Cùng với sự tiến bộ khoa học, đã có những nghiên cứu đầu tiên trên thế giới về nọc bò cạp cách đây hơn 100 năm và đã xác định nọc độc bò cạp có hoạt tính về thần kinh.. Trong nọc bò cạp
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM
KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
Trang 2BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM
KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỮU CƠ
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1 TSKH Hoàng Ngọc Anh
2 GS TSKH Utkin Yuri Nikolaevich
TP Hồ Chí Minh – 2017
Trang 31 MỞ ĐẦU
Cùng với sự phát triển về kinh tế, xã hội của thế giới, việc nghiên cứu, tìm tòi, và phát triển tìm ra các loại dược phẩm mới để chữa trị bệnh cho con người là vấn đề ngày càng cấp bách của xã hội và khoa học Bên cạnh việc tổng hợp các loại thuốc chữa bệnh có nguồn gốc từ thực vật thì nọc độc động vật đang là nguồn dược liệu quý hiếm để bổ sung cho việc tổng hợp các nguồn thuốc mới
Từ lâu, nọc độc các loài động vật như rắn, ong, bọ cạp và nhiều loài khác đã được sử dụng làm nguyên liệu chính để chữa bệnh Trong dân gian, bò cạp thường được dùng nguyên con (toàn yết) hoặc phần đuôi (yết vĩ) để trị động kinh ở trẻ em, uốn ván, bán thân bất toại, quai bị, méo miệng… dưới dạng thuốc bột hoặc làm viên uống Cùng với sự tiến bộ khoa học, đã có những nghiên cứu đầu tiên trên thế giới về nọc bò cạp cách đây hơn 100 năm và đã xác định nọc độc bò cạp có hoạt tính về thần kinh Tuy nhiên, việc nghiên cứu nọc bò cạp ở Việt Nam chỉ mới ở giai đoạn bắt đầu, chưa có nhiều nghiên cứu được công bố về việc ứng dụng nọc bò cạp làm thuốc trị bênh cho con người mà chỉ là những bài thuốc dân gian được truyền miệng chưa có nhiều kiểm chứng khoa học
Trong nọc bò cạp chứa nhiều các polypeptide có khả năng tác động lên các thụ thể và các kênh ion của màng tế bào bị kích thích, các loại polypeptide này đã và đang được các nhà khoa học nghiên cứu nhằm tạo ra các thuốc mới chữa các bệnh như: Parkinson, cao huyết áp, ung thư, Alzheimer Nhằm đóng góp một nguồn nguyên liệu mới và các nghiên cứu khoa học mới cho ngành dược, hướng tới làm thuốc chữa bệnh và làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo, nhóm nghiên cứu chúng tôi
đã tiến hành các nghiên cứu về nọc bò cạp Heterometrus laoticus Qua đề tài “Phân lập và khảo
sát tính chất toxin của một số toxin mới từ nọc bò cạp Heterometrus laoticus”, đây là hướng
nghiên cứu mới về nọc bò cạp Heterometrus laoticus với hi vọng sẽ mang đến cơ sở cho những
nghiên cứu tiếp theo về việc ứng dụng của nọc bò cạp dùng làm nguồn nguyên liệu cho dược phẩm
Trang 42 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Bọ cạp đen Heterometrus laoticus được thu mua ở tỉnh An Giang thành 2 đợt, đợt 1 vào tháng
5 và đợt 2 vào tháng 8 với tổng số 2 lần là 850 cá thể Bọ cạp thu mua sau đó được nuôi trong phòng thí nghiệm để lấy nọc phục vụ cho các nghiên cứu
Để thu nọc bọ cạp từ phần đuôi có chứa túi nọc, bọ cạp được kích thích trực tiếp vào phần đuôi (đốt thứ 5 hoặc đốt thứ 6) sử dụng một dòng điện một chiều có tần số kích thích là 2,63kHz và được duy trì trong suốt quá trình tiết nọc của bọ cạp (5 – 7 giây) Bọ cạp được giữ cố định trên một bản kim loại, bản kim loại này được nối với cực âm của nguồn điện Điện cực dương được sử dụng
để kích thích trực tiếp vào phần đuôi chích để bọ cạp tiết hoàn toàn nọc có trong túi nọc ra ngoài Nọc được bọ cạp tiết ra được thu trên các lam thủy tinh mỏng dưới dạng chất lỏng không màu hoặc
có màu trắng sữa đục Nọc sau khi thu được làm khô trong bình hút ẩm có chứa CaCl2 khan trong khoảng 4 giờ Nọc sau khi khô được gom lại trong một lọ thủy tinh nhỏ và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ -20oC cho đến khi sử dụng Bọ cạp sau khi mua về để ổn định một ngày rồi tiến hành lấy nọc, khoảng cách giữa hai lần lấy nọc liên tiếp là hai tuần
Nọc thô được tinh chế thành các phân đoạn nhỏ hơn sử dụng phương pháp sắc ký lọc gel trên gel Sephadex G-50 và sắc ký lỏng hiệu năng cao Các phân đoạn nọc thu được tiếp tục được đánh giá độc tính trên chuột và dễ và nghiên cứu cấu trúc sử dụng phổ cộng hưởng từ hạt nhân và khối phổ
Trang 53 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1 Định danh bọ cạp đen thumẫu tại An Giang
Bọ cạp đen được tiến hành thu mẫu tại vùng An Giang, miền Nam, Việt Nam Sau đó, mẫu
vật bọ cạp được tiến hành vận chuyển sang Pháp, gửi mẫu tại phòng Sinh thái môi trường thuộc Viện
Bảo tàng lịch sử Quốc gia Pháp của Tiến sỹ khoa học Wilson R Lourenco để tiến hành định danh
bọ cạp
Kết quả xác định mẫu bọ cạp ở vùng An Giang thuộc loại Heterometrus laoticus (Phụ lục 1)
3.2 Nuôi bọ cạp trong phòng thí nghiệm và thu hoạch nọc
Bọ cạp H laoticus sau khi thu mua tại vùng An Giang (2 đợt, 850 cá thể) được chia vào các
thau để tiến hành thử nghiệm nuôi nhốt trong phòng thí nghiệm, mỗi thau có số lượng trung bình từ
65-75 cá thể, tiến hành nuôi và theo dõi trong 06 tháng cho kết quả như hình 3.1
Trang 6Hình 3.1 Lượng nọc bọ cạp thu được theo thời gian
Lượng nọc thu được từ bọ cạp nuôi trong phòng thí nghiệm giảm dần theo thời gian nuôi Trong phòng thí nghiệm, bọ cạp được nuôi với mật độ khá lớn so với tự nhiên, không gian hoạt động
ít, thức ăn được cung cấp đầy đủ nên không có tình trạng cạnh tranh nguồn thức ăn cũng như chống lại kẻ thù trong môi trường tự nhiên
3.3 Khảo sát, đánh giá và phân tích nọc thô bọ cạp H laoticus
3.3.1 Phân tích hàm lượng protein tổng trong nọc thô
Lượng protein có trong nọc thô được xác định bằng phương pháp so màu biuret với đường chuẩn được xây dựng bằng các nồng độ dung dịch albumin khác nhau Từ kết quả xây dựng đường
chuẩn và phương trình hồi quy của đường chuẩn tính toán được nồng độ protein có trong nọc H laoticus thu được là 1,293 mg/mL và từ đó xác định được hàm lượng của protein tan trong nước của
dung dịch nọc thô lấy từ bọ cạp là 64,65%
3.3.2 Phân tích nọc bọ cạp bằng sắc ký lọc gel trên gel Sephadex G50 và xác định khối lượng phân tử các phân đoạn
Thực hiện sắc ký lọc gel trên gel Sephadex G – 50 với 4.500 mg nọc thô tại Phòng Các chất
có hoạt tính sinh học, Viện Sinh học Nhiệt đới, thu được 5 phân đoạn nọc với tỷ lệ khối lượng từng
phân đoạn được thể hiện trong bảng 3.1
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1
0,7594
0,6106 0,5737
0,3942 0,3529
0,489
0,93
0,5652 0,6628
0,4864 0,3758
Trang 7Bảng 3.1 Khối lượng các phân đoạn nọc bọ cạp
Phân đoạn Lượng nọc (mg) Tỉ lệ (%)
Bằng sắc ký lọc gel, nọc thô từ loài bọ cạp H.laoticusđã được phân tách thành 5 phân đoạn
nọc khác nhau tương ứng với các khối lượng phân tử khác nhau Khối lượng phân tử của 5 phân đoạn này được xác định sơ bộ bằng phương pháp SDS-PAGE và so sánh với mẫu chuẩn khối lượng (hình 3.2)
Hình 3.2 Kết quả điện di 5 phân đoạn nọc so với mẫu chuẩn
Trang 83.3.3 Khảo sát độc tính của các phân đoạn của nọc bọ cạp H laoticus đối với chuột
Bảng 3.2 Kết quả thử độc tính trên chuột của các phân đoạn nọc
Phân
đoạn Biểu hiện của chuột sau khi tiêm các phân đoạn Nhận xét
1 Chuột gãi mõm, nằm im sau đó hoạt động bình thường Không độc
2 Chuột giảm hoạt động, xù lông, thở gấp nhưng phục
hồi sau 30 phút
Độc nhẹ
3 Chuột nằm im, chảy nước bọt, liệt chi, thở gấp nhưng
4 Chuột nằm im, mắt nhắm, co giật, liệt chi, chảy
nước bọt, chuột tử vong sau 3 giờ
Độc gây chết
5 Chuột run, nằm im, hoạt động bình thường sau 60 phút Không độc
Nước
cất
Chuột run, nằm im, sau đó bình thường Không độc
Phân đoạn 4 được tách ra từ nọc thô bọ cạp H laoticus bằng phương pháp sắc ký lọc gel, thông
qua thử nghiệm độc tính lên chuột cho thấy phân đoạn 4 có độc tính gây chết Vì vậy, phân đoạn 4 được xác định độc tính cấp đối với chuột và đạt được kết quả độc tính cấp của phân đoạn 4 tách ra
từ nọc thô bọ cạp Heterometrus laoticus là LD50 = 24, 07 ± 1,09 mg/kg.Phân đoạn 4 sau khi được xác nhận có độc tính mạnh được tiếp tục phân tách bằng HPLC để thu được các phân đoạn thứ cấp (hình 3.3)
Hình 3.3 Sắc ký đồ khi phân tách phân đoạn 4 bằng HPLC
Các phân đoạn thứ cấp của phân đoạn 4 tiếp tục được đánh giá độc tính trên chuột và cho kết quả tóm tắt trong bảng 3.2 Các phân đoạn thứ cấp có độc tính (phân đoạn 4.6, 4.7, 4.11 và 4.15) được tiếp tục tinh chế và xác định khối lượng phân tử của các peptide thành phần
Trang 9Bảng 3.3 Kết quả thử độc tính các phân đoạn thứ cấp
Phân đoạn Độc tính Phân đoạn Độc tính
4.1 Không độc 4.14 Không độc
4.3 Gây độc 4.16 Không độc 4.4 Không độc 4.17 Không độc
4.5 Gây độc 4.18 Không độc
4.6 Độc gây chết 4.19 Không độc
4.7 Gây độc 4.20 Không độc 4.8 Không độc 4.21 Không độc 4.9 Không độc 4.22 Không độc 4.10 Không độc 4.23 Không độc
4.11 Gây độc 4.24 Không độc 4.12 Không độc 4.25 Không độc
4.13 Không độc Nước muối
sinh lý Không độc
3.4 Tinh chế và xác định khối lượng phân tử các phân đoạn thứ cấp
Phân đoạn 4.6 được phân tách ra thành 3 phân đoạn gồm 4.6.1, 4.6.2, 4.6.3 Phân đoạn 4.6.1 thu được lượng mẫu tương đối ít, trong khi đó ở phân đoan 4.6.2 và 4.6.3 lượng mẫu thu được nhiều nên được tiếp tục tinh chế để xác định khối lượng phân tử Kết quả cho thấy phân đoạn thứ cấp 4.6.2
có khối lượng phân tử 3.669,155 Da, còn phân đoạn thứ cấp 4.6.3 có khối lượng phân tử 2.915,040
Da
Phân đoạn 4.7 tách ra 4 phân đoạn Trong đó, peptide 4.7.2 được tinh chế và khảo sát khối lượng phân tử, kết quả cho thấy peptide 4.7.1 có khối lượng phân tử là 3.700,2 Da và peptide 4.7.2
có khối lượng phân tử là 3.846,872 Da
Phân đoạn 4.11 đã tách được 01 peptide 4.11.1 sạch và xác định khối lượng phân tử của nó là 3.695,907 Da
Phân đoạn 4.15 đã tách ra làm 8 phân đoạn peptide Trong số đó, chúng tôi đã làm sạch và xác định khối lượng phân tử của ba peptide của phân đoạn thứ cấp 4.15.8 là 2.461,105 Da ; 3.285,285
Trang 10Phân đoạn Khối lượng phân tử (Da)
4.6.2 (Hetlaxin) 3.670,8 4.6.3 2.915,4 4.7.1 3.700,2 4.7.2 3.846,2
đã được xác định bằng phương pháp thoái hóa Edman là ISXTGSXQ Trình tự amino acid của Hetlaxin cũng đồng thời được phân tích bằng khối phổ MALDI (Hình 3.4)
Hình 3.4 Phân tích trình tự amino acid của Hetlaxin bằng khối phổ
Cùng một lúc thực hiện vỡ mảnh MS/MS hoàn toàn của chuỗi peptide và xác định khối lượng peptide bằng phương pháp dấu bàn tay nhờ trypsin Dựa trên dữ liệu của thoái hóa Edman và khối phổ trong hay 3.18 trình tự các amino acid của Hetlaxin có thể được xác định Dữ liệu khối phổ MS/MS của mảnh peptide thu được dưới tác động của trypsin chỉ ra rằng gốc cystein ở đầu cuối -C
đã bị amide hóa và gốc lysin ở vị trí 30 đã được tìm thấy bằng phương pháp xác định trình tự amino
Trang 11acid bằng MS/MS của mảnh thu được dưới tác động của trypsin Cấu trúc của Hetlaxin đã được xác định như trong hình 3.5
Hình 3.5 Cấu trúc bậc 1 của Hetlaxin
So sánh trình tự amino acid của Hetlaxin với trình tự amino acid của các alpha-toxin có tương tác với kênh kali (Hình 3.6) cho thấy Hetlaxin là đồng đẳng của các toxin này Hetlaxin có sự tương đồng cao với toxin AFB73769, trình tự amino acid của toxin này được suy ra từ sản phẩm của cDNA
(tổng hợp) thu được từ tuyến nọc của bọ cạp H laoticus của Thái Lan, cho đến nay vẫn chưa có tài
liệu về hoạt tính sinh học của toxin này Một toxin tương đồng khác (HsTX1-P59867 và toxin P0DJ31những toxin này có tương tác mạnh với kênh Kali Kv1.1 và Kv1.3 (Hình 3.6)
Vm24-1 Vm24-10 20 30
ISCTGSKQCY DPCKKKTGCP NAKCMNKSCK CYGC* HETLAXIN
ISCTGSKQCY DPCKRKTGCP NAKCMNKSCK CYGCG AFB73769
IRCSGSRDCY SPCMKQTGCP NAKCINKSCK CYGC* P84094(KAX6D_HETSP) ASCRTPKDCA DPCRKETGCP YGKCMNRKCK CNRC* P59867 (KAX63_HETSP)
AAAISCVGSPECP PKCRAQ-GCK NGKCMNRKCK CYYC* P0DJ31 (KA211_VAEMS)
AAAISCVGSKECL PKCKAQ-GCK SGKCMNKKCK CY-CP P0DJ32(KA212_VAEMS)
Hình 3.6 So sánh sự tương đồng của hetlaxin với các toxin khác
Kết hợp với phân tích khối phổ MS và MS/MS và dữ liệu thu được khi thực hiện phương pháp thoái hóa Edman, cấu trúc của phân đoạn 4.6.2 đã được xác định Sự tương tác của các peptide tách
ra với kênh Kv1.3 cũng được xem xét, từ đó nhận định chuỗi polypeptide đã cô lập được là một toxin mới và tạm được đặt tên là Hetlaxin Hetlaxin thuộc họ alpha-toxin, đây là một trong những toxin
đầu tiên tách ra từ H.laoticus và có ái lực mạnh với kênh kali Kv1.3 Trong khi đó Hetroscorpin -1
(HS-1) toxin tách ra từ H.laoticus tại Thái Lan có trình tự amino acid khác xa so với Hetlaxin và
không có báo cáo nào về tách dụng trên kênh thần kinh K, HelaTx1 cũng tách từ bọ cạp này thì lại không có tương tác mạnh trên kênh Kv1.3 như Hetlaxin
Trang 123.5.2 Khảo sát tác động của Hetlaxin lên kênh K +
Sự tương tác của Hetlaxin với cổng dẫn truyền ion K+ của các kênh kali đã được nghiên cứu trong các thí nghiệm cạnh tranh liên kết Chimeric protein KcsA-Kv1.3 và KcsA-Kv1.1, biểu hiện khác loài trong màng E coli, đã được sử dụng như các kênh K+ và R-AgTx2 được sử dụng như một phối tử Sự liên kết của R-AgTx2 được ghi nhận nhờ kính hiển vi đồng tiêu quét laser Có thể thấy rằng Hetlaxin cạnh tranh hiệu quả với R-AgTx2 trong liên kết với cả hai kênh chimeric (Hình 3.7) Các giá trị IC50 được xác định là 0,48 ± 0,01 μM và 6,7 ± 0,4 μM tương ứng cho Kv1.3 và Kv1.1, trong khi đó giá trị Ki được tính sử dụng phương trình Cheng-Prusoff là 59 ± 6 nM và 0,8 ± 0,3 M Những số liệu này cho thấy Hetlaxin tương tác hiệu quả với kênh kali Kv1.3, trong khi đó sự tương tác với kênh Kv1.1 thấp hơn khoảng mười lần [53,87]
Hình 3.7 Sự cạnh tranh của Hetlaxin với R-AgTx trong liên kết với kênh kali KcsA-K v 1.1 (A) và
KcsA-K v 1.3 (B)
Cho đến thời điểm hiện tại, từ loài H laoticus phân bố ở Thái Lan chỉ có hai toxin đã được cô
lập và xác định trình tự là Hetroscorpin-1 (HS-1) và HelaTx1 HS-1 có khối lượng phân tử của 8.293
Da, chứa 6 gốc cysteine và thuộc họ scorpine có độc tính với côn trùng và có hoạt tính kháng khuẩn nhưng không có báo cáo nào về sự tương tác của HS-1 với các kênh kali HelaTx1 có khối lượng phân tử 2.763 Da và chứa 4 gốc cysteine, có khả năng tương tác với các kênh kali khác nhau và tương tác mạnh nhất với kênh Kv1.1 (EC50 = 9,9 ± 1,6 μM) HelaTx1 cũng liên kết với kênh Kv1.3, tuy nhiên ái lực liên kết thấp hơn nhiều so với kênh Kv1.1 Ở nồng độ 30 μM, toxin HelaTx1 chỉ tương tác 20 % đối với kênh kali
Dựa trên các kết quả thử nghiệm khả năng liên kết với kênh kali của protein từ Hetlaxin cô lập
từ nọc loài H laoticus phân bố ở Việt Nam cho thấy khả năng liên kết và ức chế hoạt động của kênh
kali Kv1.3 và Kv1.1 Đối với kênh Kv1.3, protein mới phát hiện có khả năng ức chế ở nồng độ khá thấp, 0,48 ± 0,01 μM và 6,7 ± 0,4 μM tương ứng cho Kv1.3 và Kv1.1 Những nghiên cứu này cho thấy Hetlaxincó khả năng ức chế hoạt động kênh Kv1.3 hiệu quả hơn HelaTx1 đã được công bố và
-9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 0
300 600 900 1200
1000 2000 3000 4000
Trang 13là toxin có khả năng ức chế kênh Kv1.3 mạnh nhất được phân lập từ H laoticus cho đến nay (0,48
µM) [90] [85]Trước đây, đa số báo cáo đều cho thấy rằng các toxin của nọc bọ cạpH laoticus này
đều tác dụng trên kênh thần kinh Kv1.1 và chưa có báo cáo nào chỉ rõ sự liên kết của các protein này với Kv1.3 Hetlaxin là toxin đầu tiên tại thời điểm bài viết được tách từ nọc bọ cạp H laoticus có tác
động mạnh trên kênh Kv1.3
3.6 Khảo sát độc tính của các phân đoạn của nọc bọ cạp H laoticus lên dế
3.6.1 Kết quả khảo sát độc tính của các phân đoạn nọc thu được trên dế
Các phân đoạn của nọc bọ cạp H laoticus được thử nghiệm xác định độc tính đối với côn
trùng bằng phương pháp tiêm bên bụng dế, mỗi lô gồm 6 con và tiêm đối chứng sử dụng nước cất
cho kết quả như bảng 3.5
Bảng 3.5 Kết quả thử độc tính trên dế của các phân đoạn nọc
PĐ Các biểu hiện của dế Nhận xét
1 Dế nằm im, sau đó hoạt động bình thường Không độc
2 Dế nằm im, sau đó hoạt động bình thường Không độc
3 Dế nằm im, sau đó hoạt động bình thường Không độc
4 Dế nằm im, sau đó hoạt động bình thường Không độc
Nước cất Dế run, nằm im, sau đó bình thường Không độc
Đối với phân đoạn 5, sau khi được tiêm trong năm phút đầu tiên, dế hoạt động mạnh, chạy nhảy liên tục Đến phút thứ 10, dế bắt đầu nằm yên và đến phút thứ 26, dế có biểu hiện tử vong, tứ chi rụng ra Phân đoạn 5 được xác định là phân đoạn có độc tính đối với côn trùng
3.6.2 Xác định độc tính cấp của phân đoạn độc lên côn trùng theo đường tiêm bụng bên dế
Sau khi tiến hành tiêm bên bụng dế của các lô thử nghiệm và các lô đối chứng chúng tôi xác định được như sau :
Xác định được liều tối đa không gây chết LD0 = 20,3 µg/g
Xác định được liều tối thiểu gây chết 100% LD100 = 393,75 µg/g
Xác định liều chết trung bình LD50 theo phương pháp Karber – Behrens theo bảng 3.7 ta có:
∑ab =1.600,52
