đều dung dịch trên máy Vortex Ống đầu tiên là mẫu blank Khi đó ta được đường chuẩn với hàm lượng các ống theo thứ tự tăng dần là 0 – 1 – 2 – 3 – 4 – 5 mg/L NH4+

Bảng 3.2: Thành phần hóa chất trong dãy đường chuẩn đo đạm NH4+

Bước 2: Tiến hành phản ứng tạo màu xanh ở các mẫu nước ao đã qua xử lý:

mẫu cần phân tích được li tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút Cho vào mỗi ống nghiệm 1000 µL mẫu (phần trong sau khi ly tâm), 4 mL nước khử khoáng, 1

mL dung dịch EDTA, 5 mL Phenol Sodium Nitroprusside, 5 mL Sodium Hypochloride Trộn đều dung dịch trong ống nghiệm trên máy vortex và để khoảng 20 phút ở nhiệt độ phòng

Bước 3: Đo NH4+

Bật máy quang phổ khoảng 30 phút trước khi đo, hàm lượng NH4+ được xác định bằng cách đo cường độ hấp thu màu (OD) ở bước sóng 640 nm.Đo giá trị OD ở 6 ống nghiệm đã biết hàm lượng NH4+ trước, sau đó đo OD các nghiệm thức Sử dụng giá trị OD của ống số 0 (không có NH4+, không có màu xanh) làm mẫu blank đưa giá trị OD về 0, tiến hành đo OD 5 ống nghiệm còn lại Năm ống nghiệm 1, 2, 3, 4, 5 lần lượt có giá trị NH4+ là 1, 2, 3, 4, 5 mg/L

có màu xanh đậm dần sẽ tương ứng với 5 giá trị OD tăng dần Từ giá trị OD

tương ứng với hàm lượng đạm đã biết, dùng chương trình vẽ đồ thị trong Excel xác định phương trình đường chuẩn của NH4+

Bảng 3.3: Phương trình đường chuẩn NH4+

Phương trình đường chuẩn NH4+ Y = ax + b

3.3.3.2 Đo lân hòa tan PO 4 3-

Xác định nồng độ P2O5 bằng phương pháp so màu trên máy quang phổ

kế Spectrophotometer tại bước sóng 880 nm (phương pháp so màu) dựa trên phương pháp xác định PO43-

của Watanabe and Olsen [66]

*Hóa chất đo lân:

Dung dịch A: 12 g Ammonium Molybdate Antimony Potassium Tartrate

((NH4)6Mo7024) + 0,2908 g Potassium Antimony Tartrate (K(SbO)C4H4O6) +

140 mL dung dịch H2SO4 đậm đặc, thêm nước khử khoáng cho đủ 2 lít dung

dịch A

Hóa chất trữ trong chai thủy tinh màu tối ở nhiệt độ phòng

Dung dịch B: 1,056 g Acid Ascorbic 200 mL dung dịch A, được pha và

sử dụng ngay trong quá trình đo lân

 Xây dựng đường chuẩn P2O5

Chuẩn bị 6 ống nghiệm được đánh số từ 0 - 5, lần lượt thêm vào mỗi ống các thành phần

Bảng 3.4: Thành phần hóa chất trong dãy đường chuẩn đo lân PO43-

Để ổn định 15 - 20 phút ở nhiệt độ phòng Tiến hành đo lân trong mẫu Dựa vào phương trình đường chuẩn ta có: A = a*C + b

Trong đó: C là hàm lượng lân hòa tan của mẫu được quy

về nồng độ P2O5 (mg/L)

A là độ hấp thụ quang

Dựa vào độ hấp thụ quang của mẫu cần phân tích để tính hàm lượng

PO43- có trong mẫu nước thải theo công thức:

4

2 5

3 4 PO

P O

C M PO

- Đặt điện cực của điện kế vào mẫu cần đo, ghi lại kết quả Sau mỗi lần

đo phải rửa điện cực thật sạch bằng nước cất rồi lau khô bằng giấy mềm

3.3.3.4 Đo chỉ số TSS (Total Suspended Solids)

TSS là tổng lượng vật chất hữu cơ và vô cơ lơ lửng (phù sa, mùn bã hữu

cơ, tảo) lơ lửng trong nước (có kích thước 10–5 - 10–6 m) Một phần các chất lơ lửng có kích thước lớn hơn 10–5 m sẽ lắng xuống đáy

Hàm lượng tổng chất rắn lơ lửng hoặc hàm lượng chất rắn có khả năng lắng tụ là chỉ tiêu đánh giá mức độ ô nhiễm của nước từ các cơ sở nuôi thủy sản

* Phương pháp xác định:

TSS được xác định theo phương pháp khối lượng

* Tiến hành định lượng:

- Sấy giấy lọc ở nhiệt độ 105oCtrong 8 giờ

- Cân giấy lọc vừa sấy xong (m1 (mg))

- Lọc 100 mL mẫu nước qua giấy lọc đã xác định khối lượng

- Để ráo

- Dùng kẹp (không dùng tay) đưa miếng giấy lọc vào sấy ở nhiệt độ

m1 = Khối lượng ban đầu của giấy lọc (mg)

(mg)

v = Thể tích mẫu nước đem lọc (mL)

1000 = hệ số đổi thành 1 lít

3.3.3.5 Đo nhu cầu oxy hoá học (Chemical Oxygen Demand – COD)

COD là lượng oxy cần thiết cho quá trình oxy hoá hoá học các chất hữu

cơ trong nước thành CO2 và H2O

Đại đa số các chất hữu cơ có trong nước đều mang đặc trưng khử nên COD đặc trưng cho khả năng tiêu thụ oxy hoà tan trong quá trình oxy hoá chất hữu cơ Với ý nghĩa đó, COD được gọi là “độ oxy hoá của nước”

2KMnO4 K2O + 2MnO2 + 3/2O2

Lượng KMnO4 còn thừa lại sau phản ứng lại bị khử tiếp bằng một lượng xác định KI trong môi trường axít H2SO4:

2KMnO4 + 10KI + 8 H2SO4 = 5I2 + 2MnSO4 + 6K2SO4 + 8H2O

Lượng I2 được giải phóng ra, được chuẩn độ bằng Na2S2O3 chỉ thị hồ tinh bột:

I2 + 2Na2S2O3 = Na2S4O6 + 2NaI

Trình tự tiến hành

Mẫu thật: Cho 50 mL nước cần nghiên cứu vào bình nón, 1mL NaOH

20%; 10mL KMnO4 0,01N; đun cách thủy 10 phút; lấy ra để nguội đến nhiệt

độ phòng (có thể nhúng bình nón vào chậu nước lạnh, rồi thêm 2 mL H2SO425%, 2 mL KI 10% lắc đều, để yên chỗ tối 5 phút Sau đó chuẩn độ bằng dung dịch Na2S2O3 0,01N chỉ thị hồ tinh bột Ghi thể tích Na2S2O3 (B mL) Trong bước này ta đã thực hiện được:

Số mili đương lượng chất khử trong mẫu nước + chất khử lẫn trong thuốc thử và sự tự huỷ của KMnO4 là:

V KMnO2 + N KMnO4 - V Na2S2O3 x N Na2S2O3

Khi nồng độ của KMnO4 và Na2S2O3 đều là 0,01N ta có:

10 * 0,01 - V (Na2S2O3) * 0,01 hay 10 * 0,01 - B * 0,01

Mẫu trắng: Cho vào bình nón 50 mL nước cất, 1mL NaOH 20%, 10 mL

KMnO4 0,01N và tiếp tục làm như mẫu thật Ghi thể tích Na2S2O3 tiêu tốn là

A mL Trong bước này ta đã thực hiện được:

Số mL đương lượng chất khử có trong thuốc thử và lượng tự huỷ của KMnO4 là: 0,01 * 10 - A 0,01

Vậy số mL đương lượng chất khử có trong mẫu nước là:

(0,01 * 10 - B * 0,01) - (0,01*10 - A * 0,01) = (A - B) * 0,01

Số mili đương lượng có trong 1 lít nước là:

( ).0,01

.100050

Dung dịch H2SO4 25%

Dung dịch Na2S3O3 0,01N

Dung dịch hồ tinh bột