Tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên A (Nhóm máu A) trên màng tế bào hồng cầu người (LV thạc sĩ)

Tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên A (Nhóm máu A) trên màng tế bào hồng cầu người (LV thạc sĩ)Tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên A (Nhóm máu A) trên màng tế bào hồng cầu người (LV thạc sĩ)Tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên A (Nhóm máu A) trên màng tế bào hồng cầu người (LV thạc sĩ)Tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên A (Nhóm máu A) trên màng tế bào hồng cầu người (LV thạc sĩ)Tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên A (Nhóm máu A) trên màng tế bào hồng cầu người (LV thạc sĩ)Tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên A (Nhóm máu A) trên màng tế bào hồng cầu người (LV thạc sĩ)Tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên A (Nhóm máu A) trên màng tế bào hồng cầu người (LV thạc sĩ)Tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên A (Nhóm máu A) trên màng tế bào hồng cầu người (LV thạc sĩ)Tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên A (Nhóm máu A) trên màng tế bào hồng cầu người (LV thạc sĩ)Tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên A (Nhóm máu A) trên màng tế bào hồng cầu người (LV thạc sĩ)Tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên A (Nhóm máu A) trên màng tế bào hồng cầu người (LV thạc sĩ)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

- - -  - - -

Nguyễn Thị Hằng

TẠO DÒNG TẾ BÀO LAI SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG KHÁNG KHÁNG NGUYÊN A (NHÓM MÁU A)

TRÊN MÀNG TẾ BÀO HỒNG CẦU NGƯỜI

Chuyên ngành sinh học thực nghiệm

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả đƣợc công bố trong luận văn là hoàn toàn trung thực, chính xác và chƣa đƣợc công bố ở bất kỳ công trình nào khác

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Học viên

Nguyễn Thị Hằng

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân tha ̀ nh tới TS Nguyễn Thị Trung chủ

nhiệm đề tài KC04.13/11-15 đã hết lòng giúp đỡ, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu để hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Tiếp theo, tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn tới các thầy, cô của trường Đại học Thái Nguyên, Viện Sinh thái và Tài Nguyên sinh vật và các thầy, cô của Viện Công nghệ sinh học đã nhiệt tình giảng dạy cho tôi trong suốt thời gian tham gia khóa học

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn TS Lê Văn Phan, ThS Vũ Thị Thu Hằng,

BSTY Thân Đức Dương và các cán bộ phòng kiểm nghiệm – Công ty cổ phần phát

triển công nghệ nông thôn đã tạo mọi điều kiện để tôi thực hiện luận văn tốt nghiệp

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến GS TS Trương Nam Hải và các

cán bộ phòng Kỹ thuật di truyền, những người thân trong gia đình cùng bạn bè đã luôn hỗ trợ, động viên, khuyến khích tôi trong suốt quá trình học tập

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Học viên

Nguyễn Thị Hằng

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ix

MỞ ĐẦU 1

NỘI DUNG 3

Chương 1 Tổng quan 3

1.1 Tổng quan về miễn dịch 3

1.1.1 Hệ miễn dịch 3

1.1.2 Hệ thống miễn dịch bẩm sinh 4

1.1.3 Hệ thống miễn dịch thích ứng 5

1.1.3.1 Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào 7

1.1.3.2 Đáp ứng miễn dịch dịch thể 8

1.1.4 Kháng nguyên 9

1.1.5 Kháng thể 10

1.2 Khái quát về hệ thống nhóm máu người 12

1.2.1 Phân loại hệ thống nhóm máu ở người 12

1.2.2 Hệ thống nhóm máu ABO 13

1.2.3 Vai trò của máu trong y học 14

1.2.4 Truyền máu và nguyên tắc truyền máu 14

1.2.5 Phương pháp xác định nhóm máu hệ ABO 15

1.3 Kháng thể đơn dòng 16

1.3.1 Công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng 16

1.3.2 Sản xuất kháng thể đơn dòng bằng công nghệ tế bào lai 19

1.3.3 Vai trò của kháng thể đơn dòng 20

1.3.4 Tình hình sản xuất kháng thể đơn dòng đặc hiệu kháng nguyên nhóm máu hệ ABO 21

1.4 Động lực học sinh trưởng và sản xuất của tế bào động vật 21

Chương 2 Vật liệu và phương pháp 25

2.1 Vật liệu 25

2.1.1 Động vật 25

2.1.2 Hồng cầu mẫu 25

2.1.3 Dòng tế bào myeloma 25

2.1.3 Hóa chất 25

2.1.4 Máy móc thiết bị 26

2.2 Phương pháp 26

2.2.1 Gây miễn dịch 26

2.2.2 Chuẩn bị tế bào nền 27

2.2.3 Nuôi cấy tế bào myeloma 28

2.2.4 Dung hợp và tạo dòng tế bào lai 29

2.2.5 Tách dòng tế bào lai 31

2.2.6 Phản ứng ngưng kết hồng cầu trên đĩa 96 giếng 32

2.2.7 Phản ứng ngưng kết hồng cầu trên phiến kính 33

2.2.8 Phương pháp đếm tế bào 33

2.2.9 Xây dựng đường cong sinh trưởng để nghiên cứu sự sinh trưởng và sản xuất kháng thể của các dòng tế bào lai 33

2.2.10 Xác định loại globulin miễn dịch 34

2.2.11 Loại bỏ phenol bằng ammonium sulfate 35

2.2.12 Tạo sinh phẩm xác định nhóm máu A 36

2.2.13 Xác định độ đặc hiệu 36

2.2.14 Xác định hiệu giá 36

2.2.15 Xác định cường độ và ái tính 36

Chương 3 Kết quả 38

3.1 Đánh giá hiệu quả gây miễn dịch của hồng cầu mẫu A+ 38

3.2 Dung hợp tạo tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên A 39

3.3 Sàng lọc hỗn hợp tế bào lai sản xuất kháng thể kháng kháng nguyên A 41

3.4 Tạo dòng tế bào lai đơn sản xuất kháng thể đơn dòng kháng lại kháng nguyên A 43

3.5 Xác định phân lớp kháng thể do dòng tế bào A6G11C9 sản xuất 44

3.6 Sự sinh trưởng và sản xuất kháng thể của dòng tế bào lai A6G11C9 tiết kháng thể kháng kháng nguyên A 45

3.7 Hiệu giá kháng thể trong dịch nuôi cấy tế bào lai A6G11C9 49

3.8 Độ nhạy và độ đặc hiệu của kháng thể do dòng tế bào lai A6G11C9 sản xuất 50

3.9 Loại bỏ phenol đỏ ra khỏi dịch nuôi cấy tế bào lai A6G11C9 bằng phương pháp tủa ammonium sulfate 52

3.10 Tạo sinh phẩm xác định nhóm máu A 55

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Thành phần của đáp ứng miễn dịch bẩm sinh và đáp ứng miễn dịch đặc hiệu

3

Hình 1.2 Quá trình thực bào 4

Hình 1.3 Cách tế bào NK và protein bổ thể tạo lỗ trên màng để tiêu diệt tế bào lây nhiễm tác nhân gây bệnh 5

Hình 1.4 Tế bào T bám vào kháng nguyên lạ liên kết với protein MHC 6

Hình 1.5 Kháng nguyên được hiện diện cùng protein MHC 7

Hình 1.6 Hàng rào miễn dịch tế bào T 8

Hình 1.7 Hàng rào miễn dịch tế bào B 9

Hình 1.8 Cấu trúc của phân tử kháng thể 11

Hình 1.9 Kháng nguyên nhóm máu của người 13

Hình 1.10 Sơ đồ truyền máu 15

Hình 1.11 Các phương pháp sản xuất kháng thể đơn dòng 19

Hình 1.12 Công nghệ tế bào lai 20

Hình 1.13 Phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên - kháng thể 21

Hình 1.14 Đường cong sinh trưởng của tế bào 24

Hình 2.1 Tế bào đại thực bào khi nuôi cấy tĩnh……… 28

Hình 2.2 Sơ đồ pha loãng tới hạn 31

Hình 2.3 Phản ứng ngưng kết hồng cầu trên đĩa đáy chữ V 32

Hình 2.4 Cách đọc kết của của phản ứng ngưng kết hồng cầu trên đĩa 96 đáy chữ V 32

Hình 2.5 Buồng đếm tế bào 33

Hình 2.6 Cơ chế và cách đọc kết quả của phản ứng ELISA xác định phân lớp kháng thể 35

Hình 3.1 Phản ứng ngưng kết giữa huyết thanh của chuột được gây miễn dịch với hồng cầu mẫu A+, B+, O+ 38 Hình 3.2 Lách và hạch vùng kheo thu được từ chuột được gây miễn dịch với hồng cầu mẫu A+ 39

Hình 3.3 Tế bào sau dung hợp 40

Hình 3.4 Tế bào lai hình thành sau 6 ngày dung hợp 40

Hình 3.5 Tế bào lai sau 2 ngày dung hợp ở các giếng khác nhau 41

Hình 3.6 Sự phát triển của tế bào lai 42

Hình 3.7 Sàng lọc giếng chứa hỗn hợp tế bào lai sản xuất kháng thể kháng kháng nguyên A 43

Hình 3.8 Sàng lọc dòng tế bào lai đơn sản xuất kháng thể kháng kháng nguyên A 44

Hình 3.9 Chọn dòng tế bào lai sản xuất kháng thể kháng kháng nguyên A tốt nhất 44

Hình 3.10 Phản ứng ELISA xác định isotye kháng thể 45

Hình 3.11 Đường cong sinh trưởng của dòng tế bào lai A6G11C9 trong môi trường DMEM + 10% FBS 47

Hình 3.12 Đường cong sinh trưởng của dòng tế bào lai A6G11C9 khi nuôi cấy trong môi trường có nồng độ huyết thanh thấp DMEM + 1%FBS 48

Hình 3.13 Đồ thị biểu thị sự hình thành kháng thể của dòng tế bào A6G11C9 khi nuôi cấy trong môi trường DMEM + 10% FBS 49

Hình 3.14 Đồ thị biểu thị sự hình thành kháng thể của dòng tế bào A6G11C9 khi nuôi cấy trong môi trường DMEM + 1% FBS 49

Hình 3.15 Xác định hiệu giá kháng thể bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu 50

Hình 3.16 Phản ứng ngưng kết hồng cầu trên đĩa 96 giếng đáy chữ V xác định độ đặc hiệu của kháng thể 51

Hình 3.17 Phản ứng ngưng kết hồng cầu trên phiến kính xác định ái tính kháng thể và cường độ của phản ứng ngưng kết 52

Hình 3.18 Dịch nuôi cấy trước và sau khi tủa ammonium sulphate 53

Hình 3.19 Độ đặc hiệu của kháng thể trước và sau khi tủa 54

Hình 3.20 Hiệu giá kháng thể trước và sau khi tủa ammonium sulfate 54

Hình 3.21 Sinh phẩm A và phản ứng ngưng kết hồng cầu của sinh phẩm với panel hồng cầu hệ ABO 56

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 1 Hưỡng dẫn đọc kết quả của phương pháp huyết thanh mẫu 16

Bảng 1 2 Hưỡng dẫn đọc kết quả của phương pháp hồng cầu mẫu 16

Bảng 2 1 Môi trường sử dụng……… 25

Bảng 2 2 Một số dung dịch 26

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

MHC Major histocompatibility complex

APC Antigen presenting cell

ISBT International society of blood transfusion

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

EBV Epstein – Barr virus

scFv Single chain fragment variable

VH Variable domains of the heavy

VL Variable domains of the light

RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

hmAb Human monoclonal antibody

HGPRT Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase PEG Polyethylene glycol

HAT Hypoxanthyl aminoteptrin thymidine

DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium

FBS Fetal bovine serum

FCA Freund’s complete adjuvant

FIA Freund’s incomplete adjuvant

HT Hypoxanthine thymine

DMSO Dimethylsulfoxide

MỞ ĐẦU

Máu được xem là một loại thuốc đặc biệt được sử dụng trong điều trị nội khoa, cấp cứu ngoại khoa, sản khoa và triển khai nhiều kỹ thuật y học cao cấp như ghép tạng, mổ tim, lọc máu ngoài thận Tuy nhiên, có rất nhiều tai biến nguy hiểm xảy ra khi sử dụng máu trong điều trị bệnh do có sự ngưng kết giữa kháng nguyên trên màng hồng cầu người cho với kháng thể trong huyết thanh của người nhận Năm 2014, Hiệp hội truyền máu quốc tế đã thống kê có 35 hệ nhóm máu với hơn 300 kháng nguyên nhóm máu khác nhau Hầu hết các kháng nguyên trên màng hồng cầu có tính sinh miễn dịch yếu được dùng để nghiên cứu di truyền và quan hệ huyết thống, chỉ có hai nhóm kháng nguyên đặc biệt quan trọng gây ra phản ứng ngưng kết khi truyền máu dẫn đến tai biến đó là kháng nguyên A, B của hệ nhóm máu ABO và kháng nguyên D của hệ nhóm máu Rh Để truyền máu thành công phải có sự tương thích giữa máu người cho và người nhận Do đó, trước khi truyền máu cần phải tiến hành xác định nhóm máu Nhóm máu được xác định bằng phương pháp ngưng kết sử dụng hồng cầu mẫu hoặc huyết thanh mẫu Huyết thanh mẫu chính là các kháng thể đơn dòng đặc hiệu kháng nguyên nhóm máu, có 3 loại huyết thanh mẫu anti-A, anti-B, anti-AB được

sử dụng trong xác định nhóm máu hệ ABO và huyết thanh mẫu anti-D để xác định nhóm máu hệ Rh Nhiều phương pháp được phát triển để sản xuất kháng thể đơn dòng như công nghệ lai tế bào, công nghệ bất tử tế bào B, công nghệ phage display, công nghệ kháng thể tái tổ hợp Phương pháp lai tế bào đã được được ứng dụng thành công

để tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể kháng lại kháng nguyên nhóm máu hệ ABO Hiện nay, thuốc thử xác định nhóm máu có bản chất là các kháng thể đơn dòng đã được sản xuất thành công như Blood Grouping (Prestige Diagnostics U.K.), Monoclonal blood grouping reagent (Maxwin international), Anti – A Monoclonal reagent (Atlas Medical), Transclone® (Biorad)…

Ngày nay, nhu cầu sử dụng máu trong điều trị bệnh ngày càng lớn do vậy nhu cầu sử dụng huyết thanh mẫu ngày càng gia tăng Tuy nhiên, Việt Nam vẫn chưa sản xuất được kháng thể đơn dòng xác định nhóm máu mà chủ yếu sử dụng hồng cầu mẫu thu thập từ các tình nguyện viên hoặc kháng thể đơn dòng nhập ngoại Việc sử dụng thuốc thử xác định nhóm máu là hồng cầu mẫu tốn ít chi phí nhưng lại mất rất nhiều

máu thu được từ tình nguyện viên Còn việc sử dụng huyết thanh mẫu nhập ngoại lại

có giá thành cao như vậy chi phí để mua huyết thanh mẫu dùng trong xác định nhóm máu cho số lượng máu thu gom hàng năm lên đến hàng trăm tỷ đồng sẽ làm tăng gánh nặng kinh tế đối với bệnh nhân Xuất phát từ những cơ sở khoa học và thực tiễn trên,

chúng tôi thực hiện đề tài“Tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng

kháng nguyên A (nhóm máu A) trên màng tế bào hồng cầu người” với mục tiêu tạo ra

dòng tế bào lai đơn sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên A sử dụng như thuốc thử xác định nhóm máu A ở người

NỘI DUNG Chương 1 Tổng quan

Lớp phòng thủ thứ nhất giúp cơ thể chống lại tác nhân gây bệnh là hàng rào vật

lý (da và màng nhày) Lớp phòng thủ này bao gồm các enzyme và dịch nhày có thể tấn công trực tiếp tác nhân gây bệnh hoặc ức chế tác nhân gây bệnh để ngăn chặn sự xâm nhập của chúng Tuy nhiên, bề mặt keratine của da hoặc khoang cơ thể chứa dịch nhày

là môi trường lý tưởng cho hầu hết sinh vật do đó tác nhân gây bệnh có thể vượt qua hàng rào vật lý này Khi tác nhân gây bệnh vượt qua lớp phòng thủ thứ nhất đi vào cơ thể, nó sẽ chạm trán với hệ thống miễn dịch của cơ thể

Hình 1.1 Thành phần của đáp ứng miễn dịch bẩm sinh và đáp ứng miễn dịch đặc hiệu

[36]

Hệ thống này được chia thành hai loại: 1) hệ thống miễn dịch bẩm sinh đáp ứng nhanh và không đặc hiệu, 2) hệ thống miễn dịch thích ứng đáp ứng chậm và đặc hiệu với từng tác nhân gây bệnh Mỗi loại khác nhau về cách nó đáp ứng với tác nhân gây

bệnh (nhanh hay chậm), các tế bào thẩm quyền miễn dịch và sự đặc hiệu của nó cho từng loại tác nhân gây bệnh tuy nhiên cả hai loại đáp ứng miễn dịch đều có vai trò quan trọng như nhau trong hệ miễn dịch [27, 33]

1.1.2 Hệ thống miễn dịch bẩm sinh

Hệ thống miễn dịch bẩm sinh bao gồm các hàng rào (vật lý, hóa học, sinh học), thành phần tế bào (các tế bào thực bào, tế bào giết tự nhiên, tế bào tua) và thành phần hóa học (protein bổ thể, các cytokine và protein cấp) Đặc điểm nổi bật của hệ thống miễn dịch bẩm sinh là thiếu trí nhớ miễn dịch do vậy các đáp ứng miễn dịch bẩm sinh duy trì không thay đổi mặc dù tiếp xúc với kháng nguyên nhiều lần

Tế bào thực bào gồm đại thực bào (macrophage) và tế bào bạch cầu trung tính (neutrophil) Tế bào đại thực bào có các thụ thể carbohydrate cho phép nó phân biệt các tế bào của cơ thể và các tế bào lạ Các tế bào thực bào nuốt tác nhân gây bệnh vào trong phagosome Sau đó, phagosome dung hợp với lysosome chứa các enzyme và các chất hóa học để phân giải tác nhân gây bệnh bằng cách giải phóng lượng lớn gốc oxy

tự do Tế bào đại thực bào không chỉ tiêu diệt tác nhân gây bệnh mà nó còn tiêu diệt các tế bào già, tế bào chết hoặc các tế bào bị tổn thương của cơ thể

Hình 1.2 Quá trình thực bào [40]

Tế bào tua (Dendritic Cell – DC) là thành phần tế bào chính của đáp ứng miễn dịch bẩm sinh Tế bào này có mặt trong nhiều mô khác nhau, ở da nó được gọi là tế bào Langerhans Nó là tế bào trình diện kháng nguyên (Antigen presenting cell – APC) có chức năng chính là xử lý kháng nguyên và trình diện kháng nguyên trên bề mặt tế bào T của hệ thống miễn dịch

Tế bào giết tự nhiên (natural killer cell - NK cell) không tấn công trực tiếp tác nhân gây bệnh mà chúng giết chết tế bào của cơ thể đã bị lây nhiễm tác nhân gây bệnh

Tế bào giết tự nhiên giết tế bào bằng cách hình thành lỗ hổng trên màng tế bào Perforin được giải phóng bởi tế bào giết tự nhiên và chèn vào màng tế bào của tế bào

bị lây nhiễm để tạo thành lỗ trên màng Lỗ này cho phép nước đi vào làm tế bào căng lên sau đó vỡ ra Tế bào giết tự nhiên cũng tấn công các tế bào ung thư trước khi chúng có thể thay đổi để phát triển thành khối u

Bổ thể gồm 20 loại protein khác nhau tuần hoàn tự do trong máu Khi chúng tiếp xúc với vi khuẩn hoặc thành tế bào nấm, những protein này ngưng kết lại tạo thành phức hợp tấn công màng và chèn vào màng tế bào của tế bào lạ sau đó hình thành lỗ tương tự như tế bào NK Một vài protein khác như interferon α, β,  đóng vai trò như những phân tử tín hiệu bảo vệ các tế bào bình thường khi tiếp xúc với các tế bào đã bị lây nhiễm

Hình 1.3 Cách tế bào NK và protein bổ thể tạo lỗ trên màng để tiêu diệt tế bào lây

nhiễm tác nhân gây bệnh [26]

Sự kết hợp của các tế bào thực bào, tế bào giết tự nhiên và hệ thống bổ thể một cách hiệu quả giúp loại bỏ hầu hết vi khuẩn và nấm Tuy nhiên, các tác nhân gây bệnh

cụ thể có thể tiến hóa để ẩn nấp bên trong tế bào chủ khi các tế bào thực bào và bổ thể không thể bắt lấy chúng [26]

1.1.3 Hệ thống miễn dịch thích ứng

Bề mặt của hầu hết tế bào động vật có xương sống chứa glycoprotein được sản xuất bởi phức hợp tương hợp mô chính (Major histocompatibility complex – MHC)

Những glycoprotein này được gọi là protein MHC và ở người nó là protein HLA (human leukocyte antigen) Gen mã hóa protein MHC có độ đa hình cao do đó hiếm khi hai cá thể có cùng một MHC Chính vì vậy, MHC được sử dụng như một marker

để phân biệt các tế bào của cơ thể và các tế bào lạ Có 2 lớp protein MHC MHC lớp I

có mặt trên mọi tế bào có nhân của cơ thể Tuy nhiên, MHC lớp II chỉ được tìm thấy trên tế bào đại thực bào, tế bào B và tế bào T CD4+ Ba loại tế bào này làm việc với nhau trong một dạng của đáp ứng miễn dịch và maker protein MHC – II của chúng cho phép chúng nhận diện các tế bào khác Tế bào T độc (phá hủy tế bào lây nhiễm) có đồng thụ thể CD8+ chỉ tương tác với kháng nguyên hiện diện cùng với protein MHC –

I của tế bào bị lây nhiễm Tế bào T trợ giúp có thụ thể CD4+ chỉ có thể tương tác với kháng nguyên hiện diện cùng với protein MHC – II của các tế bào lympho khác

Hình 1.4 Tế bào T bám vào kháng nguyên lạ liên kết với protein MHC [26] Khi các phân tử lạ xâm nhập vào cơ thể, nó có thể lây nhiễm vào các tế bào của

cơ thể hoặc bị bắt bởi các tế bào APC Trong tế bào, kháng nguyên của phân tử lạ được xử lý và chuyển đến màng tế bào Ở màng tế bào, kháng nguyên đã xử lý được kết hợp với protein MHC – I và điều này cho phép tế bào T độc (T CD8+) nhận diện

sự có mặt của kháng nguyên khi chúng hiện diện cùng với protein MHC – I

Hình 1.5 Kháng nguyên được hiện diện cùng protein MHC [26]

(A Tế bào của cơ thể có protein MHC trên bề mặt để xác định chúng là các tế bào tự thân Hệ thống miễn dịch không tấn công các tế bào này; B Tế bào lạ hoặc vi sinh vật

có kháng nguyên trên bề mặt Tế bào B có khả năng bám trực tiếp vào kháng nguyên

tự do trong cơ thể và khởi đầu sự tấn công phân tử lạ xâm lấn; C Tế bào T chỉ có thể bám vào kháng nguyên sau khi kháng nguyên được xử lý và kết hợp với protein MHC trên bề mặt của tế bào trình diện kháng nguyên APC)

Các tế bào đại thực bào kiểm tra bề mặt của tất cả các tế bào mà nó đi qua Khi đại thực bào tiếp xúc với phân tử lạ trong cơ thể, nó phân giải một phần phân tử lạ đồng thời kháng nguyên của phân tử lạ sẽ được kết hợp với protein MHC – II của tế bào đại thực bào Sự tổ hợp của protein MHC – II và kháng nguyên lạ là cần thiết cho

sự tương tác với thụ thể trên bề mặt của tế bào T trợ giúp (T CD4+) Ở cùng thời điểm, khi đại thực bào tiếp xúc với kháng nguyên thì nó sẽ giải phóng interleukin – 1 Tế bào

T trợ giúp đáp ứng với interleukin – 1 để kích hoạt đáp ứng miễn dịch qua trung gian

tế bào được thực hiện bởi tế bào T và đáp ứng miễn dịch dịch thể được thực hiện bởi tế bào B [26]

1.1.3.1 Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào

Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào được thực hiện bởi tế bào T có vai trò bảo vệ cơ thể tránh khỏi sự lây nhiễm virus, giết chết các tế bào bất thường hoặc tế bào của cơ thể bị nhiễm virus Khi đại thực bào xử lý kháng nguyên lạ, chúng sẽ tiết ra interleukin – 1 để kích hoạt sự phân chia và tăng sinh tế bào T trợ giúp Tế bào T trợ giúp được hoạt hóa bởi phức hợp kháng nguyên và protein MHC – II có mặt trên đại thực bào, nó sẽ tiết các cytokine được gọi là yếu tố kích hoạt dòng đại thực bào (Macrophage Colony-Stimulating Factor – MSCF) và interferon –  để điều khiển hoạt động của tế bào đại thực bào Bên cạnh đó, tế bào T trợ giúp tiết interleukin – 2 để

kích hoạt sự tăng sinh của tế bào T độc đặc hiệu với kháng nguyên Tế bào T độc có thể phân hủy tế bào nhiễm chỉ khi những tế bào này biểu hiện kháng nguyên lạ kết hợp với protein MHC – I [26]

Hình 1.6 Hàng rào miễn dịch tế bào T [26]

1.1.3.2 Đáp ứng miễn dịch dịch thể

Tế bào B nhận diện kháng nguyên bằng kháng thể liên kết màng (thụ thể kháng thể) Những thụ thể kháng thể này có khả năng nhận diện nhiều cấu trúc hóa học khác nhau (protein, lipid, polysaccharide và các chất hóa học nhỏ,…) Mỗi tế bào B có một thụ thể riêng và chỉ có khả năng nhận diện đặc hiệu một kháng nguyên Do vậy, một kháng nguyên đơn sẽ hoạt hóa một tế bào B đơn và quá trình này đƣợc gọi là sự chọn lọc dòng tế bào B vì kháng nguyên đã chọn lọc tế bào B với sự đặc hiệu chính xác để hoạt hóa chúng [36]

Khi tế bào B tiếp xúc với phân tử lạ, phần kháng nguyên sẽ đi vào tế bào B bởi quá trình endocytosis và đƣợc tổ hợp với protein MHC-II Tế bào T trợ giúp nhận diện kháng nguyên đặc hiệu hiện diện cùng protein MHC-II có trên bề mặt tế bào B và giải phóng ra interleukin – 2 Phân tử tín hiệu này kích thích sự phân chia của tế bào B Bên cạnh đó, các kháng nguyên tự do không đi vào tế bào B sẽ kết hợp với thụ thể kháng thể trên bề mặt của tế bào B Sự tiếp xúc kháng nguyên này kích thích sự sinh sản của tế bào B hoạt hóa

Các tế bào B hoạt hóa sau đó sẽ được biệt hóa thành các tế bào B nhớ và các tế bào plasma sản xuất kháng thể Kháng thể được giải phóng vào huyết tương, bạch huyết, dịch ngoại bào để trung hòa kháng nguyên và đánh dấu cho sự tiêu diệt phân tử

lạ của tế bào đại thực bào hoặc hoạt hóa bổ thể của hệ thống miễn dịch bẩm sinh Khi đáp ứng miễn dịch dịch thể giảm xuống, một số tế bào plasma bị chết theo con đường appotosis và một số tế bào di chuyển đến tủy xương và tiết kháng thể trong vài năm

Sự hoạt hóa ban đầu của của các tế bào lympho nguyên bản cũng kích hoạt sự biệt hóa của các tế bào nhớ có đời sống dài, có thể tồn tại nhiều năm sau lây nhiễm Các tế bào nhớ đáp ứng nhanh và hiệu quả hơn các tế bào lympho B nguyên bản [26]

Hình 1.7 Hàng rào miễn dịch tế bào B [26]

1.1.4 Kháng nguyên

Kháng nguyên là bất kỳ cơ chất nào có khả năng cảm ứng sự hình thành kháng thể và phản ứng đặc hiệu với kháng thể được tạo ra Chúng phản ứng với cả thụ thể của tế bào T và kháng thể Hai đặc tính quan trọng của kháng nguyên là: 1) tính đặc hiệu (có khả năng kết hợp đặc hiệu với các sản phẩm của đáp ứng miễn dịch (kháng thể và thụ thể của tế bào T); 2) tính sinh miễn dịch (có khả năng kích thích cơ thể sinh đáp ứng miễn dịch đặc hiệu)

Mỗi phân tử kháng nguyên này có một hoặc một số quyết định kháng nguyên được gọi là epitope và mỗi epitope có thể liên kết với một kháng thể đặc hiệu do đó một kháng nguyên có thể liên kết với nhiều kháng thể tại các vị trí liên kết khác nhau

Các kháng nguyên có khối lượng phân tử thấp được gọi là hapten không có khả năng gây đáp ứng miễn dịch nhưng có thể phản ứng với kháng thể sẵn có Những phân tử này cần được ghép với phân tử mang để cảm ứng sự hình thành kháng thể Phân tử mang có thể là một protein của vật chủ

Cấu trúc bậc bốn của phân tử kháng nguyên đóng vai trò quan trọng trong việc xác định tính kháng nguyên Các phân tử như lipid và ADN thường là các kháng nguyên yếu Hầu hết kháng nguyên là kháng nguyên phụ thuộc tuyến ức hoặc kháng nguyên không phụ thuộc tuyến ức Kháng nguyên phụ thuộc tuyến ức cần có sự hỗ trợ của tế bào T mới kích thích được tế bào B biệt hóa thành tế bào plasma sản xuất kháng thể, ví dụ như protein và tế bào máu ngoại lai Kháng nguyên không phụ tuyến ức không yêu cầu sự tham gia của tế bào T để sản xuất kháng thể Thay vào đó, chúng trực tiếp kích hoạt tế bào B đặc hiệu bằng cách liên kết với thụ thể kháng thể trên bề mặt tế bào B Những phân tử này sản xuất kháng thể IgM và IgG2 và không kích hoạt

tế bào nhớ sau thời gian dài Hầu hết polysaccharide của vi khuẩn (tìm thấy ở thành tế bào vi khuẩn) được xếp vào nhóm kháng nguyên này Polysaccharide nhất định như LPS (lipopolysaccharide) không chỉ cảm ứng sự hoạt động của tế bào B đặc hiệu mà còn có thể tác động kích hoạt nhiều tế bào B [15]

1.1.5 Kháng thể

Kháng thể là các phân tử glycoprotein được sản xuất bởi tế bào B của hệ thống miễn dịch Mỗi phân tử kháng thể bao gồm 2 chuỗi polypeptide ngắn giống nhau được gọi là chuỗi nhẹ và 2 chuỗi polypeptide dài giống nhau được gọi là chuỗi nặng Bốn chuỗi này được liên kết với nhau bằng cầu nối disulfide hình thành phân tử dạng chữ

Y

Mỗi chuỗi nhẹ gồm một vùng hằng định (light chain constant region, CL) và một vùng biến đổi (light chain variable region, VL) Vùng chức năng đầu N của chuỗi nhẹ (VL) có trình tự axit amin biến đổi là vị trí liên kết với kháng nguyên Tuy nhiên,

để liên kết được với kháng nguyên thì vùng biến đổi của chuỗi nhẹ cần kết hợp với vùng biến đổi của chuỗi nặng Vùng chức năng đầu C của chuỗi nhẹ (CL) có trình tự axit amin không thay đổi có thể là kappa (κ) hoặc lamda (λ) và khoảng 60% chuỗi nhẹ

ở người là kappa

Mỗi chuỗi nặng gồm ba hoặc bốn vùng hằng định (heavy chain constant region – CH1, CH2, CH3) và một vùng biến đổi (heavy chain variable region – VH) Vùng biến đổi của chuỗi nặng nằm ở đầu N đối xứng với vùng biến đổi của chuỗi nhẹ Trình tự amino acid của vùng biến đổi rất khác nhau giữa các phân tử kháng thể Hầu hết phần khác nhau này thuộc khu vực siêu biến đổi và thường chỉ gồm 6 – 10 amino acid Mỗi vùng biến đổi tồn tại 3 miền siêu biến đổi (complementarity determining regions - CDR) Các miền siêu biến đổi trên cả chuỗi nặng và chuỗi nhẹ được căn thẳng nhau để hình thành vị trí liên kết kháng nguyên và xác định tính đặc hiệu của phân tử kháng thể Một vài kiểu khác nhau của vùng hằng định của chuỗi nặng liên quan đến sự xác định các phân lớp khác nhau của kháng thể Chuỗi nặng của kháng thể có thể là γ(IgG), α(IgA), µ(IgM), ε(IgE) hoặc δ(IgD) IgG, IgA và IgD có 3 vùng hằng định và một vùng bản lề, IgM và IgE có 4 vùng hằng định nhưng không có vùng bản lề Vùng bản lề là trình tự peptide định vị giữa vùng hằng định 1 và 2 của chuỗi nặng Nó cho phép vùng Fab có thể di chuyển chống lại vùng Fc từ 0 đến 90º Điều này cho phép kháng thể tương tác tốt hơn với quyết định kháng nguyên [20]

Hình 1.8 Cấu trúc của phân tử kháng thể [41]

IgG là kháng thể phổ biến nhất được tìm thấy ở trong máu IgG điều khiển sự tiêu diệt các vi sinh vật ngoại lai trong các đáp ứng miễn dịch thứ cấp Kháng thể này được sử dụng để xác định sự có mặt của virus ở trong máu

IgM gồm có 5 phân tử nhỏ được tập hợp lại bởi chuỗi J Nó là phân tử kháng thể được sản xuất đầu tiên trong đáp ứng miễn dịch sơ cấp có chức năng trung hòa virus và hoạt hóa bổ thể

IgA được cấu tạo từ 2 phân tử nhỏ liên kết với nhau qua chuỗi J Nó được tìm thấy ở khu vực niêm mạc như ruột, phổi có chức năng ngăn chặn sự cố định của tác nhân gây bệnh IgA còn được tìm thấy trong nước bọt, nước mắt và sữa IgE bám vào thụ thể Fc trên tế bào đại thực bào và bạch cầu ưa kiềm và gây ra phản ứng dị ứng Nó cũng liên kết với hệ thống phòng thủ chống lại ký sinh Nó có mặt trong máu với nồng

độ khá thấp Thông thường, kháng thể này được sử dụng để kiểm tra sự dị ứng

IgD là một thành phần nhỏ của máu chiếm khoảng 1% protein trên màng của tế bào lympho B và nó được đồng biểu hiện với một kháng thể bề mặt khác gọi là IgM Ngoài ra, IgD còn hoạt hóa bạch cầu ưa axit và tế bào mast sản xuất các yếu tố kháng

vi sinh vật [34]

1.2 Khái quát về hệ thống nhóm máu người

1.2.1 Phân loại hệ thống nhóm máu ở người

Trước năm 1900, người ta nghĩ rằng tất cả các loại máu là như nhau Sự hiểu biết sai lầm này dẫn đến nhiều trường hợp tử vong khi truyền máu từ động vật vào người và từ người vào người Việc truyền máu trở nên an toàn hơn khi Karl Landsteiner phát hiện ra hệ thống nhóm máu ABO vào năm 1901 Như vậy, kiểu nhóm máu của những người khác nhau có thể không giống nhau và nó phụ thuộc vào marker bề mặt (kháng nguyên) được tìm thấy trên màng tế bào hồng cầu (Red blood cell – RBC) Do đó, nhóm máu được phân loại dựa vào sự có mặt của kháng nguyên

có mặt trên màng RBC Hiện nay, có khoảng 35 nhóm máu (ABO, Rh, MNS, Kell, Lewis, Duffy, Kidd, Indian,…) với hơn 300 kháng nguyên nhóm máu đã được thống

kê bởi hiệp hội truyền máu quốc tế (International Society of Blood Transfusion – ISBT) năm 2014 [37] Hầu hết, kháng nguyên nhóm máu trên bề mặt hồng cầu có tính kháng nguyên yếu và được sử dụng trong nghiên cứu di truyền Chỉ có 2 kháng nguyên A, B của hệ thống nhóm máu ABO và kháng nguyên D của hệ thống nhóm máu Rh có tính kháng nguyên mạnh đóng vai trò quan trọng trong truyền máu và trong sản khoa

Kháng nguyên nhóm máu có thể là đường hoặc protein, chúng liên kết với các thành phần khác nhau trên màng hồng cầu Kháng nguyên nhóm máu ABO có bản chất là đường Chúng được sản xuất bởi một loạt các phản ứng với sự tham gia của các

enzyme xúc tác chuyển hóa các đơn vị đường ADN của người xác định kiểu enzyme

mà họ có do đó quy định kiểu kháng nguyên đường hình thành trên màng tế bào hồng cầu của họ Ngược lại, kháng nguyên của nhóm máu Rh lại có bản chất là protein ADN của mỗi người mang thông tin di truyền của kháng nguyên protein Gen RhD mã hóa kháng nguyên D Một số người không có gen RhD nên không sản xuất kháng nguyên D và do đó protein RhD vắng mặt trên tế bào hồng cầu của họ Bên cạnh kháng nguyên đường (glycan hoặc carbohydrate), tế bào hồng cầu có ba loại protein mang kháng nguyên nhóm máu: protein xuyên màng một lần, protein xuyên màng nhiều lần và protein liên kết glycosylphosphatidylinositol (GPI) [6]

Hình 1.9 Kháng nguyên nhóm máu của người [6]

1.2.2 Hệ thống nhóm máu ABO

Hệ thống nhóm máu ABO gồm 4 nhóm máu A, B, AB và O được xác định bằng sự có mặt hoặc vắng mặt của hai kháng nguyên A và B Kháng nguyên nhóm máu ABO là các cấu trúc carbohydrate có mặt trên màng hồng cầu và nhiều mô Những kháng nguyên này được định vị tại đầu tận cùng của chuỗi glucizic và biểu hiện ở nhiều dạng khác nhau: oligosaccharide trong nước tiểu, glycoprotein trong dịch tiết của cơ thể và dịch mô, glycolipid ở màng Trong hệ thống nhóm máu ABO, mỗi kháng nguyên được đặc trưng bởi một gốc đường đặc hiệu Kháng nguyên A có đầu tận cùng là N-acetylgalactosamine và kháng nguyên B có đầu tận cùng là galactose [22]

Kháng nguyên trên màng hồng cầu là các kháng nguyên tự thân và được bỏ qua bởi hệ miễn dịch Tuy nhiên, hệ miễn dịch sẽ sản xuất các kháng thể chống lại các kháng nguyên khác với kháng nguyên tự thân của hồng cầu [6] Người nhóm máu A

có kháng nguyên A trên hồng cầu mà không có kháng nguyên B do đó có kháng thể kháng kháng nguyên B trong huyết thanh Người nhóm máu B có kháng nguyên B trên màng hồng cầu và kháng thể kháng kháng nguyên A trong huyết thanh Người nhóm máu AB có cả kháng nguyên A và B trên màng hồng cầu do vậy không có kháng thể kháng kháng nguyên A và kháng thể kháng kháng nguyên B trong huyết thanh Còn người có nhóm máu O thì huyết thanh có cả kháng thể kháng kháng nguyên A và kháng thể kháng kháng nguyên B do màng hồng cầu thiếu cả hai kháng nguyên A và B [17]

1.2.3 Vai trò của máu trong y học

Trong cơ thể của mỗi người trưởng thành có khoảng hơn 5 lít máu Máu mang oxy và các chất dinh dưỡng đến các tế bào đồng thời cũng mang đi các các sản phẩm

dư thừa của các tế bào này Ngoài ra, máu còn vận chuyển các tế bào miễn dịch để chống lại các tác nhân lây nhiễm và mang tiểu cầu để tạo thành các vết đông máu khi mạch máu bị tổn thương để ngăn chặn sự mất máu Máu được vận chuyển đi khắp cơ thể qua hệ thống tuần hoàn Khi cơ thể hoạt động nhiều, tim sẽ bơm máu mạnh và nhanh hơn để cung cấp nhiều máu từ đó tăng cường oxy cho cơ Khi cơ thể bị viêm nhiễm, máu vận chuyển nhiều tế bào miễn dịch đến vị trí lây nhiễm, tại đây các tế bào miễn dịch tập hợp lại để ngăn chặn các tác nhân có hại [5]

Với những chức năng như trên máu đóng vai trò rất quan trọng đối với cơ thể

và nó được coi là một loại thuốc đặc biệt trong y tế Máu thường được sử dụng khi: i) người bị mất máu do phẫu thuật, bị thương hoặc bị ốm; ii) khi cơ thể không có khả năng tạo đủ máu (Một số bệnh và quá trình điều trị có thể gây trở ngại với khả năng tạo máu của tủy xương Ví dụ, người bị bệnh ung thư thường cần truyền máu bởi vì hóa trị làm giảm sự sản xuất tế bào máu mới của tủy xương); iii) để ngăn các biến chứng từ sự rối loạn máu: bệnh hồng cầu hình lưỡi liềm, bệnh thiếu máu địa trung hải, bệnh thiếu máu cấp…[38]

1.2.4 Truyền máu và nguyên tắc truyền máu

Truyền máu là quá trình tiếp nhận các sản phẩm của máu vào trong tĩnh mạch của một người khác Trước đây, máu toàn phần được sử dụng để truyền máu nhưng hiện nay nó hiếm khi được sử dụng Thay thế vào đó, nhiều thành phần đặc biệt của máu được truyền khi cần thiết Tế bào hồng cầu là thành phần được sử dụng để tăng khả năng vận chuyển oxy của máu và tránh sự mệt mỏi và các biến chứng khác Truyền máu mất khoảng 1-4 giờ phụ thuộc vào thành phần và thể tích máu được truyền Hầu hết truyền máu được thực hiện tại bệnh viện nhưng nó cũng được thực hiện ở bất cứ nơi nào khi cần thiết Trong hầu hết trường hợp, máu có nguồn gốc từ những tình nguyện viên [39]

Hình 1.10 Sơ đồ truyền máu [42]

Kháng nguyên là bất kỳ cơ chất nào có khả năng gây đáp ứng miễn dịch Nếu

hệ thống miễn dịch tiếp xúc với kháng nguyên không được tìm thấy trong tế bào của chính cơ thể, nó sẽ khởi đầu sự tấn công chống lại kháng nguyên Ngược lại, kháng nguyên được tìm thấy trong tế bào của cơ thể được gọi là “kháng nguyên tự thân”, thông thường hệ miễn dịch sẽ không tấn công những kháng nguyên này Màng của mỗi tế bào hồng cầu chứa hàng triệu kháng nguyên bị bỏ qua bởi hệ miễn dịch Tuy nhiên khi bệnh nhân nhận truyền máu, các kháng thể tự nhiên của hệ thống nhóm máu ABO có trong huyết tương của người nhận sẽ tấn công bất kỳ tế bào hồng cầu cho nào chứa kháng nguyên khác với kháng nguyên tự thân sau đó phá hủy chúng gây ra phản ứng tan máu cấp tính Do đó, việc xác định đúng nhóm máu người cho, nhóm máu người nhận cũng như sự tương tích nhóm máu giữa người cho và người nhận là cần thiết để truyền máu an toàn [7]

1.2.5 Phương pháp xác định nhóm máu hệ ABO

Kiểu nhóm máu của hệ nhóm máu ABO có thể được xác định bằng phương pháp huyết thanh mẫu hoặc phương pháp hồng cầu mẫu

Phương pháp huyết thanh mẫu dùng huyết thanh đã biết trước kháng thể cho phản ứng với hồng cầu của bệnh nhận để xác định sự có mặt của kháng nguyên trên bề mặt hồng cầu từ đó xác định được kiểu nhóm máu của bệnh nhân

Bảng 1.1 Hướng dẫn đọc kết quả của phương pháp huyết thanh mẫu

Huyết thanh mẫu A Huyết thanh mẫu B Huyết thanh mẫu AB

(+) có ngưng kết, (-) không ngưng kết

Phương pháp hồng cầu mẫu sử dụng hồng cầu mẫu đã biết trước kháng nguyên cho phản ứng với kháng thể của bệnh nhân để xác định kháng thể có mặt trong huyết thanh từ đó xác định kiểu nhóm máu của bệnh nhân [35]

Bảng 1.2 Hướng dẫn đọc kết quả của phương pháp hồng cầu mẫu

Hồng cầu mẫu A Hồng cầu mẫu B Hồng cầu mẫu O

1.3.1 Công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng

Kháng thể đơn dòng là kháng thể được sản xuất bởi một dòng tế bào B và nhận diện đặc hiệu một kháng nguyên Một vài phương pháp được sử dụng để sản xuất kháng thể đơn dòng của người gồm: bất tử tế bào B, công nghệ phage display, chuột chuyển gen, công nghệ kháng thể đơn dòng tái tổ hợp

Bất tử tế bào B được thực hiện bằng công nghệ lai tế bào hoặc công nghệ bất tử

EBV (Epstein – Barr virus) Với công nghệ lai tế bào, sự dung hợp giữa tế bào lympho

B miễn dịch với tế bào myeloma (người hoặc chuột) tạo ra tế bào lai mang đặc tính của cả 2 dòng tế bào đó là khả năng sinh trưởng vô hạn và sản xuất kháng thể đặc hiệu

với kháng nguyên gây miễn dịch Công nghệ tế bào lai được sử dụng thành công để tạo tế bào lai chuột tuy nhiên tế bào lai người lại gặp phải trở ngại do thiếu dòng tế bào myeloma người phù hợp Tế bào B cũng được bất tử bằng cách biến nạp EBV vào tế bào lympho B miễn dịch Tuy nhiên, tế bào lympho B biến nạp EBV không thể sinh trưởng vô hạn bởi vì chúng không phải là các tế bào ung thư, chúng khó nhân dòng và thường chỉ sản xuất một lượng nhỏ kháng thể Công nghệ tế bào lai – EBV được thiết lập dựa trên sự kết hợp của 2 phương pháp và duy trì những ưu điểm của cả hai

Công nghệ phage display là phương pháp chọn lọc các gen vùng biến đổi đặc

hiệu kháng nguyên để biểu hiện các mảnh kháng thể chức năng Các bước chính trong phage display bao gồm: xây dựng thư viện kháng thể, biểu hiện trên bề mặt phage, bio-panning (lựa chọn phage biểu hiện kháng thể), sàng lọc phage biểu hiện kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên đích Mảnh gen VH và VL được khuếch đại từ mARN của

tế bào lympho B sử dụng RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) Mảnh gen mã hóa vùng biến đổi chuỗi đơn (single chain fragment variable_scFv) được tạo ra bằng cách tổ hợp ngẫu nhiên mảnh gen VH và VL sử dụng PCR Thư viện sau đó sẽ được tách dòng để biểu hiện scFv trên bề mặt của thực khuẩn thể Lựa chọn phage biểu hiện scFv đặc hiệu với kháng nguyên mong muốn bằng cách cho các dòng thực khuẩn thể biểu hiện scFv liên liên kết với các kháng nguyên hoặc hapten khác nhau Các kháng thể không bám được loại bỏ bằng cách rửa sau đó kháng thể bám

được rửa giải và nhân lên bằng cách lây nhiễm vào E coli Lặp lại bước này một vài

lần thì có thể lựa chọn được các mảnh scFv đặc hiệu kháng nguyên Sau đó, sự đặc hiệu của mảnh scFv có thể được sàng lọc sử dụng phương pháp miễn dịch enzyme (enzyme-linked immunosorbent assay_ELISA) hoặc lọc tế bào hoạt hóa huỳnh quang (fluorescent-activated cell sorting_FACS) nếu protein liên kết màng tế bào là đích Khi

sự đặc hiệu đã được phân lập, gen của các vùng biến đổi kháng thể được đưa vào vector biểu hiện toàn bộ kháng thể người và chuyển vào tế bào để sản xuất kháng thể đơn dòng người đầy đủ (human mAbs_hmAbs) Một thư viện phage display phân lập mAb đã được cấp phép bởi FDA và ít nhất 35 mARN người tạo ra từ công nghệ phage display đã được đưa vào thử nghiệm lâm sàng

Chuột chuyển gen là một kỹ thuật khác để tạo kháng thể đơn dòng Chuột chuyển gen biểu kháng thể người được báo cáo lần đầu tiên năm 1994 Kỹ thuật chuyển gen chuột bao gồm sự phân hủy các locus gen mã hóa chuỗi nặng và chuỗi nhẹ của chuột và chuyển vào gen mã hóa chuỗi nặng và chuỗi nhẹ kappa của người Qua một vài thập kỷ, đoạn gen V đã được chuyển thêm vào chuột chuyển gen để kéo dài thời gian thu hồi kháng thể Hiện nay, hơn 50 kháng thể đơn dòng sản xuất từ chuột chuyển gen đã được đưa vào thử nghiệm lâm sàng và 6 kháng thể đơn dòng đã được cấp phép cho thương mại Sự biểu hiện kháng thể người trong chuột chuyển gen ngăn chặn đáp ứng kháng thể chuột chống người và duy trì những thuận lợi của công nghệ lai tế bào chuột phục vụ sản xuất kháng thể cho thử nghiệm

Công nghệ kháng thể tái tổ hợp từ dòng tế bào B của người sản xuất kháng thể

Để thực hiện phương pháp này cần phải phân lập được tế bào B đơn từ lách chuột hoặc

tế bào máu ngoại vi PBMC (Peripheral blood mononuclear cell) người sử dụng vi hạt kết hợp với marker chọn lọc tế bào B hoặc phân loại tế bào hoạt hóa huỳnh quang dựa vào marker bề mặt của tế bào B đơn Sau khi phân lập được tế bào B đơn, tách mRNA

để tổng hợp cADN của gen chuỗi nặng và chuỗi nhẹ mã hóa cho các đoạn biến đổi của kháng thể trong mỗi tế bào bằng RT-PCR và tổ hợp các gen chuỗi nặng và chuỗi nhẹ lại với nhau sử dụng kỹ thuật PCR overlapping Đối với mỗi tế bào, chuỗi nặng và chuỗi nhẹ tương ứng được khuếch đại bằng RT-PCR lồng và biểu hiện trong vector

nhân dòng để sản xuất kháng thể đơn dòng người đặc hiệu in – vitro Sử dụng những

phương pháp để nhân và biểu hiện kháng thể đơn dòng người có hiệu quả cao và yêu cầu ít tế bào Hơn nữa, kháng thể tái tổ hợp cho phép tạo ra nhanh chóng số lượng kháng thể đơn dòng đặc hiệu kháng nguyên trong một thời gian ngắn [30]

Hình 1.11 Các phương pháp sản xuất kháng thể đơn dòng [43]

1.3.2 Sản xuất kháng thể đơn dòng bằng công nghệ tế bào lai

Tế bào lai là tế bào được tạo ra để sản xuất một lượng lớn kháng thể đặc hiệu kháng nguyên (kháng thể đơn dòng) Để sản xuất kháng thể đơn dòng, chuột được gây miễn dịch với kháng nguyên đặc hiệu Sau một vài tuần, thu máu từ chuột đã gây miễn dịch để định lượng kháng thể trong huyết thanh Khi hiệu giá kháng thể đủ cao, chuột được giết và thu lấy lách để tách tế bào lympho B Những tế bào lympho này được dung hợp với tế bào ung thư tủy myeloma thiếu gen HGPRT (hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase) sử dụng PEG (polyethylene glycol) hoặc Sendai virus Các

tế bào dung hợp được nuôi cấy trong môi trường HAT (hypoxanthyl aminoteptrin thymidine) Tế bào myeloma mất khả năng tổng hợp kháng thể và thiếu enzyme HGPRT là những enzyme cho phép tế bào tổng hợp purine từ hypoxanthine Ban đầu,

sự vắng mặt của HGPRT không phải là vấn đề vì tế bào có thể sử dụng con đường thay thế để tổng hợp purine Tuy nhiên, khi tế bào nuôi cấy trong môi trường aminoteprin, chúng không thể sử dụng con đường thay thế khác và nó phụ thuộc hoàn toàn vào HGPRT để tồn tại Tế bào lympho B được phân lập từ chuột có enzyme

HGPRT và cũng có khả năng sản xuất kháng thể, khi tiếp xúc với kháng nguyên nó sẽ biệt hóa thành tương bào plasma sản xuất kháng thể nhưng đó lại là giai đoạn cuối cùng của quá trình biệt hóa nên chúng không thể nhân lên trong nuôi cấy Do vậy, chỉ

có tế bào lai mới có khả năng tồn tại trong môi trường HAT Dịch nuôi cấy tế bào lai được kiểm tra để tìm những tế bào sản xuất kháng thể mong muốn Vì có thể có nhiều hơn một tế bào lai trong các giếng ban đầu, các tế bào đơn từ các giếng dương tính kháng thể phải được tạo dòng và cấy truyền Sau khi tạo được dòng tế bào lai đặc hiệu kháng nguyên thì kháng thể đơn dòng được sản xuất bằng cách tiêm dòng tế bào lai

này vào khoang bụng của chuột hoặc sử dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào in – vitro [8, 23,

25]

Hình 1.12 Công nghệ tế bào lai [44]

1.3.3 Vai trò của kháng thể đơn dòng

Kháng thể đơn dòng là công cụ hữu ích trong nhiều nghiên cứu y sinh và có giá trị kinh tế cũng như giá trị y học lớn Một số lượng lớn kháng thể đơn dòng tinh sạch được phát triển cho nhiều thử nghiệm có độ nhạy cao Ví dụ phản ứng thử thai, sử dụng các hạt được bao phủ bởi kháng thể đơn dòng kháng lại hormone sinh sản (human chorionic gonadotropin – hCG) như là kháng nguyên Khi những hạt này được trộn với mẫu có chứa hormone của một phụ nữ có thai, phản ứng kháng nguyên – kháng thể có thể quan sát được bằng mắt Nhóm máu hệ ABO có thể được xác định sớm với sự giúp đỡ của huyết thanh người mang kháng thể đặc hiệu đã biết Những huyết thanh này đã được thay thế bởi kháng thể đơn dòng được sản xuất bởi tế bào lai

Do đó giá trị chuẩn đoán và sàng lọc của kháng thể đơn dòng qua phản ứng huyết thanh học đã được chứng minh Bên cạnh việc sử dụng kháng thể đơn dòng để xác định nhóm máu, kháng thể đơn dòng còn được sử dụng trong chuẩn đoán (các phản ứng Elisa để phát hiện virus), tinh sạch miễn dịch và trong trị liệu [26]

1.4 Động lực học sinh trưởng và sản xuất của tế bào động vật

Nuôi cấy tế bào động vật khó hơn nuôi cấy vi sinh vật bởi vì chúng yêu cầu nhiều dinh dưỡng hơn và thông thường chỉ sinh trưởng trên một bề mặt đặc biệt Mặc

dù vậy, nhiều tế bào động vật khác nhau bao gồm tế bào biệt hóa và không biệt hóa đã được nuôi cấy thành công

Tế bào động vật không thể tổng hợp được các amino acid thiết yếu và sự sinh trưởng của tế bào động vật trong nuôi cấy cần cung cấp 9 axit amin này (histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, threonine, tryptophan và valine) Ngoài ra, nuôi cấy tế bào động vật thường yêu cầu thêm cysteine, glutamine

và tyrosine Các thành phần thiết yếu khác của môi trường cần cho nuôi cấy tế bào động vật là vitamin, muối vô cơ, carbohydrate (glucose…) và huyết thanh Huyết thanh là một hỗn hợp gồm hàng trăm protein và nhiều yếu tố khác cần cho sự biệt hóa của tế bào của tế bào trong nuôi cấy Insuline trong huyết thanh là một hormone được yêu cầu cho sự sinh trưởng của tế bào động vật có xương sống…Mặc dù tế bào động vật có thể sinh trưởng trên môi trường không huyết thanh vì các loại tế bào này yêu cầu yếu tố sinh trưởng đặc biệt không có mặt trong huyết thanh Ví dụ, tế bào tiền thân tạo máu yêu cầu hormone erythropoietin và tế bào lympho T của hệ thống miễn dịch yêu cầu interleulin – 2 Các yếu tố này bám vào protein thụ thể trên màng tế bào tạo ra tín hiệu để tế bào tăng sinh

Trong mô động vật nguyên vẹn, hầu hết các tế bào liên hệ chặt chẽ và tương tác với các tế bào khác thông qua một loạt cầu nối tế bào Các tế bào cũng liên hệ với chất nền ngoại bào (một mạng lưới phức tạp các protein tiết và carbohydrate để lấp đầy khoảng trống giữa các tế bào) Chất nền được tiết bởi chính các tế bào giúp tế bào liên kết với các tế bào khác trong mô Chất nền ngoại bào bao gồm các thành phần: collagen, axit hyaluronic, mucopolysaccharise, proteoglycan, glycoprotein Tế bào

đông vật in – vivo có xu hướng tương tác với nhau và với chất nền ngoại bào Không

giống như vi khuẩn và nấm men có thể sinh trưởng ở trạng thái lơ lửng, hầu hết tế bào động vật đều cần bề mặt rắn đặc biệt được phủ chất nền ngoại bào (ECM – extracellular matrix) để sinh trưởng Chất nền ngoại bào đóng vai trò như cầu nối để liên kết các tế bào lại với nhau

Sự sinh trưởng của tế bào động vật tương tự như sự sinh trưởng của hầu hết vi sinh vật và được nghiên cứu bằng cách phân tích đường cong sinh trưởng khi nuôi cấy theo mẻ Tức là tế bào động vật được nuôi cấy trong hệ thống kín, trong quá trình nuôi cấy không thay đổi môi trường và thời gian nuôi cấy càng kéo dài thì nồng độ chất dinh dưỡng càng giảm sút, các chất thải trong trong môi trường tăng lên Sự sinh trưởng của tế bào động vật trải qua 4 giai đoạn Trong suốt giai đoạn đầu được gọi là lag phase, số lượng tế bào ít thay đổi do tế bào ít hoặc hầu như không phân chia mà chủ yếu chỉ thích ứng với môi trường mới Sau đó, tế bào bắt đầu bước vào giai đoạn sinh trưởng theo cấp số nhân được gọi là log phase (hay exponential growth phase) làm gia tăng kích thước quần thể với thời gian nhân đôi từ 18 đến 24 giờ (đối với tế bào lai chuột là 12 đến 24 giờ), sự sinh sản của tế bào chủ yếu được thực hiện trong giai đoạn này với thời gian thế hệ tối thiểu, mật độ tế bào tối đa đạt được trong nuôi cấy tĩnh là 106 tế bào/ml Trong nuôi cấy theo mẻ, sự sinh trưởng theo cấp số nhân thường được theo sau bởi giai đoạn chuyển tiếp và đạt đến giai đoạn cân bằng được gọi là stationary phase, đặc trưng bởi sự giới hạn sinh trưởng, sự cạn kiệt nguồn dinh dưỡng, ức chế sản xuất hoặc tích tụ các sản phẩm độc hại Đối với nuôi cấy tế bào động vật, tế bào sẽ ngừng sinh trưởng khi đã hình thành một lớp đơn liên tục trên bề mặt dụng cụ nuôi do sự ức chế tiếp xúc Sau pha cân bằng tế bào đi vào giai đoạn cuối cùng được gọi là pha suy vong (death phase) đặc trưng bởi số lượng tế bào chết vượt qua số lượng tế bào mới hình thành [2] Một vài thông số quan trọng thường được tính toán trong nuôi cấy tế bào đó là:

Số thế hệ là số lần mà tế bào phân chia (g)

Nt = No.2g g = log (Ne/No)/ln2= (log Nt – log No)/ln2

Tốc độ sinh trưởng (k) là số thế hệ sinh ra trong một đơn vị thời gian thường biểu thị bằng số thế hệ trong một giờ:

k = g/t = (log Nt – log No)/(t.ln2)

Thời gian thế hệ là thời gian cần thiết để số lượng quần thể tăng lên gấp đôi:

T= 1/k

Trong đó:

t: thời gian nuôi cấy

Nt: Số lượng tế bào ở thời điểm t

No: Số lượng tế bào ban đầu

Hình 1.14 Đường cong sinh trưởng của tế bào Tốc độ sản xuất kháng thể không phụ thuộc vào tốc độ sinh trưởng Ví dụ, một

số tác giả đã quan sát kháng thể tiếp tục được sản xuất ở giai đoạn cân bằng và trong một số trường hợp tốc độ sản xuất khác thể đạt tối đa trong suốt giai đoạn cân bằng Ngược lại, một vài dòng tế bào lai cho thấy tốc độ sản xuất kháng thể giảm khi chúng đạt đến giai đoạn cân bằng Động lực học sản xuất kháng thể có thể do một vài cơ chế

ức chế, môi trường cạn kiệt làm giảm đáng kể tốc độ sản xuất kháng thể của những tế bào này Trái lại, Fazekas de St Groth (1983) đã kiểm tra một số dòng tế bào lai trong nuôi cấy liên tục và không thấy sự ực chế ngược của sự tổng hợp kháng thể bởi tốc độ sản xuất kháng thể về cơ bản là giống nhau ở mật độ tế bào 105 và 106 tế bào/ml Cơ chế hình thành động lực học kháng thể có thể được giải thích như sau: thứ nhất, kháng thể hình thành trong tế bào và được giải phóng trong suốt giai đoạn chết khi màng tế bào bị phân giải; thứ hai, tốc độ sản xuất kháng thể tăng trong suốt giai đoạn cân bằng Một vài nghiên cứu đã cho thấy quần thể tế bào cân bằng đạt được tốc độ sản xuất kháng thể cao hơn trong suốt giai đoạn sinh trưởng và tốc độ sản xuất kháng thể có liên quan đến số lượng tế bào sống [12, 21, 24]

Chương 2 Vật liệu và phương pháp