Nghiên cứu phân lập và chuyển gen liên quan đến tính chịu hạn vào giống lúa ở việt nam

Xuất phát từ thực tế nêu trên, chúng tôi đã đề xuất và tiến hành thực hiện đề tài : “Nghiên cứu phân lập và chuyển gen liên quan đến tính chịu hạn vào giống lúa ở Việt Nam” với mục đích

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

_

Cao Lệ Quyên

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ CHUYỂN GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN VÀO GIỐNG

LÚA Ở VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2017

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan: Luận án là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS Phạm Xuân Hội và PGS.TS Đinh Đoàn Long

Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được tác giả nào công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình

Hà Nội, ngày 20 tháng 09 năm 2017

Nghiên cứu sinh

Cao Lệ Quyên

LỜI CẢM ƠN

NCS xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Phạm Xuân Hội (Viện

Di truyền Nông nghiệp), PGS TS Đinh Đoàn Long (Khoa Y Dược, Trường Đại học Quốc Gia Hà Nội) và TS Michel Nicole (Trung tâm Nghiên cứu Vì

Sự Phát triển, Montpellier, Pháp) là những người thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho NCS trong suốt thời gian học tập, thực hiện và hoàn thành bản luận án này

NCS xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Khoa học

Tự nhiên, Phòng Sau Đại học , Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh học (Trường ĐH KHTN) và Ban lãnh đạo Viện Di truyền Nông nghiệp đã tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn hiện luận án

NCS xin chân thành cảm ơn các thầy,các cô Bộ môn Di truyền (Khoa Sinh học, Trường ĐH KHTN) đã giảng dạy NCS trong quá trình học tập và tập thể cán bộ nghiên cứu Bộ môn Bệnh học Phân tử (Viện DTNN) và các bạn

bè, đồng nghiệp đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến để NCS hoàn thiện bản luận án này

Tôi xin được cảm ơn gia đình và người thân đã luôn ở bên cạnh tôi, quan tâm, cảm thông và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận án

Hà Nội ngày 20 tháng 09 năm 2017

NCS Cao Lệ Quyên

MỤC LỤC

MỤC LỤC 1

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 5

DANH MỤC HÌNH 9

DANH MỤC BẢNG 12

MỞ ĐẦU 14

Chương 1 TỔNG QUAN 20

1.1 HÁN HẠN-YẾU TỐ KÌM HÃM TRONG SẢN XUẤT NÔNG NGHIỆP 20

1.1.1 Khái niện về hạn hán 20

1.1.2 Tác động tiêu cực của hạn hán đến sản xuất nông nghiệp 21

1.2 PHẢN ỨNG CỦA THỰC VẬT TRONG ĐIỀU KIỆN HẠN 24

1.2.1 Ảnh hưởng của hạn hán đối với thực vật 24

1.2.2 Đáp ứng chống, chịu hạn của thực vật 26

1.2.3 Cơ sở phân tử của đáp ứng chống chịu hạn ở thực vật 29

1.3 CÁC NHÂN TỐ PHIÊN MÃ LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN Ở THỰC VẬT 34

1.3.1 Nhóm nhân tố phiên mã NAC 36

1.3.2 Nhóm nhân tố phiên mã MYB/MYC 37

1.3.3 Nhóm nhân tố phiên mã bZIP 38

1.3.4 Nhóm nhân tố phiên mã AP2/ERF 40

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG LÚA CHUYỂN GEN

CHỊU HẠN TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 41

1.4.1 Nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen chịu hạn trên thế giới 44

1.4.2 Tình hình nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen ở Việt Nam 50

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 53

2.1 VẬT LIỆU VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 53

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 53

2.1.2 Vật liệu nghiên cứu 54

2.1.3 Thiết bị 57

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 57

2.2.1 Xử lý cây lúa trong điều kiện hạn 57

2.2.2 Tách chiết, định lượng DNA/RNA 58

2.2.3 Sinh tổng hợp DNA bổ sung hoàn chỉnh (full-length cDNA) 60

2.2.4 Nhân bản đoạn DNA đặc hiệu bằng kĩ thuật PCR 62

2.2.5 Thiết kế vector chuyển gen 65

2.2.6 Biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn A tumefaciens 67

2.2.7 Đánh giá khả năng hình thành callus và tái sinh ở lúa 68

2.2.8 Chuyển gen vào lúa thông qua vi khuẩn Agrobacterium 69

2.2.9 Đánh giá số lượng bản sao của gen chuyển 71

2.2.10 Đánh giá sinh trưởng, phát triển, khả năng chịu hạn của lúa chuyển gen 74

2.2.11 Đánh giá biểu hiện gen OsDREB1A bằng phương pháp PCR định

lượng 75

2.2.12 Đánh giá biểu hiện gen bằng phương pháp PCR bán định lượng76 Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 77

3.1 PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN OsDREB1A/OsDREB2A 77

3.1.1 Phân lập trình tự mã hóa OsDREB1A/OsDREB2A 77

3.1.2 Thiết kế vector chuyển gen OsDREB1A/OsDREB2A 92

3.1.3 Biến nạp vector biểu hiện vào A tumefaciens chủng LBA4404 94

3.2 NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH CHUYỂN GEN VÀO GIỐNG LÚA Ở VIỆT NAM 95

3.2.1 Khả hình thành callus của tập đoàn giống lúa Việt Nam 95

3.2.2 Khả năng tái sinh của tập đoàn giống lúa Việt Nam 99

3.2.3 Khảo sát khả năng tiếp nhận gen của giống lúa Việt Nam 103

3.3 TẠO GIỐNG LÚA CHÀNH TRỤI CHUYỂN GEN 108

3.3.1 Biến nạp trình tự mã hóa OsDREB1A/OsDREB2A vào lúa Chành trụi 108

3.3.2 Sàng lọc các dòng Chành Trụi chuyển gen 108

3.4 ĐÁNH GIÁ KIỂU HÌNH CÂY CHUYỂN GEN 118

3.4.1 Đánh giá sinh trưởng và phát triển của các dòng lúa chuyển gen T2 118

3.4.2 Đánh giá khả năng giữ nước và phục hồi của các dòng lúa chuyển gen T2 120

3.4.3 Đánh giá khả năng chịu hạn và tạo hạt của các dòng chuyển

gen T3 124

3.4.4 Đánh giá biểu hiện OsDREB1A và gen liên quan chịu hạn khác

trong cây chuyển gen thế hệ T3 127

KẾT LUẬN 130 KIẾN NGHỊ 132 DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 133 TÀI LIỆU THAM KHẢO 134 PHỤ LỤC 151

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

A thaliana Arabidopsis thaliana

A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens

(ACGT-containing abscisic acid response element)

Bank)

acid)

CDBK protein kinase phụ thuộc canxi

(calcium-dependent protein kinase)

(dehydration responsive element-binding protein)

E coli Escherichia coli

quốc (Food and Agriculture Organization of United Nations)

(Intergovernmental Panel on Climate Change)

kb Kilobase

của phôi (late embryogenesis abundant)

(Mitogen-Activated Protein Kinase)

site)

transciption activation factor /CUC- Cup shaped cotylendon

sequence)

reaction)

PEG Polyethylene glycol

species)

transcription polymerase chain reaction)

S cerevisiae Saccharomyces cerevisiae

medium)

SDS-PAGE Điện di gel polyacrylamide có chƣ́a SDS (SDS -

Polyacrylamide gel electrophoresis)

Ti-plasmid Plasmid gây khối u (tumor inducing plasmid)

5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 | Giản đồ mô tả quá trình phản ứng chịu hạn ở thực vật 30

Hình 1.2 | Con đường dẫn truyền tín hiệu đáp ứng stress ở A thaliana 35

Hình 2.1 | Giản đồ miêu tả kỹ thuật sinh tổng hợp sợi phân tử cDNA sợi 1 của mRNA trưởng thành (GeneRacerTM

Kit - Invitrogen) 61 Hình 2.2 | Giản đồ quy trình thiết kế vector chuyển gen pBIG-Lip9 và pBIG-

UBI mang trình tự mã hóa OsDREB1A và OsDREB2A 66 Hình 3.1 | Vị trí và tổ chức của OsDREB1A (Nipponbare cv.) 77 Hình 3.2 | Điện di sản phẩm khuếch đại trình tự mã hóa OsDREB1A với mồi

Hình 3.12 | Khả năng tạo callus của các giống lúa số thứ tự từ 1-24 96

Hình 3.13 | Khả năng tạo callus của các giống lúa số thứ tự từ 25-47 97

Hình 3.14 | Khả năng tái sinh của các giống lúa 101

Hình 3.15 | Phản ứng của 5 giống lúa khi chuyển gen theo quy trình I 103

Hình 3.16 | Quy trình chuyển gen giống Chành trụi sử dụng nền môi trường MS 106

Hình 3.17 | Hình ảnh tư liệu hóa các bước trong quy trình chuyển gen vào giống lúa Chành Trụi 107

Hình 3.18 | Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra cây Chành trụi chuyển gen 110

Hình 3.19 | Kết quả điện di sản phẩm PCR cây chuyển gen biến nạp cấu trúc pBIG/Ubi:OsDREB2A với 02 cặp mồi đặc hiệu gen chuyển/Hygromycin 111

Hình 3.20 | Kết quả kiểm tra số bản sao cây chuyển gen bằng lai Southern Blotting 114

Hình 3.21 | Kết quả sàng lọc cây chuyển gen đồng hợp qua thông qua tỷ lệ nảy mầm trên môi trường Hygromycin 115

Hình 3.22 | So sánh một số chỉ tiêu sinh trưởng giữa các dòng cây chuyển gen T2 119

Hình 3.23 | Độ hụt khối của các dòng lúa chuyển gen T2 khi mất nước cưỡng bức 121

Hình 3.24 | Khả năng gữ nước và phục hồi của các dòng chuyển gen T2 sau mất nước cưỡng bức 122

Hình 3.25 | Kết quả phục hồi của các dòng chuyển gen T2 sau xử lý hạn cưỡng bức 123

Hình 3.26 | Khả năng phục hồi của các dòng chuyển gen T3 sau ngừng tưới 2-3 tuần 124 Hình 3.27 | Khả năng phục hồi, tạo hạt của các dòng T3 chuyển gen khi xử lý hạn 3 tuần ở giai đoạn trưởng thành 126

Hình 3.28 | Nghiên cứu mức độ biểu hiện OsDREB1A trong cây chuyển

gen T3 127 Hình 3.29 | Mức độ biểu hiện của các gen liên quan đến tính chịu hạn trong các dòng cây chuyển gen T3 128

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 | Các nghiên cứu chuyển gen chức năng tăng cường tính chống/chịu

mặn ở lúa 46

Bảng 1.2 | Nghiên cứu tạo giốn lúa chuyển gen chịu hạn trên thế giới 49

Bảng 2.1 | Danh sách các giống lúa được trồng ở miền Bắc Việt Nam được sử dụng trong nghiên cứu 53

Bảng 2.2 | Trình tự các primer (oligo) sử dụng trong nghiên cứu 54

Bảng 2.3 | Thành phần môi trường đã được sử dụng trong chuyển gen lúa 56

Bảng 3.1 | Khả năng tạo callus của tập đoàn 47 giống lúa 95

Bảng 3.2 | Kết quả phân tích Anova hai nhân tố (3 lần lặp lại) khả năng tạo callus của 47 giống lúa 98

Bảng 3.3 | Kết quả phân tích Anova hai nhân tố (3 lần lặp lại) khả năng tái sinh của 26 giống lúa 100

Bảng 3.4 | Kết quả khảo sát khả năng tái sinh của 26 giống lúa có khả năng tạo callus tốt 102

Bảng 3.5 | Khả năng tiếp nhận gen của 5 giống lúa Việt Nam 104

Bảng 3.6 | Kết quả biến nạp các vector chuyển gen vào lúa Chành Trụi 108

Bảng 3.7 Kết quả kiểm tra các cây chuyển gen T0 112

Bảng 3.8 | Kết quả theo dõi của các dòng lúa chuyển gen T0 112

Bảng 3.9 | Kết quả ước tính số lượng bản sao và tình trạng đồng hợp các dòng T1 117

Bảng 3.10 | Kết quả sinh trưởng của các dòng lúa chuyển gen T1 đồng hợp tử 118

Bảng 3.11 | Một số chỉ tiêu sinh trưởng của cây chuyển gen T2 và cây đối chứng 119 Bảng 3.12 | Khả năng giữ nước của các dòng lúa chuyển gen T2 121 Bảng 3.13 | Khả năng phục hồi, kết hạt của các dòng lúa chuyển gen T3 sau

xử lý hạn 125

MỞ ĐẦU

Việt Nam là một nước nông nghiệp với khoảng 70% dân số sinh sống ở nông thôn và 48% lấy nông nghiệp làm sinh kế Do đặc điểm tự nhiên và điều kiện nền kinh tế, phần lớn các hoạt động sản xuất nông nghiệp của nước ta trong đó có sản xuất lúa gạo (nguồn lương thực chính) bị phụ thuộc vào nguồn nước mưa tự nhiên và nguồn nước đổ về qua hai hệ thống sông Hồng (miền Bắc) và sông Mekong (đồng bằng sông Cửu Long) Do đó, hạn hán hoặc hiện tượng thiếu nước tưới cho sản xuất nông nghiệp, đặc biệt là sản xuất lúa nước có thể xảy ra khi có sự thiếu hụt lượng mưa hoặc nguồn nước

đổ về qua hai hệ thống sông chính bị hạn chế

Đối với sản xuất nông nghiệp, hạn hán là yếu tố môi trường gây ảnh hưởng lớn nhất, là nguyên nhân chính làm giảm năng suất, sản lượng cây trồng, đặc biệt là với những cây trồng cần nhiều nước tưới như cây lúa Gần đây, do ảnh hưởng của hiện tượng biến đổi khí hậu toàn cầu, hạn hán xảy ra ngày càng thường xuyên hơn, với mức độ ngày càng trầm trọng, gây tác động lớn tới tổng sản lượng lương thực quốc gia, ảnh hưởng tới công tác xuất khẩu lúa gạo, đe doạ trực tiếp tới an ninh lương thực trong khu vực và trên thế giới

Từ thực tế đó, việc tạo ra các giống cây trồng có năng suất cao, đồng thời chống/chịu được với các điều kiện bất lợi của môi trường trở thành một trong những nhiệm vụ then chốt của khoa học nông nghiệp trong nước

Thực tế hiện nay cho thấy những giống cây trồng chống chịu điều kiện môi trường bất lợi được sử dụng trong sản xuất ở Việt Nam đều được lai tạo dựa trên các phương pháp chọn giống truyền thống, hầu như chưa có giống cây trồng chịu hạn nào được tạo ra bằng phương pháp công nghệ sinh học hiện đại Hiện nay, với sự phát triển bùng nổ của sinh học phân tử và công nghệ tế bào, hai định hướng chọn giống chịu hạn đang được các nhà khoa học

trong nước cũng như quốc tế đặc biệt quan tâm là chọn giống kết hợp chỉ thị phân tử và chọn giống nhờ kỹ thuật chuyển gen thực vật Trong hai phương pháp này thì bước đầu phương pháp chọn giống kết hợp chỉ thị phân tử đã bước đầu thu được các kết quả ấn tượng đặc biệt là với các tính trạng đơn gen như các gen kháng, gen quy tính tính trạng số lượng

Tuy nhiên, do tính trạng chịu hạn là tính trạng đa gen nên định hướng chọn giống ứng dụng chỉ thị phân tử đang gặp khó khăn lớn trong việc quy tụ các tính trạng, gen quan trọng liên quan đến chịu hạn Gần đây, dựa trên những thành tựu nghiên cứu về chức năng hệ gen thực vật, cùng với sự phát triển các kỹ thuật microaray, proteomic , các nhà khoa học đã phát hiện và chứng minh vai trò quan trọng của nhóm gen điều khiển trong việc tăng cường tính chịu hạn ở thực vật Nhóm gen điều khiển mặc dù không tham gia trực tiếp vào quá trình đáp ứng với điều kiện hạn của thực vật nhưng sự biểu hiện của chúng lại có vai trò điều hòa biểu hiện của rất nhiều gen chức năng khác tham gia vào quá trình đáp ứng hạn, dẫn tới làm tăng cường khả năng chịu hạn ở thực vật

Phát hiện này đã mở ra một hướng nghiên cứu rất cho lĩnh vực chọn giống chuyển gen ở thực vật, đó là chỉ cần chuyển một hay một vài gen điều khiển thay vì vài trăm gen chức năng vào cây để tăng cường tính chống chịu của cây trồng Chính vì lí do này mà các nghiên cứu phân lập, đặc tính hoá các gen điều khiển liên quan đến tính chịu hạn đang trở thành định hướng nghiên cứu đầy tiềm năng trong việc chuyển gen/chọn tạo giống chịu hạn

Ở Việt Nam, trong khoảng 10 năm trở lại đây, các nghiên cứu về phân lập gen chịu hạn và tạo giống cây trồng chống chịu hạn bằng công nghệ chuyển gen thực vật đã bắt đầu được một số phòng thí nghiệm quan tâm Tuy nhiên, hầu hết các chương trình, dự án nghiên cứu về gen chống chịu stress môi trường nói chung và chống chịu hạn nói riêng đều được tiến hành với

nguồn vật liệu hoặc nền di truyền không phải của Việt Nam, do đó tính ứng dụng ra thực tiễn sản xuất ít nhiều bị hạn chế Xuất phát từ thực tế nêu trên, chúng tôi đã đề xuất và tiến hành thực hiện đề tài : “Nghiên cứu phân lập và chuyển gen liên quan đến tính chịu hạn vào giống lúa ở Việt Nam” với mục đích để tạo nguồn vật liệu, số liệu quan trọng trong việc tạo ra các giống cây trồng chuyển gen có khả năng chống chịu điều kiện hạn

Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chung:

Phân lập và chuyển được gen liên quan đến tính chịu hạn vào giống lúa

ở Việt Nam để tạo nguồn vật liệu cho việc chuyển gen/lai tạo các giống cây chống chịu hạn

Mục tiêu cụ thể:

i) Phân lập được gen mã hóa nhân tố phiên mã OsDREB1A/2A liên quan

tính chịu hạn trên giống lúa Việt Nam

ii) Tối ưu hoá được quy trình biến nạp gen thông qua vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens trên một số giống lúa ở Việt Nam

iii) Tạo ra được một số dòng lúa chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã

OsDREB1A/2A tăng khả năng chịu hạn trong điều kiện phòng thí

nghiệm

Đối tượng và nội dung nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của luận án:

(i) Các gen OsDREB1A/2A mã hóa nhân tố điều hòa phiên mã liên quan

tới tính chịu hạn của giống lúa trồng ở Việt Nam và vai trò, biểu hiện của các gen mã hóa nhân tố phiên mã này trong các dòng lúa chuyển gen dưới sự điều khiển của các promoter liên tục hoặc cảm ứng;

(ii) Khả năng tạo callus, tái sinh và tiếp nhận gen lạ thông qua vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens của một số giống lúa trồng ở phía Bắc Việt Nam

Các nội dung nghiên cứu chính:

 Nội dung 1: Phân lập và thiết kế vector chuyển gen

OsDREB1/OsDREB2A của giống lúa Việt Nam dưới sự điều khiển của

promoter liên tục (Ubiquitine)/cảm ứng (Lip9)

 Nội dung 2: Nghiên cứu qui trình chuyển gen vào giống lúa

trồng ở Việt Nam thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

 Nội dung 3: Tạo giống lúa Chành Trụi chuyển gen

OsDREB1/OsDREB2A

 Nội dung 4: Đánh giá kiểu hình và biểu hiện của các dòng chuyển gen trong điều kiện xử lý hạn tại phòng thí nghiệm

Địa điểm nghiên cứu

Luận án được thực hiện tại 2 địa điểm chính: Bộ môn Bệnh học Phân

tử, Viện Di truyền Nông nghiệp (Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam) là địa chỉ uy tín , dẫn đầu trong cả nước về công tác phân lập , nghiên cứu chức năng của các gen mã hóa nhân tố phiên mã ; và Phòng thí nghiệm Tương tác Cây trồng -Vi sinh vật , Trung tâm nghiên cứu vì sự phát triển (IRD, Montpellier) là phòng thí nghiệm hiện đại, có nhiều chuyên gia uy tín trong nghiên cứu chức năng, biểu hiện của gen/bộ gen thực vật (đặc biệt là lúa)

Đóng góp mới của luận án

Luận án là công trình nghiên cứu cơ bản theo định hướng ứng dụng hai

gen mã hóa nhân tố phiên mã OsDREB1A và OsDREB2A liên quan tính chịu hạn Trong nghiên cứu này, trình tự mã hóa hai nhân tố phiên mã OsDREB1A

và OsDREB2A được phân lập từ nguồn vật liệu di truyền của giống lúa Việt

Nam và được đưa vào vector biểu hiện thực vật dưới sự điều khiển bởi

promoter hoạt động liên tục (Ubiquitin) hoặc promoter cảm ứng stress (Lip9)

Bốn dòng lúa Chành trụi chuyển gen thế hệ T3 đã được xác định có mang gen chuyển ổn định (một bản sao, đồng hợp tử) Thử nghiệm cho thấy, cả bốn dòng lúa đều có khả năng sống sót và tiếp tục sinh trưởng, ra hạt khi bị xử lý hạn cưỡng bức ở giai đoạn mạ/sinh trưởng Đặc biệt là hai dòng L3 và L5

(Lip9:OsDREB1A) có kiểu hình tương đồng với cây không chuyển gen trong

điều kiện bình thường và có tỷ lệ sống sót cao khi xử lý hạn

Luận án đã nghiên cứu khả năng phát sinh callus và tái sinh chồi từ callus của lượng lớn giống lúa ở Việt Nam và đã chỉ ra được một số giống lúa

có tiềm năng để nghiên cứu, xây dựng quy trình chuyển gen thích hợp cho từng giống lúa Điều này càng ý nghĩa hơn khi thời gian gần đây với công nghệ chỉnh sửa hệ gen đang có những bước tiến dài, chúng ta có thể tạo ra được các giống lúa công nghệ sinh học không qua lai tạo, có các đặc điểm nông sinh học vượt trội mà vẫn giữ các phẩm chất của giống gốc ban đầu

Trong luận án này lần đầu tiên ở Việt Nam, phản ứng PCR định lượng được áp dụng thành công để ước tính số lượng bản sao của cấu trúc chuyển gen và xác định các dòng chuyển gen đồng hợp ngay từ thế hệ T1 Phương pháp này có một số ưu thế so với các phương pháp trước đó: tiết kiệm thời gian và vật liệu thí nghiệm, mức độ chính xác cao và xác định được thể đồng hợp ngay ở thế hệ T1 và rất phù hợp cho điều kiện phòng thí nghiệm còn nhiều hạn chế trong nước

Ứng dụng thực tiễn của luận án

Kết quả nghiên cứu của luận án đã tạo ra được các dòng T3 (đồng hợp,

một bản sao gen OsDREB1A dưới sự điều khiển của promoter cảm ứng Lip9)

có kiểu hình tương đồng cây đối chứng không chuyển gen và đặc biệt có khả năng phục hồi và kết hạt sau 3 tuần ngừng tưới nước Đây là kết quả quan

trọng, chứng tỏ tiềm năng ứng dụng của gen OsDREB1A và điều hòa biểu

hiện của gen mã hóa nhân tố phiên mã dưới sự điều khiển của promoter cảm ứng trong công tác tạo giống cây chuyển gen chịu hạn Trên cơ sở kết quả của

luận án, các vector biểu hiện gen OsDREB1A và OsDREB2A được tạo ra đang

được nghiên cứu chuyển vào các giống cây trồng quan trọng như ngô, đậu tương, bông… để chọn tạo các giống cây chuyển gen chịu hạn nhằm đáp ứng nhu cầu cấp thiết của sản xuất trong điều kiện thay đổi khí hậu toàn cầu Ngoài ra dòng chuyển gen tiếp tục được duy trì theo dõi trong nhà lưới để làm nguyên liệu cho công tác lai tạo giống khi điều kiện thực tế cho phép (chấp nhận cây lúa chuyển gen và vật liệu di truyền do sự kiện chuyển gen tạo ra)

do mất cân bằng áp suất thẩm thấu giữa cây và môi trường, dẫn đễn sự thiếu hụt nước trong tế bào Trong trường hợp này, tác động của môi trường bên ngoài rất lớn, gây ảnh hưởng đáng kể lên sự phát triển của cây Thông thường, hạn được phân biệt thành 3 loại là hạn không khí, hạn đất và hạn toàn diện

Hạn không khí thường có đặc trưng là nhiệt độ cao (39o

C - 42oC) và độ

ẩm thấp (< 65%), thường gặp ở những tỉnh miền Trung Việt Nam vào những đợt gió Lào và ở vùng Bắc bộ vào cuối thu, đầu đông Đối với thực vật nói chung và cây lúa nói riêng, hạn không khí thường gây ra hiện tượng héo tạm thời thậm chí nếu bị khô kiệt nước, nguyên sinh chất bị đứt vỡ cơ học dẫn đến

tế bào mô bị tổn thương và chết [21, 36, 90] Hạn đất tác động trực tiếp đến

bộ phận rễ làm ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cây Đối với cây trồng cạn, hạn đất cũng ảnh hưởng nghiêm trọng đến giai đoạn gieo hạt và nảy mầm Lượng nước trong đất không đủ làm co mầm và héo; nếu thiếu nước nặng sẽ gây thui chột mầm và chết [36] Hạn toàn diện là hiện tượng khi có cả hạn đất và hạn không khí xảy ra cùng một lúc Hạn toàn

diện thường dẫn đến hiện tượng héo vĩnh viễn, cây không có khả năng phục hồi Ở nước ta, hạn toàn diện thường xảy ra ở các tỉnh miền Trung như Nghệ

An, Hà Tĩnh , gây thiệt hại đáng kể cho cây trồng nói chung và cây lúa nói riêng [9, 11, 16]

1.1.2 Tác động tiêu cực của hạn hán đến sản xuất nông nghiệp

Trong các yếu tố bất lợi của môi trường, hạn hán là nhân tố chính và phổ biến nhất gây ảnh hưởng tiêu cực đến sản xuất nông nghiệp Hiện nay, các vùng canh tác phải đối mặt với hạn hán chiếm khoảng 1% tổng diện tích đất nông nghiệp trên toàn thế giới, và được dự báo sẽ tăng lên 30% vào cuối thế kỉ 21 [11] Mức độ ảnh hưởng của hạn hán đến sản xuất nông nghiệp phụ thuộc vào tần xuất, cường độ, tính khắc nghiệt của đợt hạn hán và cả tính nhạy cảm của từng đối tượng cây trồng Ảnh hưởng của hạn hán đối với nông nghiệp có thể diễn ra hàng năm hoặc thậm chí là mãi mãi, do tác động tới chất lượng sản phẩm, giảm năng suất, tăng nguy cơ nhiễm bệnh và các dịch hại do sâu bọ, tăng chi phí tưới tiêu, dẫn tới làm mất sản lượng cây trồng và giảm thu nhập của người nông dân [10]

Tại Trung Quốc, hạn hán nghiêm trọng thường xuyên xảy ra ở vùng miền Bắc Tình trạng hạn hán bắt đầu từ cuối tháng 7 hàng năm gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến vùng trồng ngô lớn nhất tại đây (chiếm 60% tổng diện tích trồng trọt) Nền sản xuất nông nghiệp ở Ấn Độ cũng thường xuyên phải đối mặt với các đợt hạn hán nghiêm trọng Đặc biệt đợt hạn hán năm

2010 đã khiến tăng trưởng của quốc gia này giảm 1% Đợt hạn hán tồi tệ

trong 02 năm gần đây xảy ra tại Thái Lan đã đẩy quốc gia xuất khẩu gạo lớn

nhất thế giới đối mặt với vụ mùa thất thu, sản lượng giảm hơn 50% Ở Mỹ,

thiệt hại do hạn hán hàng năm khoảng 6-8 tỉ USD, tính riêng trong năm 2012,

hơn 80% diện tích gieo trồng ở nước này đã bị ảnh hưởng bởi hạn hán [11,

36, 58, 90]

Ở Việt Nam, hạn hán là một trong những nguyên nhân gây thiệt hại lớn cho sản xuất nông nghiệp và tác động tiêu cực đến đời sống nhân dân Trong các năm gần đây, hạn hán ngày càng xảy ra thường xuyên hơn, kéo dài hơn, trên diện tích lớn hơn do đó mức độ ảnh hưởng cũng vì thế ngày càng trầm trọng hơn Đợt hạn hán trong hai năm 1994-1995 ở Đắc Lak gây thiệt hại cho ngành sản xuất cà phê hơn 600 tỉ đồng Đợt hạn hán khác năm 1995-1996 ở miền Bắc cũng tàn phá khoảng 13.380 ha hoa màu của vùng Trung Du và 100.000 ha hoa màu của vùng đồng bằng sông Hồng Đặc biệt, năm 1998, hạn hán đã xảy trên toàn lãnh thổ VN, với mức độ cực kỳ nghiêm trọng ở Tây Nguyên, miền Trung và Nam bộ Tổng diện tích bị tác động trên toàn quốc năm 1998 là 734.284 ha, trong đó riêng khu vực đồng bằng sông Cửu Long là 276.656 ha Đợt hạn hán này đã khiến cho 3,8 triệu dân thiếu nước sinh hoạt, gây thiệt hại khoảng 5000 tỉ đồng Hạn hán cũng xảy ra trầm trọng ở đồng bằng Cửu Long và Tây Nguyên mùa khô 2004-2005, diện tích các loại cây trồng bị thiếu nước và hạn là 171.986 ha, trong đó mất trắng là 34.335 ha, với tổng thiệt hại khoảng 1743 tỷ đồng Đợt nắng nóng kéo dài từ đầu tháng 10-

2009 đến 2010 đã khiến ngành nông nghiệp các tỉnh Đồng bằng Sông Cửu Lông bị thiệt hại hàng trăm tỉ đồng Trong báo cáo tháng 4/2010 của Tổng cục Thủy lợi-Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, tình hình khô hạn, thiếu nước ngọt liên tục kéo dài đã ảnh hưởng tới năng suất của khoảng 26.000 ha lúa đông xuân ở các vùng Trung du, Đồng bằng Bắc bộ và khoảng 100.000 ha

ở Nam bộ Sơ bộ, tổng thiệt hại do hạn hán tại 2 khu vực này đã lên tới 1.258

tỷ đồng [8, 9, 11, 16]

Năm 2016 vừa qua, Việt Nam đã phải đối mặt với một đợt hạn hán nghiêm trọng đi kèm xâm nhập mặn tại Đồng bằng sông Cửu Long Đây là

đợt hạn hán nghiêm trọng nhất trong 100 năm qua tại khu vực này.Trong đợt hạn hán này, có 13 tỉnh tại Đồng bằng sông Cửu Long bị mặn xâm nhập (10 tỉnh đã công bố thiên tai, trong đó nhiều tỉnh công bố cấp độ 2) Theo ước tính của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, có khoảng 160.000 ha lúa bị thiệt hại, ước tính có khoảng 800.000 tấn lúa đã bị mất trắng (nguồn Tổng cục Trồng trọt)

Các tỉnh miền Trung và Tây Nguyên cũng đã xảy ra đợt hạn hán nghiêm trọng trong nửa đầu năm 2016 khi lượng nước trên các ao hồ, công trình thủy lợi rơi vào tình trạng cạn kiệt và gây thiệt hại lớn cho ngành nông nghiệp Đến cuối tháng 3/2016, con số thiệt hại do hạn ở các tỉnh Tây Nguyên đều ở mức trên 100 tỷ đồng Gần 23.000 ha đất lúa phải dừng sản xuất do thiếu nước ở khu vực Nam Trung Bộ Thiếu nước và hạn hán cũng đã ảnh hưởng lớn đến diện tích cây công nghiệp ở Tây Nguyên và Đông Nam Bộ với tổng diện tích lần lượt là 15.823 ha và 28.000 ha (nguồn Tổng cục Trồng trọt)

Thống kê thiệt hại của Vụ kinh tế Nông nghiệp cho thấy, tính đến hết tháng 5 năm 2016, số hộ thiếu nước sinh hoạt là 288.259 Thiệt hại về lúa lên tới 249.944 ha, hoa màu 18.960 ha, cây ăn quả 30.522 ha, cây công nghiệp 149.704 ha, thủy sản là 6.857 ha… Ước tính hạn hán, xâm ngập mặn đã làm thiệt hại khoảng 15.183 tỷ đồng

Theo dự báo của FAO, do tác động của hạn hán, sản lượng lúa gạo hai

vụ xuân và vụ mùa của vùng trồng lúa trên khắp cả nước, đặc biệt là vùng đồng bằng sông Hồng nói riêng sẽ có xu hướng giảm dần, có thể giảm tới 12,5% vào năm 2050 và 16,5% vào năm 2070 Ngân hàng Phát triển Châu Á (ADB) cũng dự báo các tác động của các hiện tượng biến đổi khí hậu, trong

đó đặc biệt là hạn hán đến ngành sản xuất lúa gạo và cà phê của Việt Nam có thể đến rất sớm, ngay từ năm 2020 [11]

1.2 PHẢN ỨNG CỦA THỰC VẬT TRONG ĐIỀU KIỆN HẠN

1.2.1 Ảnh hưởng của hạn hán đối với thực vật

Thực vật sinh trưởng thông qua quá trình phân chia, kéo dài và biệt hóa

tế bào Quá trình sinh trưởng phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố như di truyền, sinh lý, sinh thái, hình thái và sự tương tác qua lại giữa các yếu tố Tuy nhiên, tất cả các yếu tố này đều có thể bị ảnh hưởng khi môi trường bị khô hạn Sinh trưởng tế bào là một trong số những quá trình sinh lý nhạy cảm nhất đối với

sự thiếu hụt nước, do sức trương tế bào giảm Ở thực vật bật cao, khi cây bị thiếu nước nghiêm trọng, quá trình kéo dài tế bào bị ức chế do dòng nước từ xylem dẫn tới các tế bào đang trong quá trình kéo dài bị cản trở Hệ quả của

sự ức chế quá trình nguyên phân và quá trình kéo dài tế bào là thực vật bị giảm chiều cao, giảm diện tích che phủ của lá và cuối cùng dẫn tới giảm quá trình sinh trưởng và tích lũy sinh khối của cơ thể thực vật trong điều kiện hạn [8, 11, 36, 21]

Đối với cây trồng, đặc biệt là các cây ngũ cốc, rất nhiều quá trình sinh

lý quyết định sản lượng thu hoạch bị tác động bởi điều kiện hạn hán Mức độ ảnh hưởng của hạn hán đến sản lượng thu hoạch của cây trồng tùy thuộc vào mức độ khô hạn, thời gian bị hạn hán và tùy thuộc vào loại cây trồng Ví dụ, lúa và ngô trong điều kiện hạn vừa phải và hạn khắc nghiệt có thể giảm năng suất 25-90%, đậu tương giảm 45-70%, cải dầu giảm khoảng 30% và khoai tây giảm 13% Hai giai đoạn quan trọng nhất quyết định sản lượng cây ngũ cốc

là thời gian ra hoa và thời gian kết hạt Hạn hán xuất hiện trong giai đoạn ra hoa thường làm cây bị mất khả năng sinh sản hoặc giảm số lượng hoa Sự thiếu hụt nước trong quá trình kết hạt làm giảm quá trình sinh trưởng của tế bào, dẫn tới giảm hàm lượng và hoạt tính của các loại enzyme tham gia vào

quá trình sinh tổng hợp sucrose và tinh bột trong tế bào, do đó làm giảm quá trình kết hạt của cây [21, 36, 90]

Ở thực vật bậc cao, thiếu hụt nước trong đất thường làm giảm khả năng hấp thụ, vận chuyển và trao đổi chất dinh dưỡng trong cây do nhu cầu về nước và dinh dưỡng của thực vật có mối liên hệ rất chặt chẽ Khi bị hạn hán,

rễ không thể hấp thu và vận chuyển chất dinh dưỡng lên các cơ quan phía trên, từ đó ảnh hưởng tới quá trình trao đổi chất dinh dưỡng của tế bào Ngoài

ra, tốc độ thoát hơi nước giảm trong điều kiện hạn cũng làm giảm khả năng hấp thụ và hiệu quả sử dụng chất dinh dưỡng của thực vật [11, 21, 36]

Đáp ứng đầu tiên của thực vật khi môi trường trở nên khô hạn là đóng khí khổng để giảm sự thoát hơi nước Hoạt động này dẫn tới hệ quả ngăn cản dòng CO2 đi vào lá và làm giảm quá trình cố định carbon, dẫn tới sự dư thừa điện tử, từ đó tạo ra các hợp chất chứa oxi hoạt tính gây độc tế bào Khả năng đồng hóa CO2 giảm cũng đồng thời làm tăng tính nhạy cảm của thực vật với những tổn thương do ánh sáng mặt trời gây nên [21, 36, 90]

Việc thiếu hụt nước gây tác động tiêu cực tới bộ máy quang hợp, làm giảm khả năng tổng hợp và tích lũy sinh khối của thực vật Khi bị thiếu nước, thể tích tế bào giảm, tế bào chất trở nên đặc hơn làm tăng tính tương tác giữa các phân tử, do đó các protein dễ bị phân hủy hơn Độ nhớt của tế bào chất tăng có thể gây độc cho tế bào và ảnh hưởng tới hoạt động chức năng của các enzyme, trong đó có cả các enzyme của bộ máy quang hợp Thực nghiệm đã chứng minh trong giai đoạn bị stress hạn, hoạt tính của các enzyme quang hợp như giảm từ 2-9 lần, tương ứng với sự giảm thế nước của lá Bên cạnh các enzyme quang hợp, thành phần sắc tố như diệp lục và các carotenoid cũng đóng vai trò rất quan trọng đối với qúa trình quang hợp Trong điều kiện thực vật bị stress hạn, do màng lục lạp bị tổn thương, cấu trúc không bào bị biến đổi, cùng với sự xuất hiện của các giọt lipid và các gốc oxi hoạt tính khiến

cho hàm lượng và tỉ lệ giữa các thành phần sắc tố bị thay đổi, dẫn tới làm giảm quá trình quang hợp của cây [11, 21, 36, 90]

Một yếu tố khác ảnh hưởng tới quá trình quang hợp đó là sự ức chế quá trình phosphoryl hóa và tổng hợp ATP từ ADP Trong điều kiện khô hạn ở mức vừa phải, đây là yếu tố chính gây ức chế quá trình quang hợp, do làm thay đổi hoạt động của chuỗi truyền điện tử trong bộ máy quang hợp Ngoài

ra, sự thay đổi khả năng sử dụng CO2 của diệp lục (do đóng khí khổng) cũng làm thay đổi hoạt động của quang hệ II và chuỗi truyền điện tử, dẫn tới sự giảm hoạt động của bộ máy quang hợp [36, 90]

Trong điều kiện stress hạn, thực vật thường sản sinh ra các hợp chất oxi hoạt tính, bao gồm các gốc anion superoxide, hydroxyl, hydro peroxide, alkoxy (RO) và oxi nguyên tử Các hợp chất oxi hóa hoạt tính có nhiều tác động tiêu cực như thúc đẩy quá trình peroxide hóa lipid gây tổn thương màng

tế bào, oxi hóa và phân giải protein, bất hoạt enzyme, phân giải DNA Sự tích lũy các chất chứa oxi hoạt tính có thể gây ra nhiều tổn thương cho tế bào, ảnh hưởng tới các hoạt động chức năng của tế bào, mô và thực vật [90]

1.2.2 Đáp ứng chống, chịu hạn của thực vật

Trong môi trường tự nhiên, thực vật đối phó với điều kiện khô hạn hán bằng rất nhiều đáp ứng khác nhau để duy trì sự sống Đối với cây trồng, “chịu hạn” được định nghĩa là khả năng sinh trưởng, ra hoa và cho sản lượng cao trong điều kiện nguồn cung cấp nước không đầy đủ Môi trường khô hạn làm xuất hiện hàng loạt các phản ứng không đặc trưng trong tế bào, dẫn tới hàng loạt các tổn thương cho cơ thể thực vật Để đối phó với điều kiện hạn hán, trước tiên thực vật sẽ khởi động cơ chế phòng vệ chống lại sự thiếu hụt nước, sau đó sẽ là một loạt các cơ chế ở các cấp độ khác nhau Đáp ứng của thực vật

với điều kiện hạn có thể chia thành ba loại: đáp ứng hình thái, đáp ứng sinh lý

và đáp ứng hóa sinh [21, 22, 36]

1.2.2.1 Đáp ứng hình thái

Đáp ứng hình thái là một cơ chế thích nghi của thực vật với điều kiện môi trường hạn hán kéo dài Ở mức độ hình thái, thực vật đáp ứng lại với điều kiện hạn bằng hai khả năng: trốn hạn (escape) và tránh hạn (avoidance) [21]

Trốn hạn là cách thực vật rút ngắn chu kỳ sống hay thời gian sinh trưởng để có thể sinh sản trước khi môi trường trở nên khô hạn Thay đổi thời gian ra hoa là một dấu hiệu quan trọng chứng tỏ sự thích nghi của thực vật với môi trường, thường xuất hiện khi thời gian sinh trưởng bị giới hạn bởi điều kiện hạn và nhiệt độ cao Trong nông nghiệp, việc kết hợp thời gian sinh trưởng của cây trồng với thời gian đất có độ ẩm cao là yếu tố quyết định tạo

ra sản lượng thu hoạch cao [21, 22]

Tránh hạn là cơ chế thực vật thay đổi linh hoạt kiểu hình để giảm thiểu

sự mất nước, đồng thời duy trì lượng nước hấp thụ vào cơ thể trong điều kiện hạn hán Trong điều kiện hạn, Thực vật có thể phát triển một hệ rễ dày, đâm sâu để có thể hấp thụ đầy đủ lượng nước cho quá trình sinh trưởng Ở một số loài thực vật thuộc họ cọ, ví dụ như cây dừa có hiện tượng thay đổi đường kính và cấu trúc thân để đáp ứng với điều kiện môi trường hạn hán Ngoài ra,

để giảm sự thoát hơi nước, thực vật thường hạn chế số lượng, tiết diện và độ che phủ của lá Trong điều kiện nhiệt độ cao, sự hình thành các lớp bảo vệ trên bề mặt lá như lông tơ cũng là một cơ chế giúp giảm nhiệt độ và tốc độ thoát hơi nước trên bề mặt lá, đồng thời tăng mức độ phản xạ ánh sáng để bảo

vệ lá [22]

1.2.2.2 Đáp ứng sinh lý

Các đáp ứng tức thì trong thời gian ngắn của thực vật khi cơ thể bị thiếu nước do khô hạn chủ yếu liên quan tới các đáp ứng sinh lý Để thích nghi với điều kiện môi trường khô hạn, thực vật chủ yếu tập trung vào việc duy trì thế nước trong các mô, cơ quan quan trọng Tích lũy và dự trữ nước trong cơ thể là phương thức thích nghi phổ biến nhất của các loài thực vật với stress hạn Hạn chế sự thoát hơi nước thông qua hoạt động đóng khí khổng (qua trung gian acid abcisic) cũng là một cơ chế đáp ứng nhanh với hạn của thực vật Một số biến đổi thích nghi trong điều kiện hạn thường thấy ở thực vật như hình thành mô xốp dự trữ nước, thay đổi tính thấm biểu bì, cuốn lá và rụng lá để giảm thoát hơi nước Bên cạnh đó, để bù đắp lượng nước bị thiếu hụt do môi trường khô hạn, rễ thực vật đã phát triển đặc tính hướng nước rất nhạy, giúp thực vật có thể phát hiện ra các tầng đất có gradient nước cao và hướng sự phát triển các nhánh rễ tới những vị trí này [21, 22]

Thực vật có khả năng đối phó với stress hạn bằng cách giảm hoạt động trao đổi chất Một số loài thực vật còn có khả năng duy trì các chức năng sinh học trong điều kiện thế nước thấp Thực vật C4 thích nghi với hạn hán nhờ khả năng giảm thiểu sự mất hơi nước trong quá trình cố định CO2 (thông qua

cơ chế tích lũy CO2 vào ban đêm), do đó chỉ sử dụng một lượng nước rất ít so với với thực vật C3 [21]

1.2.2.3 Đáp ứng sinh hóa

Đáp ứng sinh hóa đầu tiên của tế bào nhân chuẩn với các loại stress sinh học (biotic) và phi sinh học (abiotic) là sản sinh ra ROS Ở thực vật, quá trình sản sinh ROS là một đáp ứng phòng vệ sớm của tế bào với stress hạn ROS bao gồm gốc superoxide , peroxide hydro và gốc hydroxyl , được tạo ra trong quá trình trao đổi chất bình thường liên quan đến oxy và đóng vai trò

quan trọng đối với các con đường truyền tín hiệu của tế bào Trong điều kiện hạn hán, các ROS hoạt động như những phân tử tín hiệu thứ cấp để khởi động các phản ứng phòng vệ của tế bào Tuy nhiên, khi hàm lượng ROS tăng cao trong giai đoạn tế bào bị stress hạn sẽ gây ra các tổn thương oxy hóa cho tế bào [36]

Do có tính phản ứng rất mạnh, các ROS có thể gây peroxide hóa lipid, phân giải protein, oxy hóa DNA và thậm chí có thể gây chết tế bào Để giảm thiểu ảnh hưởng của stress oxy hóa sinh ra trong điều kiện môi trường khô hạn, thực vật đã hình thành một hệ thống bảo vệ chống oxy hóa rất phức tạp, bao gồm các enzyme (ví dụ như superoxide dismutase, catalase, peroxidase, ascorbate peroxidase, glutathione reductase…) và các thành phần không phải enzyme (ví dụ như glutathione, acid ascorbic, carotenoid ) ROS được loại

bỏ khỏi tế bào theo cả hai cơ chế phụ thuộc và không phụ thuộc enzyme, trong đó sử dụng enzyme là cơ chế hiệu quả nhất để chống lại stress oxy hóa [21, 22, 36]

Một đáp ứng phổ biến khác của thực vật với điều kiện hạn là điều chỉnh

áp suất thẩm thấu nhờ quá trình tổng hợp mới một số hợp chất như đường , acid amin , glycine-betaine Các hợp chất dạng hòa tan trong nước này có khả năng bắt giữ các phân tử nước trong giai đoạn môi trường khô hạn, đồng thời không gây độc tế bào hay cản trở trao đổi chất của tế bào khi tích lũy ở nồng độ cao [21, 36]

1.2.3 Cơ sở phân tử của đáp ứng chống chịu hạn ở thực vật

Đáp ứng chống chịu hạn của thực vật được thực hiện thông qua một chuỗi các quá trình phức tạp có thể chia thành 3 giai đoạn: nhận tín hiệu, dẫn truyền tín hiệu và đáp ứng chống chịu , với sự tham gia của hàng loạt yếu tố như kinase, nhân tố điều hòa phiên mã, protein chức năng (Hình 1.1)

Hình 1.1 | Giản đồ mô tả quá trình phản ứng chịu hạn ở thực vật

1.2.3.1 Nhận tín hiệu

Đây là bước đầu tiên để thực vật đáp ứng với stress môi trường với sự tham gia của một số hormone quan trọng như ABA, cytokinin, auxin ethylence… Cho tới nay, các nhà khoa học vẫn cho rằng rễ là cơ quan chính

có khả năng cảm nhận stress hạn của môi trường và ABA là phân tử tín hiệu nội sinh có vai trò then chốt trong quá trình này [85, 91, 92] Hai chức năng được nghiên cứu nhiều nhất của ABA trong đáp ứng stress hạn là đóng khí khổng và điều hòa biểu hiện của một nhóm lớn các gen đáp ứng stress Chính

vì vậy, quá trình dẫn truyền tín hiệu stress hạn thường liên quan chặt chẽ với quá trình dẫn truyền tín hiệu ABA Trong tế bào thực vật tồn tại song song hai con đường truyền tín hiệu stress: phụ thuộc ABA và không phụ thuộc ABA [85, 91, 92]

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh ABA có khả năng hoạt hóa nhiều loại protein kinase [27, 85, 92] Các protein kinase sau đó sẽ tiếp tục hoạt hóa các

nhân tố phiên mã thông qua quá trình phosphoryl hóa để điều khiển sự biểu hiện của các gen chức năng đáp ứng stress hạn [24] Một số nghiên cứu trên

cây mô hình Arabidopsis thaliana cho thấy histidine kinase AtHK1 có liên

quan tới quá trình cảm nhận tín hiệu thay đổi áp suất thẩm thấu [92] Sự biểu hiện của AtHK1 kéo theo sự biểu hiện của một số nhân tố phiên mã đáp ứng stress (ví dụ như AREB1, ANAC, DREB2A) và các protein này đóng vai trò

là yếu tố điều hòa dương tính trong đáp ứng chống chịu hạn và mặn theo cả

hai con đường phụ thuộc và không phụ thuộc ABA ở A thaliana [24, 62, 41]

Tuy nhiên, những bằng chứng cụ thể chứng minh vai trò của các protein này hiện vẫn chưa sáng tỏ

1.2.3.2 Quá trình truyền tín hiệu

Sau khi tín hiệu stress được phát động, tế bào sẽ sản sinh ra các phân tử tín hiệu thứ cấp thông qua các phản ứng enzyme đặc trưng Phân tử tín hiệu thứ cấp được chia thành ba loại cơ bản: (a) các phân tử kị nước liên kết màng

tế bào như diacylglycerol, IP3 và phosphatidylinositol; (b) các phân tử ưa nước như cAMP, cGMP và Ca2+

nằm trong tế bào chất và (c) các phân tử khí như NO và CO có thể khuếch tán xuyên qua tế bào chất và màng tế bào Ngoài ra, các ROS sinh ra trong điều kiện stress hạn và một số phân tử tín hiệu khác như Ca2+

(được dự trữ trong các bào quan riêng, có thể được giải phóng nhanh chóng khi cần thiết) cũng có thể đóng vai trò là phân tử tín hiệu thứ cấp trong phản ứng chống chịu hạn ở thực vật [21, 22, 36]

Quá trình truyền tín hiệu là một chuỗi các phản ứng phosphoryl hóa protein, đòi hỏi các điều kiện chính xác về không gian và thời gian đối với tất

cả các phân tử tín hiệu Chính vì vậy, ngoài các thành phần trực tiếp dẫn truyền tín hiệu, trong tế bào còn có những phân tử nhất định tham gia vào quá trình biến đổi, đóng gói hoặc cấu thành các thành phần tín hiệu Các phân tử

hỗ trợ này bao gồm các yếu tố biến đổi protein, ví dụ như enzyme xúc tác quá trình lipid hóa, methyl hóa, glycosyl hóa và ubiquitin hóa protein… [22]

1.2.3.3 Đáp ứng chống chịu

Các phản ứng đáp ứng chịu hạn là bước cuối cùng để đáp ứng lại tín hiệu stress hạn, tế bào thực vật tăng cường sự biểu hiện của hàng loạt các gen liên quan tới đáp ứng chống chịu Dựa vào chức năng trong đáp ứng chống chịu hạn, có thể chia sản phẩm protein của các gen chức năng này thành một

số nhóm: protein tham gia vào quá trình tổng hợp chất hòa tan, enzyme chống oxy hóa, protein sốc nhiệt, protein LEA (late embryogenesis abundant protein), aquaporin, polyamin, protein tham gia ổn định cấu trúc màng, protein tham gia vào các quá trình tổng hợp, phân giải và sửa chữa [56, 91, 104]

Trong điều kiện stress hạn, tế bào thực vật còn tích lũy các ROS với nồng độ cao có khả năng gây độc cho tế bào Do đó, bên cạnh việc tích lũy các chất hòa tan, theo hướng ngược lại, tế bào có chế độ khử độc ROS, bảo vệ các bào quan và các chất phân tử lượng cao [91] Một nhóm hợp chất khác có chức năng bảo vệ tế bào thực vật trong điều kiện stress hạn là các protein sốc nhiệt (HSP) Một số nghiên cứu về chuyển gen HSP đã chứng minh vai trò tăng cường tính chống chịu hạn của HSP trong cây chuyển gen và trong tế bào nấm men [91]

Protein LEA là một họ lớn các protein được biểu hiện nhiều ở giai đoạn phát triển phôi muộn và trong nhiều điều kiện stress khác nhau như hạn, mặn, lạnh, nóng và ABA Đặc điểm chung của protein LEA là ưa nước, bền nhiệt

và biểu hiện gen đáp ứng ABA Chức năng của protein LEA cho tới nay vẫn chưa được làm rõ, tuy nhiên hầu hết các nhà nghiên cứu đều cho rằng protein này hoạt động như những phân tử liên kết nước trong các quá trình tạo phức

hóa ion và duy trì ổn định cấu trúc màng tế bào và các đại phân tử Rất nhiều nghiên cứu đã chứng minh việc chuyển gen mã hóa protein LEA đã giúp tăng khả năng chống chịu hạn của cây chuyển gen Điều này chứng tỏ vai trò quan trọng của protein LEA trong đáp ứng chống chịu hạn ở thực vật [91, 92, 104]

Aquaporin là nhóm protein thuộc họ protein xuyên màng có tính bảo thủ cao Aquaporin tham gia vào quá trình vận chuyển nước qua màng bằng cách tạo ra các lỗ dẫn nước trong lớp lipid kép của màng, giúp tăng tốc độ hấp thu nước Protein này được biểu hiện nhiều trong các tế bào thuộc mô đang sinh trưởng và mô rễ Các nghiên cứu về vai trò của aquaporin vẫn được thực hiện nhiều năm qua, tuy nhiên mối tương quan giữa aquaporin và khả năng chống chịu hạn của thực vật vẫn chưa được làm sáng tỏ Nghiên cứu ở cấp độ gen cho thấy sự biểu hiện của gen mã hóa aquaporin được điều hòa dương trong điều kiện stress hạn và điều hòa âm trong điều kiện stress mặn, chứng tỏ mức độ tích lũy aquaporin dường như liên quan tới đáp ứng của tế bào với thế nước của môi trường ngoại bào [91]

Ngoài các hợp chất trực tiếp tham gia vào các quá trình điều hòa áp suất thẩm thấu, liên kết nước, khử độc…, các protein/enzyme tham gia vào các quá trình tổng hợp, phân giải và sửa chữa cũng có vai trò nhất định giúp bảo vệ tế bào chống lại điều kiện khô hạn Ví dụ , yếu tố kéo dài chuỗi 1-α (ELF1-α) là một thành phần không thể thiếu trong quá trình sinh tổng hợp protein và được tích lũy với hàm lượng rất cao trong quá trình đáp ứng stress

ở thuốc lá, chứng tỏ vai trò của protein này đối với đáp ứng chống chịu của tế

bào Ở A thaliana và đậu Hà Lan, hàm lượng mRNA của các gen mã hóa các

protein tương đồng với protease và ubiquitinase (thành phần chính của bộ máy phân giải protein) tăng lên rõ rệt trong điều kiện hạn và mặn [37, 39, 70] Đây có thể là một cơ chế giúp tế bào loại bỏ các protein bị sai hỏng do stress

và tái sử dụng nguồn nitơ [31, 51, 70]

Bên cạnh đó, do tác động của stress hạn, các gốc acid amin trong phân

tử protein có thể bị biến đổi bởi các quá trình như deamin hóa, isomer hóa hay oxy hóa Để hạn chế ảnh hưởng của các quá trình này, tế bào cũng tăng cường tổng hợp các enzyme sửa chữa như L-isoaspartyl methyl transferase biến đổi gốc L-isoaspartyl (trong các protein bị sai hỏng do stress) thành gốc L-aspartyl Đặc biệt, ở rêu, tế bào đáp ứng với stress hạn chủ yếu theo cơ chế sửa chữa protein Các thực tế trên chứng tỏ trong tế bào luôn có sự chuyển đổi linh hoạt giữa hoạt động của hai bộ máy bảo vệ/sửa chữa và phân giải protein trong đáp ứng stress hạn [58, 91]

1.3 CÁC NHÂN TỐ PHIÊN MÃ LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN Ở THỰC VẬT

Dòng chảy di truyền từ DNA đến protein trải qua quá trình rất quan trọng là quá trình phiên mã Các nhân tố phiên mã bám vào trình tự DNA đặc hiệu trên vùng khởi động gen của các gen chức năng và điều hòa biểu hiện các gen này Nhóm gen mã hóa các nhân tố phiên mã chiếm khoảng 8-10% trong mỗi hệ gen và đóng vai trò quan trọng trong mọi hoạt động của sự sống như quá trình sinh trưởng, phát triển và chống chịu với bất lợi môi trường Ở lúa, hơn 2600 gen mã hóa nhân tố phiên mã đã được phân lập và phân chia thành các nhóm, họ và siêu họ dựa theo trình tự nucleotide và chức năng

Rất nhiều gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan đến chịu hạn ở thực vật đã được nghiên cứu chức năng ở mức độ phân tử và được phân làm 2 nhóm chính: phụ thuộc ABA và không phụ thuộc ABA (Hình 1.2) Các đại diện của nhóm nhân tố phiên mã phụ thuộc ABA có thể kể tới như nhóm NAC, nhóm AREB/ABF, nhóm MYB và MYC trong số đó nhóm NAC có các đại diện đã được phân lập và nghiên cứu đặc tính chi tiết ở lúa Nhóm không phụ thuộc ABA có đại diện là các gen thuộc họ AP2/ERF đã được

phân lập và nghiên cứu chức năng ở cả cây mô hình Arabidopsis (Hình 1.2) và các cây lương thực quan trọng như ngô, lúa, đậu tương

Các nhân tố phiên mã về mặt cầu trúc có hai vùng hoạt động : (1) vùng hoạt hoá các protein chức năng (activation domain) và (2) vùng liên kết (binding domain) với các trật tự DNA đặc hiệu (cis-acting element) trên vùng khởi động gen (promoter) Các nhân tố phiên mã điều hòa biểu hiện các gen chức năng tăng cường tính chịu hạn phân loại dựa vào trật tự DNA đặc hiệu

mà chúng liên kết Vùng khởi động gen của hầu hết các gen liên quan đến tính chịu hạn thường chứa một/nhiều trật tự DNA đặc hiệu phổ biến là ABRE (ABA responsive element - yếu tố đáp ứng ABA) và DRE/CRT (Dehydration responsive element/C repeat - yếu tố/đoạn C lặp lại đáp ứng hạn), NAC, MYB với chức năng là điểm bám của các nhân tố phiên mã biểu hiện phụ thuộc/không phụ thuộc vào ABA

Hình 1.2 | Con đường dẫn truyền tín hiệu đáp ứng stress ở A thaliana

1.3.1 Nhóm nhân tố phiên mã NAC

Protein NAC là một trong những họ nhân tốc phiên mã (transcription factor – TF) lớn đặc trưng của thực vật, với khoảng 110 thành viên ở

Arabidopsis và 150 thành viên ở lúa [41, 79] Các nhân tố phiên mã thuộc họ

NAC (NAM, ATAF, CUC) tham gia vào rất nhiều hoạt động chức năng quan trọng trong quá trình phát triển và đáp ứng stress của thực vật Nghiên cứu hệ

gen của Arabidopsis cho thấy toàn bộ các gen mã hóa nhân tố phiêm mã NAC

đều cảm ứng với ít nhất một loại yếu tố stress phi sinh học như hạn, mặn, lạnh hay ABA [41, 45] Protein NAC chứa domain NAC đặc trưng đóng vai trò liên kết DNA, bao gồm 168 gốc axit amin tạo thành 1 chuỗi xoắn β kép đối

song song và 2 chuỗi xoắn α nằm hai bên Trình tự bảo thủ WKATQTD nằm

trên chuỗi β có vai trò chính quyết định đặc tính lên kết DNA của protein NAC [41, 79] Protein NAC điều hòa hoạt động promter của các gen đáp ứng stress nhờ đặc tính liên kết với yếu tố NACBS (NAC-binding site) (5’-TTNCTGA/G-3’), với trình tự lõi được xác định là CGTG/A [45, 72, 79, 93]

Một số nhân tố phiên mã NAC thuộc phân nhóm III-3, có tên là ATAF hay SNAC (stress-responsive NAC), đã được nghiên cứu khá chi tiết ANAC019, ANAC055 và RD26 là ba thành viên thuộc nhóm này, đã được chứng minh cảm ứng biểu hiện trong điều kiện hạn, mặn và ABA Các protein này liên kết với promoter và hoạt hóa sự biểu hiện của một số gen đáp ứng

stress (ví dụ như như ERD1), qua đó tăng cường khả năng chống chịu hạn của

cây chuyển gen mô hình [96] ATAF1 cũng là một nhân tố phiên mã có ảnh

hưởng đến khả năng chống chịu hạn của cây Arabidopsis [41] Bên cạnh đó,

các nhân tố phiên mã của phân nhóm SNAC còn tham gia vào quá trình cảm nhận tín hiệu stress của tế bào thực vật [42, 63] Ngoài ra, một số nhân tố phiên mã của các phân nhóm khác như ANAC092 (phân nhóm II-3) và VNI2