Nghiên cứu chế tạo điện cực biến tính trên cở sở vật liệu nanocompozit của polime dẫn và vật liệu nanocacbon nhằm xác định điện hóa dopamin trong mẫu dược phẩm và sinh học

Do có tính chất ôxi hóa-khử điện hóa nên các phương pháp phân tích điện hóa được xem là lý tưởng khi xác định định lượng DA và cũng là giải pháp triển vọng nhất trong nghiên cứu phân tíc

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

_

Đỗ Phúc Tuyến

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO ĐIỆN CỰC BIẾN TÍNH TRÊN CƠ

SỞ VẬT LIỆU NANOCOMPOZIT CỦA POLIME DẪN VÀ VẬT LIỆU NANOCACBON NHẰM XÁC ĐỊNH ĐIỆN HÓA DOPAMIN TRONG MẪU DƯỢC PHẨM VÀ SINH HỌC

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Hà Nội - 2017

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

_

Đỗ Phúc Tuyến

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO ĐIỆN CỰC BIẾN TÍNH TRÊN CƠ

SỞ VẬT LIỆU NANOCOMPOZIT CỦA POLIME DẪN VÀ VẬT LIỆU NANOCACBON NHẰM XÁC ĐỊNH ĐIỆN HÓA DOPAMIN TRONG MẪU DƯỢC PHẨM VÀ SINH HỌC

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 62440118

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 TS Đỗ Phúc Quân

2 GS.TS Từ Vọng Nghi

Hà Nội - 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Đỗ Phúc Tuyến

LỜI CẢM ƠN

Công trình khoa học này được hoàn thành là sự nỗ lực của bản thân tôi cùng quá trình đào tạo và chỉ bảo của các thầy cô hướng dẫn, sự hỗ trợ tạo điều kiện và dành thời gian của đồng nghiệp và gia đình

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới cố GS.TS.Từ Vọng Nghi, sinh thời đã trực tiếp hướng dẫn tận tình, sâu sắc về mặt khoa học đồng thời tạo mọi điều kiện thuận lợi cho phép tôi hoàn thành tốt bản luận án này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới TS.Đỗ Phúc Quân, người đã tận tình trực tiếp chỉ bảo và định hướng chuyên môn khoa học cũng như đã truyền dạy những kỹ năng và phương pháp nghiên cứu để giúp tôi hoàn thành luận án này

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến GS.TS Phạm Hùng Việt và Ban giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Công nghệ Môi trường và Phát triển Bền vững (CETASD), trường Đại học Khoa học Tự nhiên-ĐHQG Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài tại trung tâm

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô trong Khoa Hóa học, Bộ môn Hóa học phân tích, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên-ĐHQG Hà Nội đã dạy dỗ, giúp

đỡ và bồi dưỡng cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt quá trình học tập

Công trình nghiên cứu của tôi được hoàn thành với sự hỗ trợ kinh phí từ Qũy Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia–NAFOSTED qua đề tài nghiên cứu 104.07.108.09; cũng như sự tài trợ kinh phí của Đại học Quốc gia Hà Nội thông qua đề tài QG.10.16

Tôi cũng xin cảm ơn các nhà khoa học đã có những ý kiến phản biện và ý kiến về chuyên môn giúp hoàn thành luận án này

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, đồng nghiệp đã luôn ở bên tôi, quan tâm, giúp đỡ, động viên và khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Hà nội, ngày tháng năm 2017

Đỗ Phúc Tuyến

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 DOPAMIN (DA) 3

1.1.1 Giới thiệu chung 3

1.1.2 Vai trò của dopamin trong cơ thể 4

1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DA 6

1.2.1 Phương pháp huỳnh quang 8

1.2.2 Phương pháp khối phổ 9

1.2.3 Phương pháp miễn dịch liên kết enzym (ELISA) 11

1.2.4 Phương pháp điện hóa 11

1.3 ĐIỆN CỰC BIẾN TÍNH HÓA HỌC XÁC ĐỊNH ĐIỆN HÓA DA 17

1.3.1 Tổng quan các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước 17

1.3.2 Các phương thức biến tính điện cực để xác định DA 25

1.3.3 Mục tiêu và ý nghĩa khoa học của đề tài nghiên cứu 36

1.4 KẾT LUẬN TỔNG QUAN 37

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39

2.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 39

2.2 THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT 40

2.2.1 Thiết bị và dụng cụ 40

2.2.2 Hóa chất 40

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41

2.3.1 Các phương pháp nghiên cứu phản ứng và bề mặt điện cực 41

2.3.2 Phương pháp von-ampe xung vi phân 43

2.3.3 Phương pháp điện hóa tổng hợp polime 43

2.3.4 Phương pháp phổ Raman 44

2.3.5 Phương pháp xác định các thông số đặc trưng của điện cực 44

2.3.6 Ứng dụng phân tích mẫu và đánh giá kết quả 45

2.4 THỰC NGHIỆM 45

2.4.1 ĐIỆN CỰC NF-SWCNTs/P3MT/GCE 45

2.4.2 ĐIỆN CỰC AuNPs/OPPy-MIP/Gr/GCE 49

2.4.3 PHÂN TÍCH MẪU DƯỢC PHẨM VÀ SINH HỌC 51

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 53

3.1 ĐẶC TRƯNG ĐIỆN HÓA CỦA DA TRÊN GCE 53

3.1.1 Trong môi trường pH 4 53

3.1.2 Trong môi trường pH 7 55

3.2 ĐIỆN CỰC BIẾN TÍNH NF-SWCNTs/P3MT/GCE 58

3.2.1 Tổng hợp poli-(3-metylthiophen) (P3MT) trên điện cực GCE và khảo sát đáp ứng với DA 58

3.2.2 Tổng hợp compozit của Nafion với P3MT trên điện cực GCE và khảo sát đáp ứng với DA 65

3.2.3 Khảo sát các tính chất điện hóa của DA trên điện cực NF-SWCNTs/P3MT/GCE 75

3.2.4 Các đặc trưng phân tích của điện cực NF-SWCNTs/P3MT/GCE 79

3.3 ĐIỆN CỰC BIẾN TÍNH AuNPs/OPPy-MIP/Gr/GCE 89

3.3.1 Tổng hợp và khảo sát graphen (Gr) 89

3.3.2 Tổng hợp và khảo sát các lớp vật liệu biến tính 91

3.3.3 Tính chất của điện cực AuNPs/OPPy-MIP/Gr/GCE 103

3.3.4 Các đặc trưng phân tích của điện cực AuNPs/OPPy-MIP/Gr/GCE 110

3.4 KẾT QUẢ ỨNG DỤNG PHÂN TÍCH MẪU 114

3.4.1 Quy trình phân tích 114

3.4.2 Phân tích DA bằng điện cực NF-SWCNTs/P3MT/GCE 116

3.4.3 Phân tích DA bằng điện cực AuNPs/OPPy-MIP/Gr/GCE 117

3.5 TỔNG HỢP CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 119

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN 122

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 123

TÀI LIỆU THAM KHẢO 124

PHỤ LỤC i

Phụ lục 1: Tín hiệu EDS của bề mặt điện cực AuNPs/OPPy-MIP/Gr/ITO i

Phụ lục 2: Một số tín hiệu phân tích thực tế iii

Phụ lục 3 Kết quả kiểm nghiệm đối chứng mẫu dược phẩm v

Phụ lục 4 Kết quả kiểm nghiệm đối chứng mẫu nước tiểu vi

Phụ lục 5: Một số vấn đề lý thuyết điện hóa liên quan đến luận án viii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ tiếng Việt (tiếng Anh)

AA Axit ascobic (Ascorbic acid)

AuNPs Hạt nano vàng (Gold nanoparticles)

CE Điện di mao quản (Capillary Electrophoresis)

CNTs Cacbon nano dạng ống (Carbon nanotubes)

CPs Polime dẫn (Conducting polymers)

CV Von-ampe vòng (Cyclic voltametry)

CVD Tổng hợp ngưng hơi hóa học (Chemical vapor deposition)

DA Dopamin (Dopamine)

DOPA 3,4-Dihydroxyphenylalanin (3, 4-Dihydroxyphenylalanine) DOPAC 3,4-Dihydroxyphenyl axetic axit (3,4-Dihydroxyphenyl-acetic

acid) DPV Von-ampe xung vi phân (Differential-Pulse Voltammetry) ELISA Phương pháp miễn dịch liên kết enzym (Enzyme Linked

Immunosorbent Assay) FSCV Phương pháp von-ampe vòng quét nhanh (Fast-scan cyclic

voltametry) GCE Điện cực glasy cacbon (Glassy carbon electrode)

Gr Graphen (Graphene)

Gr/GCE Điện cực glasy cacbon biến tính bằng graphen

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-performance liquid

chromatography) HPLC/FL Sắc ký lỏng ghép nối đe-tec-tơ huỳnh quang (High-performance

liquid chromatography with fluoresence detector) HVA Axit homovanilic (Homovanillic acid)

ITO Oxit inđi thiếc (Indium tin oxide)

Viết tắt Viết đầy đủ tiếng Việt (tiếng Anh)

LC Sắc ký lỏng (Liquid chromatography)

LC-ECD Phương pháp sắc ký lỏng ghép nối cảm biến điện hóa (Liquid

chromatography–electrochemical detection) MEKC Sắc ký điện động học mixen (micellar electrokinetic

chromatography) MIP Polime in dấu phân tử (Molacular imprinting polymer)

PMMA Polimetyl metacrylat (Polymethyl methacrylate)

PPy Polipyrol (Polypyrrol)

Py Pyrol (Pyrrol)

S/N Tỷ lệ cường độ tín hiệu trên nhiễu (Signal-to-noise ratio)

SAMs Các đơn lớp tự lắp ghép (Self-assembled monolayers)

SWCNTs Ống nanocacbon đơn vách (Single wall carbon nanotubes) TBAP Tetrabutyl amoni peclorat (Tetrabuthyl ammonium perchlorate)

UA Axit uric (Uric acid)

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Hàm lượng bình thường dopamin trong mẫu sinh học 7 Bảng 1.2 Bảng tổng hợp công trình nghiên cứu trên thế giới công bố gần đây

20

Bảng 3.1 Số liệu đường chuẩn xác định DA trong môi trường đệm PBS nồng

độ 0,1 M với pH 4, điện cực làm việc GCE, phương pháp đo von-ampe vòng 53

Bảng 3.2 Số liệu đường chuẩn xác định DA trong môi trường đệm PBS nồng

độ 0,1 M với pH 4, điện cực làm việc GCE, phương pháp đo xung vi phân 54

Bảng 3.3 Số liệu đường chuẩn xác định DA trong môi trường đệm PBS nồng

độ 0,1 M với pH 7, điện cực làm việc GCE, phương pháp đo xung vi phân 58

Bảng 3.4 Số liệu đường chuẩn xác định DA trong môi trường đệm PBS nồng

độ 0,1 M với pH 4, điện cực làm việc P3MT/GCE, kỹ thuật đo von-ampe vòng 62

Bảng 3.5 Vị trí điện thế của píc anot (Epa) và píc catot (Epc) khi xác định DA

bằng điện cực P3MT/GCE trong môi trường PBS 0,1 M với pH 4 63

Bảng 3.6 Số liệu đường chuẩn xác định DA trong môi trường đệm PBS nồng

độ 0,1 M với pH 4, điện cực làm việc P3MT/GCE, đo xung vi phân 64Bảng 3.7 Vị trí thế oxi hóa và cường độ tín hiệu theo pH của điện cực NF/P3MT/GCE 68

Bảng 3.8 Khoảng tách píc tín hiệu điện thế giữa DA và AA theo pH 69 Bảng 3.9 Cường độ tín hiệu píc anot (Ipa) và píc catot (Ipc) với nồng độ DA

khi đo CV với điện cực NF/P3MT/GCE trong đệm PBS 0,1 M và pH 4 70

Bảng 3.10 Thế oxi hóa khử và cường độ tín hiệu của điện cực NF/P3MT/GCE

trong PBS 0,1 M với pH 4 chứa DA 5×10-5 M với tốc độ quét thế thay đổi 71

Bảng 3.11 Số liệu đường chuẩn xác định độ DA với điện cực NF/P3MT/GCE

trong đệm PBS 0,1 M và pH 4, phương pháp xung vi phân 73

Bảng 3.12 Số liệu đường chuẩn DA trong hỗn hợp chứa đồng thời DA và AA

trên điện cực NF/P3MT/GCE, môi trường đo pH 4, PBS 0,1 M 74

Bảng 3.13 Vị trí píc tín hiệu của AA, DA, UA và khoảng tách tín hiệu 77 Bảng 3.14 Thế oxi hóa khử và cường độ tín hiệu của điện cực NF-

SWCNTs/P3MT/GCE trong PBS 0,1 M với pH 4 chứa DA 10-4 M với tốc độ quét thế thay đổi 79

Bảng 3.15 Số liệu đường chuẩn xác định DA trong môi trường đệm PBS nồng

độ 0,1 M với pH 4 điện cực làm việc NF-SWCNTs/P3MT/GCE 80

Bảng 3.16 Số liệu đường chuẩn xác định DA trong môi trường đệm PBS nồng

độ 0,1 M với pH 4 chứa đồng thời AA, DA, UA và đường chuẩn xác định DA điện cực làm việc NF-SWCNTs/P3MT/GCE, đo xung vi phân 81

Bảng 3.17 Số liệu về độ lặp lại khi đo DA, phương pháp xung vi phân, điện

cực làm việc NF-SWCNTs/P3MT/GCE 84

Bảng 3.18 Ảnh hưởng của các chất đến tín hiệu DPV của DA 86 Bảng 3.19 Các thông số đặc trưng của các điện cực biến tính 88 Bảng 3.20 Thế oxi hóa khử và cường độ tín hiệu của điện cực AuNPs/OPPy-

MIP/Gr/GCE trong PBS 0,1 M pH 7 chứa DA 5×10-5 M theo tốc độ quét thế 104

Bảng 3.21 Cường độ tín hiệu (Ipa) khi quét CV với tốc độ quét (ʋ) thay đổi

dung dịch K3Fe(CN)6 /K4Fe(CN)6 5 mM trong KCl 0,1 M, điện cực làm việc OPPy-MIP/Gr/GCE 106

Bảng 3.22 Cường độ tín hiệu (Ipa) khi quét CV với tốc độ quét (ʋ) thay đổi

dung dịch Fe(CN)64-/3- 5 mM trong KCl 0,1 M sử dụng điện cực làm việc AuNPs/OPPy-MIP/Gr/GCE 107

Bảng 3.23 Hệ số góc k tương ứng nồng độ DA 109 Bảng 3.24 Số liệu đường chuẩn xác định DA trong môi trường đệm PBS nồng

độ 0,1 M với pH 7 điện cực làm việc AuNPs/OPPy-MIP/Gr/GCE 110

Bảng 3.25 Độ lặp lại khi đo DA bằng điện cực AuNPs/OPPy-MIP/Gr/GCE

112

Bảng 3.26 Số liệu về sự thay đổi cường độ tín hiệu DPV của DA 10 µM khi

trong dung dịch đo xuất hiện các chất khác với nồng độ cao gấp n lần 113

Bảng 3.27 Số liệu về độ chụm xác định nồng độ dopamin trong mẫu thuốc

tiêm sử dụng điện cực biến tính NF-SWCNTs/P3MT/GCE 116

Bảng 3.28 Phân tích mẫu thuốc tiêm với điện cực NF-SWCNTs/P3MT/GCE

117

Bảng 3.29 Phân tích mẫu nước tiểu với điện cực NF-SWCNTs/P3MT/GCE

117

Bảng 3.30 Kết quả phân tích mẫu nước tiểu so sánh phương pháp điện hóa

với điện cực AuNPs/OPPy-MIP/Gr/GCE và phương pháp ELISA 118

Bảng 3.31 Số liệu về độ chụm xác định nồng độ DA trong mẫu nước tiểu 10

µM sử dụng điện cực biến tính AuNPs/OPPy-MIP/Gr/GCE 119

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Các chất quan trọng trong sinh hóa thuộc nhóm catecholamin 3

Hình 1.2 Phản ứng tổng hợp DA trong phòng thí nghiệm 4

Hình 1.3 Khớp thần kinh và vai trò truyền dẫn tín hiệu của DA [175] 6

Hình 1.4 Phản ứng oxi hóa – khử DA 13

Hình 1.5 Hình minh họa hệ thiết bị cấy ghép truyền tín hiệu không dây gồm điện cực kích thích và các cảm biến nhạy với các hợp chất thần kinh trong nhân đồi thị và vi mạch đo, chuyển đổi và truyền tín hiệu [4] 16

Hình 1.6 Số lượng bài báo liên quan đến phương pháp và một số chất thần kinh quan trọng trong giai đoạn 2010-2013 [115] 17

Hình 1.7 Số lượng công trình được công bố đến 2013 liên quan đến ứng dụng các vật liệu nano để xác định dopamin [115] 18

Hình 1.8 Cấu trúc các vật liệu cacbon nano [41, 107] 26

Hình 1.9 Các phương thức chức năng hóa cacbon dạng ống nano [66, 106] 27

Hình 1.10 Nguyên tắc chung cho polime in dấu phân tử [151] 36

Hình 2.1 Các vị trí và các nhóm chức hình thành trong quá trình chức năng hóa SWCNTs [66, 106] 46

Hình 2.2 Quá trình chuyển lớp màng graphen tổng hợp CVD lên bề mặt điện cực glasy cacbon [166] 50

Hình 2.3 Sơ đồ quá trình chế tạo điện cực AuNPs/Gr/OPPy-MIP/GCE 51

Hình 2.4 Mẫu dược phẩm thuốc tiêm dopamin được tiến hành phân tích 52

Hình 3.1 Tín hiệu CV (hình A) và đường chuẩn cường độ tín hiệu píc anot (hình B) của điện cực GCE trong dung dịch DA với môi trường đo pH 4 của dung dịch đệm PBS 0,1 M 53

Hình 3.2 Tín hiệu von-ampe xung vi phân (hình A) với điện cực GCE trong

môi trường pH 4 dung dịch đệm PBS 0,1 M và đường tuyến tính cường độ dòng tín hiệu theo nồng độ DA (hình B) 54

Hình 3.3 Tín hiệu xung vi phân của hỗn hợp DA và AA khi xác định bằng

điện cực GCE trong môi trường đo dung dịch đệm PBS 0,1 M với pH 4 55

Hình 3.4 Đường tín hiệu von-ampe vòng khi quét liên tục 5 vòng dung dịch

DA trong môi trường pH 7 dung dịch đệm PBS 0,1 M 55

Hình 3.5 Tín hiệu CV (hình A) và DPV (hình B) khi sử dụng điện cực GCE

xác định DA trong sự có mặt của AA 56

Hình 3.6 Tín hiệu CV (hình A) và DPV (hình B) của điện cực GCE trong

dung dịch pH 7 đệm PBS 0,1 M chứa AA, DA và UA 57

Hình 3.7 Tín hiệu xung vi phân (hình A) và đường chuẩn (hình B) xác định

DA với điện cực GCE trong môi trường pH 7 đệm photphat 0,1 M 57

Hình 3.8 Tín hiệu điện phân và cơ chế tổng hợp điện hóa lớp màng

poli-(3-metylthiophen) 59

Hình 3.9 Hình ảnh hiển vi điện tử (SEM) của lớp màng P3MT 59 Hình 3.10 Ảnh hưởng của thời gian điện phân tổng hợp màng P3MT nên khả

năng đáp ứng với DA 60

Hình 3.11 Tín hiệu CV -0,3–0,7 V tốc độ quét 100 mV/s của điện cực GCE

và P3MT/GCE trong dung dịch DA 50 µM, môi trường dung dịch đệm PBS 0,1 M pH 4 61

Hình 3.12 Tín hiệu CV (hình A) và đường chuẩn theo píc anot (hình B) của

điện cực P3MT/GCE dung dịch DA, PBS 0,1 M, pH 4 62

Hình 3.13 Tín hiệu xung vi phân (hình A) và đường chuẩn (hình B) khi xác

định DA bằng điện cực P3MT/GCE trong môi trường đệm PBS 0,1 M, pH 4 63

Hình 3.14 Tín hiệu DPV (hình A) và CV (hình B) khi sử dụng điện cực

P3MT/GCE để xác định AA, DA, UA, hỗn hợp AA-DA-UA trong môi trường PBS 0,1 M với pH 4 64

Hình 3.15 Hình ảnh hiển vi điện tử (SEM) của lớp compozit NF/P3MT 65 Hình 3.16 Tín hiệu DPV và cường độ tín hiệu điện cực NF/P3MT/GCE trong

dung dịch DA 0,1 M, PBS 0,1 M, pH 4 với hàm lượng nafion phủ khác nhau 66

Hình 3.17 Ảnh hưởng của pH đến quá trình oxy hoá DA trên điện cực

NF/P3MT/GCE 67

Hình 3.18 Vị trí píc tín hiệu điện thế của DA phụ thuộc vào pH của dung dịch

đệm PBS 0,1 M 68

Hình 3.19 Ảnh hưởng của pH đến khả năng tách tín hiệu hỗn hợp DA-AA

trên điện cực NF/P3MT/GCE trong đệm PBS 0,1 M các giá trị pH khác nhau 69

Hình 3.20 Đường CV của DA nồng độ khác nhau (a→k) (hình A) và quan

hệ cường độ tín hiệu píc anot (Ipa) và píc catot (Ipc) với nồng độ DA (hình B) trên điện cực NF/P3MT/GCE trong đệm PBS 0,1 M và pH 4 70

Hình 3.21 Đường CV (hình A) của điện cực NF/P3MT/GCE trong đệm PBS

0,1 M với pH 4 chứa nồng độ DA 5×10-5 M với tốc độ quét thế thay đổi và quan

hệ cường độ tín hiệu píc anot (Ipa), píc catot (Ipc) tuyến tính căn bậc hai tốc độ quét thế (hình B) 71

Hình 3.22 Tín hiệu xung vi phân (hình A) và đường chuẩn (hình B) khi xác

định DA bằng điện cực NF/P3MT/GCE 72

Hình 3.23 Tín hiệu DPV (hình A) và đường chuẩn DA (hình B) trong hỗn

hợp chứa đồng thời DA và AA trên điện cực NF/P3MT/GCE, môi trường đo

pH 4, PBS 0,1 M 73

Hình 3.24 Tín hiệu DPV (hình A) và CV (hình B) trong hỗn hợp chứa đồng

thời AA, DA và UA trên điện cực NF/P3MT/GCE trong đệm PBS 0,1 M pH 4 74

Hình 3.25 Hình ảnh hiển vi điện tử (SEM) của bề mặt điện cực

NF-SWCNTs/P3MT/GCE 75

Hình 3.26 Tín hiệu DPV (hình A) khi sử dụng các thể tích dung dịch

NF-SWCNTs khác nhau để biến tính điện cực NF-NF-SWCNTs/P3MT/GCE và đồ thị cường độ tín hiệu (hình B) tương ứng 76

Hình 3.27 Tín hiệu DPV (hình A) và cường độ píc anot của DA (hình B) khi

đo hỗn hợp gồm DA 1×10-4 M, AA 2,5×10-3 M, UA 4,15×10-4 M trên điện cực NF-SWCNTs/P3MT/GCE trong đệm PBS 0,1M với các giá trị pH thay đổi 77

Hình 3.28 Tín hiệu CV (hình A) của điện cực NF-SWCNTs/P3MT/GCE trong

PBS 0,1 M, pH 4 chứa DA 10-4 M với tốc độ quét thế thay đổi và đường biểu diễn tuyến tính (hình B) giữa cường độ píc anot và catot với tốc độ quét thế 78

Hình 3.29 Tín hiệu von-ampe xung vi phân (hình A) dung dịch DA với điện

cực NF-SWCNTs/P3MT/GCE, môi trường pH 4 dung dịch đệm PBS 0,1 M và đường chuẩn (hình B) cường độ tín hiệu tỷ lệ nồng độ DA 79

Hình 3.30 Tín hiệu DPV (hình A) của điện cực NF-SWCNTs/P3MT/GCE

trong dung dịch đệm PBS 0,1 M pH 4 chứa đồng thời AA, DA, UA và đường

chuẩn xác định DA (hình B) 81

Hình 3.31 Tín hiệu CV (hình A) và DPV (hình B) của dung dịch đệm PBS

0,1 M pH 4 chứa AA, DA và UA riêng rẽ 82

Hình 3.32 Tín hiệu CV (hình A) và DPV (hình B) của dung dịch đệm PBS

0,1 M pH 4 chứa AA, DA và UA hỗn hợp 82

Hình 3.33 Quá trình oxi hóa các chất AA, DA, UA trên bề mặt P3MT 83 Hình 3.34 Mô phỏng quá trình khuyếch tán DA, AA vào bề mặt điện cực biến

tính NF-SWNT/P3MT/GCE 83

Hình 3.35 Độ ổn định tín hiệu sau nhiều lần đo ở nhiều nồng độ DA của điện

cực NF-SWCNTs/P3MT/GCE 85

Hình 3.36 Cường độ tín hiệu DPV của dopamin trong sự có mặt của một số

hợp chất với nồng độ gấp 500 đến 2000 lần 86

Hình 3.37 Hình A: Tín hiệu DPV của điện cực NF-SWCNTs/P3MT/GCE

trong mẫu trắng trước (1) và sau khi làm sạch điện cực (2) Hình B: Đường CV của quá trình làm sạch điện cực NF-SWCNTs/P3MT/GCE sau khi đo DA với tốc độ quét 100 mV/s, 20 vòng quét trong đệm PBS 0,1 M, pH7 87

Hình 3.38 Phổ Raman của lớp graphen 90 Hình 3.39 Hình ảnh hiển vi lực nguyên tử (AFM) của lớp graphen 90 Hình 3.40 Tín hiệu điện hóa quá trình tổng hợp lớp polipyrol không chứa

phân tử dopamin (A) và polipyrol có chứa phân tử dopamin (B) 91

Hình 3.41 Hình minh họa tương tác giữa phân tử dopamin trong polipyrol in

dấu phân tử dopamin 91

Hình 3.42 Ảnh hưởng của số vòng quét CV (n) trong quá trình tổng hợp

PPy(DA) đến độ nhạy với DA 93

Hình 3.43 Đường chuẩn xác định DA bằng điện cực PPy-MIP/Gr/GCE với

số vòng quét CV (n) tổng hợp PPy-MIP khác nhau 94

Hình 3.44 Tín hiệu CV và cơ chế phản ứng của quá trình quá oxi hóa

PPy-MIP thành OPPy-PPy-MIP 95

Hình 3.45 Hình ảnh hiển vi điện tử (SEM) của bề mặt điện cực ITO phủ lớp

màng polipyrol chưa quá oxi hóa (PPy-MIP) và đã bị quá oxi hóa (OPPy-MIP) 96

Hình 3.46 Píc tín hiệu điện hóa của quá trình khử tổng hợp AuNPs 97 Hình 3.47 Đường chuẩn xác định DA bằng điện cực AuNPs/PPy-

MIP/Gr/GCE với số vòng quét CV (n) tổng hợp AuNPs khác nhau 98

Hình 3.48 Ảnh hưởng của số vòng quét CV (n) trong quá trình tổng hợp

AuNPs đến độ nhạy với DA 99

Hình 3.49 Hình ảnh hiển vi điện tử của bề mặt điện cực ITO khi được tổng

hợp trực tiếp các hạt nano vàng (ITO/AuNPs) bằng phương pháp điện hóa 100

Hình 3.50 Hình ảnh hiển vi điện tử (SEM) của bề mặt điện cực ITO phủ lớp

compozit OPPy-MIP/AuNPs 101

Hình 3.51 Tín hiệu EDS của bề mặt điện cực AuNPs/OPPy-MIP/Gr/ITO 102 Hình 3.52 Tín hiệu CV khi quét trong dung dịch K3Fe(CN)6 /K4Fe(CN)6 nồng

độ 5 mM và KCl 0,1 M với các điện cực làm việc khác nhau 103

Hình 3.53 Tín hiệu CV (hình A) và quan hệ tuyến tính (hình B) giữa cường

độ tín hiệu píc anot (Ipa) và píc catot (Ipc) với tốc độ quét thế ʋ (mV/s) Môi trường đo dung dịch đệm PBS 0,1 M pH 7, DA 5×10-5M 104

Hình 3.54 Tín hiệu quét CV (A) và đường biểu diễn Ipa–ʋ1/2 (B) khi đo dung dịch K3Fe(CN)6 /K4Fe(CN)6 5 mM trong KCl 0,1 M với điện cực làm việc OPPy-MIP/Gr/GCE 106

Hình 3.55 Tín hiệu quét CV (A) và đường biểu diễn I–ʋ1/2 (B) khi đo dung dịch Fe(CN)64-/3- 5 mM trong KCl 0,1 M với điện cực làm việc AuNPs/OPPy-MIP/Gr/GCE 107

Hình 3.56 Đường chronoampe ở thế 100 mV nồng độ DA thay đổi , điện cực

AuNPs/OPPy-MIP/Gr/GCE nồng độ khác nhau trong đệm PBS 0,1 M, pH 7 108

Hình 3.57 Đường I-t-1/2 (đường Cottrell) khi đo dung dịch DA với điện cực làm việc AuNPs/OPPy-MIP/Gr/GCE nồng độ khác nhau trong đệm PBS 0,1

M, pH 7 108

Hình 3.58 Đường biểu diễn tuyến tính giữa độ dốc (k) của đường I-t1/2 với nồng độ DA, điện cực làm việc là AuNPs/OPPy-MIP/Gr/GCE 109

Hình 3.59 Tín hiệu DPV (hình A) dung dịch DA trong môi trường đệm PBS

0,1 M với pH 7 điện cực làm việc AuNPs/OPPy-MIP/Gr/GCE và đường chuẩn tương ứng (hình B) 110

Hình 3.60 Tín hiệu DPV (hình A) và đường chuẩn tuyến tính cường độ tín

hiệu với nồng độ DA (hình B) khi đo dung dịch đệm PBS 0,1 M, pH 7, chứa

DA, AA và UA với điện cực làm việc AuNPs/OPPy-MIP/Gr/GCE 111

Hình 3.61 Độ ổn định tín hiệu sau nhiều lần đo ở nhiều nồng độ DA của điện

cực AuNPs/OPPy-MIP/Gr/GCE 112

Hình 3.62 Cường độ tín hiệu DPV của dopamin trong sự có mặt của các chất

ảnh hưởng với nồng độ cao 113

1

MỞ ĐẦU

Dopamin (DA) là chất truyền dẫn thần kinh quan trọng nhất trong số các chất thuộc nhóm catecholamin (gồm epinphrin, norepinphrin và dopamin) Nhóm chất này là những chỉ tiêu xét nghiệm để chẩn đoán sàng lọc những bệnh nguy hiểm như u tế bào ưa crôm (pheochromocytoma), u nguyên bào thần kinh (neuroblastoma) và u tế bào hạch (ganglioneuroma) Trong cơ thể, DA có vai trò quan trọng đối với hệ thần kinh trung ương kiểm soát sự vận động, chức năng thận, hệ thống hoocmon và tim mạch DA liên quan trực tiếp đến bệnh Parkinson và nhiều chức năng khác của não bộ, liên quan đến trạng thái hưng phấn quá mức do bị kích thích, trạng thái trầm cảm, chứng nghiện chất kích thích và quá trình hồi tỉnh sau mê Trong y học người ta rất mong muốn xác định được một cách nhanh chóng và chính xác nồng độ DA trong cơ thể tại từng thời điểm và cả quá trình điều trị bệnh [51] Vì vậy, những trang thiết bị phân tích trực tiếp DA trên cơ thể nếu chế tạo được sẽ có ý nghĩa vô cùng to lớn trong y học Đã có rất nhiều nỗ lực nghiên cứu của các nhà khoa học để chế tạo các cảm biến xác định trực tiếp DA và cho đến nay đây vẫn là một hướng nghiên cứu đầy triển vọng Vì vậy, nghiên cứu chế tạo trang thiết bị phân tích

DA là đề tài có tính cấp thiết và ý nghĩa thực tiễn cao, được đặc biệt quan tâm nghiên cứu bởi nhiều nhà khoa học trên thế giới

Hàm lượng DA trong mẫu sinh học, trực tiếp trong cơ thể, đặc biệt là trong não thường nhỏ và thay đổi liên tục [148, 150] Do đó, mục tiêu nghiên cứu phát triển trang thiết bị kích thước nhỏ, xác định nhanh, nhạy và chọn lọc đối với DA là rất cần thiết Do có tính chất ôxi hóa-khử điện hóa nên các phương pháp phân tích điện hóa được xem là lý tưởng khi xác định định lượng DA và cũng là giải pháp triển vọng nhất trong nghiên cứu phân tích lâm sàng [19, 96] Nghiên cứu chế tạo các cảm biến điện hóa xác định các chất sinh học đã được sớm nghiên cứu từ những năm 1920 và đến ngày nay đạt được những

2

thành tựu quan trọng [101] Trong đó, DA là chất được chú ý với số lượng các công trình nghiên cứu chiếm tỷ lệ rất cao so với các chất sinh học khác [115]

Ở Việt Nam, mặc dù bệnh Parkinson là bệnh phổ biến và cho đến hiện tại vẫn

là nỗi ám ảnh với các bệnh nhân và gia đình người bệnh do phải điều trị lâu dài, chi phí xét nghiệm y tế, chi phí kiểm nghiệm dược phẩm đều đắt đỏ nhưng chưa được nhiều nhà khoa học nước ta quan tâm phát triển [3] Vì vậy, chúng tôi đã lựa chọn đề tài nghiên cứu chế tạo các điện cực biến tính dùng trong phân tích điện hóa DA với độ nhạy và chọn lọc cao nhằm ứng dụng phân tích y sinh và kiểm nghiệm dược phẩm Theo hướng nghiên cứu này, nhiều loại vật liệu tiên tiến đã được ứng dụng như polime dẫn điện, nanocacbon, graphen, hạt nano kim loại hoặc oxit kim loại

Thực hiện đề tài nghiên cứu trên, chúng tôi đã chế tạo thành công hai loại điện cực biến tính trên cơ sở biến tính bề mặt điện cực GCE bằng các vật liệu mới có cấu trúc nano Các điện cực biến tính chế tạo được có những đặc tính nhạy và chọn lọc với DA trong môi trường có mặt axit ascobic, axit uric và một

số chất khác Đồng thời, đã ứng dụng thành công phân tích mẫu thuốc tiêm DA

và mẫu nước tiểu cho kết quả chính xác

Những kết quả đạt được có giá trị khoa học và thực tiễn cao, những vấn

đề thuộc hướng nghiên cứu là độ nhạy, độ chọn lọc và ứng dụng của điện cực

đã được nghiên cứu giải quyết Các công trình công bố liên quan đến luận án

là mới tại Việt Nam và được các nhà khoa học trên thế giới thừa nhận

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 DOPAMIN (DA)

1.1.1 Giới thiệu chung

Nhóm chất trong phân tử có vòng benzen đính hai nhóm hydroxyl (nhóm catechol) và một nhóm amin được gọi là nhóm catecholamin Dopamin (DA) chính là catecholamin với công thức hóa học đơn giản nhất, công thức phân tử của dopamin C6H3(OH)2-CH2-CH2-NH2, danh pháp hoá học theo IUPAC là 4-(2-aminoetyl) benzen-1,2-diol Dopamin cũng thuộc nhóm các chất phenetylamin (chứa vòng benzen và nhóm amin) là nhóm các dược chất liên quan đến bệnh thần kinh Tên gọi dopamin xuất phát do là một monoamin và

là tiền chất của 3,4-dihydroxyphenylalanin (levodopamin hoặc L-DOPA)

Hình 1.1 Các chất quan trọng trong sinh hóa thuộc nhóm catecholamin

DA có khối lượng mol phân tử 153,178 g/ mol, tan hoàn toàn trong nước

và trong etanol 95 %; không tan trong ete, ete dầu hỏa, clorofoc, benzen và toluen DA bị phân hủy bởi ánh sáng và oxi trong không khí Trong dung dịch nước DA có hằng số phân ly pKa = 8,93 Trong dung dịch trung hòa hoặc axit

DA tồn tại ở dạng kết hợp với proton, tương đối dễ tan và bền vững Trong môi trường kiềm, DA phân ly proton và tồn tại ở trạng thái khó tan, dễ dàng bị oxi hóa bởi oxi không khí Trong thực tế dạng hóa chất hoặc dược phẩm thường được sử dụng là dopamin hydroclorua (DA.HCl), tức là dạng muối hydroclorua

do dopamin kết hợp với axit clohydric Ở trạng thái khô DA.HCl dạng bột không màu, khi hòa tan trong nước dung dịch tạo thành có pH axit nhẹ nên

HO

OH

Norepinephrin (Noradrenalin)

(Adrenalin)

HO

Dopamin

4

dung dịch tương đối bền Trong cơ thể dưới tác dụng xúc tác của enzym monoamin oxidaza, dopamin bị oxi hóa DA cũng tự oxi hóa ở điều kiện thường, phản ứng trực tiếp với oxi tạo thành quinon và các gốc tự do Tốc độ oxi hóa có thể tăng do sự có mặt muối sắt (II), kiềm hoặc các tác nhân oxi hóa khác Trong điều kiện thích hợp DA có thể polime hóa hình thành hạt kích thước nano hoặc lớp phủ polidopamin thuộc loại melanin (nhóm các polime tạo sắc tố) với nhiều tính chất lý hóa hữu ích như làm lớp chắn ánh sáng, bao phim dược phẩm, chế tạo cảm biến sinh học [90]

DA được tổng hợp lần đầu tiên vào năm 1910, được phân tích xác định tồn tại trong não người vào năm 1957 Ngày nay, DA được tổng hợp trong phòng thí nghiệm từ phản ứng demetyl hóa 3,4-dimethoxyphenethylamin với hydro bromua [31]

Hình 1.2 Phản ứng tổng hợp DA trong phòng thí nghiệm

DA được sử dụng trong y học làm thuốc chống sốc do nhồi máu cơ tim, chấn thương, nhiễm khuẩn huyết và trong phẫu thuật tim làm thuốc tăng co cơ tim DA thường được coi là thuốc thông dụng trong liệu pháp hàng đầu điều trị suy tim DA được sử dụng dạng thuốc tiêm với nồng độ DA.HCl 40 mg/mL,

80 mg/mL và 160 mg/mL

1.1.2 Vai trò của dopamin trong cơ thể

Năm 1952, Arvid Carlsson và Nils-Åke Hillarp đã chứng minh DA không chỉ là tiền chất của các chất là norepinephrin (noradrenalin) và epinephrin (adrenalin) mà còn là chất dẫn truyền thần kinh quan trọng trong chu trình tổng hợp sinh hóa Năm 2000, Carlsson được nhận giải thưởng Nobel sinh lý học và y khoa vì phát hiện này

HO

5

Trong cơ thể DA được tổng hợp từ các axit amin tiền chất là tyrosin và là chất trung gian để tổng hợp noradrenalin DA được tìm thấy với nồng độ cao trong tủy thượng thận, não và nhân đuôi (thuộc hạch đáy, liên quan tới việc điều chỉnh các cử động tự ý ở mức độ tiềm thức) DA tạo cảm giác hưng phấn trong não Nó cung cấp thông tin liên lạc giữa các tế bào thần kinh cũng như giữa các tế bào thần kinh và tế bào cơ bắp DA ức chế một số loại nơron và kích thích một số khác DA là chất ức chế chính của sự tiết prolactin ở tuyến phía trước tuyến yên Trong thùy trán, dopamin kiểm soát dòng chảy của các thông tin từ các khu vực trong não DA có vai trò tích cực trong hành vi và nhận thức, động lực, trừng phạt, phấn khích Nó đóng vai trò chủ chốt đối với những trải nghiệm của chúng ta về sự vui thú và nỗi đau, liên quan đến khao khát, sự nghiện ngập, và được sản sinh khi cơ thể ở trong trạng thái khỏe mạnh, sảng khoái, vui vẻ DA cũng liên quan đến quá trình hồi tỉnh sau gây mê và hồi phục trí nhớ [25]

Quá trình sinh tổng hợp DA xảy ra trong các nơron và tế bào tủy sống tuyến thượng thận gồm các bước L-phenylalanin → L-tyrosin → L-DOPA → DA Như vậy, cơ thể có thể sản sinh DA gián tiếp từ phenylalanin, một loại axit amin cơ thể không thể tự tổng hợp mà phải lấy từ thức ăn, hoặc trực tiếp từ tyrosin là axit amin cơ thể có thể tự tổng hợp Mặc dù DA có thể tồn tại trong nhiều loại thực phẩm nhưng không thể trực tiếp cung cấp DA cho não bộ do cơ chế tự bảo vệ của màng não DA không tác dụng khi uống do không thể trực tiếp đi qua màng não mà phải được sinh ra trong não do chuyển hóa từ tiền chất của nó

Khớp thần kinh (synapse) là một khớp nối đặc biệt, qua đó tín hiệu từ tế bào thần kinh sẽ truyền qua một tế bào thần kinh khác cũng như qua một loại

tế bào không phải là tế bào thần kinh (như tế bào cơ hoặc tế bào tuyến) Mỗi nơron thần kinh có khả năng sản xuất chỉ một loại chất truyền dẫn thần kinh

6

Hình 1.3 Khớp thần kinh và vai trò truyền dẫn tín hiệu của DA [175]

Trong y học, người ta chỉ định xét nghiệm catecholamin để chẩn đoán bệnh u tế bào ưa crôm (pheochromocytoma), là loại u tế bào thận có thể gây chết vì tăng huyết áp và suy tim [78] Người ta cũng chỉ định xét nghiệm catecholamin đối với trẻ sơ sinh để nhằm phát hiện sớm bệnh u nguyên bào thần kinh (neuroblastoma), là khối u thể rắn ngoài não thường gặp nhất ở trẻ

em [129, 150] Nồng độ catecholamin trong cơ thể rất dễ thay đổi để đáp ứng lại trạng thái hoặc cảm xúc Nhiệt độ môi trường, mất máu, tập thể thao, hạ đường huyết, thậm chí thay đổi tư thế đứng lên ngồi xuống và ngược lại đều có thể làm cho cơ thể thay đổi nồng độ catecholamin

Các kết quả xét nghiệm đơn bằng lấy mẫu tức thời không chính xác để chẩn đoán bệnh trong y học Lấy tổng hợp toàn bộ nước tiểu trong vòng 24 giờ (mẫu nước tiểu/ 24 giờ) là giải pháp xét nghiệm nồng độ catecholamin áp dụng trong xét nghiệm y tế Kết quả xét nghiệm là manh mối chẩn đoán ban đầu với một số bệnh nguy hiểm

1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DA

Để xác định DA cũng như các chất thuộc nhóm catecholamin khác trong mẫu sinh học các phương pháp được áp dụng phổ biến nhất gồm sắc ký lỏng ghép nối cảm biến huỳnh quang (HPLC/FL), sắc ký lỏng ghép nối cảm biến điện hóa (HPLC/ECD), sắc ký lỏng ghép nối cảm biến khối phổ (HPLC/MS),

7

và phương pháp miễn dịch enzym (ELISA) [7, 105] Trong đó, phương pháp điện hóa với điện cực biến tính được sử dụng cho các phép đo trực tiếp trên cơ thể [43, 65, 89, 115] Hàm lượng bình thường của DA trong huyết tương và trong nước tiểu/ 24 giờ theo khuyến cáo của các cơ sở y tế và tài liệu tham khảo được chỉ ra ở Bảng 1.1

Bảng 1.1 Hàm lượng bình thường dopamin trong mẫu sinh học

STT Loại mẫu/ chỉ tiêu Hàm lượng bình thường (DA)

2 Mẫu nước tiểu/ 24 giờ ≤ 600 µg/ 24 giờ (3900 nmol/ 24 giờ)

Trong cơ thể DA ở ngưỡng nồng độ nanomol và trong hệ thần kinh nồng

độ DA liên tục thay đổi bởi nhiều yếu tố phức tạp Do đó, phân tích dopamin đòi hỏi quy trình đặc biệt, tiêu tốn nhiều thời gian chuẩn bị mẫu cũng như phân tích Các phương pháp phân tích các catecholamin trong đó có dopamin được thừa nhận gồm phương pháp sắc ký lỏng (LC) với cột tách pha đảo và tác nhân tạo cặp ion ghép nối cảm biến điện hóa (ECD), khối phổ (MS), hoặc huỳnh quang (FL) [126] Do nền mẫu phức tạp với nhiều thành phần gây nhiễu cho tín hiệu phân tích nên các quy trình xử lý mẫu trước khi mẫu được phân tích sắc ký lỏng thường đòi hỏi khắt khe Các phương pháp phân tích catecholamin

bị ảnh hưởng bởi các dược phẩm và thức ăn mà người bệnh sử dụng nên khi xét nghiệm việc yêu cầu tránh sử dụng một số chất cũng là cách giúp kết quả chính xác hơn Phương pháp khối phổ được áp dụng phân tích các catecholamin cho độ chọn lọc cao dựa trên quy trình xử lý mẫu phù hợp và có ưu điểm là độ đặc hiệu cao Ngoài ra, phương pháp miễn dịch liên kết enzym (ELISA) với ưu điểm thời gian phân tích tương đối nhanh nên được ứng dụng phổ biến trong thực tế để phân tích mẫu máu, mẫu nước tiểu Các phương pháp phân tích này đều cần các trang thiết bị hiện đại, kinh phí đầu tư ban đầu lớn, chi phí và thời

8

gian chuẩn bị mẫu cao, thử nghiệm viên phải được đào tạo chuyên sâu Dưới đây là tổng quan những ưu điểm và hạn chế của từng phương pháp

1.2.1 Phương pháp huỳnh quang

Các phân tử catecholamin có nhóm chức phenolic nên có thể trực tiếp phân tích phổ huỳnh quang với bước sóng kích thích và phát xạ tương ứng 280

nm và 310 nm Phương pháp huỳnh quang chủ yếu được vận dụng để chế tạo đe-tec-tơ ghép nối với các hệ tách chất như sắc ký lỏng, điện di So với đe-tec-

tơ điện hóa, đe-tec-tơ huỳnh quang dễ vận hành và phổ biến hơn Để gia tăng

độ nhạy và phạm vi ứng dụng, các cột dẫn xuất hóa được sử dụng để dẫn xuất các phân tử catecholamin nhằm gia tăng tính chất huỳnh quang trước khi đi vào

hệ phân tích [2, 128, 164]

Đã có rất nhiều thuốc thử huỳnh quang khác nhau được sử dụng để dẫn xuất hóa các catecholamin Trong hệ thống phân tích, các catecholamin được chạy qua một cột dẫn xuất hóa (còn gọi là tiền cột), tại đây catecholamin được tác dụng với thuốc thử huỳnh quang tạo thành dẫn xuất có huỳnh quang trước khi được tách trong hệ sắc ký lỏng hoặc điện di mao quản và phát hiện ở đe-tec-tơ huỳnh quang

Ví dụ, hệ sắc ký lỏng pha đảo gồm cột tách C18, đe-tec-tơ huỳnh quang

có bước sóng kích thích phổ 220 nm và tia phát xạ bước sóng 320 nm được áp dụng xác định trực tiếp và đồng thời với độ nhạy 2,5 đến 25 pmol đối với norepinephrin, octopamin, epinephrin, dopamin, dihydroxyphenylalanin, tyramin, tyrosin, serotonin, 5-hydroxytryptophan, N-axetyl-serotonin và tryptophan [11]

Bằng hệ HPLC có cột dẫn xuất hóa được tối ưu các thông số với thuốc thử huỳnh quang là 1,2-benzo-3,4-dihydrocarbazol-9-ethyl chloroformat, DA

và nhiều hợp chất khác trong mẫu tế bào não của chuột đã được phân tích chính xác và chọn lọc cao [149]

9

Catecholamin cũng được nghiên cứu để phân tích bằng phương pháp điện di mao quản ghép nối cảm biến huỳnh quang Phương pháp điện di thích hợp cho yêu cầu phân tích với lượng mẫu nhỏ Tương tự như phương pháp HPLC, để ứng dụng phương pháp điện di mao quản thì các catecholamin cũng thường được dẫn xuất hóa Ví dụ, Các hợp chất catecholamin gồm DA và 3,4-dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC), DOPA, epinephrin (E), norepinephrin (NE) và 3,4-dihydroxyphenyl glycol (DOPAG) trong mẫu nước tiểu đã được phân tích bằng phương pháp điện di mao quản với dung dịch đệm borat làm nền chất điện ly Phản ứng tạo phức của các chất cần phân tích với terbi (III) clorua và EDTA tạo phức phát quang mạnh catechol-EDTA-Terbi với bước sóng kích thích và phát xạ tương ứng ở 300 nm và 545 nm Giới hạn phát hiện của phương pháp đạt đến 10-7 mol/L Phương pháp có thể áp dụng phân tích mẫu nước tiểu sau khi xử lý mẫu bằng quy trình làm sạch và làm giàu [129]

Một số thuốc thử để dẫn xuất hóa catecholamin gồm o-phthaldehyt, naphthalen-2; 3-dicacboxaldehyt; 5-Furoylquinoline-3-carboxaldehyt; fluorescein isothiocyanat; n-hydroxysuccinimidyl fluorescein-O-axetat; 4-fluoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol; ethylenediamin; benzylamin; 1,2-diphenyl-etylen-diamin; 1,2-phenylenediamin; terbium (III) [129]

1.2.2 Phương pháp khối phổ

Phương pháp khối phổ có độ đặc hiệu cao cho phép nhận dạng chất trong nền mẫu phức tạp và cung cấp thông tin về cấu trúc các chất Phương pháp này được ứng dụng phân tích DA cũng như các catecholamin khác [72, 124] Đe-tec-tơ khối phổ ghép nối với các hệ thiết bị tách chất như LC và CE là những

hệ thống trang bị hiện đại được sử dụng ngày càng phổ biến Phương pháp ghép nối khối phổ kép (HPLC-MS/MS) là một hệ thiết bị mới với nhiều ưu việt khi

áp dụng phân tích các catecholamin sau khi mẫu được chuẩn bị bằng các quy trình chiết tách tối ưu [150]

137 và 160 tương ứng với epinephrin, norepinephrin, DA và hydroxytryptamin [131]

5-Ví dụ, các catecholamin được chiết từ 300 µL mẫu nước tiểu bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng đặc hiệu cho các hợp chất chứa nhóm catechol Sau đó mẫu được phân tích trên thiết bị khối phổ với phương pháp ion hóa bằng chùm tia điện tử (ESI-MS/MS) Phần tách chất bằng HPLC không sử dụng tác nhân tạo cặp ion Các phân tử catecholamin mang đồng vị bền được sử dụng làm chất chuẩn nội Epinephrin, norepinephrin và dopamin được phân tích trong khoảng thời gian 3,5 phút Giới hạn định lượng 2,5 g/L cho epinephrin

và DA, 10 g/L cho norepinephrin Độ sai lệch (CV) < 9,6%; hiệu suất thu hồi đạt 71 ± 12 % [126]

Ví dụ, phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng ghép nối khối phổ kép (UPLC-MS/MS) đã được xây dựng để phân tích mẫu dịch vi thẩm tách não người bởi các nhà khoa học Phần Lan và Thụy Điển Hệ thiết bị UPLC-MS/MS được sử dụng là AquityUPLC của hãng Waters ghép nối với cảm biến khối phổ

ba tứ cực Agilent 6410 (do hãng Agilent technologies sản xuất), cột tách sử dụng là cột pentaflorophenyl (Gold PFP Hypersil, hãng sản xuất Thermo Scientific) kích thước 2,1×150 mm, đường kính trong 1,9 mm Nghiên cứu này

đã phân tích được DA, serotonin (5-HT) và nhiều chất khác trong mẫu dịch vi thẩm tách thu từ hai bệnh nhân bị tổn thương não cấp tính, dịch não thất thu từ bốn bệnh nhân bị tràn dịch não [120] Kết quả cho thấy phương pháp không chỉ

11

cho độ nhạy, độ chọn lọc và độ chính xác cao mà còn được ứng dụng lắp đặt ngay tại giường bệnh để đo liên tục nhằm quan trắc tình trạng bệnh nhân

1.2.3 Phương pháp miễn dịch liên kết enzym (ELISA)

Phương pháp ELISA là phương pháp thử nghiệm trên cơ sở hấp thụ miễn dịch liên kết với enzym để phát hiện và định lượng peptit, protein, kháng thể

và các độc tố, phân tử sinh học, vi khuẩn, vi rút Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên tính đặc hiệu của kháng nguyên với kháng thể liên kết với một enzym Phân tích kết quả bằng tín hiệu quang khi cơ chất phản ứng với enzym Trên cơ sở nguyên tắc của phương pháp ELISA, có rất nhiều hãng thiết bị

đã xây dựng phương pháp và thiết kế thiết bị để xác định DA như hãng Genway, DLD, IBL, Biolegend… [46, 61] được ứng dụng phân tích mẫu sinh học trong

y tế Trong các phương pháp này, DA được chiết từ mẫu sinh học bằng gel ái lực cis-diol nhờ lớp boronat trên thành đĩa giếng để loại các tạp chất Sau khi được giữ trên gel ái lực boronat, DA được rửa sạch rồi axetylat hóa thành N-axyldopamin sau đó dẫn xuất hóa dưới tác dụng của enzym thành N-axyl-3-metoxytyramin

Đĩa giếng được gắn kháng thể do dê tạo ra khi được tiêm kháng nguyên từ thỏ (goat anti rabbit) DA trong các mẫu sau khi được chiết và axetylat hóa đóng vai trò kháng nguyên được đưa vào giếng và được kháng thể trong đĩa giếng giữ lại Một kháng thể khác có liên kết enzym photphataza kiềm tính được thêm vào đĩa giếng sẽ tác dụng đặc hiệu với kháng nguyên Khi dung dịch

cơ chất là p-nitrophenyl photphat được thêm vào, nhờ tác dụng của enzym trên kháng thể thứ cấp, phản ứng chuyển hóa cơ chất xảy ra tạo tín hiệu phân tích tỷ lệ với nồng độ DA trong mẫu

1.2.4 Phương pháp điện hóa

Do có tính điện hoạt cao và dễ dàng phản ứng oxi hóa khử nên phương pháp điện hóa được ứng dụng hiệu quả để phân tích DA [113, 158] Phương

12

pháp điện hóa được ứng dụng xác định DA gồm chế tạo các đe-tec-tơ điện hóa

và phương pháp điện hóa trực tiếp với điện cực làm việc phù hợp Các

đe-tec-tơ điện hóa được chế tạo để ghép nối với các hệ thống tách chất như sắc ký, điện di nhằm tăng tính chọn lọc [37] Phương pháp điện hóa có bản chất là các quá trình hoặc phản ứng điện hóa chủ yếu ở lớp tiếp xúc điện cực và dung dịch

đo Hai nhóm kỹ thuật điện hóa chính là đo dòng với điện thế không đổi (potentiostatic) và đo kiểm soát điện thế (potentiometric) Cả hai phương pháp cần ít nhất hai điện cực và dung dịch điện ly Một trong hai điện cực phản ứng với chất điện ly được gọi là điện cực làm việc (còn gọi là điện cực chỉ thị) Điện cực còn lại là điện cực so sánh, điện thế của điện cực so sánh không thay đổi

do có bản chất độc lập với hệ [138] Phương pháp kiểm soát điện thế liên quan đến các quá trình chuyển điện tích ở lớp tiếp xúc điện cực và dung dịch Điện thế được sử dụng để tác động các quá trình trao đổi điện tích làm thay đổi dòng điện Cường độ dòng điện vì vậy phản ánh tốc độ trao đổi điện tử giữa chất oxi hóa và chất khử Trong phương pháp kiểm soát điện thế, dòng điện được đo là dòng Faraday, tức dòng điện phát sinh do quá trình chuyển trạng thái oxi hóa khử của chất điện hoạt và nó tuân theo định luật Faraday (lượng chất tỷ lệ thuận với lượng điện chuyển qua)

1.2.4.1 Các đe-tec-tơ điện hóa

Đe-tec-tơ điện hóa có ưu điểm về độ nhạy khi ứng dụng xác định các chất điện hoạt như DA Độ nhạy đe-tec-tơ tử ngoại (UV) khoảng 10-8 g/mL, đe-tec-tơ mảng di-ot (DAD) khoảng 10-9 g/ mL, đe-tec-tơ huỳnh quang 10-11 g/mL, đe-tec-tơ khối phổ và đe-tec-tơ điện hóa khoảng 10-11 g/mL Đe-tec-tơ điện hóa thường có độ đặc hiệu hơn các đe-tec-tơ quang [101] Ưu điểm của phương pháp điện hóa là độ nhạy và độ chọn lọc cao, khoảng tuyến tính rộng, trang bị nhỏ gọn và chi phí thấp Giới hạn phát hiện có thể đạt tới siêu vết (nanomol) với thể tích mẫu vô cùng nhỏ (5 – 20 µL) nghĩa là lượng chất chỉ từ 10-13–10-15

Với hệ thống thiết bị sắc ký lỏng ghép nối đe-tec-tơ điện hóa (LC-ECD),

đã có rất nhiều công trình khoa học được công bố ứng dụng phân tích DA và các chất thuộc nhóm catecholamin trong mẫu dược phẩm và mẫu sinh học [145] Ví dụ, phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng ghép nối đe-tec-tơ điện hóa (UHPLC-ECD) được các nhà khoa học thuộc Đại học Utrecht-Hà Lan ứng dụng xác định một số chất truyền dẫn thần kinh với lượng mẫu chỉ 10 µL từ dịch vi thẩm tách [116] Đe-tec-tơ điện hóa là một vi tế bào điện hóa với điện cực làm việc glasy cacbon đường kính 0,7 mm, điện cực so sánh Ag/AgCl Theo phương pháp này, thời gian phân tích các chất truyền dẫn thần kinh được rút ngắn Các chất xác định được gồm noradrenalin, DA, serotonin, các dẫn xuất axit homovanillic, axit 5-hydroxyindol axetic, axit 3,4-dihydroxyphenyl axetic Phương pháp đã được tối ưu để đáp ứng yêu cầu về độ nhạy và thể tích mẫu tiêu tốn nhỏ Các chất truyền dẫn thần kinh monoamin được xác định với

O

O

NH3+

1000 µM [21]

1.2.4.2 Phương pháp điện hóa trực tiếp

Phân tích DA và các chất truyền dẫn thần kinh khác trực tiếp trong mẫu hoặc trên cơ thể sống là một trong những mục tiêu nghiên cứu đã được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm từ rất sớm Phương pháp điện hóa được đánh giá có nhiều lợi thế nhất [96] Các phương pháp điện hóa được áp dụng phân tích các chất truyền dẫn thần kinh có cơ sở từ những công trình nghiên cứu của Jaroslav Heyrovsky (giải Nobel Hóa học năm 1959) khi ông áp dụng nghiên cứu phương pháp cực phổ cho các hợp chất hữu cơ [96] Từ những năm 1973 đến 1974, nhà khoa học Ralph Adams và cộng sự đã sử dụng các vi điện cực cacbon để cấy trực tiếp vào não chuột nhằm đo trực tiếp các chất truyền dẫn thần kinh họ catecholamin [75] Vi điện cực sợi cacbon được Gonon và cộng

15

sự phát minh những năm 1981 [48] đã phát triển đột phá kỹ thuật điện hóa đo chất thần kinh trực tiếp trong não Một dấu mốc quan trọng tiếp theo là những kết quả đạt được bởi nhóm nhà khoa học Gerhardt năm 1984 [44] trong việc phát triển các cảm biến chọn lọc trên cơ sở biến tính điện cực cacbon nhờ lớp phủ polime Các kết quả từ những công trình nghiên cứu này đặt nền móng cho các điện cực biến tính ngày nay

Để xác định và nghiên cứu các hợp chất liên quan đến hoạt động của hệ thần kinh (các hợp chất thần kinh), thiết bị đo phải đảm bảo phù hợp cả bốn yếu tố (4S – size, speed, selectivity, sensitivity) là kích thước, tốc độ đo, chọn lọc và nhạy [4] Khớp thần kinh kích thước chỉ 10–100 nm là nơi các chất thần kinh tồn tại và hoạt động nên thiết bị đo phải có kích thước nhỏ cỡ nm Sự chuyển hóa của các chất diễn ra trong cỡ mili giây nên thiết bị đo phải có tốc

độ đo tương đương Đồng tồn tại trong môi trường đo là hàng loạt các chất tương tự về cấu trúc và tính chất nên phương pháp phân tích phải có độ chọn lọc tín hiệu từng chất Cuối cùng, nồng độ các chất thần kinh ở ngưỡng rất nhỏ, phương pháp phân tích phải đủ nhạy để phát hiện

Ngày nay, để phân tích siêu nhanh bắt kịp tốc độ chuyển hóa của DA trong não, có hai kỹ thuật đo chính được ứng dụng với vi điện cực là đo dòng (amperometry) và von-ampe vòng quét nhanh (FSCV) [4] Phương pháp von-ampe vòng quét nhanh với tốc độ quét lên đến 106 V/s Bằng phương pháp này người ta thu được phổ đồ von-ampe trong vài mili giây Các vi điện cực sợi cacbon được sử dụng trong phương pháp này để xác định các chất truyền dẫn thần kinh, hoocmon hoặc dẫn xuất [130] Nồng độ và quá trình chuyển hóa DA trong não chuột đã được nghiên cứu đo trực tiếp bằng phương pháp FSCV ngay

từ khi các vi điện cực sợi cacbon được chế tạo [63, 64] Sau đó, liên tục các công trình nghiên cứu và ứng dụng được phát triển cho đến ngày nay Qua nhiều thập kỷ liên tục nghiên cứu, không chỉ nhiều chi tiết của quá trình truyền

16

dẫn DA trong não đã được các nhà khoa học làm sáng tỏ mà kỹ thuật FSCV cũng đã được phát triển Độ nhạy của phương pháp FSCV không ngừng được nghiên cứu nâng cao nhờ các phương pháp biến tính bề mặt điện cực bằng các vật liệu mới Các kỹ thuật mới cho phép chế tạo các trang bị siêu nhỏ FSCV với dãy (array) nhiều vi điện cực cùng lúc để cấy lên cơ thể nhằm đo đồng thời nhiều chất khác nhau

Hình 1.5 Hình minh họa hệ thiết bị cấy ghép truyền tín hiệu không dây gồm

điện cực kích thích và các cảm biến nhạy với các hợp chất thần kinh trong nhân đồi thị và vi mạch đo, chuyển đổi và truyền tín hiệu [4]

Với cơ thể người, cấy các mảng gồm nhiều vi điện cực đo bằng FSCV và kết nối truyền dẫn tín hiệu không dây là vô cùng hữu ích trong nghiên cứu điều trị bệnh nhân Parkinson Mô hình này đã được Garris và cộng sự nghiên cứu phát triển (hình 1.5) Trung tâm và quyết định thành công của tất cả các kỹ thuật điện hóa này chính là các điện cực Nghiên cứu các điện cực biến tính hóa học hoặc sinh học hiện nay rất được kỳ vọng với những hướng tiếp cận mới và hiện đại [138] Nhờ các phản ứng điện hóa xảy ra ở lớp tiếp xúc giữa bề mặt điện

17

cực với đối tượng đo mà người ta có thể đo được những chất biến đổi rất nhanh như chất truyền dẫn thần kinh [96]

1.3 ĐIỆN CỰC BIẾN TÍNH HÓA HỌC XÁC ĐỊNH ĐIỆN HÓA DA

1.3.1 Tổng quan các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước

Nghiên cứu chế tạo điện cực biến tính nhằm xác định DA một cách nhanh chóng, chính xác, chọn lọc và trực tiếp trên cơ thể là hướng nghiên cứu quan trọng được quan tâm đặc biệt Kết quả tổng hợp trình bày trên hình 1.6 cho thấy

DA là hợp chất sinh học rất được quan tâm nghiên cứu theo hướng phát triển phương pháp điện hóa để phân tích xác định [14, 15, 34, 55, 132]

Hình 1.6 Số lượng bài báo liên quan đến phương pháp và một số chất thần

kinh quan trọng trong giai đoạn 2010-2013 [115]

Nguyên nhân của sự quan tâm nghiên cứu này, như đã trình bày trong các phần trước, xác định trực tiếp nồng độ DA trong cơ thể rất quan trọng và điện hóa là phương pháp có nhiều ưu điểm, khả thi nhất với chi phí thấp so với các kỹ thuật khác Hình 1.7 là tổng hợp đến năm 2013 số các công trình nghiên cứu được công bố cho thấy các loại ống cacbon nano đứng đầu tiếp đến là các hạt nano kim loại và oxit kim loại

18

Hình 1.7 Số lượng công trình được công bố đến 2013 liên quan đến ứng dụng

các vật liệu nano để xác định dopamin [115]

Bảng 1.2 tổng hợp các kết quả nghiên cứu đáng chú ý được công bố đến nay liên quan đến hướng nghiên cứu chế tạo điện cực biến tính xác định DA Trong những công trình nghiên cứu được công bố hiện nay, các nhà khoa học trên thế giới tập trung cải thiện độ chọn lọc, tách tín hiệu của DA ra khỏi tín hiệu của AA, UA và các chất ảnh hưởng khác, hạ thấp giới hạn phát hiện và tối

ưu môi trường đo ở pH trung tính Đã có rất nhiều phương thức, kỹ thuật và vật liệu khác nhau được áp dụng để biến tính bề mặt điện cực nhằm gia tăng tốc độ quá trình trao đổi điện tích, tích tụ chọn lọc hoặc thẩm thấu chọn lọc chất cần phân tích vào bề mặt điện cực [38] Các phương thức đáng chú ý bao gồm các điện cực biến tính bằng các đơn lớp tự lắp ghép (SAMs) [108, 163], các điện cực biến tính bằng các lớp phủ chọn lọc ion hoặc chọn lọc phân tử [70, 71, 118,

126, 137, 140], các điện cực biến tính bằng polime dẫn [83, 85, 86, 106, 170]

Xu hướng nghiên cứu hiện đại chế tạo các điện cực biến tính trên cơ sở kết hợp các tính chất đặc biệt của nhiều loại vật liệu mới Các vật liệu mới kết hợp thành các cấu trúc đặc biệt như nanocompozit, vật liệu lai giữa hữu cơ và vô cơ đã cho những hiệu quả đặc biệt Các công trình nghiên cứu đáng chú ý gồm kết

DA, tách tín hiệu của DA khỏi tín hiệu AA và UA, ứng dụng phân tích mẫu thực là dược phẩm và sinh học Các loại mẫu dược phẩm và mẫu sinh học được thử nghiệm như mẫu thuốc tiêm dopamin, mẫu nước tiểu, mẫu dịch sinh học [40, 60, 91, 119, 122, 152, 169]

20

Bảng 1.2 Bảng tổng hợp công trình nghiên cứu trên thế giới công bố gần đây

STT Phương pháp biến tính phát hiện Giới hạn Khoảng tuyến tính với DA Môi trường đo Yếu tố ảnh hưởng Năm Tham khảo

1 Biến tích bề mặt điện cực GC bằng

nanocompozit của axit phytic và graphen oxit 0,016 µM 0,05 – 10 µM PBS 10 mM/ pH 7 AA, UA 2017 [134]

2 Polime dẫn poli 5-amino-1H-tetrazol được

tổng hợp điện hóa để biến tính điện cực GC -

5 – 100 µM, 100 µM – 1,0 mM PBS 0,1 M/ pH 7,2 AA, UA, … 2017 [58]

3

Chế tạo điện cực hồ cacbon nano bằng cacbon

nano dạng cầu đã được chức năng hóa

(Functionalised carbon nano spheres paste

electrode)

0,01 µM 0,0493 – 3,98 µM PBS 0,1 M/ pH 7 AA, UA 2017 [30]

4 Biến tính điện cực GC bằng compozit của

5

Điện cực hồ cacbon (CP-carbon paste) được

biến tính bằng nano compozit của ZrO 2

Điện cực GC được biến tính bằng lớp nano

compozit của graphen oxit và mangan

tetraphenylporphyrin

9 Biến tính bề mặt điện cực glassy cacbon bằng

10

Điện cực vàng được biến tính bề mặt bằng lớp

polime in dấu phân tử trên cơ sở silic và

Poly(aniline boronic axit)

11

Sử dụng dạng bọt (foam) của graphen, CNTs

và polime in dấu phân tử (GF/CNT/MIP) trực

tiếp làm điện cực

6,67×10 -16 M 2×10−15 – 1×10−12 M - AA, UA,… 2016 [82]

21

STT Phương pháp biến tính phát hiện Giới hạn Khoảng tuyến tính với DA Môi trường đo Yếu tố ảnh hưởng Năm Tham khảo

12 Bạc hạt nano kết hợp với sợi nano polipyrrol

13 Điện cực GC được biến tính bằng hợp kim

14

Điện cực sợi Poliamid 6/poli-allylamin

hydrochlorua (PA6/PAH) Cacbon nano đa

vách chức năng hóa

15

Cảm biến trên cơ sở nanocompozit của

graphen oxit đã khử hóa và polime dẫn

poli(3,4-etylendioxythiophen) (PEDOT)

78 fM 1 pM–160 nM PBS 0,2 M/ pH 7,4 AA, UA 2015 [141]

16 Cacbon nano đa vách (MWCNTs) được xử lý

để kết hợp hạt Bo nano làm điện cực trực tiếp 0,11 μM 0,062– 0,250 mM PBS 0,01 M/ pH 7 AA, UA 2015 [127]

17

Bạc hạt nano Ag(I) đính li-gan 4-nitro

phenylxyanamid được sử dụng biến tính điện

cực GCE

18 GCE/ SDS-MWCNTs 1×10 -8 M 8,0×10 -7 －8,0×10 -5 M PBS 0,1 M/ pH 7 AA, UA 2014 [161]

19

Mixen của cacbon nano đa vách đã được chức

năng hóa (e-MWCNTs) vơi copolime P (St-alt

-MAn)-co-P(VM-alt -MAn)

5,0×10−8 M 1,0×10−7–1,0×10 −3 M PBS 0,1 M/ pH 7 AA 2014 [87]

20 GCE/ MWNTs/ NiFe 2 O 4 hạt nano 0,02 μM 0,05 – 6 μM

6 – 100 μM PBS 0,1 M/ pH 7 AA, UA, 2014 [33]

21 Graphen được khử điện hóa để biến tính điện

22 Biến tính điện cực GC bằng lớp polime của

23

Hạt nano kim loại Pd-Pt tạo vật liệu

nanocompozit với graphen oxit chức năng hóa

với poli(diallyldimetylamoni clorua)

0,04 μM 4 – 200 µM PBS 0,1 M/ pH 7,4 AA, UA 2013 [152]

24

Biến tính điện cực GC bằng lớp nano

compozit của poli tyrosin và MWCNTs đã

được chức năng hóa các nhóm cacboxyl

0,02 μM 0,1 – 30 µM PBS 0,1 M/ pH 7,4 AA, UA 2013 [143]