SO SÁNH NĂNG SUẤT VÀ GIÁ TRỊ DINH DƯỠNG CỦA NẤM LINH CHI (Ganoderma lucidum) TRÊN HAI LOẠI CƠ CHẤT (BÃ MÍA, MẠT CƯA)

Tỉ lệ nhiễm, thời gian phủ tơ, năng suất và hiệu quả kinh tế được so sánh giữa các bọc phôi nấm linh chi trên các cơ chất bã mía, mạt cưa cao su phối hợp với các nguồn dinh dưỡng bổ sung là cám gạo (5%), bột bắp (5%), diamonium phosphate(1,5‰). Kết quả cho thấy tỉ lệ nhiễm ở cơ chất bã mía (8,3%) cao hơn so với mạt cưa cao su (3,3%), thời gian phủ tơ của nấm linh chi trên cơ chất mạt cưa cao su là (22 – 33 ngày) nhanh hơn trên bã mía (23 – 35 ngày); thời gian bắt đầu và kết thúc thu hoạch của nấm trên cơ chất mạt cưa cao su (55 ngày) nhanh hơn bã mía (71 ngày); năng suất trung bình trên cơ chất mạt cưa cao su (63,6gkg) cao hơn bã mía (47,5gkg cơ chất khô); tuy nhiên hiệu quả kinh tế của cơ chất bã mía (243,6%) cao hơn mạt cưa (130,9%). Phân tích nấm linh chi thành phẩm cho thấy hàm lượng đạm của nấm trồng trên bã mía (4,14%) cao hơn trên mạt cưa (1,31%); hàm lượng tro của nấm trồng trên bã mía (0,41%) lớn hơn mạt cưa (0,17%). Nghiệm thức đạt hiệu quả kinh tế và chất lượng cao được chọn là: cơ chất bã mía bổ sung 1,5‰ diamonium phosphate cho hiệu quả kinh tế cao (447,8%), chất lượng quả thể (hàm lượng đạm tổng:5,4 %, hàm lượng tro tổng số: 0,6 %), với khả năng kháng khuẩn (Escherichia coli) thể hiện bằng nồng độ ức chế tối thiểu đối với vi khuẩn Escherichia coli là 6µgml.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠVIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TRẦN THỊ MỸ NHUNG

SO SÁNH NĂNG SUẤT VÀ GIÁ TRỊ DINH DƯỠNG

CƠ CHẤT (BÃ MÍA, MẠT CƯA)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Chuyên ngành CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠVIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TRẦN THỊ MỸ NHUNG

SO SÁNH NĂNG SUẤT VÀ GIÁ TRỊ DINH DƯỠNG

CỦA NẤM LINH CHI (Ganoderma lucidum) TRÊN HAI LOẠI

CƠ CHẤT (BÃ MÍA, MẠT CƯA)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Chuyên ngành CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LỜI BẢN QUYỀN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân và Thầy, Cô hướng dẫn.Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bốtrong bất kỳ luận văn nào trước đây

TS Bùi Thị Minh Diệu Trần Thị Mỹ Nhung

TS Trần Nhân Dũng

i

Luận văn đính kèm theo đây với tên đề tài “So sánh năng suất và giá trị dinh

dưỡng của nấm linh chi (Ganoderma lucidum) trên hai loại cơ chất (bã mía, mạt cưa)” do Trần Thị Mỹ Nhung thực hiện và báo cáo đã được hội đồng chấm luận văn

Xin chân thành cảm ơn TS Bùi Thị Minh Diệu, TS Trần Nhân Dũng đã tận tìnhhướng dẫn, giúp đỡ và cho tôi những ý kiến quý báu để tôi hoàn thành đề tài nghiêncứu.

Xin chân thành cảm ơn Thầy Lê Thanh Phước - phó trưởng Khoa Khoa học Tựnhiên và Cô Bùi Thị Bửu Huê - phòng thí nghiệm chuyên sâu hóa hữu cơ Khoa Khoahọc Tự nhiên, Cô Lý Thị Liên Khai và Cô Huỳnh Kim Diệu bộ môn thú y thuộc KhoaNông nghiệp và Sinh học Ứng dụng đã tận tình hướng dẫn, bổ sung kiến thức và tạođiều kiện cho tôi hoàn thành tốt thí nghiệm còn lại của đề tài

Xin chân thành cảm ơn em Nguyễn Ngọc Thạnh, ThS Huỳnh Xuân Phong –cán bộ phòng Thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm, anh Trần Văn Bé Năm –cán bộ phòng Thí nghiệm Sinh học Phân tử và anh chị cán bộ các phòng thí nghiệmcủa viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã đóng góp ý kiến và tạo điềukiện thuận lợi để tôi thực hiện đề tài

Cảm ơn sự trợ giúp của các em học viên, sinh viên: Lê Phạm Thị Tường Anh,Dương Thanh Vân, Nguyễn Lê Anh Đào, Đặng Thị Quyên, Trần Chí Công, TrươngQuốc An, Bùi Thị Mỹ Hương, Trần Thanh Tuấn, Nguyễn Viết Nhẫn Hoa

Xin nhận nơi con lòng biết ơn đến gia đình đặc biệt là Mẹ, người đã luôn bêncạnh động viên, hỗ trợ để con có thể hoàn thành chương trình học Cảm ơn Anh(Chồng) đã luôn giúp đỡ em hoàn thành tốt công việc cơ quan và việc nhà để cho em

TÓM LƯỢC

Tỉ lệ nhiễm, thời gian phủ tơ, năng suất và hiệu quả kinh tế được so sánh giữa các bọc phôi nấm linh chi trên các cơ chất bã mía, mạt cưa cao su phối hợp với các nguồn dinh dưỡng bổ sung là cám gạo (5%), bột bắp (5%), diamonium phosphate(1,5‰) Kết quả cho thấy tỉ lệ nhiễm ở cơ chất bã mía (8,3%) cao hơn so với mạt cưa cao su (3,3%), thời gian phủ tơ của nấm linh chi trên cơ chất mạt cưa cao

su là (22 – 33 ngày) nhanh hơn trên bã mía (23 – 35 ngày); thời gian bắt đầu và kết thúc thu hoạch của nấm trên cơ chất mạt cưa cao su (55 ngày) nhanh hơn bã mía (71 ngày); năng suất trung bình trên cơ chất mạt cưa cao su (63,6g/kg) cao hơn bã mía (47,5g/kg cơ chất khô); tuy nhiên hiệu quả kinh tế của cơ chất bã mía (243,6%) cao hơn mạt cưa (130,9%) Phân tích nấm linh chi thành phẩm cho thấy hàm lượng đạm của nấm trồng trên bã mía (4,14%) cao hơn trên mạt cưa (1,31%); hàm lượng tro của nấm trồng trên bã mía (0,41%) lớn hơn mạt cưa (0,17%) Nghiệm thức đạt hiệu quả kinh tế và chất lượng cao được chọn là: cơ chất bã mía bổ sung 1,5‰ diamonium phosphate cho hiệu quả kinh tế cao (447,8%), chất lượng quả thể (hàm lượng đạm tổng:5,4 %, hàm lượng tro tổng số: 0,6 %), với khả năng kháng khuẩn (Escherichia coli) thể hiện bằng nồng độ ức chế tối thiểu đối với vi khuẩn Escherichia coli là 6µg/ml

Từ khóa: Antibacterial activity, bã mía, Escherichia col i , mạt cưa cao su, MIC, nấm linh chi (Ganoderma lucidum)

iv

Key words: Antibacterial activity, bagasse, Escherichia col i , Ganoderma lucidum, MIC, rubber sawdus

v

MỤC LỤC LỜI BẢN QUYỀN I LỜI CẢM TẠ III TÓM LƯỢC IV ABSTRACT V MỤC LỤC VI DANH SÁCH BẢNG VIII DANH SÁCH HÌNH X TỪ VIẾT TẮT XI CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đ ẶT VẤN ĐỀ 1

1.2 M ỤC TIÊU ĐỀ TÀI 2

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 T ÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT NẤM LINH CHI 3

2.1.1 Thế giới 3

2.1.2 Trong nước 4

2.2 S Ơ LƯỢC VỀ NẤM 5

2.2.1 Đặc điểm sinh học 5

2.2.2 Giá trị y dược của nấm linh chi 6

2.3 C ÁC NHÂN TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH TRỒNG NẤM 8

2.4 C ÁC NHÂN TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN NĂNG SUẤT CỦA NẤM 8

2.4.1 Giống nấm 8

2.4.2 Thành phần dinh dưỡng 8

2.4.3 Điều kiện nuôi ủ 9

2.4.4 Một số bệnh thường gặp và cách phòng trị 9

2.5 C ÁC LOẠI CƠ CHẤT ĐỂ TRỒNG NẤM 10

2.5.1 Mạt cưa cao su 10

2.5.2 Bã mía 11

2.6 Thành phần dinh dưỡng của một số loại phụ gia bổ sung trong trồng nấm 13

2.6.1 Cám gạo 13

2.6.2 Bắp và sản phẩm từ bắp 14

2.6.3 Phân Diamonium phosphate (DAP) 14

2.7 K Ỹ THUẬT TRỒNG VÀ CHĂM SÓC NẤM LINH CHI 15

2.8 S Ơ LƯỢC VỀ VI KHUẨN E SCHERICHIA COLI 16

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

3.1 P HƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 19

3.1.1 Địa điểm – Thời gian nghiên cứu 19

3.1.2 Vật liệu nghiên cứu 19

3.2 P HƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

3.2.1 Phân lập dòng nấm linh chi 20

3.2.2 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của loại cơ chất và chất dinh dưỡng bổ sung đến năng suất và chất lượng của nấm linh chi 21

3.2.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ phối trộn cơ chất và chất dinh dưỡng bổ sung đến năng suất và chất lượng của nấm linh chi 22

3.2.4 Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng kháng khuẩn của nấm linh chi trên vi khuẩn Escherichia coli 25

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

4.1 K ẾT QUẢ PHÂN LẬP TƠ NẤM 28

4.2 Ả NH HƯỞNG CỦA LOẠI CƠ CHẤT VÀ CHẤT DINH DƯỠNG BỔ SUNG ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN CỦA TƠ NẤM 29

4.2.1 Ảnh hưởng của loại cơ chất và chất dinh dưỡng bổ sung đến thời gian tơ phủ 29

4.2.2 Ảnh hưởng của loại cơ chất và chất dinh dưỡng bổ sung đến tỷ lệ bịch phôi bị nhiễm 31

4.2.3 Ảnh hưởng của loại cơ chất và chất dinh dưỡng bổ sung đến thời gian thu hoạch quả thể 33

4.2.4 Ảnh hưởng của lọai cơ chất và chất dinh dưỡng bổ sung đến kích thước tai nấm 35

4.2.5 Ảnh hưởng của cơ chất và chất dinh dưỡng bổ sung đến năng suất của nấm 36

4.3 T HÀNH PHẦN DINH DƯỠNG CỦA QUẢ THỂ NẤM SAU THU HOẠCH 37

4.3.1 Ảnh hưởng của cơ chất và chất dinh dưỡng bổ sung đến hàm lượng đạm tổng số của quả thể nấm (% trên trọng lượng khô) 38

4.3.2 Ảnh hưởng của cơ chất và chất dinh dưỡng bổ sung đến hàm lượng tro tổng số của quả thể nấm (% trên trọng lượng khô) 39

4.4 H IỆU QUẢ KINH TẾ 41

4.5 K HẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA NẤM LINH CHI TRÊN VI KHUẨN 42

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44

5.1 K ẾT LUẬN 44

5.2 K IẾN NGHỊ 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

PHỤ LỤC 48

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 1 Thành phần hóa học của nấm linh chi 7

Bảng 2 Thành phần các loại chất có dược tính trong nấm linh chi

Bảng 6 Thành phần hóa học của một vài loại cám gạo 13

Bảng 7 Thành phần hóa học của một số loại bắp và sản phẩm từ bắp 14

Bảng 8 Bảng bố trí tỉ lệ thành phần dinh dưỡng bổ sung vào hai loại cơ chất

DANH SÁCH HÌNH Trang .Hình 1 Chu trình phát triển của nấm linh chi

6 Hình 2 Hình dạng vi khuẩn Escherichia coli dưới kính hiển vi

17 Hình 3 Một số vật liệu dùng trong thí nghiệm 19

Hình 4 Vi khuẩn Escherichia coli phát triển trên môi trường Nutrient Agar sau 24 giờ

20 Hình 5 Quy trình phân lập dòng thuần nấm linh chi 21

Hình 6 Quy trình nuôi trồng nấm linh chi

23 Hình 7 Hệ sợi nấm linh chi trên môi trường PDA 27

Hình 8 Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ nhiễm nấm tạp ở các nghiệm thức

30 .Hình 9 Biểu đồ biểu diễn thời gian bắt đầu và kết thúc thu hoạch ở các nghiệm thức

32 .Hình 10 Biểu đồ biểu diễn kích thước tai nấm ở các nghiệm thức

34 Hình 11 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của cơ chất và chất dinh dưỡng bổ sung đến năng suất của nấm linh chi 35

Hình 12 Biểu đồ biểu diễn hàm lượng đạm tổng số có trong quả thể nấm ở các nghiệm thức 37

Hình 13 Biểu đồ biểu diễn hàm lượng tro tổng số có trong quả thể nấm ở các nghiệm thức 38

Hình 14 Khuẩn lạc vi khuẩn Escherichia coli phát triển trên các đĩa sau 18 giờ 42

Hình 15 Khuẩn lạc vi khuẩn E coli phát triển trên các đĩa đối chứng sau 24 giờ 42

Hình 16 Kết quả MIC trên E.coli sau 24 giờ 42

DAP: Diamonium phosphate

DMSO: Dimethyl Sulfoxide

G: Cám gạo

MHA: Mueller-Hinton Agar

MC: Mạt cưa cao su

MIC: Minimum Inhibitory Concentration

NA: Nutrient Agar

NFE:

P: DAP

PDA: Potato - D - glucose – Agar

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Ngành trồng nấm đã được hình thành và phát triển trên thế giới từ nhiều nămnay Ở Việt Nam thì nghề sản xuất nấm ăn và nấm dược liệu đang có tiềm năng manglại hiệu quả kinh tế cao Nguyên liệu dùng để trồng nấm rất phong phú như mạt cưa,rơm rạ, bã mía… Một trong những loại nấm quý có thể trồng trên các nguồn này đó làNấm linh chi Nấm linh chi có thành phần dinh dưỡng cao, đặc biệt là chứa một sốthành phần có đặc tính hóa dược cao như acid garnoderic, polysaccharide,germanium…

Thành phần hóa học và dược tính của linh chi đã được các nhà khoa học phântích cho thấy có gần 200 hoạt chất và dẫn chất trong Linh chi bao gồm: acid amin, cácacid hữu cơ, các acid béo, terpenoid, alkaloid, protein, glycoprotein, các khoáng đalượng và vi lượng Chúng đã được khẳng định là nhân tố quan trọng cho nhiều loạiphản ứng chống ung thư, dị ứng, lão hóa, xơ vữa…

Nấm linh chi đã được trồng thử nghiệm ở nước ta từ năm 1997 trên các nguyênliệu mạt cưa cao su, mụn dừa, rơm rạ Nấm linh chi là sản phẩm mang dược tính quýhiện có nhu cầu rất cao nhưng trong nước vẫn chưa đáp ứng được Do đó, hàng nămchúng ta phải nhập khẩu khoảng 43 tấn Linh chi từ các nước như Trung Quốc, ĐàiLoan Trong khi đó, ở nước ta hoàn toàn có đủ điều kiện để có thể nuôi trồng làm tăngsản lượng nấm linh, hạn chế lượng nấm linh chi phải nhập khẩu từ nước ngoài Đặcbiệt ở Đồng bằng Sông Cửu Long với sản lượng mía cây đạt 15,2 triệu tấn/năm Vì thếlượng bã mía thải ra hằng năm là rất lớn nên vấn đề ô nhiễm từ nguồn bã mía này là rấtnghiêm trọng và đây là nguồn cơ chất phong phú có thể dùng trồng nấm linh chi Nhưvậy trồng nấm linh chi trên các cơ chất này vừa giúp tận dụng được nguồn phế thải,hạn chế các rác thải này thải ra môi trường đồng thời tạo thêm việc làm cho người dân

Xuất phát từ những lý do trên, đề tài “So sánh năng suất và giá trị dinh dưỡng

của nấm linh chi (Ganoderma lucidum) trên hai loại cơ chất (Bã mía, mạt cưa)”

cần được tiến hành

1.2 Mục tiêu đề tài

Xác định được cơ chất và chất dinh dưỡng bổ sung thích hợp cho trồng nấmlinh chi đạt hiệu quả kinh tế, năng suất và giá trị dinh dưỡng cao

 Nội dung nghiên cứu

- Phân lập giống nấm Linh chi ở Sở Khoa học Công Nghệ và Ứng dụng TiềnGiang để thu thập và bổ sung vào nguồn giống nấm ăn, dược liệu của Viện Ngiên cứu

& Phát triển Công nghệ Sinh học

- Nghiên cứu qui trình trồng nấm Linh chi trên cơ chất bã mía và so sánh với

cơ chất mạt cưa cao su

- Đánh giá và so sánh các chỉ tiêu về năng suất - chất lượng của sản phẩm nấmthu được từ nguồn nguyên liệu là bã mía so với mạt cưa cao su

- Khảo sát khả năng kháng khuẩn của nấm linh chi trên vi khuẩn Escherichia coli

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU2.1 Sơ lược về nấm Linh chi

Chi Linh chi: Ganoderma

Loài: Ganoderma lucidum

- Hình thái cấu tạo:Nấm linh chi gồm 2 phần cuống nấm và mũ nấm:

+ Cuống nấm dài hoặc ngắn, đính bên có hình trụ đường kính 0,5 - 3cm Cuốngnấm ít phân nhánh, đôi khi có uốn khúc cong queo Lớp vỏ cuống màu đỏ, nâu đỏ, nâuđen, bóng, không có lông, phủ suốt lên mặt tán nấm

+ Mũ nấm khi non có hình trứng, lớn dần có hình quạt hoặc hình thận Trên mặt

mũ có vân gạch đồng tâm màu sắc từ vàng chanh vàng nghệ vàng nâu vàng cam

-đỏ nâu - nâu tím nhẵn, bóng láng như vecni (Carlile et al., 1997).

- Đặc điểm sinh thái và phân bố: Nấm linh chi là một trong những loại nấm phá

gỗ, đặc biệt trên các cây thuộc bộ Đậu (Fabales) Thể quả có nhiều vào mùa mưa (từtháng 5 – 11 dương lịch) và thường mọc tốt dưới bóng rợp, ánh sáng khuếch tán nhẹ(Sharma, 1998) Nấm tiết ra các enzyme phân giải màng tế bào endopolygalacturonase(endo - PG) và endopectin methyl - translinase (endo - PMTE) có tác dụng làm nhũn,phá hủy các tế bào thực vật rất mạnh tạo ra các hợp chất đường đơn giản được nấm sửdụng để sinh trưởng và phát triển (Nguyễn Hữu Đống và Đinh Xuân Linh, 1999)

Hình 1 Chu trình phát triển của nấm linh chi

(Nguyễn Lân Dũng, 2007)

2.1.2 Giá trị y dược của nấm linh chi

Nấm linh chi được dùng làm thuốc rất lâu đời, theo “ Thần nông bản thảo” cáchđây hai nghìn năm trước người ta đã biết dùng nấm linh chi để làm thuốc Linh chi làmột biệt dược có tác dụng rất lớn đối với con người Có khoảng 110 phương thuốc trịbệnh cho con người từ nấm linh chi, trong đó có các bài thuốc sử dụng nấm linh chinấu với chim cút, vịt, chim bồ câu, kết hợp các vị thuốc nam làm món ăn cho người

bệnh hoặc người bình thường có tác dụng rất hữu hiệu (Cao et al., 2006) Các kết quả

nghiên cứu dược lý trên lâm sàng đã chứng minh: Linh chi có tác dụng an thần, làmgiảm hưng phấn của thần kinh trung ương, giảm đau, bảo vệ gan, giải độc, hạ đườnghuyết, thải trừ chất phóng xạ, cường tim, hạ huyết áp, làm giảm cholesterol trong máu,chống vữa, xơ động mạch, giúp cho cơ tim chịu được trạng thái thiếu máu.Polysaccharide trong linh chi chỉ có tác dụng ức chế tế bào ung thư, tăng miễn dịchcho cơ thể (Xing-Feng Bao, 2002) Chất germanium của linh chi giúp khí huyết lưu

thông, acid ganoderic có tác dụng chống viêm chống dị ứng (Prasad et al., 2008) Nếu

đem so sánh nấm linh chi và nhân sâm người ta nhận thấy: Hàm lượng germaniumtrong linh chi cao hơn nhân sâm từ 5 đến 8 lần Lượng polysaccharide có trong linh chilàm tăng cường miễn dịch cho cơ thể, làm mạnh gan và tiêu diệt tế bào ung thư Từnhững tính năng, tác dụng của linh chi mà người ta liệt nó vào loại dược liệu đặc biệt

mà các cây khác không có được (Shu – Ting Chang et al 2007)

Bảng 1 Thành phần hoá học của nấm Linh chi

[(*) Viện Pasteur TPHCM, 2009]

[(**) Phân viện dược liệu TP.HCM, 2010]

Bảng 2 Thành phần các hoạt chất có dược tính trong nấm linh chi

Steroid Ganodosteron

Lanosporeic acid ALanosterol

GanordermadiolGanosporelacton A,BLucidon A

Bảo vệ ganBảo vệ ganNucleoside Adenosin dẫn xuất Ức chế kết dính tiểu cầu, thư giãncơ, giảm đauProtein Lingzhi -8 Chống dị ứng phổ rộng, điều hòamiễn dịch

(Lê Lý Thuỳ Trâm, 2007)

2.2 Các nhân tố ảnh hưởng đến quá trình trồng nấm

Theo Đinh Xuân Linh (2006), ngoài yếu tố dinh dưỡng từ các chất có trong nguyênliệu trồng nấm linh chi thì sự tăng trưởng và phát triển của nấm có liên quan đến nhiềuyếu tố khác nhau như: nhiệt độ, ẩm độ, ánh sáng, pH, oxy,…

 Nhiệt độ: nấm linh chi phát triển ở nhiệt độ tương đối rộng Ở giai đoạn nuôi sợinhiệt độ thích hợp từ 20oC - 30oC Nhiệt độ thích hợp để nấm ra quả thể từ 22oC - 28oC

 Độ ẩm: độ ẩm rất quan trọng với sự phát triển tơ và quả thể của nấm Trong giaiđoạn tăng trưởng tơ độ ẩm cơ chất: 60% - 65% Ở giai đoạn tưới đón nấm ra quả thể, độ

ẩm không khí tốt nhất là 80 - 95%

 Độ thông thoáng: Trong suốt quá trình nuôi sợi và phát triển quả thể nấm cần oxy

để hô hấp vì vậy nhà trồng cần có độ thông thoáng tốt, tránh gió lùa trực tiếp

 Ánh sáng: Giai đoạn nuôi sợi không cần ánh sáng Giai đoạn phát triển quả thểcần ánh sáng tán xạ khoảng 500 – 1200 lux (ánh sáng đọc được) Cường độ ánh sángcân đối từ mọi phía

 Độ pH: nấm thích nghi trong môi trường trung tính đến acid yếu (pH 5,5 – 7,0).

 Dinh dưỡng: Sử dụng trực tiếp nguồn cellulose, có thể trồng nấm linh chi trên

gỗ khúc, mạt cưa, rơm rạ, bã mía, vỏ cây đậu,

2.3 Các nhân tố ảnh hưởng đến năng suất của nấm

2.3.1 Giống nấm: đúng chủng loại và có năng suất, dược tính cao

2.3.2 Thành phần dinh dưỡng

Theo Trần Văn Mão (2004), nấm linh chi cũng như các loài sinh vật khác cầnchất dinh dưỡng để cung cấp năng lượng cho bản thân Các chất dinh dưỡng bao gồm:đường, đạm, khoáng chất vv

 Vai trò của đường

Theo Lê Duy Thắng (1997), nấm sử dụng tốt nhất là đường đơn (glucose).Nhưng trong nguyên liệu trồng nấm đường ở dạng đường đôi (đường ăn, đường mía)hoặc đường đa (tinh bột) Các chất có kích thước phân tử lớn này khi bị phân giải sẽcho ra những thành phần đơn giản hoặc nhỏ hơn Sản phẩm cuối cùng là D-glucose, D-glucose là dạng đường đơn mà hầu hết tất cả loại nấm đều cần đến Nó là nguồncacbon chính trong việc tổng hợp các chất trong cơ thể nấm, bao gồm các thành phầncấu tạo nên sợi nấm và các hợp chất liên quan đến hoạt động sống Nói chung nấm cần

nguồn cacbon hay đường là yếu tố bắt buộc, không có nó nấm sẽ không thể tăngtrưởng hay phát triển được

 Vai trò của chất khoáng

Các chất khoáng là những chất không thể thiếu được trong hoạt động sống củanấm Nấm cần khoảng 17 nguyên tố cần thiết để tăng trưởng đặc biệt là N, P, K đểphân hóa quả thể nhất là trong giai đoạn nụ nấm Chất khoáng ngoài việc đáp ứng cácyêu cầu biến dưỡng còn giúp tăng năng suất cho nấm Từ nguồn carbon và đạm, nấm

sẽ tạo ra các acid amin là đơn vị căn bản để tạo ra protein Phosphor tham gia trongthành phần cấu tạo acid nucleic (Lê Xuân Thám, 1996)

Liên quan đến loại cơ chất và chất dinh dưỡng bổ sung vào thành phần nàyđược thêm vào ngay từ lúc phối trộn cơ chất Theo Nguyễn Lân Dũng (2007), dinhdưỡng thêm vào nguyên liệu có thể là 4% - 8% cám gạo, 4% – 8% bột bắp, 4% – 6 %bột đậu nành, 1% đường ăn hoặc khoáng như Kali, Phosphate, Magiê,… Ngoài ra,nhiều loại phân đạm vô cơ: Diamonium phosphate (DAP), urea, amonium sulphate…đều có thể dùng để tưới bổ sung cho nấm nhưng với nồng độ khoảng 1,0‰ – 1,5‰,nếu vượt quá sẽ gây ngộ độc cho nấm Urea dùng tưới nấm rất tốt, nhưng khi phát sinhbệnh, nhất là mốc phải ngưng ngay Tuy nhiên, quan trọng vẫn là khâu chế biến và ủ

nguyên liệu Nguyên liệu chuẩn bị tốt năng suất sẽ cao

2.3.3 Điều kiện nuôi ủ

Điều kiện nuôi ủ góp phần đáng kể trong việc nâng cao năng suất nấm Nếutrong thời gian ủ tơ, nhiệt độ lên cao hoặc xuống thấp, cũng làm ảnh hưởng đến kếtquả nuôi trồng, đặc biệt trong tình trạng thiếu oxy, tơ nấm tiết nước, năng suất giảmnhanh Do đó, bịch phôi nên để thoáng, mật độ vừa phải, có cửa sổ để gió lùa vào

phòng làm giảm nhiệt độ, nhưng tránh nắng rọi trực tiếp (Fang et al., 2002)

2.3.4 Một số bệnh thường gặp và cách phòng trị

a Các bệnh thường gặp khi trồng nấm linh chi

- Bệnh sinh lý: Liên quan đến nhiều yếu tố môi trường như: nhiệt độ, pH, ánhsáng, oxy và CO2… Bệnh biểu hiện thông qua các hiện tượng: màu ngã vàng, tiếtnước, lão hóa nhanh (đối với tơ nấm), tai nấm dị dạng, thối nhũng, teo đầu, cuống dài(đối với quả thể)

- Bệnh nhiễm: Chủ yếu do côn trùng, vi sinh vật xâm nhập tấn công và lâynhiễm Các kẻ thù gây hại cho nấm bao gồm: các nhóm động vật (côn trùng, nhện,

Đức Lượng, 2004)

Việc trồng nấm bằng mạt cưa cao su có nhiều ưu điểm là:

+ Chế biến và bổ sung dinh dưỡng dễ dàng

+ Có thể khử trùng dễ dàng để hạn chế sự nhiễm tạp

+ Chăm sóc và thu hái thuận tiện

Bảng 3 Thành phần hoá học trong mạt cưa cao su

Bảng 4 Những quốc gia sản xuất mía đường hàng đầu

ra Tại các nhà máy đường, bã mía thường được đem đi đốt để cung cấp một phầnnăng lượng cho nhà máy, hoặc kết hợp với các phụ gia khác để sản xuất ván ép, nhưngchủ yếu là được đốt đi và điều đó gây ảnh hưởng xấu đến môi trường Việc sử dụng bãmía để trồng nấm là biện pháp thiết thực Qua quá trình nuôi cấy, nấm sẽ phân hủy bãmía thành các phân vi sinh nhờ enzyme Bã mía sau khi trồng nấm có thể được chếbiến và trở thành nguồn phân hữu cơ chất lượng thay thế phân hóa học cho việc canhtác nông nghiệp

Nguồn đường trong bã mía cung cấp carbon cho tơ nấm phát triển và kích thíchhình thành quả thể Để tận dụng được bã mía cho trồng nấm, bã mía cần phải đượcphơi khô rồi nghiền nhỏ hoặc chặt vụn ra, sau đó xử lý với nước vôi để giảm bớt lượngđường thừa và tăng pH

Bảng 5 Thành phần hoá học trong bã mía

Bảng 6 Thành phần hóa học của một vài loại cám gạo

Bảng 7 Thành phần hóa học của một số loại bắp và sản phẩm từ bắp

2.5.3 Phân Diamonium phosphate (DAP)

Phân DAP là loại phân trung tính, thành phần gồm:

2.6 Kỹ thuật trồng và chăm sóc nấm linh chi

 Điều kiện nhà trồng

Nhà trồng nấm phải sạch sẽ, cao ráo, thoáng khí, thoát nước và giữ được độ

ẩm Tùy mỗi loại nấm mà có khoảng nhiệt độ và độ ẩm thích hợp khác nhau Ngoài

ra, khoảng nhiệt độ và độ ẩm của từng loài nấm cũng khác nhau trong từng giai đoạnsinh trưởng của nấm Tuy nhiên, nhìn chung thì nhiệt độ thích hợp của nhà trồngnấm linh chi khoảng 22oC - 28oC, độ ẩm 80oC - 95oC, phải bảo đảm thoáng khí chonhà trồng và ánh sáng nhẹ để hệ sợi nấm phát triển tốt (Nguyễn Hữu Đống, 2002).Điều kiện nhà trồng ảnh hưởng quan trọng đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm cũngnhư năng suất nấm Xử lý nhà trồng nấm bằng vôi bột (100g/m2) trước khi đưa bịch

phôi vào nhà trồng Phổ biến hiện nay người ta nuôi trồng nấm thích treo hơn để dàn

kệ, vì ít tốn kém và dễ vệ sinh Các bịch phôi được treo bằng dây nilon thành từngxâu 8 – 10 bịch theo kiểu nằm ngang, mỗi hàng cách nhau 20 – 30cm, mỗi dây cáchnhau 20 – 25cm, mỗi dây có thể treo từ 6 – 10 bịch phôi

 Trồng và chăm sóc nấm

Lúc mới đem bịch phôi vào nhà trồng không được tháo nút bông và không đượctưới nước trực tiếp vào bịch phôi Chỉ tưới nước dưới nền để giữ độ ẩm không khí(khoảng 3 lần/ngày) Quan sát đến khi nào hệ sợi nấm phát triển tốt và lan khắp khối

cơ chất (tơ có màu trắng đồng nhất), đồng thời không bị nhiễm nấm mốc hay tạpkhuẩn thì tháo nút bông ở cổ chai Khi quả thể nấm bắt đầu xuất hiện, tưới nước phunsương nhẹ bên ngoài mặt túi và nền để tạo độ ẩm không khí Thông thường thì ta cóthể tưới nước 2 – 3 lần/ngày Nhận biết một số bịch phôi nhiễm nấm lúc trồng: Cácbịch phôi bị nhiễm nấm mốc (mốc vàng hoa cau, mốc xanh,…) hoặc tạp khuẩn có thểquan sát được bằng mắt thường không được tháo nút bông ra mà phải loại các bịch này

ra khỏi nơi trồng để tránh lây nhiễm cho các bịch khác (Nguyễn Lân Dũng, 2007)

 Một số điểm lưu ý khi trồng nấm linh chi

Ngoài việc chịu ảnh hưởng bởi các tác nhân như nhiệt độ, độ ẩm, pH, ánh sángnấm linh chi rất nhạy cảm với các tác nhân gây ô nhiễm môi trường như hóa chất,thuốc trừ sâu, các kim loại nặng, kể cả trong nguyên liệu cũng như không khí và môitrường xung quanh khu vực nuôi trồng Trong điều kiện ô nhiễm trên, tai nấm sẽ bịbiến dạng hoặc ngừng tạo quả thể Do đó, không sử dụng hóa chất và thuốc trừ sâu khi

trồng nấm linh chi Dịch bệnh gây hại nấm: chủ yếu là mốc xanh Trichoderma Đối

với mốc xanh, có thể hạn chế bằng cách khử trùng tốt nguyên liệu (Nguyễn Hữu Đống,2002)

2.7 Khả năng kháng vi khuẩn Escherichia coli của nấm Linh chi

2.7.1 Sơ lược về vi khuẩn Escherichia coli

Escherichia coli (E coli) là một trong những loài Coliforms chính ký sinh trong

đường ruột của động vật máu nóng ở nhiệt độ 44  0,5oC trong 24 - 48h E coli có

khả năng thủy phân tryptophan trong môi trường sinh indol, không sinh acetoin (acetylmethylcarbinol), không sử dụng citrate làm nguồn carbon duy nhất (TCVN 5287 :1994)

Hình 2 Hình dạng vi khuẩn E Coli dưới kính hiển vi

(http://en.wikipedia.org/wiki/Coliform_bacteria, ngày 10/3/2012)

E coli có thể phân lập được dễ dàng ở khắp nơi trong môi trường có thể bị ô

nhiễm phân hay chất thải Vi sinh vật này có thể phát triển và tồn tại rất lâu trong môi

trường Trong những năm gần đây các nhà nhiên cứu cũng chứng minh rằng E coli

cũng có thể phân lập được từ những vùng nước ấm, không bị ô nhiễm hữu cơ Với sự

phân bố rộng rãi như vậy, E coli cũng dễ dàng phân lập được từ các mẫu thực phẩm

do nhiễm vào từ nguyên liệu hay thông qua nguồn nước (Nguyễn Tiến Dũng, 2007)

Hầu hết các dòng E coli tồn tại một cách tự nhiên và không gây hại trong

đường tiêu hoá, ngược lại chúng còn đóng vai trò quan trọng trong việc ổn định sinh lýđường tiêu hoá Tuy nhiên có ít nhất 4 dòng sau đây có thể gây bệnh cho người và một

số loài động vật (Nguyễn Tiến Dũng, 2007):

- Enteropathogenic E coli (EPEC)

- Enterotocigenic E coli (ETEC)

- Enteroinvasive E coli (EIEC)

- Enterohaemorrhagic E coli (EHEC)/ verocytocin E coli (VTEC) hay E coli O157: H7.

Các dòng E coli gây bệnh khi chúng xâm nhiễm vào người qua con đường thực

phẩm có thể gây nên các bệnh rối loạn đường tiêu hoá, các biểu hiện lâm sàng biếnđộng có thể từ nhẹ đến rất nặng, có thể đe dọa mạng sống của con người phụ thuộc vàoliều lượng, dòng gây nhiễm và khả năng đáp ứng của từng người (Nguyễn Tiến Dũng,2007)

Dòng ETEC chứa plasmid mã hóa 1 enterotoxin Có 2 loại enterotoxin khácnhau được tìm thấy trong các dòng ETEC, cả 2 loại enterotoxin điều gây bệnh viêmruột (Huỳnh Xuân Phong, 2010)

- Liều lượng: 106 - 1010 tế bào

- Thời gian ủ bệnh: 16 - 48 giờ

- Triệu chứng: bệnh viêm ruột

- Thời gian bệnh: 1 - 2 ngày

Dòng EHEC chứa plasmid mã hóa 1 verotoxin gây triệu chứng bệnh lỵ, đôi khi

gây bệnh thận, điển hình nhất là dòng E.coli 0157 : H7.

Độc chất của EHEC là 1 cytotoxin, nó phá huỷ tế bào ruột kết, có thể gây bệnh

và ảnh hưởng đến chức năng thận

- Liều lượng: 100 tế bào

- Thời gian ủ bệnh: 3 - 4 ngày

- Triệu chứng: bệnh viêm ruột, kiết lỵ, thận hư

- Thời gian bệnh: 3 - 7 ngày, đôi khi lâu hơn

Một số dòng gây bệnh khác hiếm gặp khác của E coli là: EIEC (Enteroinvasive

E coli) và EPEC (Enteropathogenic E coli) (Huỳnh Xuân Phong, 2010).

2.7.2 Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn

Hoạt tính kháng khuẩn của dịch trích nấm linh chi Ganoderma lucidum được thu

từ quả thể đã được thử nghiệm có khả năng kháng được 6 loài vi khuẩn: Escherichia coli (MTCC-443), Staphylococcus aureus (MTCC-737), Klebsiella pneumoniae (MTCC-2405), Bacillus subtilis (MTCC-1789), Salmonella typhi (MTCC-531) and Pseudomonas aeruginosa (MTCC-779) (Pandey, 2008) Theo Sadaf Quereshi et al., (2010), nấm linh chi Ganoderma lucidum có khả năng kháng lại loài vi khuẩn Escherichia coli Dịch trích nấm linh chi được ly trích bằng methanol và sử dụng dung môi hòa tan là Dimethyl sulfoxide (DMSO) Nồng độ tối thiểu kháng lại Escherichia coli là 6µg/ml nhưng kháng hoàn toàn thì ở nồng độ cao hơn (12µg/ml).

Theo Akihisa et al (2005), Cao et al (2006) và Gao et al (2002), thì dịch chiết

nước và methanol của quả thể Linh Chi ức chế sự nhân lên của virus Hiệu quả cũngnhận thấy trên tế bào lympho T của người nhiễm HIV-1 Phân đoạn hỗn hợp methanol(A) kháng virus rất mạnh Các phân đoạn khác, như hexan (B), etyl acetat (C), trung

tính (E), kiềm (G) đều có tác dụng kháng virus tốt (Brian et al., 1951).

Dịch chiết từ nấm Hoàng chi Ganoderma colossum bằng nước hay etylic đều cóhoạt tính kháng khuẩn đối với 2 nhóm vi khuẩn G+ (B pumilus, B cereus, B subtilis,

S aureus) và vi khuẩn G- (E.coli, S.typhi, V parahaemaliticus) (Toshihiro, 2005).

Dịch chiết Flavonoit từ nấm Hoàng chi có hoạt tính kháng khuẩn mạnh hơn so với

dịch chiết từ nấm Hoàng chi bằng nước hay etylic (Chairul et al., 1990 và Tokuyama

cô, nấm Bào ngư Ở Châu Âu, trồng nấm trở thành một ngành công nghiệp lớn, được

cơ giới hoá toàn bộ nên năng suất và sản lượng rất cao Ở Châu Á, trồng nấm mangtính chất thủ công, năng suất không cao Tuy nhiên, sản xuất qui mô gia đình nhưngnhiều hộ cùng sản xuất, do đó sản lượng nấm được cung ứng ra thị trường cũng rấtlớn Nuôi trồng nấm linh chi được ghi nhận từ năm 1621, nhưng để nuôi trồng ở quy

mô công nghiệp phải hơn 300 năm sau với thành công của GS Dật Kiến Vũ Hưng.Năm 1971, Naoi Y nuôi trồng tạo được quả thể trên nguyên liệu là mạt cưa.Ponmurugan et al., (2007) nghiên cứu ảnh hưởng của các loại cơ chất bã mía, mạt cưacao su, rơm lúa nếp lên sự phát triển và chất lượng của nấm linh chi Kết quả cho thấynấm Linh chi phát triển mạnh và cho năng suất cao nhất trên mạt cưa cao su (68,3g/kg

cơ chất khô), rơm lúa nếp (59,7g/kg cơ chất khô) và thấp nhất là bã mía (48,9g/kg cơchất khô) Bên cạnh đó thành phần dinh dưỡng như: tổng đường hòa tan, tổng protêinhòa tan, tổng acid amin cũng đạt giá trị cao nhất ở mạt cưa cao su (35,24mg/g,27,13mg/g, 18,16mg/g), rơm lúa nếp (26,13mg/g, 20,14mg/g, 14,28mg/g) và thấp nhất

là bã mía (21,76mg/g, 18,42mg/g, 10,01mg/g) Narayanasamy et al., (2009) đã thửnghiệm trồng nấm linh chi trên hai loại cơ chất mạt cưa giấy thải, bã mía trong điềukiện phòng thí nghiệm Năng suất mạt cưa giấy thải đạt khoảng (43,9 – 52,6g/kg cơchất khô), bã mía đạt khoảng (41,9 – 50,2g/kg cơ chất khô)

Nếu tính từ năm 1979, sản lượng nấm khô ở Nhật đạt trên 5 tấn/năm, thì đến năm

1995 sản lượng lên gần 200 tấn/năm Như vậy trong vòng 16 năm mà sản lượng nấmlinh chi của Nhật đã tăng gấp 40 lần Quy trình nuôi trồng ở Nhật sử dụng chủ yếu là

gỗ khúc và phủ đất, nên cho tai nấm to và năng suất cao, nhưng lại dễ bị sâu bệnh vàcạn kiệt nguồn gỗ Ở Trung Quốc, linh chi được trồng chính yếu tại 10 khu vực, baogồm vùng ngoại ô Bắc Kinh, Tứ Xuyên, Thiết Kim, và An Huy Người Trung Quốcthường trồng nấm trong túi nhựa để sản xuất quy mô cho số lượng nhiều và phươngpháp nuôi trồng ở Thượng Hải với việc sử dụng mạt cưa và một số phế liệu của nônglâm nghiệp, là cải tiến so với cách trồng của Nhật Nguyên liệu được cho vào chaihoặc lọ, khử trùng và cấy giống Các chai hoặc lọ được xếp lên nhau thành nhiều lớptrên mặt đất để tưới và và thu hái nấm Trên thế giới, nước Trung Quốc vẫn là nướcchủ yếu tiêu thụ sản phẩm về linh chi Hiện nay, thế giới hàng năm sản xuất vàokhoảng 4300 tấn, trong đó riêng Trung Quốc trồng khoảng 3000 tấn còn lại là cácquốc gia Hàn Quốc, Đài Loan, Nhật Bản, Thái Lan, Hoa Kỳ, Malaysia, Việt Nam,Indonesia và SriLanka (Lê Lý Thùy Trâm, 2007)

2.8.2 Trong nước

Kỹ thuật trồng nấm linh chi ngày càng phát triển, tại Việt Nam nhiều nhà nônghọc cũng đã nghiên cứu, thiết lập một trại trồng nấm và bào chế linh chi ở Sài Gòn từnăm 1987 Thông thường nấm linh chi ở nước ta được nuôi trồng bằng mạt cưa cao su

và một số thành phần phế liệu của nông nghiệp Năm 2008, TP Mỹ Tho đã sản xuấtthử nghiệm 1,500 bịch phôi nấm Linh chi nhưng có khoảng 200 bịch phôi bị nhiễmnấm tạp nên năng suất chỉ đạt khoảng 79,2kg, năng suất trung bình đạt 66g nấm/bịch.Nguyễn Duy Điềm và Huỳnh Thị Dung (2003) đã nghiên cứu trồng nấm linh chi trênhai loại cơ chất là bã mía, mạt cưa cao có su bổ sung 6% bột bắp Năng suất trung bìnhtrên cơ chất mạt cưa là (43,4g nấm/500g cơ chất khô) và bã mía (38,5g nấm/500g cơchất khô)

Nghề trồng nấm linh chi ở nước ta khá phát triển, nếu chỉ tính riêng ở TP Hồ ChíMinh, hiện nay tổng sản lượng nấm nuôi trồng từ 30 – 40 tấn khô/năm và tiêu biểu ởmột số tỉnh như Đồng Nai tại xã Sông Trầu, huyện Trảng Bom Tuy bước đầu nghềtrồng nấm linh chi đang được mở rộng nhưng chưa đáp ứng được nhu cầu tiêu thụtrong nước Hiện nay, lượng nấm linh chi tiêu thụ ở Việt Nam hàng năm là khoảng

100 tấn Trong đó, lượng nấm linh chi nhập về từ Trung Quốc khoảng 36 tấn, HànQuốc khoảng 7 tấn, số còn lại do trong nước sản xuất Năm 2010, lượng nấm linh chitiêu thụ trên 100 tấn/năm (Nguyễn Hữu Đống, 2002)

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Địa điểm – Thời gian nghiên cứu

Địa điểm: Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Phân tử, Sở Khoa Học Công

Nghệ và Ứng Dụng Tiền Giang, phòng thí nghiệm Hóa – Dược thuộc Khoa Khoa học

Tự nhiên, phòng thí nghiệm của bộ môn thú y thuộc Khoa Nông nghiệp và Sinh họcỨng dụng, Trường Đại Học Cần Thơ

Thời gian: Đề tài thực hiện từ tháng 10/2011 đến tháng 5/2012.

3.1.2 Vật liệu nghiên cứu

a Vật liệu

- Mẫu nấm linh chi (Ganoderma lucidum) dùng để phân lập: tai nấm có hình

thái vừa, không bị sâu, không quá già hay quá non có nguồn gốc từ Sở Khoa họcCông nghệ Tiền Giang

- Bã mía vừa được mua từ nhà máy đường Phụng Hiệp, tỉnh Hậu Giang, mạtcưa cao su được mua từ Đồng Nai

- Cám gạo, bột bắp được mua từ cơ sở thức ăn Phương Kiều, đường 30/4 vàDAP được mua từ cửa hàng phân bón đường 3/2, quận Ninh Kiều, Tp Cần Thơ

Hình 3 Một số vật liệu dùng trong thí nghiệm

- Mẫu vi khuẩn Escherichia coli thuần đã được phân lập ở phòng thí nghiệmcủa bộ môn thú y thuộc Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại họcCần Thơ

Hình 4 Vi khuẩn Escherichia coliphát triển trên môi trường Nutrient Agar

sau 24 giờ

b Dụng cụ và thiết bị

- Dụng cụ và thiết bị: Thiết bị vô cơ mẫu, thiết bị chưng cất đạm, lò nung cao độ,

tủ ủ, tủ sấy, tủ cấy, nồi khử trùng, ống nghiệm, đĩa petri, que cấy, dao cấy, bình hút

ẩm, cân điện tử, nồi thanh trùng, máy cô quay chân không…

c Hóa chất

- Hóa chất phân tích %N tổng số: H2SO4 0,05N, NaOH 10N, acid boric,

- Hóa chất phân lập nấm: D - Glucose, Peptone, Agar, MgSO4.7H20, KH2PO4,

- Hóa chất thử tính kháng khuẩn của nấm linh chi: Dung môi DMSO, methanol,nước cất, nước muối sinh lý, môi trường Nutrient agar (NA), môi trường Mueller-Hinton agar (MHA), kim cấy, đĩa petri, cồn 70o, cồn 96o,

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Phân lập dòng nấm linh chi

 Mục đích: Tạo nguồn dòng thuần cung cấp cho các thí nghiệm tiếp theo

- Nuôi ủ ở nhiệt độ 28oC trong 4 - 6 ngày

- Khi tơ nấm bắt đầu mọc lan ra từ tổ chức nấm đã cấy khoảng 2/3 đĩa petri, tiếnhành cấy chuyền nhằm tuyển chọn tơ nấm thuần và mạnh từ các đĩa petri Sau khimẫu phân lập đã thuần tiến hành cấy chuyền sang ống nghiệm chứa môi trườngthạch nghiêng CM, ủ ở 30oC đến khi tơ nấm mọc gần đầy ống nghiệm Tiếp tụckiểm tra độ thuần của tơ nấm trong các ống nghiệm và trữ ở 4oC, sau 6 tháng cấychuyền 1 lần

Hình 5 Quy trình phân lập dòng thuần nấm linh chi

 Chỉ tiêu theo dõi: Quan sát độ thuần của khuẩn ty.

3.2.2 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của loại cơ chất và chất dinh dưỡng bổ sung đến năng suất và chất lượng của nấm linh chi

 Mục đích thí nghiệm: tìm ra loại cơ chất (mạt cưa, bã mía, cơ chất phối

trộn giữa bã mía và mạt cưa) và các thành phần dinh dưỡng (cám gạo, bột bắp vàDAP) bổ sung tối ưu nhất cho năng suất, chất lượng cao

 Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 loại

cơ chất, 4 loại chất dinh dưỡng bổ sung khác nhau với 16 nghiệm thức, 3 lần lặp lại(10 bịch phôi/1 lần lặp lại) Tổng cộng có 480 bịch phôi

Cấy giống vào bịch phôi

Ủ (28 – 30oC) Tưới đón quả thểThu hoạchGiống thuần

b Tạo meo giống cấp 2

Bảng 9 Thành phần môi trường nhân giống cấp 2

Các bước tạo giống cấp 2 được thực hiện trong tủ cấy vô trùng

+ Dùng dao nhỏ inox được khử trùng trên lửa đèn cồn rồi cắt từng miếng agar

có chứa giống cấp 1 trên đĩa petri

+ Chuyển vào túi nhựa đã chuẩn bị sẵn Sau đó ủ ở nhiệt độ 28 - 30oC cho đếnkhi sợi tơ nấm phát triển tốt và lan sâu vào môi trường hạt lúa tạo thành giống cấp 2

c Tạo bịch phôi

Xử lý nguyên liệu: Nguyên liệu chính làm môi trường trồng nấm là 2 loại phế

thải công - nông nghiệp giàu cellulose là: bã mía và mạt cưa cao su Bã mía được xử lývới nước vôi 3% để diệt vi khuẩn và trung hòa pH Trộn đều để đạt độ ẩm thích hợp(không quá ướt cũng không quá khô), sau đó ủ đống và đậy kín bằng màng phủ nylon,sau 2 ngày đảo trộn rồi đậy kín lại đến ngày thứ 4 Mạt cưa cao su được ủ đống vớinước vôi 1,5% trong 1 ngày

Đóng bịch:

- Đối với cơ chất không phối trộn là bã mía và mạt cưa: phối trộn dinh dưỡngtheo bảng 8 và cho vào đầy bịch nylon

- Đối với cơ chất phối trộn:

+ Cơ chất 50% bã mía + 50% mạt cưa: Trộn đều 1kg bã mía và 1kg mạt cưa

đã xử lý sau đó bổ sung các dưỡng chất theo tỉ lệ ở bảng 8 Đóng vào bịch(mỗi bịch 1500g cơ chất)

+ Cơ chất 20% bã mía+ 80% mạt cưa: Trộn đều 400g bã mía và 1600g mạtcưa đã xử lí, sau đó bổ sung các dưỡng chất theo tỉ lệ ở bảng 8 Đóng vào bịch(mỗi bịch 1500g cơ chất)

- Bịch phôi phải được đóng sao cho có độ rắn vừa phải (1500g cơ chất, có độ

ẩm 50 - 70%), đậy nút bông, sau đó đem khử trùng ở 121oC, 1 giờ

 Ghi chú: Cơ chất được điều chỉnh về ẩm độ 50 - 70% khi ủ, nhiệt độ đống ủ phải

đạt 40 - 45oC, pH thích hợp cho trồng nấm linh chi: 5,5 – 7

Cấy vào bịch phôi: Bịch phôi sau khi khử trùng để nguội 1 ngày, sau đó tiến

hành cấy giống cấp 2, mỗi bịch phôi cho vào khoảng 7g lúa (có tơ nấm mọc) Bịchphôi được ủ ở 25 - 28oC trong điều kiện thoáng khí cho đến khi tơ nấm lan đầy bịch.Sau 20 - 28 ngày tơ nấm mọc đầy bịch phôi thì ta tiến hành tháo nút bông để phun tướinước đón quả thể

 Ghi chú: Các bịch phôi được treo trong nhà lưới của Viện cây ăn quả miền

Nam – Tiền Giang để đảm bảo điều kiện giống nhau về ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm

d Thu hoạch nấm: Khi trên tai nấm linh chi xuất hiện một đường viền màuvàng xung quanh bìa tài nấm là nấm đã chín, bắt đầu thu hoạch Đối với nấm linh chidùng kéo hoặc dao sắc cắt chân nấm sát bề mặt túi, sau đó thoa nước vôi loãng vào vịtrí cắt nhằm tránh nấm nhiễm khuẩn vào đợt thu hoạch sau, đợt 1 thu hoạch xong sẽtiến hành chăm sóc như lúc ban đầu để tiếp tục thu hoạch đợt 2 Mỗi loại nấm có thờigian và cách thu hoạch khác nhau và có thể chia làm nhiều đợt (thông thường khoảng

2 – 3 đợt) Tuy nhiên, năng suất của lần sau sẽ không bằng lần trước trên cùng mộtbịch phôi (quả thể ra nhỏ hơn, sản lượng và khối lượng ít hơn)

e Các chỉ tiêu theo dõi và phương pháp đánh giá

- Ghi nhận và so sánh số ngày tơ lan khắp khối cơ chất, thời gian thu hoạch (quảthể ở dạng hình quạt, thận) ở mỗi nghiệm thức trên từng cơ chất với nhau

- Ghi nhận số bịch phôi bị nhiễm và tính tỷ lệ (%) số bịch phôi bị nhiễm trên từngnghiệm thức

- Ghi nhận năng suất sau 2 đợt và so sánh năng suất trung bình của mỗi bịch phôi

ở các nghiệm thức giữa các cơ chất với nhau

- Nấm được thu hoạch sau đó khảo sát một số chỉ tiêu như:

 Hàm lượng đạm tổng số được xác định bằng phương pháp Kjeldalh (phụ lục 2)

3.2.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng kháng khuẩn của nấm linh chi trên vi

khuẩn Escherichia coli

Mục đích thí nghiệm: đánh giá khả năng kháng khuẩn của quả thể nấm linh chi

ở nghiệm thức cho năng suất, giá trị dinh dưỡng tối ưa đối với vi khuẩn Escherichia coli, từ đó tìm ra nồng độ tối thiểu ức chế loài vi khuẩn này.

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm

thức (Nghiệm thức bổ sung 12μg/ml cao nấm, 6 μg/ml, 3 μg/ml, và ĐC), 3 lần lặp lại

 Các bước tiến hành:

a Điều chế cao linh chi:

- Quả thể nấm Linh chi trồng trên cơ chất tối ưu ( cơ chất chọn được từ thínghiệm 1) được chọn để điều chế cao nấm linh chi

- Sấy khô quả thể ở 50oC trong 24h

- Cắt nhỏ, ngâm trong methanol 1-2 ngày, sau đó lấy dịch chiết

- Loại dung môi trong dịch chiết và cô đặc bằng máy cô quay đến khi trọng lượngkhông đổi (từ 5g nấm linh chi khô sau khi cô quay sẽ cho 0,61g cao linh chi)

- Trọng lượng nấm tươi: 30g

- Trọng lượng nấm khô: 10g

- Trọng lượng cao: 1,22g

b Xác định tính kháng khuẩn

Chuẩn độ đục: Sử dụng thang độ đục Mac Facland 0.5

- Chuẩn bị huyền dịch: cho 0,5ml BaCl2 0,048M (BaCl2.2H20 1,175%) vào99,5ml H2S04 0,18M (1%) đồng thời khuấy liên tục để tạo huyền dịch

- Điều chỉnh độ đục của huyền dịch sao cho mật độ quang khi đo ở bước sóng

625nm trong khoảng 0,08 – 0,1

- Phân phối thành các ống có cùng cỡ với ống dùng để chuẩn bị vi sinh vật, mỗi

ống 4 - 6ml huyền dịch

- Chuẩn độ đục được bảo quản trong tối ở nhiệt độ phòng, trước khi sử dụng

phải lắc mạnh để huyền dịch phân tán đều trở lại Nếu thấy lợn cợn phải loại

bỏ Hàng tháng phải kiểm tra lại độ hấp thu

Chuẩn độ vi khuẩn: Vi khuẩn được nuôi trên môi trường Mueller-Hinton +

Agar (MHA) ủ 37ºC±2ºC trong 24 giờ Dùng que cấy tiệt trùng lấy một ít khuẩnlạc cho vào ống nghiệm chứa dung dịch NaCl 0,85% Điều chỉnh độ đục cho bằng vớiMac Facland 0.5, huyền dịch vi khuẩn trên được pha loãng 10 lần để có mật độ vikhuẩn khoảng 107 CFU/ml Vi khuẩn sau khi điều chỉnh độ đục sử dụng trong vòng 15phút

Chuẩn bị nồng độ chất thử: Cân 6mg cao linh chi sau đó hòa tan vào 10ml DMSO

đã được tiệt trùng được dung dịch gốc với nồng độ là 0,6mg/ml Pha dung dịch gốcvào môi trường MHA (18ml) sao cho đạt nồng độ 12µg/ml, 6µg/ml, 3µg/ml và các đĩađối chứng không chứa chất thử, các đĩa đối chứng chỉ chứa dung môi DSMO Thínghiệm được tiến hành với 4 nghiệm thức, 3lần lặp lại Tổng số nghiệm thức thínghiệm: 4 x 3 = 12 nghiệm thức Khoảng nồng độ cần pha tùy thuộc vào MIC(Minimum Inhibitory Concentration) dự đoán của chất thử Chất thử nghiệm được trộnvào môi trường thạch đã nấu chảy để nguội đến 48 - 50oC, lắc để đảm bảo trộn đều

chất thử trong môi trường, đổ vào đĩa petri và để thạch đông lại Sau đó tiến hành cấy

vi khuẩn bằng cách dùng micropipette cấy 1 - 2µl huyền dịch vi khuẩn đã điều chỉnh

ở trên lên bề mặt môi trường thạch có chứa nồng độ chất thử Mỗi chủng vi khuẩn cấuthành một chấm Để yên 15 phút cho vết chấm khô Lật ngược hộp thạch đã cấy và ủtrong tủ ấm ở 37oC trong 24 giờ (Tạ Thị Kim Chi, 2008)

Chỉ tiêu khảo sát: nồng độ ức chế tối thiểu của nấm linh chi đối với vi khuẩn E.

Coli

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả phân lập tơ nấm

Phân lập được một dòng nấm linh chi thuần trên môi trường PDA Qua kết quả

kiểm tra độ thuần cho thấy hệ sợi của dòng nấm T1G3 có màu trắng đồng nhất, không

xuất hiện khuẩn ty lạ khi quan sát bằng mắt thường, không màu dưới kính hiển vi nấm

có màu trắng đồng nhất, có hệ sợi nấm cấp hai với 2 nhân phát triển, phân nhánh và cóvách ngăn ngang (Hình 8), chứng tỏ dòng nấm thuần nhất Dòng nấm T1G3 đượcdùng cho các thí nghiệm tiếp theo

4.2 Ảnh hưởng của loại cơ chất và chất dinh dưỡng

bổ sung đến sự phát triển của tơ nấm

Phân nhánh