Nghiên cứu kỹ thuật chọn tạo giống chuối tiêu mới từ nguồn nhập nội

* Mục tiêu nghiên cứu - Xây dựng thành công quy trình nhân giống cây chuối tiêu mới nhập nội bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nước.. Tuy nhiên, sự sinh trưởng như vậy ch

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

VIỆN KHOA HỌC SỰ SỐNG

BÁO CÁO KẾT QUẢ

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

MÃ SỐ : T2013 – 26UT

NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT CHỌN TẠO GIỐNG CHUỐI

TIÊU MỚI TỪ NGUỒN NHẬP NỘI

Chủ trì đề tài: ThS Đào Duy Hưng

THÁI NGUYÊN, 2013

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

VIỆN KHOA HỌC SỰ SỐNG

BÁO CÁO KẾT QUẢ

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

MÃ SỐ : T2013 – 26UT

NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT CHỌN TẠO GIỐNG CHUỐI

TIÊU MỚI TỪ NGUỒN NHẬP NỘI

Chủ trì đề tài : ThS Đào Duy Hưng

Những người tham gia : ThS Lê Thị Hảo

KS Nguyễn Hương Xiêm

Thời gian thực hiện : Từ tháng 01/2013 đến tháng 12/2013

Địa điểm nghiên cứu : Khu Công nghệ Tế bào

Viện Khoa học Sự sống Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

THÁI NGUYÊN, 2013

TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ

nguồn nhập nội”

– Chủ nhiệm đề tài: ThS Đào Duy Hưng

– Tel.: 0978131645 E-mail: duyhungtn09@gmail.com – Cơ quan chủ trì đề tài: Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

– Cơ quan và cá nhân phối hợp thực hiện:

– Thời gian thực hiện: Tháng 01/ 2013 đến tháng 12/2013

- Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng giá thể đến sự thích ứng cây chuối tiêu

mới in vitro ngoài điều kiện tự nhiên

- Nội dung 5: Xây dựng vườn cây mẹ giống chuối tiêu mới làm nguồn vật liệu

3 Kết quả chính đạt được (khoa học, ứng dụng, đào tạo, kinh tế – xã hội,

v.v…)

3.1 Kết quả nghiên cứu

phút là hiệu quả nhất cho mục đích tạo vật liệu khởi đầu cây chuối tiêu

mới nuôi cấy mô

2 Môi trường MS có bổ sung saccharose 30g/l; inositol 100 mg/l; agar 6,8 g/l và BAP 4 mg/l; pH = 5,8 thích hợp cho mục đích tái sinh chồi chuối tiêu mới in vitro

3 Môi trường MS có bổ sung saccharose 30g/l; inositol 100 mg/l; agar 6,8 g/l; BAP 4 mg/l và IAA 0,3 mg/l; pH = 5,8 thích hợp cho nhân nhanh chồi chuối tiêu mới in vitro

4 Môi trường 1/2MS có bổ sung saccharose 30g/l; inositol 100 mg/l; agar 6,8 g/l và NAA 0,6 mg/l; pH= 5,8 thích hợp cho tạo cây hoàn chỉnh chồi chuối tiêu mới in vitro

5 Giá thể: đất phù sa + trấu hun (4:1) là giá thể thích hợp nhất cho cây chuối tiêu mới nuôi cấy mô sinh trưởng và phát triển ngoài vườn ươm

6 Đã xây dựng thành công vườn cây đầu dòng chuối tiêu mới 3.2 Kết quả khoa học

- 01 bài báo khoa học

SUMMARY

- Research Project Title: Technical study of selection a new

aromatic banana from imported source

- Code number: T2013 – 26UT

- Coordinator: Dao Duy Hung (MSC)

- Implementing Institution: Thai Nguyen University of Agriculture and Forestry

- Cooperating Institution(s):

- Duration: from 01/2013 to 12/2013

1 Objectives:

- The study Success propagation techniques by tissue culture

- Construction mom anewly imported banana plantations as a source

the most effective material for the purpose of starting a new plant tissue culture banana

2 Culture medium MS being suitable for bulb formation was basis medium (saccharose 30g/l; inositol 100 mg/l; agar 6,8 g/l; pH =5,8) added BAP (4 mg/l) is appropriate bud of anewly imported banana in vitro

3 Culture medium MS being suitable for bulb formation was basis medium (saccharose 30g/l; inositol 100 mg/l; agar 6,8 g/l; pH =5,8) added BAP (4mg/l) and IAA (0,3 mg/l) is appropriate breeding plant tissue culture banana in vitro

4 Culture medium 1/2MS added : 30g/l; inositol 100 mg/l; agar 6,8 g/l; pH= 5,8 and NAA 0,6 mg/l is appropriate for rooting shoots cultured banana

to complete in vitro

5 Growing medium: alluvial soil + rice husk smoked mixed rate( 4: 1)

is appropriate for growth of anewly imported banana in vitro in nursery

6 Has successfully built mother garden anewly imported bananas 3.2 Results science

- 01 article science

3.3 Results to apply

- 01 process plant propagation techniques anewly imported banana by tissue culture

- 2000 trees anewly imported banana by tissue culture

- Gardens mom anewly imported banana to source of material include

500 trees in Institute of Life Scienes

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu chung về cây chuối 3

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại cây chuối 3

1.1.1.1 Nguồn gốc 3

1.1.1.2 Phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật học 5

1.1.2.1 Rễ 5

1.1.2.2 Thân thật 5

1.1.2.3 Thân giả và lá 5

1.1.2.4 Hoa chuối 6

1.1.3 Giá trị dinh dưỡng 6

1.1.3.1 Bộ phận dùng và tiêu chuẩn chất lượng 10

1.1.3.2 Giá trị 11

1.2 Tình hình nghiên cứu về cây chuối 7

1.2.1 Tình hình nghiên cứu biện pháp kỹ thuật nhân giống chuối trên thế giới 7

1.2.2 Tình hình nghiên cứu biện pháp kỹ thuật nhân giống chuối ở Việt Nam 8

1.2 Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật 9

1.2.1 Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật 9

1.2.2 Tầm quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực vật 11

1.2.3 C ơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 12

1.2.4 Các yếu tôt ảnh hưởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật 13

1.2.4.1 Lựa chọn mẫu cấy 13

1.2.4.2 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy 14

1.2.4.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy 18

CHƯƠNG II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 20

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 20

2.1.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 20

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Nội dung nghiên cứu 20

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.2.1 Nội dung 1: Nghiên cứu kỹ thuật vào mẫu và tái sinh chồi giống chuối tiêu mới từ chồi sinh trưởng ngoài tự nhiên 21

2.2.2.2 Nội dung 2: Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh cụm chồi giống chuối tiêu mới 24

2.2.2.3 Nội dung 3: Nghiên cứu kỹ thuật ra rễ cho chồi nuôi cấy để tạo cây chuối hoàn chỉnh trong phòng thí nghiệm 26

2.2.2.4 Nội dung 4: Nghiên cứu kỹ thuật luyện cây, cấy cây ra bầu và chăm sóc cây trong vườn ươm trước khi xuất vườn 28

2.2.2.5 Nội dung 5: Xây dựng vườn cây đầu dòng giống chuối tiêu mới 29

2.2.3 Xử lý số liệu 29

2.2.4 Điều kiện thí nghiệm 29

2.2.4.1 Thí nghiệm in vitro 29

2.2.4.2 Thí nghiệm thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên 30

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Kết quả nghiên cứu vào mẫu và tái sinh chồi giống chuối tiêu mới từ chồi sinh trưởng ngoài tự nhiên 31

3.1.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của H 2 0 2 20% đến khả năng vô trùng mẫu 31

3.1.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của HgCl 2 0,1% đến khả năng vô trùng mẫu 32 3.1.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng BAP đến khả năng tái sinh chồi 33

3.1.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tái sinh chồi

34

3.2 Kết quả nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh cụm chồi giống chuối tiêu mới 35

3.2.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả nhân chồi 35

3.2.2 Kết quả nghiên cứu cứu ảnh hưởng kết hợp của BAP và IAA đến hiệu quả nhân chồi 36

3.2.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và IBA đến hiệu quả nhân chồi 37

3.3 Kết quả nghiên cứu kỹ thuật ra rễ cho chồi nuôi cấy để tạo cây chuối hoàn chỉnh trong phòng thí nghiệm 38

3.3.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến hiệu quả ra rễ chồi chuối tiêu mới 38

3.3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến hiệu quả ra rễ chồi chuối tiêu mới 39

3.4 Kết quả nghiên cứu kỹ thuật luyện cây, cấy cây ra bầu và chăm sóc cây trong vườn ươm trước khi xuất vườn 40

3.5 Kết quả xây dựng vườn cây đầu dòng giống chuối tiêu mới 41

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG BÁO CÁO

MỞ ĐẦU

Cây chuối có tên khoa học là Musa Paradisiaca L thuộc họ chuối (Musacae)[4], là cây ăn quả ngắn ngày, một loại quả bổ dưỡng và giá trị nên

có quy mô sản xuất lớn nhất nước ta Những năm gần đây, sản xuất chuối

có xu hướng tăng với tổng diện tích 105- 110 ngàn ha và tổng sản lượng hàng năm 1,4-1,6 triệu tấn Chuối còn là một trong số ít cây ăn quả có khả năng phát triển sản xuất thành những vùng tập trung quy mô 400-500 ha Tại Quyết định phê duyệt quy hoạch phát triển rau quả và hoa cây cảnh đến năm 2010, tầm nhìn 2020 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, chuối được xác định là loại cây ăn quả xuất khẩu chủ lực của nước

tương đương dứa đạt 100 ngàn tấn và kim ngạch xuất khẩu chỉ đứng sau dứa và thanh long đạt 35 triệu USD [1]

Theo các số liệu thống kê của Tổ chức Nông lương thế giới (2007) [37], sản lượng chuối trên thế giới năm 2007 khoảng 72,6 triệu tấn Trong

đó dẫn đầu là Ấn độ 21,7 triệu tấn, tiếp đến là Trung Quốc 8,0 triệu tấn, Philippin 7,5 triệu tấn, Equador 6,0 triệu tấn, Indonesia 5,5 triệu tấn v.v… Việt Nam xếp thứ 13 về sản lượng với gần 1,4 triệu tấn

Cây chuối cho giá trị xuất khẩu cao như vậy và với định hướng phát triển nông thôn của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, cây chuối cần được tập trung đầu tư nghiên cứu Trọng điểm vào giống chuối năng suất cao, chất lượng tốt cũng như đưa công nghệ vào sản xuất cây giống để chủ động nguồn giống chất lượng cao về cả chất lượng và số lượng

Trong năm 2010, với sự giúp đỡ của các cơ quan hữu quan, Bộ môn Công nghệ Tế bào – Viện Khoa học Sự sống đã tiếp nhận được một số chồi giống chuối tiêu nhập nội trong ống nghiệm ở điều kiện vô trùng Đây là vật liệu quan trọng để chúng tôi tiến hành nghiên cứu

Trong công tác sản xuất giống chuối hiện nay, phần lớn cây chuối giống được thu từ biện pháp tách chồi, một số ít là từ biện pháp nuôi cấy mô

tế bào Với phương pháp tách chồi, chỉ cung ứng được lượng giống ít, không đồng đều và nhanh bị thoái hóa về năng suất và chất lượng quả do cây mẹ đã

bị già cỗi và mang mầm bệnh Phương pháp nuôi cấy mô tế bào mang lại lượng giống lớn, khỏe mạnh, đồng đều và sạch bệnh Việc ứng dụng phương

pháp này trong nghiên cứu để nhân nhanh giống chuối tiêu mới sẽ góp phần nhanh chóng vào chương trình chọn tạo thành công giống chuối tiêu mới này

Từ lý do đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu kỹ thuật chọn tạo giống chuối tiêu mới từ nguồn nhập nội”

* Mục tiêu nghiên cứu

- Xây dựng thành công quy trình nhân giống cây chuối tiêu mới nhập nội bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nước

- Xây dựng được một vườn cây mẹ giống chuối tiêu mới làm nguồn vật liệu

* Ý nghĩa của đề tài:

- Ý nghĩa khoa học

+ Kết quả nghiên cứu đưa ra một số kỹ thuật vi nhân nhân giống cây chuối tiêu mới bằng phương pháp in vitro Từ đó, đánh giá được tác động của một

số chất điều tiết sinh trưởng trong nhân giống cây chuối tiêu mới

+ Bổ sung nguồn tài liệu tham khảo phục vụ nghiên cứu, giảng dạy và sản xuất giống chuối tiêu mới thương phẩm có năng suất cao

- Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu góp phần hoàn thiện quy trình kỹ thuật nhân giống cây chuối mới nhập nội nhằm cung cấp giống với số lượng lớn, chất lượng đảm bảo, đồng thời giữ được đặc tính di truyền của cây chọn lọc

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về cây chuối

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại cây chuối

1.1.1.1.Nguồn gốc

Theo Simmond NW and K.Shepherd (1955) [35], nguồn gốc của các giống chuối ăn được đều xuất phát từ 2 loài chuối dại có hạt trong chi

hợp trong điều kiện tự nhiên và qua nhiều đời giữa 2 loài này đã hình thành nên rất nhiều nhóm giống chuối Trong đó nhóm phụ Cavendish mang kiểu gen AAA với rất nhiều giống chuối thương mại đã và đang được trồng trọt rộng rãi ở rất nhiềuquốc gia và vùng lãnh thổ Các nghiên cứu về chọn tạo giống và phát triển sản xuất chuối chủ yếu được thực hiện đối với nhóm phụ này

Cho đến nay, vẫn còn có ý kiến trái ngược nhau về nguồn gốc của cây chuối Tuy nhiên, theo Stover, R.H and N.W.Simmonds (1987) [36] và R.V.Valmayor., R.R.C Espino and O.C Pascua (2002) [34], nguồn gốc phát sinh của cây chuối là một vùng rộng lớn bao gồm Ấn độ, các nước vùng đông Nam châu Á và khu vực Thái Bình Dương Ngày nay, cây chuối đã được phát triển ở hầu khắp các vùng nhiệt đới ẩm trên thế giới Người ta đã tìm thấy sự đa dạng về nguồn gen cây chuối không chỉ ở nơi phát sinh nguồn gốc mà còn ở khu vực Nam Mỹ, đông và Tây Phi Giáo sư E.E Cheesman[23, 24] và học trò của ông là Simmonds

và Shepherd [35]cho rằng: các nòi chuối ăn được có nguồn gốc từ hai loài

hoang dại, có hạt là Musa acuminata Colla và Musa balbisiana Colla Trải

qua nhiều quá trình biến đổi, chúng đã trở thành loài không hạt, ăn được

1.1.1.2 Phân loại

Theo Simmond NW and K.Shepherd (1955) [35], cây chuối nằm

trong họ Musaceae là một trong 8 họ trong bộ gừng Zingiberales hay còn có tên gọi khác là Csitaminales Trong bộ gừng, Musaceae là họ nguyên

thủy nhất Chúng gồm những cây thân thảo lớn có rễ, sống lâu năm, lá mọc xoắn ốc có bẹ lá ôm lấy nhau tạo thành thân giả, phiến lá rất lớn Cụm

hoa mọc theo kiểu hoa tự bông vô hạn được hình thành ở ngọn từ thân khí sinh Trục mang hoa và thân thật được mọc lên từ củ dưới lòng đất Lá bắc lớn, bên trong chứa từ 1-3 hàng hoa Những hoa ở gốc của cụm hoa là hoa cái, hoa ở giữa là hoa lưỡng tính, hoa trên cùng là hoa đực Bao hoa gồm 2 hoặc 3 vòng nhưng tạo thành 2 cánh, cánh ngoài cùng được tạo bởi

3 đài đính liền với 2 cánh hoa và thường có màu vàng ươm hay màu vàng nhạt, cánh hoa trong nằm đối diện với mảnh ngoài thường ngắn, màu trong suốt và được hai mép của cánh ngoài bao phủ Có 5 nhị, bộ nhụy, lá noãn hợp bầu dưới, quả mọng, chứa nhiều hạt tuy nhiên ở loài chuối trồng hạt thui đi rất sớm

Họ Musaceae có 2 chi Ensete và Musa Hai chi này rất giống nhau ở

bộ lá và dạng cây, song lại có một số đặc điểm khác nhau Chi Ensete là

loại cây thân thảo, chỉ sinh sản một lần, thân ngầm không bao giờ đẻ nhánh,

hoa và lá bắc dính liền nhau và vào cuống buồng Trong khi đó, chi Musa

có 4 chi phụ là Austrilimusa, Callimusa, Eumusa và Rohdochilamy Trong

đó 2 phân chi Austrilimusa, Callimusa có số lượng nhiễm sắc thể cơ sở là

10, còn 2 phân chi Eumusa, Rohdochilamy có số lượng nhiễm sắc thể cơ sở

là 11

và phong phú nhất về nòi mà còn vì giá trị kinh tế của nó đặc biệt trong

lĩnh vực ăn tuơi và làm lương thực Buồng quả của chi Eumusa ít nhiều cụp

xuống, có thể ngang hoặc hơi ngang, hay buồng thõng xuống Buồng chuối

có nhiều nải, mỗi nải có số quả nhiều ít khác nhau nhưng đều xếp thành

hai hàng Trong Eumusa có các nòi chuối dại và nòi chuối ăn được Các

nòi chuối dại có thể không hoặc ít khi có ích nhưng lại có giá trị trong lĩnh vực nghiên cứu về phân loại Các nòi chuối ăn được theo E.E Cheesman và học trò của ông là Simmonds và Shepherd cho rằng chúng

có nguồn gốc từ hai loài quan trọng nhất là M acuminata Colla và M

Á từ các đảo Samoa ở nam Ấn độ qua các đảo lớn của Indonesia, bán đảo đông Dương và Malaysia Chúng rất đa dạng về hình dạng và ổn định về di truyền, bởi vậy cho đến nay trên thế giới chưa có một thống kê chính xác

nào về các dòng, chúng có thể khác nhau về lớp sáp ở bẹ lá, màu sắc thân giả, góc tạo bởi buồng và thân, độ dài của buồng, hình dạng của quả

sáng, mập mạp, có rất nhiều ở Ấn độ, Miến điện, Philippines đặc điểm

của Musa balbisiana là buồng thõng đứng, quả mập ngắn, ít cong và ít

số lượng về chủng loại Ngoài ra, người ta còn tìm ở Guinea có hai loài

mới không xếp được vào chi nào đó là Musa ingcusimm có số nhiễm sắc thể cơ sở là 7 và Musa baccriisinm có số nhiễm sắc thể cơ sở là 9.

1.1.2.2 Thân thật

Thân thật hay còn được gọi là củ chuối, có hình tròn dẹt và ngăn, khi phát triển đầy đủ có thể rộng 30cm Phần bên ngoài xung quanh củ chuối được bao phủ bởi những vết sẹo từ bẹ lá có dạng tròn Ở đáy mỗi bẹ lá đều có một chồi mầm nhưng chỉ các chồi ở phần giữa củ là phát triển được, có khuynh hướng mọc trồi dần lên Các sẹo lá mọc rất gần nhau làm thành khoảng cách rất ngắn Củ chuối sống lâu năm, là cơ quan chủ yếu dự trữ chất dinh dưỡng, đồng thời là nơi để rễ, lá, mầm và cuống hoa mọc ra Do đó củ chuối to mập là cơ sở đảm bảo cho cây sinh trưởng nhanh, năng suất cao Xung quanh củ chuối có nhiều mầm ngủ, sau này sẽ phát triển thành cây con [15]

khi mầm hoa phân hóa thì mọc ra một lá chót nhỏ, ngắn có tác dụng che chở buồng chuối

Lá chuối phát triển mạnh nhất từ tháng 5 đến tháng 8, mỗi tháng mọc ra

3 - 4 lá, phiến lá to, dày, màu xanh đậm và bóng Từ tháng 10 trở đi, cách 2 -

3 tuần mới ra 1 lá mới, lá thường mỏng, nhỏ, màu xanh nhạt, sinh trưởng chậm Đến tháng 12 - 1 mỗi tháng chỉ mọc được 1 lá [15]

1.1.2.4 Hoa chuối

Cây chuối con sau khi mọc (hoặc sau khi trồng) 8 - 10 tháng bắt đầu hình thành mầm hoa, sau đó khoảng 1 tháng bắt đầu trổ buồng Hoa chuối thuộc loại hoa chùm gồm 3 loại: hoa cái, hoa lưỡng tính và hoa đực [15]

cm) Loại hoa này nở ra trước tiên, nhị cái phát triển, nhị đực thoái hóa Chỉ

có hoa cái là phát triển thành trái được Do đó, khi trồng, chọn lọc cây giống tốt, chăm bón kịp thời để hình thành nhiều hoa cái là nhân tố quan trọng bảo đảm năng suất cao [15]

Hoa lưỡng tính: nằm ở phần giữa bắp chuối, loại hoa này không nhiều

lắm, về sau sẽ rụng và không hình thành trái được [15]

Hoa đực: nằm ở phía đầu bắp chuối, nhị cái thoái hóa, nhị đực phát

triển, dài bằng nhị cái Loại hoa đực không thể hình thành trái được sau này sẽ khô đi và rụng dần [15]

1.1.3 Giá trị dinh dưỡng

Chuối là một trong 5 loại quả trao đổi chủ yếu trên thị trường thế giới, bên cạnh giá trị là loại quả cho khối lượng sản phẩm lớn, chuối còn có hàm lượng dinh dưỡng khá cao, tại một số nước Châu Á, Châu Phi, chuối là lương thực, thực phẩm chủ yếu, được sử dụng như khoai tây ở các nước có khí hậu

ôn đới [14]

Thành phần hoá học chủ yếu có chứa protein, tinh bột, chất béo, các loại đường, canxi, phốt-pho, kali, kẽm, vitamin A, C, E, chất gôm, vitamin B11, cụ thể là: Trong 100g phần ăn được, có bột đường (27,7g), chất đạm (1,1g), nước (74,1g), sinh tố C (9mg), B1 (0,03mg), B2 (0,04mg), Caroten (359 Unit), Canxi (11mg), Magiê (42mg), Kali (279mg), Sắt (0,56mg), 8,6% Fructos, 4,7% Glucos, 13,7% Sacaros Đặc biệt trong chuối có nhiều Pectin,

là 1 Glucid không có giá trị về mặt năng lượng nhưng là chất gíup cho sự tiêu

hóa hấp thu tốt, chống nhiễm trùng đường ruột Chuối cung cấp nhiều năng lượng nhất (trên dưới 100 Calori/100g nạc chuối chín tươi) vì chuối chứa nhiều bột đường nhất [10]

Theo y học cổ truyền và hiện đại thì sản phẩm quả chuối là một loại thực phẩm,và là một dược liệu có khả năng trị được một số bệnh tật như bệnh huyết áp, bệnh dạ dày, bệnh đường ruột [10]

1.1.4 Tình hình nghiên cứu về cây chuối

1.1.4.1 Tình hình nghiên cứu biện pháp kỹ thuật nhân giống chuối trên thế giới

Chuối là đối tượng cây ăn quả có hình thức sinh sản vô tính với phương thức nhân giống truyền thống sử dụng chồi nách làm giống trồng các thế hệ kế tiếp Việc sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào để nhân giống chuối đã được nghiên cứu, ứng dụng từ rất lâu tại nhiều nước

trên thế giới Theo Agustin B.Molina (2002) [21], kỹ thuật nuôi cấy in

một thời gian ngắn

truyền qua nguồn đất, tiết kiệm được hoá chất xử lý đất trồng

98%, sinh trưởng nhanh hơn chồi nách nên thời gian từ trồng đến thu hoạch ngắn

đồng loạt và có thể điều khiển thời gian thu hoạch

dễ nhân giống và vận chuyển

Theo Hwang SC và Chao CP (2010) [29], tại Viện nghiên cứu chuối đài Loan đã ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô chuối trên quy mô lớn

để sản xuất cây thương mại từ năm 1983 Sau 10 năm đã có khoảng 15

triệu cây được sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy in vitro cung cấp

cho sản xuất Cũng nhờ ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô, một lượng rất lớn cây giống sạch các bệnh nguy hiểm như BBTV (Banana Bunchy Top

Virus), Fusarium wilt, Black Sigatoka đã được nhân nhanh, góp phần khôi phục nhiều vùng trồng chuối có nguy cơ tàn lụi ở Australia

1.4.1.2 Tình hình nghiên cứu biện pháp kỹ thuật nhân giống chuối ở Việt Nam

Các nghiên cứu về nhân giống chuối trước đây chỉ chú trọng các biện pháp kỹ thuật nhân bằng củ và tách chồi Những kỹ thuật này hiện còn được áp dụng khá phổ biến ở nhiều vùng miền và nhất là ở quy mô sản xuất nhỏ

Quy trình nhân giống chuối in vitro đầu tiên ở nước ta do tác giả

Trần Văn Minh và Nguyễn Văn Uyển (1993) [9] đề xuất, bao gồm 6 công đoạn chính sau: đưa mẫu vào nuôi cấy; tạo và nhân nhanh chồi chuối; tạo

rễ cây; ươm chuối trong vườn ươm; bầu chuối và trồng ra ruộng sản xuất Theo kết quả nghiên cứu của Lê Vũ Ngọc Hoa, Nguyễn Thị Diệu Hiền, Bùi Thị Ngọc Lan, Nguyễn Thanh Bình và Lê Thị Thu Hồng (2005) [7] thì trong môi trường nuôi cấy MS có bổ sung Thianin 0,4 mg/l, BAP 4 mg/l và IAA 0,5 mg/l số chồi tái sinh đạt 1,31 chồi/cây Môi trường nhân chồi tốt nhất đạt hệ số nhân 6,78 là MS có bổ sung Thianin 0,4 mg/l, BAP

5 mg/l, Adenin 80 mg/l và IAA 0,5 mg/l Môi trường vươn chồi, tạo rễ

là MS có bổ sung Thianin 0,4 mg/l, BAP 2 mg/l, AC 0,10-0,15% Trong môi trường này, tỷ lệ ra rễ 90,00-95,56% sau cấy 7 ngày và tỷ lệ chồi >5

cm đạt đến 81,95-84,42% Nghiên cứu trên giống chuối chà bột, các tác giả

Tô Việt Diễm Ca, Mai Văn Trị, Nguyễn Thị Xuân Hạnh, Nguyễn Thanh Bình và Bùi Xuân Khôi (2006) [3] cũng thu được kết quả tương tự

Theo Trịnh Thị Nhất Chung (2010) [5], sản xuất cây chuối thương phẩm sạch bệnh gồm 4 bước: 1 Tái sinh chồi; 2 Nhân cụm chồi;

3 Tái sinh cây hoàn chỉnh; 4 Ra ngôi cây trong nhà lưới Thời gian cần cho 3 giai đoạn đầu (1,2,3) là 5-6 tháng, giai đoạn 4 cần 2 tháng, tổng cộng là 8 tháng; đó là khoảng thời gian nhà vườn trồng chuối thương phẩm dự tính trong kế hoạch đặt nhà sản xuất giống chuối sạch bệnh cho mình

1.2 Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.2.1 Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật

Năm 1838, hai nhà sinh vật học Đức Schleiden và Schwann đã đề xướng thuyết tế bào và nêu rõ : “Mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm nhiều đơn vị nhỏ, các tế bào hợp thành Các tế bào phân hoá đều mang các thông tin

di truyền có trong tế bào đầu tiên, đó là trứng sau khi thụ tinh, và là những đơn vị độc lập, từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể” [17]

Năm 1902, Harberland là người đầu tiên đã quan niệm rằng bất kì một

tế bào nào của cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Ông đã cho rằng “Bằng nuôi cấy tế bào đã phân lập, người ta có thể tạo ra các phôi nhân tạo từ các tế bào sinh dưỡng” Ông cũng đã tiến hành nuôi cấy mẫu lá của một số cây một lá mầm như:

Năm 1922, Kotte, học trò của Harberland và Robbins, người Mỹ, lặp lại thực nghiệm của Haberland với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ một cây hoà thảo Trong môi trường lỏng gồm có muối khoáng và glucose, đầu rễ sinh trưởng khá mạnh, tạo nên một hệ rễ nhỏ mang cả rễ phụ Tuy nhiên, sự sinh trưởng như vậy chỉ tồn tại trong một thời gian sau đó chậm dần và dừng lại,

Năm 1934, được xem là giai đoạn thứ hai của nuôi cấy mô và tế bào thực vật khi White thành công trong việc duy trì mô rễ cây cà chua trong môi trường lỏng có chứa muối khoáng, đường saccarozơ và dịch chiết nấm men Qua thí nghiệm, ông thấy rằng có thể thay dịch chiết nấm men bằng các vitamin nhóm B (B1, B3, B6) [31]

Năm 1939, độc lập với Nobercourt, Gautheret cũng đã duy trì được sinh trưởng của mô sẹo cà rốt trong một thời gian dài Năm 1941, Van Overbeek và cộng sự đã phát hiện thấy nước dừa có ảnh hưởng tích cực đến

nhiều chất điều hoà sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin như NAA, 2,4-D

đã được tổng hợp Nhiều tác giả xác nhận cùng với nước dừa, 2,4-D và NAA

đã giúp tạo mô sẹo thông qua phân chia tế bào ở nhiều đối tượng thực vật mà trước đó rất khó nuôi cấy [18]

Năm 1954, Skoog bổ sung chế phẩm ADN chiết từ tinh dịch cá bẹ vào môi trường nuôi cấy mô thân cây thuốc lá Ông nhận thấy chế phẩm này có

và cộng sự đã xác nhận chất gây ra hiện tượng trên là 6-furfuryl amino purine

và đặt tên là kinetin Sau đó người ta đã tìm ra và tổng hợp một số chất có tác dụng kích thích phân bào tương tự như kinetin và cùng với kinetin gọi chung

là nhóm cytokinin Cytokinin được tách chiết từ thực vật bậc cao đầu tiên là zeatin có trong mầm ngô Các hợp chất này có khả năng kích thích sự phân chia tế bào của các mô đã biệt hoá cao như tế bào thịt lá hoặc nội nhũ của hạt

Trong khoảng thời gian từ 1954 - 1959, kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn được phát triển và hoàn thiện dần Năm 1956, Nickell đã duy trì được sự sinh trưởng liên tục huyền phù cây đậu trắng Melcher và Beckman đã nuôi các tế bào đơn trong các bình dung tích lớn có xục khí và bổ sung chất dinh dưỡng định kỳ

Nhờ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, Morel (1960) đã tạo ra được các protocorm từ địa lan Khi để trong các điều kiện nhất định, các protocorm có thể phát triển thành cây lan con và hoàn toàn sạch bệnh Cùng năm đó, Cocking ở trường đại học tổng hợp Nottingham đã thu được các tế bào trần (protoplast) dùng cho nuôi cấy từ mô thực vật được xử lý với enzym xenlulaza Năm 1966, Guha và cộng sự đã tạo được cây đơn bội từ nuôi cấy túi phấn của cây cà độc dược (Datura inoxia) Việc tạo cây đơn bội thành công ở nhiều loài thực vật thông qua nuôi cấy bao phấn và hạt phấn đã đóng

Từ những năm 1970 trở đi, các nhà khoa học đã chú ý vào triển vọng của kỹ thuật nuôi cấy protoplast, khi hai tác giả người Nhật Bản là Nagata và Takebe đã thành công trong việc làm cho protoplast thuốc lá tái tạo được xenlulozơ Năm 1978, Melchers và cộng sự đã lai tạo thành công protoplast của cà chua với protoplast của khoai tây, mở ra một triển vọng mới trong lai

Ngày nay, nuôi cấy mô tế bào thực vật được ứng dụng rộng rãi trong nhân giống nhiều loại thực vật, chọn dòng chống chịu, lai xa, chuyển gen vào cây trồng

1.2.2 Tầm quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực vật

Trong nhiều thập kỉ qua, nuôi cấy mô tế bào thực vật đã phát triển mạnh

mẽ ở nhiều quốc gia trên thế giới Có thể nói đây là một công cụ cần thiết trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành sinh học

Nhờ áp dụng các kĩ thuật nuôi cấy mô như: nuôi cấy mô phân sinh, callus, nuôi cấy phôi, nuôi cấy rễ tơ, nuôi cấy tế bào trần… con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn, gấp nhiều lần tốc độ vốn có trong tự nhiên Điều này sẽ góp phần tạo ra hàng loạt các cá thể mới giữ nguyên các tính trạng di truyền của cơ thể mẹ và rút ngắn thời gian để đưa một giống mới và sản xuất với quy mô lớn [9], [18]

Ngoài ra, dựa vào kĩ thuật nuôi cấy, có thể duy trì và bảo quản được nhiều giống cây trồng quý hiếm, hoặc loại bỏ các mầm bệnh của những loài thực vật sinh sản sinh dưỡng Sử dụng kĩ thuật nuôi cấy và dung hợp tế bào trần có thể tạo ra những con lai về mặt di truyền mà phương pháp lai giống cổ điển không thực hiện được Bên cạnh đó, các nhà nghiên cứu đã thu nhận các chất trao đổi thứ cấp từ tế bào nuôi cấy, dẫn đến sự ổn định và ñộc lập hơn, ít lệ thuộc vào sản xuất của thực vật ngoài tự nhiên "

mở ra triển vọng sử dụng kĩ thuật này ñể nuôi cấy sinh khối lớn có khả năng tổng hợp những chất sinh học để thu nhận các hợp chất trên quy mô công nghiệp " [8]

Ưu điểm của nuôi cấy mô tế bào thực vật trong điều kiện in vitro để

sản xuất các hợp chất thứ cấp:

+ Các tế bào thực vật có thể được nuôi cấy trong điều kiện nhân tạo

mà không phụ thuộc vào thời tiết và địa lý Không cần thiết để vận chuyển và bảo quản một số lượng lớn các nguyên liệu thô

+ Có thể kiểm soát chất lượng và hiệu suất sản phẩm bằng cách loại bỏ những trở ngại trong quá trình sản xuất thực vật, như là chất lượng của nguyên liệu thô, sự đồng nhất giữa các lô sản xuất và sự hư hỏng trong quá trình vận chuyển và bảo quản

+ Một số sản phẩm trao đổi chất được sản xuất từ nuôi cấy dịch huyền phù có chất lượng cao hơn trong cây hoàn chỉnh [9]

+ Phương pháp nhân giống in vitro đã bổ sung cho các kỹ thuật nhân giống vô tính cổ điển như dâm cành, dâm chồi, chiết, ghép, tách dòng… một

kỹ thuật tiến bộ với những ưu thế như tính khả thi rộng, tốc độ nhân giống cực kỳ cao và có tiềm năng công nghiệp hóa [2]

Một ý nghĩa không kém phần quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực vật là mở ra những hướng mới trong nghiên cứu sinh lý và di truyền thực vật như: cơ chế tổng hợp các chất, sinh lý phân tử, di truyền – đột biến, sinh lý dinh dưỡng ở các tế bà thực vật và nhiều vấn đề sinh học khác…[18]

1.2.3 Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

* Tính toàn năng (Totipotence ) của tế bào

Năm 1902, Nhà Sinh lý thực vật học người Đức Haberlandt, đã tiến hành nuôi cấy các tế bào thực vật để chứng minh tế bào là toàn năng

Haberlandt cho rằng mỗi tế bào của bất kỳ sinh vật nào cũng đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Ông nhận thấy, mỗi tế bào của cơ thể đa bào đều phát sinh từ hợp bào thông qua quá trình phân bào nguyên nhiễm Điều đó có nghĩa là mỗi tế bào của một sinh vật sẽ chứa toàn bộ thông tin di truyền cần thiết của một cơ thể hoàn chỉnh Khi gặp điều kiện thuận lợi nhất định, những tế bào đó có thể sẽ phát triển thành một

cơ thể hoàn chỉnh

Năm 1953, Miller và Skoog (Notingham Unio) đã thành công khi thực nghiệm tái sinh cây con từ tế bào lá, chứng minh được tính toàn năng của tế bào Thành công trên đã tạo ra công nghệ sinh học ứng dụng trong nhân giống vô tính, tạo giống cây trồng và dòng chống chịu [19]

Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật Cho đến nay, con người đã hoàn toàn chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh

từ một tế bào riêng rẽ

* Sự phân hoá và phản phân hoá tế bào

Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào của mô chuyển hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể Ví dụ:

Mô dậu làm nhiệm vụ quang hợp, mô bì làm nhiệm vụ bảo vệ, nhu mô làm nhiệm vụ dự trữ, mô dẫn làm nhiệm vụ vận chuyển nước và chất dinh dưỡng

Quá trình phân hoá tế bào được biểu diễn ở sơ đồ sau:

Sơ đồ 1: Quá trình phân hóa tế bào

Mặc dù các tế bào đã chuyển hoá thành các mô chức năng nhưng chúng vẫn không mất đi khả năng phân chia của mình Trong điều kiện thích hợp, các tế bào lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ Quá trình đó được gọi là phản phân hoá tế bào (ngược lại với quá trình phân hoá tế bào) Sơ đồ hoá như sau:

Sơ đồ 2: Quá trình phản phân hóa tế bào

Về bản chất sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình hoạt hoá, phân hoá gen Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hoá (mà trước đây bị ức chế) để cho biểu hiện trạng thái mới, một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hoá trong cấu trúc phân tử ADN của mỗi tế bào Mặt khác, khi tế bào nằm trong khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các

tế bào xung quanh Khi tách riêng tế bào tạo điều kiện thuận lợi cho các gen được

1.2.4 Các yếu tôt ảnh hưởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.2.4.1 Lựa chọn mẫu cấy

Việc lựa chọn mẫu nuôi cấy có ý nghĩa rất lớn đến sự sinh trưởng, phát triển của mẫu trong suốt quá trình nuôi cấy Nên việc lựa chọn mẫu cấy cần phải thực hiện một cách thận trọng để có kết quả nuôi cấy tốt nhất

Tuy mang cùng một lượng thông tin di truyền như nhau nhưng các cấu trúc mô khác nhau trên một cây có thể cho các kết quả phát sinh hình thái khác nhau Mẫu non trẻ có sự phản ứng với các điều kiện và môi trường nuôi cấy nhanh, dễ tái sinh, đặc biệt trong nuôi cấy mô sẹo, phôi Ngoài ra mô non

Tế bào phôi sinh Tế bào giãn Tế bào chuyên hoá

Phản phân hoá tế bào Phân hoá tế bào

trẻ mới được hình thành, sinh trưởng mạnh, mức độ nhiễm mầm bệnh ít hơn [19]

Các mảnh nuôi cấy càng nhỏ thì tỷ lệ sống càng thấp và các mô có nguồn gốc từ chồi đỉnh có khả năng sinh trưởng tốt hơn các mô có nguồn gốc

1.2.4.2 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy mô tế bào có thành phần thay đổi tuỳ theo loài thực vật, loại tế bào, mô và cơ quan được nuôi cấy Đối với cùng một loại mô,

cơ quan nhưng mục đích nuôi cây không giống nhau, môi trường sử dụng cũng khác nhau khá cơ bản Môi trường nuôi cấy còn thay đổi theo giai đoạn

Môi trường dinh dưỡng có đầy đủ các chất dinh dưỡng, các chất cần thiết cho

sự phân chia, phân hoá tế bào cũng như sự sinh trưởng bình thường của cây Thành phần hóa học của môi trường đóng vai trò quyết định đến sự thành công hay thất bại của nuôi cấy tế bào và mô thực vật Mỗi một loại vật liệu khác nhau có những đòi hỏi khác nhau về thành phần môi trường, khi bắt đầu nghiên cứu một số loài mới hoặc giống mới cần phải chọn lựa cho đối tượng nghiên cứu một loại môi trường cơ bản phù hợp

Từ những năm 1933, Tukey đã nghiên cứu tạo ra môi trường nuôi cấy thực vật, cho đến nay đã có rất nhiều loại môi trường khác nhau được sử dụng cho mục đích này, trong đó có một số môi trường cơ bản được sử dụng rất phổ biến như MS, LS, WP Ví dụ, môi trường MS (Murashige&Skoog, 1962)

là môi trường được sử dụng rộng rãi nhất trong nuôi cấy mô của tế bào thực vật, môi trường MS thích hợp cho cả thực vật 1 lá mầm, 2 lá mầm Hay môi trường Gramborg (1965) còn gọi là B5 dùng thử nghiệm trên đậu tương, được sử dụng trong tách và nuôi tế bào trần

Tuy có rất nhiều loại môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật nhưng đều gồm một số thành phần cơ bản sau [2]:

+ Các muối khoáng đa lượng và vi lượng

+ Nguồn cacbon

+ Các vitamin và aminoacid

+ Chất bổ sung, chất làm thay đổi trạng thái môi trường

+ Các chất điều hòa sinh trưởng

* Các muối khoáng đa lượng và vi lượng

Đối với cây trồng, các chất khoáng đa và vi lượng đóng vai trò rất quan trọng Ví dụ, magiê là một phần của phân tử diệp lục, canxi cấu tạo màng tế bào, nitơ là thành phần quan trọng của vitamin, amino axit và protein Ngoài

ra, các nguyên tố vi lượng như Fe, Zn, Mo, Mn là thành phần của một số enzim cần thiết cho hoạt động sống của tế bào

Muối khoáng là thành phần không thể thiếu trong các môi trường nuôi cấy tế bào thực vật, làm vật liệu cho sự tổng hợp các chất hữu cơ, enzym Các ion của các muối hòa tan giúp ổn định áp suất thẩm thấu của môi trường trong tế bào, duy trì điện thế hóa của thực vật Ví dụ: K, Ca rất quan trọng trong điều hòa tính thấm lọc của tế bào

- Các nguyên tố khoáng đa lượng:

Bao gồm các nguyên tố khoáng được sử dụng ở nồng độ trên 30 ppm, tức là trên 30mg/l Những nguyên tố đó là: N, S, P, K, Mg và Ca Riêng Na và

Cl cũng được sử dụng trong một vài môi trường, nhưng chưa rõ vai trò của chúng

hợp với nhau Hầu hết các thực vật đều có khả năng khử nitrat thành ammonium thông qua hệ thống nitrat reductase (NR) Ammonium được tế bào thực vật đồng hóa trực tiếp để sinh tổng hợp nên các chất đạm hữu cơ như amino acid Điều đáng lưu ý là nếu chỉ dùng ammonium (không có nitrat) thì sinh trưởng của tế bào giảm, thậm chí ngừng hoàn toàn Nguyên nhân chính

là do quá trình trao đổi ion của tế bào xảy ra lệch dẫn đến tình trạng thay đổi

độ pH của môi trường Vì vậy, hầu hết các loại môi trường đều dùng nitrat và ammonium dạng phối hợp, nhưng tùy theo đặc tính hấp thu nitow của loài cây

đó mà phối hợp theo tỷ lệ thích hợp

+ Phospho (P): Mô và tế bào thực vật nuôi cấy có nhu cầu về phospho rất cao Phospho là một trong những thành phần cấu trúc của phân tử acid

một hệ thống đệm (buffer) làm ổn định pH của môi trường trong quá trình nuôi cấy

- Các nguyên tố vi lượng:

Là những nguyên tố được sử dụng ở nông độ thấp hơn 30 ppm Đó là

Fe, B, Mn, I, Mo, Cu, Zn, Ni, Co

+ Sắt (Fe): Thiếu sắt, tế bào mất khả năng phân chia Fe thường tạo phức hợp với các thành phần khác và khi pH môi trường thay đổi, phức hợp này thường mất khả năng giải phóng Fe cho các nhu cầu trao đổi chất trong tế bào Tốt nhất là nên sử dụng Fe ở dạng phức chelat với citrat hoặc với ETDA (Ethylen Diamin Tetraacetic Acid) Từ các phức chất này Fe được giải phóng

ra trong một phạm vi pH khá rộng

+ Mangan (Mn): Thiếu Mn cũng làm cho hàm lượng các amino acid tự

do và DNA tăng lên, nhưng lượng RNA và sinh tổng hợp protein giảm dẫn đến kém phân bào

+ Bo (B): Thiếu B trong môi trường gây lên biểu hiện như thừa auxin vì thực chất B làm cho các chất ức chế auxin oxydase trong tế bào giảm Mô nuôi cấy có biểu hiện mô sẹo hóa mạnh, nhưng thường là mô sẹo xốp, mọng nước, kém tái sinh [2]

* Nguồn cacbon

Đường là thành phần dinh dưỡng quan trọng không thể thiếu trong bất

kỳ môi trường dinh dưỡng nào Nó được sử dụng làm nguồn cacbon cung cấp năng lượng trong nuôi cấy, đồng thời đóng vai trò duy trì áp suất thẩm thấu

Loại đường được sử dụng phổ biến là saccarozơ với hàm lượng từ 6% (W/v) Những loại đường khác như: fructozơ, glucozơ, maltozơ, rafinozơ chỉ dùng trong những trường hợp cá biệt Trong nuôi cấy chồi cây dâu tằm (mulberry bud), môi trường có fructozơ cho kết quả tốt hơn những loại

* Các vitamin và axit amin

Ảnh hưởng của các vitamin đến sự phát triển của tế bào nuôi cấy in vitro ở các loài khác nhau là khác nhau

Hầu hết tế bào nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các loại vitamin cơ bản nhưng với số lượng dưới mức yêu cầu Để mô có thể sinh trưởng, tốt nhất phải bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin

và amino axít Trong các loại vitamin, B1 được xem là vitamin quan trọng

nhất cho sự phát triển của thực vật Axit nicotinic (B3) và pyridoxune (B6) cũng có thể được bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm tăng cường sức sống cho mô

* Các chất bổ sung

Nước dừa: Công bố đầu tiên về sử dụng nước dừa trong nuôi cấy mô

thuộc về Van Overbeek và cộng sự (Van Overbeek cs, 1944) [32] Sau đó, tác dụng tích cực của nước dừa trong môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật đã được nhiều tác giả ghi nhận Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và chất kích thích sinh trưởng (George, 1993) [27] Nước dừa đã được sử dụng để kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều loại cây Nước dừa thường được lấy từ quả dừa để sử dụng tươi hoặc sau bảo quản Thông thường nước dừa thường được xử lý để loại trừ các protein, sau đó được lọc qua màng lọc để khử trùng trước khi bảo quản lạnh Tồn dư của protein trong nước dừa không gây ảnh hưởng đến sinh trưởng của

mô hoặc tế bào nuôi cấy, nhưng sẽ dẫn đến kết tủa dung dịch khi bảo quản lạnh Chất cặn có thể được lọc hoặc để lắng dưới bình rồi gạn bỏ phần cặn Nước dừa thường sử dụng với nồng độ 5 - 20% thể tích môi trường, kích

thích phân hóa và nhân nhanh chồi

Dịch chiết nấm men: Có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát

triển của mô và tế bào Dịch chiết nấm men là chế phẩm thường dùng trong nuôi cấy vi sinh vật, mô tế bào động vật với nồng độ thích hợp

Ngoài ra, có thể sử dụng dịch thủy phân casein hydrolyase (0,1 - 1%) hoặc bột chuối với hàm lượng 40g bột khô trong 100g/l (xanh) nhằm tăng cường sự phát triển của mô sẹo hay cơ quan nuôi cấy

làm rắn hoá môi trường Nồng độ agar sử dụng thường là 0,6 - 1%, đây là loại tinh bột đặc chế từ rong biển để tránh hiện tượng mô chìm trong môi trường

* Các chất điều tiết sinh trưởng

Các chất điều hoà sinh trưởng không thể thiếu trong các quá trình nuôi

cấy mô thực vật là các chất thuộc hai nhóm auxin và cytokinin

Auxin có tác dụng sinh lý rất nhiều mặt lên các quá trình sinh trưởng của tế bào, hoạt động của tầng phát sinh, sự hình thành rễ, hiện tượng ưu thế

ngọn [19] Các chất thuộc nhóm auxin thường được sử dụng là: NAA, IAA và 2,4D Trong đó, IAA có tác dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào và điều khiển sự hình thành rễ NAA có tác dụng làm tăng hô hấp của tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tính enzym và ảnh hưởng mạnh đến trao đổi

sự phát triển của rễ Mặt khác, một số loài như đậu, cà chua, có khả năng tạo rễ trong môi trường không có auxin Còn 2,4D được sử dụng có hiệu quả với mục đích tạo mô sẹo ở thực vật và không dùng trong môi trường tái sinh

cơ quan [18],[28]

Cytokinin là chất điều hoà sinh trưởng có tác dụng làm tăng sự phân chia tế bào, biệt hoá chồi và có tác dụng rõ rệt đối với sự phát triển chồi từ mô sẹo nuôi cấy Các cytokinin thường gặp là kinetin và BAP, cả hai đều có tác dụng kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và làm hạn chế sự hoá già của tế bào Ngoài ra các chất này có tác dụng lên quá trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp ADN, tổng hợp protein và làm

Tác động phối hợp của auxin và cytokinin có tác dụng quyết định đến

sự phát triển và phát sinh hình thái của tế bào và mô Những nghiên cứu của Skoog cho thấy, tỷ lệ auxin/cytokinin cao thì thích hợp cho hình thành rễ, thấp sẽ kích thích quá trình phát sinh chồi và ở mức cân bằng thì thuận lợi cho

Ngoài auxin và cytokinin, trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật người ta còn sử dụng các chất điều hoà sinh trưởng khác như : gibberillin (thông dụng

cường quá trình vươn thân chồi và tạo cây hoàn chỉnh ở một số loài thực vật ABA chỉ được sử dụng trong nuôi cấy nhằm kìm hãm sự sinh trưởng của chồi, tham gia bảo quản lương thực và quỹ gen in vitro [19]

1.2.4.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy

Điều kiện nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển và sinh trưởng của mô nuôi cấy

- Nhiệt độ

Mô nuôi cấy phát triển tốt nhất ở điều kiện nhiệt độ thích hợp với nó nhưng phải được duy trì một cách ổn định.Trong các phòng nuôi cấy mô, tế

bào thực vật người ta thường duy trì nhiệt độ của phòng nuôi cấy từ 25-280C nhờ các máy điều hoà nhiệt độ [19] Đây là nhiệt độ phù hợp với đa số các loài thực vật

- Ánh sáng

Ánh sáng có ảnh hưởng mạnh tới quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy phụ thuộc vào nhiều yếu tố

sáng từ 2000 - 2500 lux được dùng phổ biến cho nuôi cấy nhiều loại mô khác nhau

- Độ pH

pH của đa số các môi trường nuôi cấy được điều chỉnh trong phạm vi 5,5 - 6,0 pH dưới 5,5 làm cho agar khó chuyển sang trạng thái gel, còn pH lớn hơn 6,0 agar có thể rất cứng [19]

Độ pH của môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình thu nhận các chất dinh dưỡng vào tế bào pH có ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme, chiều hướng và tốc độ của nhiều phản ứng sinh hoá, quyết định sự hấp thụ các cation và anion qua màng tế bào, ảnh hưởng đến áp suất thẩm thấu của tế bào [16]

CHƯƠNG II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu nghiên cứu là chồi chuối tiêu giống mới nhập nội từ Trung tâm nghiên cứu phát triển vùng - Bộ Khoa học và Công nghệ Được trồng làm vật liệu tại Khu Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Khoa học Sự sống

2.1.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Các nghiên cứu được thực hiện tại Bộ môn Công nghệ Tế bào – Viện Khoa học Sự sống – Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nội dung nghiên cứu

- Nội dung 1: Nghiên cứu kỹ thuật vào mẫu và tái sinh chồi giống chuối tiêu mới từ chồi sinh trưởng ngoài tự nhiên

- Nội dung 2: Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh cụm chồi giống chuối tiêu mới

- Nội dung 3: Nghiên cứu kỹ thuật ra rễ cho chồi nuôi cấy để tạo cây chuối hoàn chỉnh trong phòng thí nghiệm

- Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng giá thể đến sự thích ứng cây chuối tiêu mới in vitro ngoài điều kiện tự nhiên

- Nội dung 5: Xây dựng vườn cây mẹ giống chuối tiêu mới làm nguồn vật liệu

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu

1

2.2.2.1 Nội dung 1: Nghiên cứu kỹ thuật vào mẫu và tái sinh chồi giống chuối tiêu mới từ chồi sinh trưởng ngoài tự nhiên

Nghiên cứu kỹ thuật vào mẫu

xà phòng dưới vòi nước chảy, cắt bỏ ngọn, gọt sạch phần rễ và vỏ ở phần củ; (ii) xịt cồn đưa mẫu vào trong tủ cấy vô trùng, tiếp tục tách bẹ để lấy phần

trong vòng 30 giây đến 1 phút; (iv) Tráng mẫu (đỉnh sinh trưởng)1-2 lần bằng nước cất vô trùng; (v) Lắc mẫu nuôi cây (đỉnh sinh trưởng) trong hóa chất khử trùng với thời gian khử trùng theo nội dung từng công thức cụ thể; (vi) Tráng sạch mẫu 4 – 5 lần bằng nước cất vô trùng; (vii) Cấy mẫu đã khử trùng vào môi trường nuôi cấy (Các thao tác từ bước ii đến bước vii được thực hiện trong điều kiện vô trùng)

Mẫu: chồi bên, thân

củ chuối tiêu mới

Giai đoạn nhân nhanh cụm chồi Mẫu: Chồi invitro

Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh Mẫu: Chồi in vitro

Giai đoạn vườn ươm

Mẫu: Cây con in

− Môi trường nuôi cấy: MS (Murashige & Skoog , 1962) [30], bổ sung 30 gram Saccharose/lít; 6,8 gram agar/lít; 100 mg Myo-Inositol/l, pH = 5,8

nhắc lại, mỗi lần 30 mẫu/ 1 công thức

Tổng số mẫu nuôi cấy

Nghiên cứu kỹ thuật tái sinh chồi

Mẫu nuôi cấy được sử dụng ở đây là chồi nách và chồi đỉnh đã được

vào mẫu thành công Các chồi này được cấy vào môi trường tái sinh có môi

trường nền là MS bổ sung Saccharose 30g/l; agar 6,8g/l; 100 mg

Myo-Inositol/l, pH = 5,8 và chất điều tiết sinh trưởng được sử dụng là BAP,

Kinetin Các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần

nhắc lại mỗi lần nhắc lại 30 mẫu, 90 mẫu/ 1 công thức

Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tái

* Các chỉ tiêu theo dõi ( theo dõi sau 30 ngày)

Tổng số mẫu nảy chồi

Tổng số mẫu đưa vào

Tổng số chồi thu được

Tổng số mẫu bật chồi

+ Chất lượng chồi:

Chồi sinh trưởng tốt(+++): Chồi mập, lá xanh thẫm

Chồi sinh trưởng trung bình(++): Chồi hơi gầy, lá xanh

Chồi sinh trưởng kém: Chồi gầy(+), lá xanh nhạt hoặc chồi bi dị dạng

2.2.2.2 Nội dung 2: Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh cụm chồi

giống chuối tiêu mới

(Chú ý là không bị dị dạng) được sử dụng làm vật liệu cấy chuyển sang môi

trường nhân nhanh Trong giai đoạn này tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của

các chất điều tiết sinh trưởng (BAP hoặc kinetin, IAA, IBA,NAA) đến hệ số nhân của chồi chuối tiêu mới Môi trường nền được sử dụng là MS bổ sung

30 gram Saccharose/lít; 6,8 gram agar/lít; 100 mg Myo-Inositol/l, pH = 5,8

nhắc lại, mỗi lần 30 mẫu , 90 mẫu/ 1 công thức

Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IBA đến hiệu quả nhân chồi

Công thức

thí nghiệm

Nồng độ BAP (Kinetin) (mg/l) Nồng độ IBA (mg/l)

Tổng chiều cao chồi + Chiều cao TB của chồi(cm) =

Tổng số chồi theo dõi

+ Chất lượng chồi:

Chồi sinh trưởng tốt (+++): Chồi mập, lá xanh thẫm

Chồi sinh trưởng trung bình (++): Chồi hơi gầy, lá xanh

Chồi sinh trưởng kém(+): Chồi gầy, lá xanh nhạt hoặc chồi bi dị dạng

2.2.2.3 Nội dung 3: Nghiên cứu kỹ thuật ra rễ cho chồi nuôi cấy để tạo cây chuối hoàn chỉnh trong phòng thí nghiệm

- Mẫu nuôi cấy: Chồi chuối tiêu mới khoẻ mạnh có từ 3-5 lá thu được

từ quá trình nhân nhanh

- Môi trường nền được sử dụng là 1/2MS bổ sung 30 gram Saccharose/lít; 6,8 gram agar/lít; 100 mg Myo-Inositol/l, pH = 5,8

- Các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, mỗi lần 30 mẫu, 90 mẫu/ 1 công thức

* Các thí nghiệm tiến hành:

Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến hiệu quả ra rễ

Công thức thí nghiệm Nồng độ NAA (mg/l)

Thí nghiệm 9: Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến hiệu quả ra rễ

Công thức thí nghiệm Nồng độ IBA (mg/l)

Tổng số chồi cấy

Tổng số rễ ra + Trung bình rễ /cây (rễ) =

Tổng số cây theo dõi

2.2.2.4 Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng giá thể đến sự thích ứng cây chuối tiêu mới in vitro ngoài điều kiện tự nhiên

Vật liệu là cây chuối tiêu mới con sau nuôi cấy mô

- Phương pháp ra cây: Trước khi đưa cây con ra trồng ngoài tự nhiên người ta thường tiến hành huấn luyện để cây quen dần với điều kiện môi trường bên ngoài Thời gian này có thể kéo dài khoảng 7 ngày và tăng dần cường độ vào những ngày cuối để tăng nhanh khả năng thích nghi của cây Cây con trong bình cấy được rửa sạch những phần thạch hoặc đường bám vào

vì chúng thường là môi trường thích hợp cho nấm bệnh phát triển hoặc côn trùng tấn công Tiếp đó ngâm cây vào nước để tránh hiện tượng mất nước, rồi đem trồng vào giá thể

- Chế độ chăm sóc cây con trong giá thể: Trong thời gian cây ở trong giá thể, hàng ngày tiến hành tưới phun bằng nước sạch 2 lần/ngày (giữ ẩm độ

giá thể khoảng 75%-80%)

- Các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần

nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 30 mẫu / công thức

- Thí nghiệm tưới phân pha loãng ta tiến hành sau khi cây đã được

luyện trong bầu với giá thể phù hợp

+ Chế độ tưới 10 lít nước trên 30 cây công thức thí nghiệm

+ Mỗi tuần tưới 1 lần phân pha loãng, các ngày khác trong tuần tưới nước theo nhu cầu cây

Tổng số cây ra bầu

Tổng chiều cao cây

+ Chiều cao trung bình cây (cm) =

Tổng số cây theo dõi

2.2.2.4 Nội dung 5: Xây dựng vườn cây mẹ giống chuối tiêu mới làm nguồn vật liệu

- Đánh giá khả năng sinh trưởng của cây chuối tiêu mới nuôi cấy mô ngoài vườn đầu dòng, thực hiện theo dõi đánh giá 4 chỉ tiêu, các chỉ tiêu theo dõi được lặp lại 3 lần mỗi lần 12 cây Gồm các chỉ tiêu:

- Chiều cao thân giả trung bình (đo từ gốc lên đến điểm giao nhau của

2 lá cao nhất); Số lá trung bình trên cây; Đường kính thân trung bình (đo cách gốc 3 cm)

* Chỉ tiêu theo dõi (2 thời điểm 30 ngày và 60 ngày sau trồng)

∑ chiều cao cây

+ Chiều cao trunh bình cây (cm) =

∑ số cây thu được

∑ lá thu được

+ Số lá trung bình trên cây (lá) =

∑ số cây thu được

∑ Đường kính thân

+ Đường kính thân trung bình (cm) =

∑ số cây theo dõi

2.2.3 Xử lý số liệu

- Tính các giá trị trung bình được thực hiện trên phần mềm Excel

- Xử lý số liệu bằng phần mềm IRISTAT (CV% độ tin cậy thí nghiệm