Nghiên cứu biểu hiện cao gen mã hóa pectinase trong bacillus subtilis ứng dụng trong công nghiệp xử lý vải bông

Để “chiến lược phát triển ngành công nghiệp Dệt may Việt Nam đến năm 2015, định hướng đến năm 2020” thành công thì ngoài việc thúc đẩy tăng năng xuất và diện tích trồng bông ra chúng ta

BỘ GIÁO DỤC

VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

LÊ TRỌNG TÀI

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN CAO GEN MÃ HÓA PECTINASE

TRONG Bacillus subtilis NHẰM ỨNG DU ̣NG TRONG CÔNG

NGHIỆP XỬ LÝ VẢI BÔNG

Chuyên ngành: Hóa sinh thực nghiệm

Mã số: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LÊ VĂN TRƯỜNG

Hà Nội - 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các đồng sự khác Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Tác giả

Lê Trọng Tài

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Văn Trường, là người thầy

đã hướng cho tôi những ý tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành bản luận văn này

Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể phòng Di truyền Vi sinh vật - Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (nay là Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen vi sinh vật) đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học và bản luận văn

Tôi xin cảm ơn tất cả các thầy cô giáo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã chia sẻ, động viên, giúp tôi vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành tốt công việc nghiên cứu của mình

Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình và bè bạn - những người luôn bên tôi, động viên, góp ý và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Tác giả

Lê Trọng Tài

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

MỞ ĐẦU 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Sơ lược về Bacillus subtilis 3

1.2 Hệ biểu hiện Bacillus subtilis 4

1.3 Pectin 5

1.4 Pectinase 6

1.4.1 Khái niệm pectinase 6

1.4.2 Phân loại và cơ chế hoạt động của pectinase 6

1.5 Pectinase của Bacillus subtilis 10

1.6 Ứng dụng của pectinase kiềm 11

1.6.1 Cấu tạo sợi bông tự nhiên 11

1.6.2 Ứng dụng pectinase kiềm trong công nghiệp xử lý vải bông 12

1.6.3 Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất bột giấy 13

1.6.4 Ứng dụng pectinase kiềm trong chiết xuất dầu thực vật, trong chế biến cà phê và trà 13 1.7 Tình Hình nghiên cứu pectinase tái tổ hợp trên thế giới và Việt Nam 13

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 14

2.1 Vật liệu 14

2.1.1 Các chủng vi khuẩn 14

2.1.2 Hóa chất thí nghiệm 15

2.1.3 Các vector sử dụng 15

2.1.4 Trình tự mồi 15

2.2 Môi trường nuôi cấy 16

2.3 Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1 Sàng lọc các chủng B subtilis có hoạt tính pectinase trên môi trường thạch đĩa 17

2.3.2 Thu nhận pectinase ngoại bào từ các chủng B subtilis tự nhiên 17

2.3.3 Thu nhận pectinase ngoại bào từ các chủng tái tổ hợp 17

2.3.4 Định lượng protein theo phương pháp Bradford [11] 17

2.3.5 Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp đường khử (Bernfeld 1955)[10] 19

2.3.6 Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp phát hiện liên kết đôi 21

2.3.7 Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn B subtilis 22

2.3.8 Tách chiết DNA plasmid từ E coli 23

2.3.9 Tách chiết DNA plasmid từ B subtilis 23

2.3.10 Các phương pháp thao tác trong sinh học phân tử 23

2.3.11 Biến nạp plasmid vào E coli bằng phương pháp xung điện 26

2.3.12 Biến nạp pMSE3/BaP-pel vào B subtilis 168 26

2.3.13 Phương pháp điện di protein SDS-PAGE (Laemmli, 2009) 27

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Sàng lọc các chủng B subtilis phân lập từ trong nước có hoạt tính pectinase cao 28

3.1.1 Sàng lọc chủng B subtilis có hoạt tính pectinase trên đĩa thạch 28

3.1.2 Nghiên cứu khả năng phân cắt pectin ở pH kiềm bởi dịch enzyme ngoại bào của các chủng nghiên cứu 29

3.1.3 Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp phát hiện liên kết đôi 31

3.2 Tách dòng gen pectinase trong E coli 32

3.2.1 Tách chiết DNA tổng số của các chủng B subtilis 32

3.2.2 Nhân gen pectinase bằng PCR 33

3.2.3 Tách dòng các gen pel vào E coli 34

3.2.4 Giải trình tự các gen pectinase 36

3.3 Tạo chủng B subtilis tái tổ hợp sản sinh pectinase 38

3.3.1 Thiết kế vector biểu hiện gen pectinase trong B subtilis 38

3.3.2 Nghiên cứu chuyển gen pectinase vào B subtilis 43

3.3.3 Biểu hiện chủng tái tổ hợp BSM sản sinh pectinase trên môi trường lỏng 44

3.4 So sánh tính chất của enzyme pectinase tái tổ hợp với enzyme pectinase sinh ra từ chủng tự nhiên 47

3.4.1 So sánh ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính pectinase tái tổ hợp và pectinase từ chủng tự nhiên 47

3.4.2 So sánh ảnh hưởng của pH tới hoạt tính pectinase tái tổ hợp và pectinase từ chủng tự nhiên 48

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHI ̣ 49

4.1 Kết luận 49

4.2 Kiến nghị 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

Tài liệu tiếng Việt 50

Tài liệu tiếng Anh 50

DANH MỤC TƢ̀ VIẾT TẮT

ammonium bromide

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Phân loại các pectinolytic enzyme 7

Bảng 1.2 Các thành phần cấu tạo sợi bông 11

Bảng 2.1 Thành phần phản ứng nhân gen 23

Bảng 2.2 Chương trình nhân gen bằng PCR 23

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng cắt pKTH/pUC bằng HindIII 24

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng cắt pJET/pel bằng HindIII 24

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng gắn gen pel với promoter 24

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng nhân gen dung hợp BaP-pel 24

Bảng 3.1 Kết quả sàng lọc các chủng B subtilis có khả năng phân hủy pectin trên đĩa thạch. 28

Bảng 3.2 Hoạt tính pectinase ở điều kiện pH phản ứng tối ưu của các chủng nghiên cứu 30

Bảng 3.3 Hoạt tính pectinase của các enzyme thu được 31

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của một đoạn pectin 6

Hình 1.2 Thủy phân pectin bởi pectin methylesterases 8

Hình 1.3 Sự thủy phân polygalacturonate bởi endo- và exopolygalacturonase 8

Hình 1.4 Sự phân cắt polygalacturonate bởi pectinase 9

Hình 1.5 Sự kết nối giữa cellulose và các chất không phải cellulose trong lớp thứ cấp của sợi bông Pectin được tồn tại ở hai loại: pectin axit và esterified pectin 11

Hình 2.1 Đồ thị đường chuẩn protein 18

Hình 2.2 Sơ đồ phản ứng khử 3,5 dinitrosalicylic axit thành 3 amino, 5-nitrosalicylic axit 19

Hình 2.3 Đường chuẩn glucose 20

Hình 2.4 Sơ đồ phản ứng cắt pectin axit của pectinase 21

Hình 3.1 Hình ảnh một số chủng B subtilis tạo vòng thủy phân pectin trên đĩa thạch LB 0,2% pectin 29

Hình 3.2 Ảnh hưởng của pH đến khả năng phân hủy pectin của các pectinase từ các chủng nghiên cứu 31

Hình 3.3 Điện di DNA tổng số của các chủng B subtilis 33

Hình 3.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen pectinase 34

Hình 3.5 Khuẩn lạc các thể biến nạp E coli DH5α mang pJET/pel trên môi trường chọn lọc LB, 100 µg/ml ampicillin 34

Hình 3.6 Điện di sản phẩm cắt pJET/pel bằng HindIII 35

Hình 3.7 Điện di sản phẩm cắt pJET/pel bằng HindIII 35

Hình 3.8 So sánh theo hàng trình tự amino acid của Pel từ 4 chủng B subtilis phân lập ở Việt Nam với Pel từ B subtilis 168 37

Hình 3.9 Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện pel trong B subtilis 39

Hình 3.10 Điện di sản phẩm cắt pKTH/pUC bằng HindIII 40

Hình 3.11 Thu nhận pel từ pJET/pel 40

Hình 3.12 Sơ đồ nhân gen dung hợp BaP-pel bằng PCR 41

Hình 3.13 Nhân gen dung hợp BaP-pel bằng PCR 42

Hình 3.14 Kiểm tra gen dung hợp BaP-pel trong pMSE/BaP-pel 42

Hình 3.15 Kiểm tra pMSE/BaP-pel trong tế bào B subtilis 168 tái tổ hợp 44

Hình 3.16 Điện di SDS-PAGE dịch enzyme ngoại bào của chủng B subtilis tái tổ hợp đa copy trên môi trường LB+Kan 45

Hình 3.17 Kiểm tra sự biểu hiện pectinase của các thể biến nạp đa copy trong tế bào B subtilis 168 sau 24 giờ nuôi cấy 45

Hình 3.18 Kiểm tra hoạt tính pectinase của thể biến nạp đa copy BSM và chủng B subtilis

168 trên cơ chất pectin axit 46

Hình 3.19 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính enzyme 47 Hình 3.20 Ảnh hưởng của pH tới hoạt tính enzyme 48

MỞ ĐẦU

Ngành công nghiệp dệt may Việt Nam đang phát triển mạnh, chiếm vị trí quan trọng trong nền kinh tế quốc Nếu phát triển bông thực hiện đúng tiến độ theo Quyết định số 36/2008/QĐ-TTg của Thủ tướng Chính phủ thì đến năm

2015 sản xuất bông trong nước là 40 ngàn tấn, đáp ứng được 10% nhu cầu và đến 2020 là 60 ngàn tấn đáp ứng được 12% nhu cầu bông xơ tiêu thụ trong nước Để “chiến lược phát triển ngành công nghiệp Dệt may Việt Nam đến năm

2015, định hướng đến năm 2020” thành công thì ngoài việc thúc đẩy tăng năng xuất và diện tích trồng bông ra chúng ta cần phải cải tiến công nghệ, ứng dụng công nghệ enzyme trong quá trình sản xuất vải bông để tạo ra sản phẩm vải bông chất lượng cao, giá thành rẻ và có thể cạnh tranh được trên thị trường quốc

tế

Sợi bông tự nhiên được cấu tạo bao gồm 95% là cellulose và 5% là không phải cellulose Vải bông mộc sau khi dệt còn chứa nhiều chất không phải cellulose Trong quá trình nhuộm vải, nếu không loại các chất không phải cellulose đi thì chúng sẽ làm cản trở thuốc nhuộm thâm nhập vào vải, dẫn đến giảm chất lượng của vải nhuộm Thông thường để loại bỏ các chất này, vải mộc phải qua bước nấu kiềm (alkaline scouring) để tẩy loại chúng đi, đây là công nghệ đơn giản nhưng nảy sinh vấn đề vừa làm giảm sự rắn chắc của sợi bông do tác động của chất kiềm tới cấu trúc của cellulose, vừa làm ô nhiễm môi trường

và tiêu hao rất lớn năng lượng Để giải quyết vấn đề này, những năm gần đây các nhà công nghệ trên thế giới đã sử dụng enzyme pectinase, một loại enzyme pectinase kiềm để phân hủy pectin trong sợi bông, thay vì sử dụng hóa chất kiềm độc hại Xử lý vải bông bằng pectinase làm tăng khả năng thấm nước của vải bông, vải mịn và trơn nhẵn hơn, do đó mang lại hiệu quả cao cho quá tŕnh t ẩy trắng (bleaching) và nhuộm màu (dyeing), làm cho chất lượng vải tốt hơn

Việc ứng dụng enzyme pectinase kiềm trong công nghệ xử lý vải bông mới phát triển khoảng 10 năm gần đây Nhưng được nhiều nhà công nghệ quan tâm vì ích lợi to lớn của chúng trong việc nâng cao chất lượng vải bông, rút ngắn

thời gian xử lý, tiết kiệm năng lượng và giảm thiểu tác hại môi trường Hiện nay một số pectinase thương mại đã được sản xuất và bán trên thị trường để sử dụng trong công nghiệp dệt như Bioprep 3000L, ScourL-Novozyme (của hãng Novozyme), alkaline pectinase (Trung Quốc), Cottonase (Mỹ)

Ở nước ta, công nghệ xử lý sợi bông hiện nay vẫn sử dụng chất kiềm, đây

là lý do tại sao chúng ta không có sản phẩm vải bông chất lượng cao và ảnh hưởng lớn đến môi trường Chính vì vậy việc sử dụng enzyme pectinase trong

xử lý vải bông thay thế hóa chất kiềm sẽ giúp cho bảo vệ môi trường, làm cho vải bông có chất lượng cao và giúp cho giá thành sản xuất giảm Từ đó nâng cao

sự cạnh tranh trong thời buổi kinh tế thị trường

Hiện nay ở nước ta chưa có cơ sở nào sản xuất được pectinase ưa kiềm ứng dụng trong công nghiệp Vì vậy việc nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn sản xuất enzyme pectinase ưa kiềm tái tổ hợp để ứng dụng cho ngành sản xuất vải bông là điều cần thiết, giúp cho ngành công nghiệp dệt nước ta chủ động được nguồn enzyme phục vụ cho việc xử lý vải bông, nâng cao chất lượng vải bông

để cạnh tranh được trên thị trường Quốc tế Đề tài “Nghiên cứu biểu hiện cao

gen mã hóa pectinase trong Bacillus subtilis ứng dụng trong cô ng nghiê ̣p xử lý vải bông” sẽ góp phần tạo ra chủng vi khuẩn tái tổ hợp sản sinh pectinase sản

lượng cao để ứng dụng cho công nghiệp xử lý pectin trong vải bông thô

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược về Bacillus subtilis

Bacillus subtilis (B subtilis) là vi khuẩn gram dương, thuộc họ Bacillaceae,

chi Bacillus, phân bố rộng rãi trong sinh quyển nhưng phổ biến nhất là trong đất

Tế bào B subtilis có Hình que, có khả năng tạo thành nội bào tử để bảo vệ trong

khi gặp điều kiện bất lợi, cho phép sinh vật chịu được những điều kiện khắc nghiệt

[35], [43] Tế bào vi khuẩn B subtilis được bao bọc bởi thành vững chắc Nó bao

gồm các lớp peptidoglycan, là một polymer của các loại đường và amino acid Thành tế bào tạo thành các rào cản giữa môi trường và tế bào vi khuẩn Nó còn giúp duy trì Hình dạng của tế bào và giúp tế bào chịu được áp lực cao của môi trường nội bào [36]

B subtilis được tìm thấy tự nhiên rất nhiều trong đất và thảm thực vật, có

ít hơn trong nước hay không khí B subtilis phát triển trong phạm vi nhiệt độ

C B subtilis là sinh vật hiếu khí sống ký

sinh có bào tử có thể sống sót ở điều kiện nhiệt độ cao, thường thấy khi nấu ăn

Hệ gen B subtilis 168 đã được giải mã thành công và công bố vào năm

1997 [23], bao gồm duy nhất một chromosome dạng vòng Tổng kích thước hệ gen là 4,2 Mbp, trong đó 4 100 gen mã hóa cho các phân tử protein Sự giải mã

thành công hệ gen B subtilis mang một ý nghĩa to lớn, giúp thúc đẩy các nghiên

cứu về proteome và metabolome của vi khuẩn này

B subtilis là vi khuẩn không gây độc và ngày càng trở thành những vi

sinh vật quan trọng hàng đầu về mặt ứng dụng Các ứng dụng của chúng bao trùm hàng loạt lĩnh vực từ sản xuất thực phẩm thủ công truyền thống đến công nghệ lên men hiện đại, sinh học phân tử, y dược học, trong các ngành công nghiệp và trong xử lí môi trường Chính vì lẽ đó nên ngày càng nhiều các nghiên

cứu ứng dụng của chúng đối với đời sống con người B subtilis là vi khuẩn có

khả năng tiết một số enzyme quan trọng như protease, lipase, xylanase, pectinase kiềm, trong đó pectinase kiềm là một trong những enzyme quan trọng

có nhiều ứng dụng trong công nghiệp sản xuất nước ép trái cây, công nghiệp xử

lý giấy và đặc biệt là công nghiệp xử lý vải bông thô

1.2 Hệ biểu hiện Bacillus subtilis

B subtilis là vi khuẩn đã được nghiên cứu khá sâu về sinh học phân tử

(chỉ sau E coli) Chúng có nhiều đặc điểm quí như: là vi khuẩn không gây bệnh,

khả năng sinh trưởng rất mạnh, môi trường lên men đơn giản, rẻ và dễ ứng dụng

trong công nghiệp Hệ tiết của B subtilis được biết là một trong những hệ tiết tốt

nhất để ứng dụng sản xuất protein tái tổ hợp Vì vậy nhiều tác giả đã chọn hệ

biểu hiện B subtilis để sản xuất protein tái tổ hợp

Promoter là yếu tố quan trọng cho sự biểu hiện gen ngoại lai trong B

subtilis Việc sử dụng promoter của gen ngoại lai khi biểu hiện trong tế bào B subilis thông thường không hiệu quả bằng sử dụng promoter của B subtilis do

RNA-polymerase holoenzyme của chúng không bám hiệu quả vào promoter ngoại lai, ngoại trừ một vài trường hợp Tín hiệu tiết (signal peptide) cũng là yếu

tố quan trọng cho sự biểu hiện hiệu quả của gen ngoại lai Wang và Doi (1989)

đã định rõ các tín hiệu tiết cần thiết cho việc sao mã và dịch mã của gen ngoại

lai trong B subtilis và những yếu tố cần thiết để vượt qua rào cản của sự biểu

hiện gen [49] Việc sử dụng vector đa copy hay vector tích hợp gen để biểu hiện gen ngoại lai cũng cần được cân nhắc bởi vì mỗi loại vector đều có những ưu điểm và nhược điểm Vector đa copy thông thường có khả năng biểu hiện mạnh hơn vector tích hợp do có lượng bản sao nhiều hơn trong một tế bào chủ nhưng lại có tính bền kém hơn Hệ biểu hiện đa copy luôn luôn cần duy trì áp lực chọn lọc (như bổ sung kháng sinh vào môi trường nuôi cấy) Ngược lại vector tích hợp do được tích hợp gen ngoại lai vào chromosome của tế bào chủ cho nên có tính bền cao hơn, không cần đến áp lực chọn lọc khi biểu hiện gen

Các chủng sản xuất protein tái tổ hợp trong công nghiệp hiện nay phần

lớn là vi khuẩn thuộc họ Bacillus Lượng enzyme tái tổ hợp trong thương mại

hiện nay được sản xuất từ họ Bacillus chiếm tới 60% [17], [37] Tuy nhiên, hệ

biểu hiện B subtilis cũng có những nhược điểm như khi biểu hiện gen ngoại lai

trong chúng thì một hiện tượng hay gặp là sự tương tác bất lợi của sản phẩm biểu hiện với chủng biểu hiện dẫn đến quá trình biểu hiện có hiệu quả thấp, thậm chí nhiều trường hợp còn không thể biểu hiện được Tuy nhiên, nếu sử dụng gen biểu hiện là gen có nguồn gốc từ chúng thì khả năng ảnh hưởng bất lợi trong khi biểu hiện là hoàn toàn được loại bỏ Hướng sản xuất protein tái tổ hợp bằng cách này là một trong những hướng sản xuất mang lại hiệu quả biểu hiện cao Hướng

biểu hiện này đã thành công với gen amylase và xylanase tái tổ hợp trong B

subtilis ở một số nghiên cứu trong nước [4], [5]

1.3 Pectin

Pectin là các đại phân tử polysaccharide phức tạp có nhiều trong tế bào

(polygalacturonate) và các oligogalacturonate Pectin có khả năng tan trong nước và có ít nhất 75% các nhóm carboxyl của galactoronate bị ester hóa với methanol Oligogalacturonate là chất đa phân tử nhỏ hơn, chỉ gồm hai hoặc vài đơn phân galacturonate Oligo methylgalacturonate cũng là chất đa phân tử gồm hai hoặc vài galacturonate, có thể một phần hoặc hoàn toàn bị methyl hóa ở vị trí C-6 [50]

Hợp chất pectin tiêu biểu cho nhóm polysaccharide có mối liên hệ gần gũi với nhau Hai thành tố cơ bản tạo thành hợp chất pectin là galacturonan và rhamnogalacturonan trong đó carbon ở vị trí C-6 của galactose bị oxy hóa tạo nhóm carboxyl, ngoài ra còn có arabinan, galactan và arabinogalactan Rhamnogalacturonan là thành phần chính trong hợp chất pectin Chuỗi sơ cấp

gồm các đơn vị α-D-galacturonate liên kết (1-4) với 2-4% L-rhamnose liên kết

β-(1-2) và β-(1-4) với D-galacturonate Chuỗi bên của rhamnogalacturonan có thành phần và độ dài đa dạng Chuỗi bên kéo dài thường là các polymer đồng nhất của axit D-galacturonic hoặc L-arabinose [50]

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của một đoạn pectin

Cấu trúc hóa học đặc trưng của pectin được thể hiện ở Hình 1.1 Các đơn

vị D-galactorunate liên kết với nhau bằng các liên kết α-1-4 glycoside Một số D-galacturonate bị methyl-este hóa vị trí O-6 của nhóm carboxyl hoặc acetyl- este hóa ở vị trí O-2 hoặc O-3 của nhóm hydroxyl, một số khác bị biến đổi thành

hóa rất đa dạng, phụ thuộc vào nguồn pectin [38]

1.4 Pectinase

1.4.1 Khái niệm pectinase

Các enzyme xúc tác phân cắt pectin được gọi chung là pectinase Enzyme pectinase được tạo ra trong tự nhiên bởi các vi sinh vật như: vi khuẩn, nấm, nấm men, côn trùng, giun tròn, nguyên sinh động vật và thực vật Trong đó vi khuẩn

B subtilis là một trong nhóm vi khuẩn có khả năng tiết enzyme pectinase

Pectinase được sử dụng nhiều trong một số ngành sản xuất như: sản xuất rượu vang, nước ép trái cây, công nghiệp dệt may, xử lí rác thải Việc ứng dụng pectinase kiềm trong công nghệ xử lí vải bông mới phát triển khoảng 10 năm gần đây nhưng được nhiều nhà công nghệ quan tâm vì ích lợi to lớn của chúng trong việc nâng cao chất lượng vải bông, rút ngắn thời gian xử l í, tiết kiệm năng lượng và giảm thải tác hại môi trường Hiện nay một số pectinase thương mại đã được sản xuất và bán trên thị trường để ứng dụng trong công nghiệp dệt

1.4.2 Phân loại và cơ chế hoạt động của pectinase

Dựa vào cơ chế hoạt động và cơ chất chúng tham gia xúc tác phân cắt mà pectinase được phân chia thành các enzyme khác nhau Pectinase được phân loại thành 3 nhóm chính, được tóm tắt trong Bảng 1.1

Bảng 1.1 Phân loại các pectinolytic enzyme [50]

Tên enzyme EC No Cơ chất Sản phẩm Cơ chế

xúc tác Esterase

3.2.1.15 3.2.1.82

4.2.2.2 4.2.2.9

4.2.2.6

4.2.2.10

Pectin Pectin

Protopectin Pectin axit Pectin axit Trigalacto- ronate 4:5 (galacturo- nate)n Pectin

Pectin axit Pectin axit

Unsaturate

d digalactu- ronate Pectin

Pectin axit + Methanol

Pectin Oligogalacturonates Monogalacturonate Monogalacturonate

Unsaturated monogalaturonate

và saturate (n-1)

turonates

Methyloligogalac-Unsaturated oligogalacturonates

Unsaturated digalacturonates

Unsaturated monogalacturonates

Unsaturated methyloli- gogalacturonates

Thuỷ phân

Chưa xác định

Thuỷ phân Thuỷ phân Thuỷ phân Thuỷ phân Thuỷ phân

Thuỷ phân

Chuyển liên kết

Chuyển liên kết

Chuyển liên kết

Chuyển liên kết Pectinase có hai cơ chế phản ứng cơ bản: thủy phân (hydrolysis) và phân

cắt chuyển liên kết (trans –element) Cơ chế thủy phân đòi hỏi sự có mặt của

nước, ngược lại, cơ chế chuyển liên kết diễn ra trong điều kiện không cần nước

và tạo ra sản phẩm có một liên kết đôi (Hình 1.4)

Pectin methylesterase (EC 3.1.1.11) tác động vào pectin để loại bỏ nhóm

methoxyl từ nhóm carboxyl C-6 của galacturonate bằng con đường thủy phân

sự ion hóa các nhóm carboxyl H+ giải phóng ra từ nhóm carboxyl mới Hình thành sẽ làm giảm độ pH của môi trường phản ứng Do vậy, có thể tiến hành đo

pH của dung dịch sau phản ứng để xác định hoạt tính pectin methylesterase

methylesterases 2

Hình 1.2 Thủy phân pectin bởi pectin methylesterases Pectin acetylesterase thủy phân pectin bằng cách loại bỏ nhóm acetyl

khỏi nhóm hydroxyl C2 và C3 của đơn vị galacturonate Searle-van Leeuwen,

Vincken và cộng sự (1996) lần đầu phát hiện pectin acetylesterase ở Aspergillus

niger [40] Shevchik và Hugouvieux-Cotte-Pattat (1997) tìm thấy hai pectin

acetylesterase khác ở Erwinia chrysanthemi 3937 [41] Tuy nhiên, các nghiên

cứu về pectin acetylesterase còn rất hạn chế

endopolygalacturonase 2

2

Hình 1.3 Sự thủy phân polygalacturonate bởi endo- và exopolygalacturonase Endopolygalacturonase (EC 3.2.1.15) và exopolygalacturonase (EC

3.2.1.67) thủy phân liên kết glycosid bên trong của polygalacturonate (Hình 1.3) Sản phẩm phản ứng là một loạt polygalacturonate mạch ngắn (đối với

endopolygalacturonate) hoặc galacturonate (với exopolygalacturonate) Hoạt tính của hai enzyme này có thể được đo bằng cách xác định mức độ Hình thành nhóm khử với 3,5-dinitrosalycylate

Endopolymethylgalacturonase: thủy phân polymethylgalacturonate

ngẫu nhiên thành oligomethylgalacturonate [6], [16] Phản ứng được xúc tác bởi

sơ đồ sau:

2 n

Hoạt tính của endopolymethylgalacturonase cũng có thể được đo bằng cách xác định tỷ lệ nhóm khử Hình thành bởi sự thủy phân các liên kết glycosid

Endopolygalacturonate lyase (EC 4.2.2.2), còn có tên gọi khác là

pectinase Enzyme này chỉ được tìm thấy ở vi sinh vật, pH tối ưu trong khoảng 8-10, cao hơn nhiều so với các enzyme phân giải pectin khác Để hoạt động

và chúng phân cắt liên kết glycosid bằng cơ chế

trans tạo thành liên kết đôi giữa C-4 và C-5 của galacturonate (Hình 1.4)

Phương pháp tốt nhất để xác định hoạt tính enzyme này là phát hiện liên kết đôi trên máy đo quang phổ ở bước sóng 232 nm [28] Ngoài ra cũng có thể xác định hoạt tính bằng phương pháp đường khử với 3,5-dinitrosalicylate [10] Phản ứng xúc tác bởi endopolygalacturnate lyase như sau:

Endopolygalacturonate lyase

Hình 1.4 Sự phân cắt polygalacturonate bởi pectinase Exopolygalacturonate lyase (EC 4.2.2.9) được phát hiện chỉ ở một số

loài vi khuẩn như Clostridium multifermentan; Erwinia aroideae; Erwinia

disolvens Cơ chất thích hợp không phải polymethylgalacturonate mà là

polygalacturonate Sản phẩm tạo thành là Δ4:5 digalacturonate không no Độ pH tối ưu của các enzyme này trong khoảng 8,0 – 9,5 Hoạt tính của exopolygalacturonate lyase có thể được xác định giống với cách tiến hành đối với endopolygalacturonate lyase Phản ứng xúc tác bởi enzyme exopolygalacturonate lyase theo sơ đồ sau:

Endo methylgalacturonate lyase (EC 4.2.2.10) phân cắt pectin bên trong

phân tử pectin, tạo thành sản phẩm cuối cùng là các oligomethylgalacturonates [6], [16] Phản ứng xúc tác bởi Endo methylgalacturonate lyase như sau:

Hoạt tính của enzyme này có thể được xác định bằng phương pháp đường khử [10], [42], hoặc đo trên máy quang phổ phát hiện các liên kết nối đôi ở bước sóng 232 nm [28]

1.5 Pectinase của Bacillus subtilis

Pectinase từ B subtilis đã được Nasser tinh sạch và nghiên cứu tính chất

và biểu hiện trong E coli từ những năm 90 của thế kỷ trước [31], [30] Enzyme

này xúc tác phản ứng phân hủy pectin axit ở pH và nhiệt độ tối ưu là 8,4 và 42

o

C Trọng lượng phân tử protein khoảng 45,6 kDa, bao gồm 420 amino acid, trong đó có 21 amino acid của peptide tín hiệu tiết Cũng như các pectinase từ vi

[32]

Các chủng B subtilis hiện có ở Việt Nam thông thường sẽ có gen pel này,

các biến chủng của chúng sẽ có một vài sai khác trong gen, do đó dựa vào trình

tự nucleotide đã biết của chúng mà có thể tổng hợp cặp mồi để nhân gen bằng PCR một cách dễ dàng

1.6 Ứng dụng của pectinase kiềm

1.6.1 Cấu tạo sợi bông tự nhiên

Hình 1.5 Sự kết nối giữa cellulose và các chất không phải cellulose trong lớp thứ cấp của sợi bông Pectin đƣợc tồn tại ở hai loại: pectin axit và esterified pectin

Sợi bông tự nhiên đƣợc cấu tạo bởi lớp ngoài mỏng gọi là lớp sơ cấp và lớp dầy bên trong là lớp thứ cấp Hàm lƣợng cellulose trong sợi bông chiếm tới 95%, chỉ 5% còn lại là chất không phải cellulose (non- cellulose) Các chất không phải cellulose này chủ yếu là pectin, ngoài ra còn có chất dị cellulose (hemicellulose), protein và chất sáp dính (waxe) [9], [39]

Bảng 1.2 Các thành phần cấu tạo sợi bông [9], [39]

bỏ các chất không phải cellulose khác trong sợi bông dễ dàng hơn

1.6.2 Ứng dụng pectinase kiềm trong công nghiệp xử lý vải bông

Công nghệ xử lý vải bông bằng enzyme được gọi là “BioScouring” là công nghệ sử dụng enzyme pectinase kiềm thay thế xút trong khâu nấu kiềm đã được nghiên cứu và triển khai trong sản xuất và đã thu được kết quả tốt ở nhiều nơi Tháng tư năm 1999, hãng Novozymes (Đan Mạch) đã đưa chế phẩm pectinase kiềm ra thị trường có tên thương mại BioPrep 3000L Sau đó ít lâu, hãng Bayer (Đức) có sản phẩm enzyme pectinase kiềm là Baylase EVO Từ dó công nghệ “BioScouring” sử dụng enzyme pectinase kiềm xử lý vải bông ra đời Công nghệ “BioScouring” với các sản phẩm chứa pectinase kiềm đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu cho thấy có hiệu quả tốt, có thể thay thế xút để loại pectin trong quá trình nấu tẩy [8], [12], [15], [19], [26] Pectin trong sợi bông có vai trò như chất kết dính liên kết cellulose và chất không phải cellulose Sử dụng enzyme pectinase kiềm không làm ảnh hưởng đến cấu trúc cellulose của sợi vải, do đó tránh tổn hại sợi [22], [29], [48] Klug-Santner và

cộng sự đã chỉ ra pectinase từ Bacillus pumilus BK2 đã loại 80% pectin của sợi

bông [22] Hiện nay, các nghiên cứu trên thế giới cho thấy việc kết hợp pectinase kiềm với một số enzyme khác như: lipase, protease, xylanase sẽ giúp

hỗ trợ loại bỏ các chất không phải cellulose (lignin, sáp, protein, hemicellulose…) hiệu quả hơn khi chỉ sử dụng một loại enzyme pectinase trong công đoạn nấu kiềm [45], [47]

Các chế phẩm pectinase kiềm hiện nay có trên thị trường: Bioprep 3000L, Pulpzyme HC, Scourzyme L –Novozymes, Baylase EVO – Bayer, Unizim PEC – Color-Center SA, Baylase EVO, Sera Zyme C – PE của Singapore, Prima Green Ecoscour của Genencor Các chế phẩm pectinase kiềm thay thế xút đã giảm rõ rệt giá thành sản xuất nhờ tiết kiệm nước, năng lượng và thời gian xử lý

so với quá trình nấu truyền thống sử dụng xút Hơn nữa, do các điều kiện xử lý

“ôn hòa” của enzyme pectinase dẫn đến tăng chất lượng vải, tăng mức độ thấm, hút nước và cũng làm tăng độ tươi sáng màu sau nhuộm theo Cavaco-Paulo & Gübitz (2003) [14]

1.6.3 Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất bột giấy

Trong công nghệ sản xuất bột giấy hiện nay, bước tẩy trắng bằng alkaline peroxide là bước bắt buộc để tạo sản phẩm giấy trắng tinh khiết Nếu bột giấy không được loại bỏ pectin axit trong bột giấy thì trong quá tình tẩy trắng các pectina axit này sẽ kết hợp với peroxide tạo ra phức hợp cationic polymer làm ảnh hưởng đến độ trắng của giấy Sử dụng pectinase kiềm để loại pectin axit trong bột giấy giúp cho quá trình tẩy trắng hiệu quả mà không ảnh hưởng đến ô nhiễm môi trường [33], [34]

1.6.4 Ứng dụng pectinase kiềm trong chiết xuất dầu thực vật, trong chế biến

cà phê và trà

Pectinase kiềm có khả năng phá vỡ vách tế bào thực vật do đó có khả năng ứng dụng trong công nghệ chiết xuất dầu thực vật từ các hạt như hạt cải, dầu dừa, hạt hướng dương, hạt nho v.v Việc xử lý các hạt với pectinase kiềm giúp cho việc chiết rút dầu thực vật hiệu quả hơn so với dùng dung môi hexane

dễ gây ung thư [20] Bổ sung pectinase kiềm cùng với hemicellulase và protease trong quá trình chế biến cà phê và trà lên men làm tăng năng suất và chất lượng sản phẩm [7]

1.7 Tình Hình nghiên cứu pectinase tái tổ hợp trên thế giới và Việt Nam

Pectinase là enzyme quan trọng trong công nghiệp do đó được đã được nhiều nhà khoa học quan tâm Nhiều tác giả đã biểu hiện thành công pectinase

dạng tái tổ hợp trong tế bào E coli [30], [21], [24], [46], trên tế bào Bacillus

[27] hay tế bào nấm men Pichia pastoris [18], [52] Tuy nhiên phần lớn các công

bố trên đều biểu hiện enzyme pectinase tái tổ hợp cho mục đích nghiên cứu tính chất của enzyme, các công bố về tình Hình sản xuất enzyme trong công nghiệp cũng như năng suất sản sinh pectinase tái tổ hợp của các chủng tái tổ hợp đều rất

ít thông tin Trên thực tế có nhiều chế phẩm enzyme pectinase thương mại là enzyme tái tổ hợp nhưng có rất ít thông tin về sản xuất pectinase tái tổ hợp trong công nghiệp được công bố Lý giải cho việc không công bố này là do các công

ty đều muốn giữ bí mật công nghệ cho nên không muốn công bố kết quả nghiên cứu của mình, đây là việc làm bình thường trong kinh doanh Gần đây Liu và

cộng sự công bố kết quả biểu hiện gen pectinase từ B subtilis trong B subtilis

WB600 hiệu suất cao mục đích ứng dụng cho sản xuất công nghiệp Các tác giả

đã biểu hiện thành công và enzyme tái tổ hợp cho hoạt tính riêng là 445 U/mg [27] Không có công bố hoạt tính pectinase cụ thể là bao nhiêu unit/ml dịch enzyme ngoại bào sau lên men Công bố mới đây của Zhang và cộng sự đã biểu

hiện cao pectae lyase từ B subtilis 168 trong tế bào P pastoris GS115 cho mục đích loại pectin trong công nghiệp xử lý sợi gai Các tác giả đã tạo được chủng P

pastoris tái tổ hợp có khả năng sản xuất pectinase trên môi trường lên men đạt

102,36 U/ml dịch lên men [52]

Ở Việt Nam hiện nay có nhiều đề tài về enzyme pectinase Các hướng nghiên cứu tập trung về cảm ứng, thu nhận, khảo sát các đặc tính, tinh sạch, cố định và ứng dụng của enzyme pectinase trên đối tượng chủ yếu là vi nấm, đặc

chủng giống VTCC- Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại học Quốc gia

Hà Nội và Trung tâm Công nghệ sinh học phục vụ đời sống và sản xuất (Biolab) được sử dụng để sàng lọc enzyme pectinase

Chủng vi khuẩn E coli chủng DH5α, DH10b (Invitrogen) được sử dụng

cho mục đích tách dòng gen

Chủng B subtilis 168 M được sử dụng cho mục đích biểu hiện gen

2.1.2 Hóa chất thí nghiệm

Các hóa chất trong sinh học phân tử:

Enzyme cắt giới hạn EcoRI, HindIII, XbaI, XhoI, ScaI, Dream Taq DNA polymerase, T4 ligase, DNA marker, protein marker đƣợc mua từ hãng

2.1.3 Các vector sử dụng

Vector cloning: pJET1.2 đƣợc mua từ hãng Fermentas

Vector biểu hiện trong B subtilis dạng đa copy pMSE3 đƣợc nhận từ viện Công nghệ sinh vật Biển Greifswald

2.2 Môi trường nuôi cấy

- Môi trường LB (g/l): Pepton 10, cao nấm men 5, NaCl 5

- Môi trường khoáng chất Belitsky (BMM):

Môi trường lên men FM (g/l): Tinh bột ga ̣o 3; pepton đâ ̣u tương 3,5;

+ T-base (g/l): (NH4)2SO4 2; K2HPO4.3H2O 18,3; KH2PO4 6; Na3-citrate 1

Tất cả thành phần môi trường đều được khử trùng ướt trước khi sử dụng

- Môi trường SOC (g/l): Tryptone 20; yeast extract 5; NaCl 0,58; KCl

0,186; MgCl2 0,95; MgSO4 2,4; glucose 3,6; pH = 7

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Sàng lọc các chủng B subtilis có hoạt tính pectinase trên môi trường thạch đĩa

Các chủng B subtilis trong bộ sưu tập chủng giống được trẻ hóa trên môi

trường LB thạch đĩa qua đêm sau đó cấy vạch sang môi trường LB thạch đĩa bổ sung cơ chất pectin 0,2%, nuôi qua đêm trong tủ ấm 37 ºC Các đĩa nuôi cấy sau

đó được nhuộm với dung dịch 0,5% hecxadecyl trimethyl trimethyl ammonium bromide (HTAB) để phát hiện vòng thủy phân pectin Các chủng sinh pectinase sẽ tạo vòng thủy phân xung quanh khuẩn lạc

2.3.2 Thu nhận pectinase ngoại bào từ các chủng B subtilis tự nhiên

Các chủng B subtilis được trẻ hóa trên môi trường LB lỏng ở 37 ºC, 200

vòng/phút qua đêm sau đó cấy chuyển 1% sang môi trường LB lỏng có bổ sung

cơ chất pectin để kích thích sự sản sinh pectinase Sau 24 giờ nuôi cấy ở cùng điều kiện, dịch enzyme ngoại bào được thu bằng ly tâm 10.000 vòng/phút trong

10 phút ở 4 ºC để loại tế bào, dịch nổi chứa enzyme ngoại bào được thu nhận và bảo quản ở -20 ºC cho các thí nghiệm tiếp theo

2.3.3 Thu nhận pectinase ngoại bào từ các chủng tái tổ hợp

Các chủng B subtilis tái tổ hợp được trẻ hóa trên môi trường LB lỏng (bổ

sung 20 µg/ml Kan) ở 37 ºC, 200 vòng/phút qua đêm sau đó cấy chuyển 1% sang môi trường lỏng (LB, BMM hay FM bổ sung 20 µg/ml Kan) Sau 26 giờ nuôi cấy ở cùng điều kiện, dịch enzyme ngoại bào được thu bằng ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 ºC để loại tế bào, dịch nổi chứa enzyme ngoại bào được thu nhận và bảo quản ở -20 ºC cho các thí nghiệm tiếp theo

2.3.4 Định lượng protein theo phương pháp Bradford [11]

Nguyên lý:

Dựa vào trạng thái cân bằng bền của thuốc nhuộm Coomassie Blue G trong dung dịch, ở điều kiện axit mạnh thuốc nhuộm này tạo phức hợp màu đỏ Khi có mặt protein, thuốc nhuộm sẽ kết hợp với protein làm cho dung dịch chuyển thành màu xanh Mức độ đậm nhạt của màu phụ thuộc vào nồng độ protein trong dung dịch do đó có thể định lượng nồng độ protein bằng việc đo dộ hấp phụ của dịch màu trên máy quang phổ ở bước sóng 595 nm

Chuyển đổi giá trị OD 595 sang nồng độ protein (mg/ml) theo công thức chuyển đổi

Đồ thị đường chuẩn protein có dạng như sau:

Đường chuẩn protein

y = 1.247x + 0.3831

R 2 = 0.9949

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

(y - 0,3831) a x= - 1,247 Trong đó x là nồng độ protein (mg/ml), y là giá trị OD 595, a là số lần pha loãng mẫu

2.3.5 Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp đường khử (Bernfeld 1955)[10]

Nguyên lý:

Nguyên lý của phương pháp này dựa vào phản ứng của đầu đường khử (reducing suger end) của các oligogalacturonate được tạo ra do phản ứng cắt liên kết glycoside của cơ chất pectin bởi pectinase với 3,5 dinitrosalicylic axit (DNSA) Trong phản ứng này, 3,5 dinitrosalicylic axit (màu vàng) bị khử thành 3 amino, 5-nitrosalicylic axit (màu đỏ cam) (Hình 2.2) Giá trị OD đo ở bước sóng 530 nm của dung dịch phản ứng phản ánh hoạt tính của enzyme pectinase

Hình 2.2 Sơ đồ phản ứng khử 3,5 dinitrosalicylic axit thành 3 amino,

Hút 50 µl dịch enzyme vào 350 µl dung dịch phản ứng 0,2% pectin, ủ

Bổ sung 400µl DNSA, đun sôi trong 5 phút, làm nguội ở nhiệt độ phòng Đo OD ở bước sóng 530 nm

Pha dung dịch DNSA: DNSA: 5 g; K-Na-tartarate: 150 g; NaOH 2M:

100 ml; nước cất: đến 500 ml

Xây dựng đường chuẩn glucose:

Đường chuẩn glucose được thiết lập để qui đổi giá trị OD 530nm của dịch phản ứng enzyme sang đơn vị unit Glucose được cân chính xác với độ sai số 0,0001 - 0,0005 mg, được pha loãng với các nồng độ từ 0,2 đến 20 mM trong nước cất 0,5 ml dung dịch glucose ở các nồng độ khác nhau được bổ sung 0,5

ml DNSA, đun sôi 5 phút, làm nguội tới nhiệt độ phòng sau đó đo OD trên máy quang phổ ở bước sóng 530 nm Đồ thị glucose chuẩn được thiết lập trên đoạn thẳng trên phương trình hồi qui bằng chương trình Excel có dạng sau:

y = 0.7267x - 0.0654

R 2 = 0.9981

-0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

OD của phản ứng so màu ở 530 nm

Định nghĩa đơn vị hoạt tính enzyme:

Một đơn vị hoạt tính enzyme (unit) được định nghĩa là lượng enzyme pectinase phân cắt cơ chất pectin tạo ra 1 µM glucose trong 1 phút

Qui đổi từ giá trị OD 530 sang Unit được tính theo công thức sau:

1000 X

E = -

t Trong đó: X là số mM đường khử được sinh ra sau phản ứng, t là thời gian phản ứng enzyme (phút), 1000 là hệ số qui đổi mM sang µM đường khử

2.3.6 Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp phát hiện liên kết đôi

Nguyên lý:

Hình 2.4 Sơ đồ phản ứng cắt pectin axit của pectinase

Enzyme pectinase phân cắt liên kết glycosid của pectin axit bằng cơ chế chuyển liên kết tạo thành liên kết đôi giữa C-4 và C-5 của galacturonate ở đầu không khử (Hình 2.4) Liên kết đôi này có thể phát hiện trên máy quang phổ ở bước sóng 232 nm [28]

1 giờ Bổ sung 400 µl dung dịch HCl 50 mM để kết thúc phản ứng, ly tâm

10000 vòng/phút trong 5 phút sau đó đo trực tiếp trên máy quang phổ ở bước sóng 232 nm

Liên kết đôi

2.3.7 Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn B subtilis

Nguyên lý:

Để tách chiết đƣợc DNA tổng số cần phá vỡ thành tế bào, phá vỡ các liên

kết của protein với DNA Khi tách chiết cần phải làm bất hoạt các enzyme phân

hủy DNA

Các bước tiến hành:

Nuôi 1 khuẩn lạc B subtilis trong LB lỏng, lắc 200 vòng/phút ở 37˚C qua

đêm Hút 1ml dịch nuôi vào ống eppendorf, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 2 phút ở 4o

C Loại dịch trên, hòa tan tế bào vào trong 100µl TE pH 8.0 Bổ sung

10 µl lysozyme nồng độ 100 µg/ml, lắc nhẹ, ủ hỗn hợp ở 37 ˚C trong 1 giờ, sau