Nghiên cứu thành phần loài sán lá song chủ (digenea) ký sinh ở cá chẽm (lates calcarifer bloch, 1790) nuôi tại tỉnh khánh hòa

i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài “Nghiên cứu thành phần loài sán lá song chủ Digenea ký sinh trên cá chẽm Lates calcarifer Bloch, 1790 nuôi tại Khánh Hòa” là công

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

NGUYỄN NGUYỄN THÀNH NHƠN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN LOÀI SÁN LÁ SONG CHỦ

(DIGENEA) KÝ SINH Ở CÁ CHẼM (LATES CALCARIFER

BLOCH, 1790) NUÔI TẠI KHÁNH HÒA

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

KHÁNH HÒA - 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

NGUYỄN NGUYỄN THÀNH NHƠN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN LOÀI SÁN LÁ SONG CHỦ

(DIGENEA) KÝ SINH Ở CÁ CHẼM (LATES CALCARIFER

BLOCH, 1790) NUÔI TẠI KHÁNH HÒA

Ngành đào tạo: Nuôi trồng thủy sản

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài “Nghiên cứu thành phần loài sán lá

song chủ (Digenea) ký sinh trên cá chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790) nuôi tại Khánh Hòa” là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi và chưa từng được công bố

trong bất cứ công trình khoa học nào khác cho tới thời điểm này

Khánh Hòa, ngày 25 tháng 08 năm 2017

Tác giả luận án

ii

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của quý phòng ban trường Đại học Nha Trang đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi được hoàn thành đề tài Đặc biệt là sự hướng dẫn tận tình của PSG TS Đỗ Thị Hòa và PGS.TS Glenn Allan Bristow đã giúp tôi hoàn thành tốt đề tài Qua đây, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến

Xin chân thành cảm ơn Dự án NUFU (NUFU Pro 67/2003) đã hỗ trợ kinh phí cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài, tạo điều kiện cho tôi được được tiếp cận các trang thiết bị hiện đại phục vụ nghiên cứu

Xin chân thành cảm ơn các bạn đồng nghiệp thuộc dự án NUFU, Phòng Sinh học Thực nghiệm, Phòng Vắc xin và Công nghệ Sinh học Thủy sản, Phòng Khoa học, Hợp tác quốc tế và Đào tạo - Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III, Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường – Trường Đại học Nha Trang đã giúp đỡ tôi trong quá trình thu mẫu, phân tích mẫu

Cuối cùng tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình và tất cả bạn bè

đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Khánh Hòa, ngày 25 tháng 08 năm 2017

Tác giả luận án

Nguyễn Nguyễn Thành Nhơn

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC HÌNH x

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 4

1.1.Một số đặc điểm sinh học của cá chẽm (Lates calcarifer) 4

1.2.Tình hình nuôi cá chẽm (Lates calcarifer) thương phẩm 6

1.2.1 Nuôi cá chẽm thương phẩm trên thế giới 6

1.2.2 Tình hình nuôi cá chẽm (Lates calcarifer) thương phẩm ở Việt Nam 9

1.3.Nghiên cứu ký sinh trùng ở cá chẽm (Lates calcarifer) nuôi 10

1.3.1 Thành phần loài ký sinh trùng ký sinh ở cá chẽm (Lates calcarifer) được phát hiện và công bố trên thế giới 10

1.3.2 Nghiên cứu ký sinh trùng trên cá chẽm (Lates calcarifer) ở Việt Nam 12

1.3.3 Nghiên cứu về sán lá song chủ ký sinh ở cá biển 13

1.4 Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong phân loại sán lá song chủ 17

1.4.1 Hệ thống học phân tử và hệ thống học truyền thống 17

1.4.2 Các chỉ thị phân tử thường sử dụng trong nghiên cứu di truyền 18

1.4.3 Ứng dụng sinh học phân tử trong phân loại sán lá song chủ 20

CHƯƠNG II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu 29

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 29

2.1.2 Thời gian nghiên cứu 29

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 29

2.2 Vật liệu nghiên cứu 30

2.2.1 Mẫu cá chẽm thương phẩm 30

2.3 Các phương pháp nghiên cứu đã sử dụng 33

2.3.1 Phương pháp phát hiện, thu thập, bảo quản, cố định và làm tiêu bản các ký sinh trùng là sán lá song chủ 33

iv

2.3.2 Phân loại sán lá song chủ bằng phương pháp hình thái học 36 2.3.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm di truyền của các loài sán lá song chủ ký

sinh ở cá chẽm (Lates calcarifer) 37

2.3.4 Khảo sát vòng đời phát triển của 1 loài sán lá song chủ ký sinh trên cá chẽm 43

2.3.5 Xử lý số liệu 46 CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 50 3.1 Tình hình nuôi cá chẽm ở Khánh Hòa 50 3.1 Thành phần giống loài sán lá song chủ (Digenea) ký sinh ở cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa 501

3.1.1 Thành phần giống loài sán lá song chủ đã tìm thấy ký sinh ở cá chẽm 51 3.1.2 Mô tả hình dạng, cấu tạo của các loài sán lá song chủ ký sinh ở cá chẽm 55

3.1.3 Xác định loài Pseudometadena celebesensis là ký sinh trung đặc hữu trên cá chẽm (Lates calcarifer) 66

3.2 Phân loại và xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài SLSC ký sinh ở

cá chẽm nuôi ở Khánh Hòa bằng kỹ thuật sinh học phân tử 71

3.2.1 Khuếch đại, giải trình tự ADN của sán lá song chủ trên cá chẽm 71 3.2.2 So sánh sự khác biệt về trình tự gen giữa các loài sán lá song chủ ký sinh trên

cá chẽm (Lates calcarifer) nuôi ở Khánh Hòa 72

3.2.3 Xây dựng cây phát sinh loài với sán lá song chủ ký sinh trên cá chẽm nuôi ở Khánh Hòa 78

3.3 Xác định mức độ nhiễm sán lá song chủ trên chẽm nuôi ở Khánh Hòa 81

3.3.1 Mức độ nhiễm sán lá song chủ ở cá chẽm nuôi theo năm nghiên cứu 81 3.3.2 Mức độ nhiễm sán lá song chủ (Digenea) ở cá chẽm nuôi trong ao đất và trong các lồng trên biển 84 3.3.3 Mức độ nhiễm sán lá song chủ trên cá chẽm nuôi thương phẩm ở các kích cỡ khác nhau của cá 87

3.4.Khảo sát sự phát triển các giai đoạn ấu trùng của loài sán Pseudometadena

celebesensis ký sinh ở cá chẽm 88

3.4.1 Kiểm tra phát hiện ấu trùng sán lá song chủ ký sinh ở các loài ốc và cá tạp 89

v

3.4.2 Kết quả của thí nghiệm dùng cá đối làm thức ăn cho cá chẽm để nghiên cứu

vòng đời loài sán song chủ Pseudometadena celebesensis 94

CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 97

4.1 Kết luận 97

4.2 Đề xuất ý kiến 98

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 99

TÀI LIỆU THAM KHẢO 100

Tài liệu Tiếng Việt 100

Tài liệu Tiếng Anh 102

vii

DANH MU ̣C CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Sản lượng cá chẽm thế giới giai đoạn 2005 - 2014 6

Bảng 1.2 Thành phần giống loài ký sinh trùng ở cá chẽm (Lates calcarifer) 10

Bảng 2.1 Số lượng và kích cỡ trung bình của mẫu cá chẽm 30 Bảng 2.2 Số lượng và kích thước cá chẽm được thu từ các ao nuôi trong thời gian từ tháng 6/2007 đến tháng 3/ 2009 31 Bảng 2.3 Số lượng và kích cỡ trung bình của cá chẽm nuôi ao được thu theo các năm

từ 2010 đến 2013 31 Bảng 2.4 Số lượng và kích cỡ của các loài cá tạp đã được dùng để kiểm tra ấu trùng metacercaria của sán lá song chủ 32 Bảng 2.5 Kích cỡ cá chẽm giống trước khi bố trí thí nghiệm 33 Bảng 2.6 Trình tự các đoạn mồi được sử dụng cho phản ứng PCR 39 Bảng 2.7 Trình tự gen 18S rRNA của các loài sán lá song chủ ký sinh ở một số loài cá biển 47 Bảng 2.8 Trình tự gen 28S rRNA của một số loài sán lá song chủ ký sinh ở một số loài cá biển 48 Bảng 3.1: Thành phần loài, mức độ nhiễm và vị trí ký sinh của sán lá song chủ ở cá chẽm 51 Bảng 3.2 Thành phần loài sán lá song chủ ký sinh ở cá chẽm nuôi ở Khánh Hòa 52

Bảng 3.3 So sánh kích thước của loài Erilepturus hamati ký sinh ở cá chẽm nuôi tại

Khánh Hòa với các nghiên cứu khác 58

Bảng 3.4 So sánh kích thước của loài Transversotrema patialense ký sinh ở cá chẽm

nuôi tại Khánh Hòa với các nghiên cứu khác 60

Bảng 3.5 So sánh kích thước của loài Pseudometadena celebesensis ký sinh ở cá

chẽm nuôi tại Khánh Hòa với các nghiên cứu khác 62

Bảng 3.7 So sánh kích thước của loài Elytrophallus sp ký sinh ở cá chẽm nuôi tại

Khánh Hòa với nghiên cứu khác 66 Bảng 3.8 Kết quả Parafit của các loài sán lá song chủ ký sinh ở cá chẽm 69

viii

Bảng 3.9 Sự tương đồng (phía dưới đường bên) và khác biệt (phía trên đường bên) về trình tự 18S rRNA 74 Bảng 3.10 Sự khác biệt về trình tự vùng ITS1 rRNA của các loài sán lá song chủ ký sinh ở cá chẽm và trên GenBank 75 Bảng 3.11 Sự tương đồng (phía dưới đường bên) và khác biệt (phía trên đường bên)

về trình tự 28S rRNA 76 Bảng 3.12 Tỷ lệ nhiễm (%) của các loài sán lá song chủ trên cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa theo các năm nghiên cứu 82 Bảng 3.13 Cường độ nhiễm trung bình (trùng/cá) của các loài sán lá song chủ trên cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa theo các năm nghiên cứu 82 Bảng 3.14 Tỷ lệ nhiễm (%) sán lá song chủ ở cá chẽm nuôi ao và lồng qua từng năm nghiên cứu 84 Bảng 3.15 Cường độ cảm nhiễm trung bình (trùng/cá) của SLSC ở cá chẽm nuôi ao và nuôi lồng tại Khánh Hòa qua từng năm nghiên cứu 85 Bảng 3.16 Mức độ nhiễm sán lá song chủ trên các kích cỡ cá chẽm khác nhau tại Khánh Hòa 87 Bảng 3.17 Mức độ nhiễm giai đoạn hậu ấu trùng metacercaria của sán lá song chủ ở

cá đối 90 Bảng 3.18 Một số chỉ tiêu về hình thái của ấu trùng metacercaria M1 ký sinh ở cá đối thu tại Khánh Hòa 91 Bảng 3.19 Một số chỉ tiêu hình thái của dạng metacercaria M2 ký sinh trên cá đối thu tại Khánh Hòa 92 Bảng 3.20 Một số chỉ tiêu hình thái của dạng ấu trùng metacercaria M3 ký sinh trên

cá đối thu tại Khánh Hòa 93

Bảng 3.21 Mức độ nhiễm sán lá song chủ loài Pseudometadena celebesensis trong

ruột cá chẽm được nuôi bằng thức ăn là cá đối, sau 30 ngày thí nghiệm 95

ix

DANH MU ̣C CÁC HÌNH

Hình 1.1 Tỷ lệ % tổng sản lượng cá chẽm (Lates calcarifer) nuôi trong 50 năm của

các nước trong khu vực 7

Hình 1.2 Hệ gen ribosome của sinh vật nhân thực 18

Hình 1.3 ADN ti thể sán lá ruột Haplorchis taichui 19

Hình 1.4 Cây phát sinh loài của các loài sán song chủ dựa trên gen 18S rRNA 23

Hình 2.1 Địa điểm thu mẫu nghiên cứu 29

Hình 2.2 Cá chẽm Lates calcarifer Bloch, 1790 30

Hình 2.3 Ốc đinh Cerithium sp 31

Hình 2.4 Các loài cá tạp làm thức ăn cho cá chẽm 32

Hình 2.5 Hình dạng và cấu tạo chung của sán lá song chủ trưởng thành 36

Hình 2.7 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với gen 18S 40

Hình 2.7 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với gen 18S 40

Hình 2.7 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với gen 18S 40

Hình 2.10 Sơ đồ thí nghiệm tìm loài cá là ký chủ trung gian thứ hai của sán lá song chủ loài Pseudometadena celebesensis 46

Hình 3.1 Helicometra fasciata Rudolphi, 1819 55

Hình 3.2 Loài Erilepturus hamati (Yamaguti, 1934) Manter, 1947 56

Hình 3.3 Loài Transversotrema patialense Soparkar, 1924 59

Hình 3.4 Loài Pseudometadena celebesensis Yamaguti, 1952 61

Hình 3.5 Loài Bucephalus margaritae Ozaki & Ishibashi, 1934 63

Hình 3.6 Loài Elytrophallus sp 65

Hình 3.7 Cây đồng tiến hóa giữa các loài sán lá song chủ và cá chẽm 68

Hình 3.8 Kết quả điện di sản phẩm PCR gen 18S rRNA và 28S rRNA của bốn loài sán lá song chủ ký sinh trên cá chẽm 71

Hình 3.9 Kết quả điện di sản phẩm PCR vùng ITS1 rRNA của bốn loài sán lá song chủ ký sinh trên cá chẽm 72

Hình 3.10 Cây phát sinh loài dựa trên gen 18S rRNA của các loài SLSC ký sinh trên cá chẽm 78

Hình 3.11 Cây phát sinh loài dựa trên gen 28S rRNA của các loài SLSC ký sinh trên cá chẽm 80

Hình 3.13 Dạng ấu trùng metacercaria M2 ký sinh trên cá đối thu tại Khánh Hòa 92

x

Hình 3.14 Dạng ấu trùng metacercaria M3 ký sinh trên cá đối thu tại Khánh Hòa 93 Hình 3.15 Hình ảnh của loài SLSC Pseudometadena celebesensis ký sinh ở ruột của cá chẽm (Lates calcarifer) sau 30 ngày dùng thức ăn là cá đối (Mugil sp.) 96

xi

TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

Đề tài luận án: Nghiên cứu thành phần loài sán lá song chủ (Digenea) ký sinh ở

cá chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790) nuôi ở Khánh Hòa

Chuyên ngành: Nuôi trồng thủy sản

Nghiên cứu sinh: Nguyễn Nguyễn Thành Nhơn

Người hướng dẫn: 1 PGS TS Đỗ Thị Hòa

2 PGS TS Glenn Allan Bristow

Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Nha Trang

Nội dung:

1 Đây là nghiên cứu đầy đủ về thành phần loài sán lá song chủ ký sinh ở cá chẽm nuôi bằng sự kết hợp giữa hai phương pháp: hình thái học và kỹ thuật sinh học phân tử Kết quả đã phát hiện được 6 loài sán lá song chủ thuộc 5 giống, 5 họ ký sinh ở

cá chẽm nuôi thương phẩm tại tỉnh Khánh Hòa, Việt Nam

Đặc biệt nghiên cứu này đã xác định được loài sán Pseudometadena celebesensis

là ký sinh trùng đặc hữu trên vật chủ là cá chẽm;

2 Luận án đã đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các loài sán lá song chủ nội ký sinh trong cơ thể cá chẽm nuôi;

3 Lần đầu tiên tiến hành khảo sát vòng đời phát triển của 1 loài sán lá song chủ

Pseudometadena celebesensis có giai đoạn trưởng thành ký sinh ở ruột của cá chẽm nuôi tại

Khánh Hòa

Người hướng dẫn Nghiên cứu sinh

(Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên)

PGS TS Đỗ Thị Hòa Nguyễn Nguyễn Thành Nhơn

xii

KEY FINDINGS

Thesis title: The digeneans composition of the cultured seabass (Lates calcarifer

Bloch, 1790) in Khanh Hoa waters

Major: Aquaculture

Major code: 62620301

PhD Student: Nguyen Nguyen Thanh Nhon

Supervisors: 1 Associate Prof PhD Do Thi Hoa

2 Associate Prof PhD Glenn Allan Bristow

Institution: Nha Trang University

Key Findings:

1 This is a complete study on the composition of digenean by combining the morphology and molecular genetic method The result described six species of digenean, belongs to 5 genus, 5 families;

Especially, seabass is known as a specific host of one digenean by analysing coevolution and scientific papers

2 The results of this thesis assess phylogenetic of digenean in seabass;

3 For the first time a survey was carried out on the development life-cycle of

species Pseudometadena celebesensis that parasitic in intestine of seabass in Khanh

Hoa

PhD Student

Nguyen Nguyen Thanh Nhon

1

MỞ ĐẦU

Ở Việt Nam hiện nay, có xu hướng đa dạng hóa các sản phẩm thủy sản trong khẩu, ngoài các sản phẩm xuất khẩu ổn định nhiều năm nay như cá tra, cá ba sa, tôm biển, tôm hùm… thì cá biển với giá trị dinh dưỡng và thương mại cao đang là mặt

hàng được ưa chuộng trên thế giới, như cá mú (Epinephelus spp.), cá giò (Rachycentron canadum), cá chẽm (Lates calcarifer) là những đối tượng nuôi phổ biến

phục vụ xuất khẩu

Cá chẽm (Lastes calcarifer) là loài rộng muối, có thể nuôi trong môi trường nước

mặn, nước ngọt, nước lợ So với nhiều loài cá biển khác, cá chẽm dễ nuôi hơn vì không đòi hỏi môi trường sống khắt khe, có thể nuôi với nhiều mô hình khác nhau, như việc tận dụng các ao nuôi tôm, ao nuôi cá tra bỏ hoang để nuôi cá chẽm đã mang lại lợi ích đáng kể về kinh tế và xã hội Với qui trình sản xuất giống và nuôi thương phẩm cá chẽm đã hoàn thiện nên việc phát triển nuôi loài cá này theo qui mô công nghiệp, nhằm cung cấp thực phẩm trong nước và phục vụ xuất khẩu là khả thi, góp phần nâng cao GDP thủy sản nước ta Bên cạnh đó, việc thuần hóa cá chẽm để nuôi ở nước ngọt có thể giúp cải thiện đời sống của người dân ở nhiều vùng địa lý khác nhau Với hiệu quả kinh tế, xã hội như đã nêu trên, nuôi cá chẽm hiện nay đã được phát triển ở nhiều địa phương ở Việt Nam Tuy nhiên, cũng như nhiều đối tượng thủy sản khác, khi được nuôi với qui mô công nghiệp thì vấn đề bệnh và tác hại của bệnh trong quá trình nuôi vẫn là một khó khăn không nhỏ cho người nuôi Các tác nhân gây bệnh thông thường như virus, vi khuẩn và ký sinh trùng (KST),… đã và đang gây những thiệt hại đáng kể cho nghề nuôi cá chẽm ở Việt Nam và các nước khác trong khu vực

Ký sinh trùng gây bệnh ở cá chẽm nuôi có nhiều nhóm khác nhau: động vật đơn bào-Protozoa, sán lá đơn chủ - Monogenea, giáp xác bậc thấp ký sinh - Crustacae, giun tròn - Nemathelminthes và sán lá song chủ (SLSC) - Digenea Các ký sinh trùng là sán

lá song chủ (SLSC) ở giai đoạn trưởng thành chủ yếu sống nội ký sinh ở dạ dày, ruột, mạch máu, gan, thận…của động vật có xương sống như cá, động vật trên cạn, trong đó

có con người SLSC là ký sinh trùng có chu kỳ sống phức tạp, trải qua nhiều giai đoạn

ấu trùng, đòi hỏi phải có từ 1 hoặc 2 ký chủ trung gian (KCTG) để hoàn thành vòng đời Do vậy, khi SLSC ký sinh gây bệnh ở các loài cá nuôi việc trị bệnh này không đơn giản, hiệu quả thấp nên cách tốt nhất vẫn là phòng bệnh, ngăn chặn sự xâm nhập của ấu trùng SLSC vào ao nuôi và vào cơ thể cá (Đỗ Thị Hòa và cộng sự, 2004)

2

Hiện nay đã có nhiều công trình nghiên cứu về KST gây bệnh ở cá biển nuôi, trong đó nghiên cứu trên cá chẽm đã được công bố, như nghiên cứu của Velasquez, (1975); Leong & Wong (1990); Liang & Leong (1991); Võ Thế Dũng và cộng sự (2012) Tuy nhiên, ở các nghiên cứu này việc định danh phân loại đến giống loài của KST đều dựa vào phương pháp hình thái học nên có thể gây nhầm lẫn giữa các loài trong cùng 1 giống, hoặc chỉ 1 loài nhưng lại được đặt các tên gọi khác nhau

Trong thời gian gần đây, ngành sinh học phân tử đã phát triển mạnh và được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khoa học khác nhau Trên thế giới, nhiều nhà khoa học đã ứng dụng sinh học phân tử để định danh phân loại đến giống loài của nhiều động, thực vật khác nhau, trong đó có các nhóm sinh vật ký sinh là tác nhân gây bệnh ở động vật thủy sản, gồm virus, vi khuẩn và KST Bằng việc kết hợp giữa phương pháp truyền thống phân loại dựa vào hình thái cấu tạo với kỹ thuật sinh học phân tử có thể đưa lại một kết quả định danh chính xác đến loài của các tác nhân gây bệnh, ngoài ra có thể xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài ký sinh trùng với nhau (Blair, 1998; Anderson, 1999; Olson et al., 2003, 2006)

Xuất phát từ thực tế trên, đề tài luận án “Nghiên cứu thành phần loài sán lá

song chủ (Digenea) ký sinh ở cá chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790) nuôi tại

Khánh Hòa” đã được thực hiện theo Quyết định số 1128/QĐ-ĐHNT của Hiệu trưởng

Trường Đại học Nha Trang ký ngày 23 tháng 09 năm 2009, theo chương trình đào tạo Tiến sĩ, chuyên ngành Nuôi trồng thủy sản

Mục tiêu của đề tài luận án:

Xác định được thành phần giống loài sán lá song chủ (Digenea) ký sinh trên cá

chẽm (Lates calcarifer) nuôi, đánh giá mức độ nhiễm và mối quan hệ di truyền của các

KST này ở cá chẽm nuôi, từ đó đánh giá khả năng gây bệnh và đề xuất biện pháp phòng ngừa các ký sinh trùng này ở cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa

Để đạt được mục tiêu trên, luận án đã thực hiện các nội dung sau:

1 Xác định thành phần giống loài sán lá song chủ (SLSC) ký sinh ở cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa

2 Phân loại và xác định mối quan hệ di truyền của các loài sán lá song chủ ký sinh ở cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Ý nghĩa của luận án

- Ý nghĩa khoa học: Đây là nghiên cứu đầy đủ về thành phần giống loài, mức độ

nhiễm và mối quan hệ di truyền của các loài sán lá song chủ ký sinh ở cá chẽm (Lates calcarifer) nuôi thương phẩm tại Khánh Hòa và làm cơ sở cho việc phát triển, mở rộng

nghiên cứu trên các loài ký sinh trùng khác

- Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả nghiên cứu của đề tài luận án này là cơ sở khoa học

để đề xuất các biện pháp phòng bệnh do sán lá song chủ gây ra ở cá chẽm nuôi

Điểm mới của luận án:

- Đây là nghiên cứu đầy đủ về thành phần loài sán lá song chủ ký sinh ở cá chẽm nuôi bằng sự kết hợp giữa hai phương pháp: hình thái học và kỹ thuật sinh học phân

tử Kết quả đã phát hiện được 6 loài sán lá song chủ thuộc 5 giống, 5 họ ký sinh ở cá chẽm nuôi thương phẩm tại tỉnh Khánh Hòa, Việt Nam Đặc biệt nghiên cứu này đã

xác định được loài sán Pseudometadena celebesensis là ký sinh trùng đặc hữu trên vật

chủ là cá chẽm;

- Luận án đã đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các loài sán lá song chủ nội ký sinh trong cơ thể cá chẽm nuôi;

- Lần đầu tiên tiến hành khảo sát vòng đời phát triển của 1 loài sán lá song chủ

Pseudometadena celebesensis có giai đoạn trưởng thành ký sinh ở ruột của cá chẽm nuôi

tại Khánh Hòa

4

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1 Một số đặc điểm sinh học của cá chẽm (Lates calcarifer)

1.1.1 Hệ thống phân loa ̣i cá chẽm

Ngành Chordata Ngành phu ̣ Vertebrata

Loài Lates calcarifer Bloch, 1790

Cá chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790), tên tiếng Anh là Barramundi hoặc Asian seabass Cá chẽm được Bloch mô tả đầu tiên vào năm 1790 và đặt tên Holocentrus calcarifer Do cá chẽm có các đặc điểm giống cá vược sông Nile (Lates niloticus Linnaeus), nên năm 1828, Curvier & Valenciennes đề nghị đặt lại tên giống là Lates (Grey, 1986) Vì vậy, hiện nay cá chẽm có tên khoa học là Lates calcarifer (Bloch,

1790)

1.1.2 Một số đặc điểm phân bố, sinh thái và dinh dưỡng của cá chẽm

Cá chẽm phân bố rộng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới thuộc tây Thái Bình Dương và Ấn Độ Dương từ Đông Phi đến Papua New Guinea, từ nam Trung Quốc, Đài Loan đến bắc Úc Cá chẽm là loài rộng muối, sống được cả vùng nước ngọt, lợ, mặn và có tập tính di cư xuôi dòng Cá bố mẹ thành thục tập trung ở vùng cửa sông và sinh sản Cá con mới nở theo dòng chảy thủy triều vào sâu trong vùng nước lợ sinh sống Khi đủ khả năng ngược dòng, chúng bắt đầu di cư ngược dòng vào sống ở các dòng sông Khi phát dục thành thục (ở độ tuổi 3+), chúng di cư xuôi dòng về vùng ven biển để sinh sản (Grey, 1986; Nguyễn Duy Hoan & Võ Ngọc Thám, 2000) Cá chẽm

là loài chuyển đổi giới tính, lúc nhỏ là cá đực, lớn chuyển sang cái Trong đàn cá chẽm cũng tồn tại một số cá thể là cá cái nguyên thủy (Nguyễn Duy Hoan & Võ Ngọc Thám, 2000)

Cá chẽm có khả năng thích ứng rộng với sự thay đổi độ mặn, cá giai đoạn giống

và trưởng thành sống được ở độ mặn từ 0 – 35‰ và có thể chịu đựng tốt với sự thay

5

đổi độ mặn đột ngột Thực tế cho thấy cá giống cỡ 2 – 3 cm có thể thuần hóa từ độ mặn 30 – 32‰ xuống 5 – 10‰ trong 2 – 3 giờ (Tucker, 2000) Vì vậy, cá chẽm rất thích hợp cho phát triển nuôi trong các điều kiện môi trường khác nhau, có thể nuôi trong ao ở cả nước ngọt, lợ cũng như nuôi bằng lồng trên biển Tuy nhiên khi tiến hành nuôi ở các môi trường có độ mặn khác nhau, cá giống cần được thuần hóa độ mặn Cá chẽm giống hoặc cá trưởng thành có thể thích ứng với nhiệt độ từ 21 – 39oC, thích hợp nhất là 27 – 30oC Nhiệt độ thay đổi đột ngột 2 – 3oC có thể gây sốc cho cá giống (Tucker, 2000)

Cá chẽm là loài cá dữ ăn mồi sống và khi đói chúng có thể ăn thịt đồng loại, đặc biệt tỷ lệ ăn thịt lẫn nhau cao nhất ở giai đoạn từ 1 – 10 cm, nên nhu cầu protein trong khẩu phần thức ăn của cá chẽm ở mức cao Theo Boonyaratpalin và Williams (2002), nhu cầu protein thô trong thức ăn của cá chẽm giống khoảng 50%, cho cá chẽm giai đoạn nuôi thịt khoảng 40 – 45% Hàm lượng một số acid amin thích hợp cho sinh trưởng của cá chẽm giai đoạn giống là: tryptophan: 0,41% protein; lysine: 4,5% protein; arginine: 3,8% protein và methionine: 2,24% protein (Boonyaratpalin et al., 2002; Coloso et al., 2004) Do cá chẽm ăn mồi sống nên trong tự nhiên cũng như trong nuôi trồng, cá chẽm thường dễ bị nhiễm các loại ký sinh trùng có vòng đời phức tạp như sán lá song chủ (Digenea), sán dây (Cestoida) hay giun đầu gai (Acanthocephala) (Đỗ Thị Hòa và và cộng sự, 2004)

Cá chẽm có kích thước lớn, khối lượng tối đa có thể đạt 60 kg Cá tăng trưởng chậm ở giai đoạn đầu, khi đạt 20 – 30 g tốc độ tăng trưởng nhanh hơn và chậm lại khi

cá đạt khoảng 4 kg Cá bột mới nở có chiều dài 1,49 mm, sau 40 ngày nuôi đạt cỡ 17,4

mm, 50 ngày đạt 28,9 mm, 90 ngày đạt 93 mm, khối lượng là 9g Trong điều kiện nuôi, cá giống cỡ 2 – 2,5 cm sau từ 6 – 24 tháng nuôi thương phẩm cá đạt cỡ 0,35 – 3

kg (Schipp, 1996)

Những đặc điểm sinh học như phân bố, dinh dưỡng, sinh sản của cá chẽm đã được nghiên cứu nhiều Đây là những điều kiện thuận lợi để nghề nuôi loài cá chẽm này phát triển nhanh trong những năm qua ở nhiều nước thuộc khu vực Châu Á - Thái Bình Dương

6

1.2 Tình hình nuôi cá chẽm (Lates calcarifer) thương phẩm

1.2.1 Nuôi cá chẽm thương phẩm trên thế giới

1.2.1.1 Sản lượng và giá trị kinh tế của nghề nuôi cá chẽm trên thế giới

Nghề nuôi trồng thủy sản thế giới tăng trưởng nhanh, từ sản lượng ít hơn 1 triệu tấn ở đầu những năm 1950, đã đạt đến 59,4 triệu tấn với giá trị 70,3 tỉ USD năm 2004 (FAO, 2004), và đạt 51,7 triệu tấn, 78,8 tỉ USD năm 2006 (FAO, 2008) Riêng nghề nuôi cá biển năm 2006 đã đóng góp 3% vào tổng sản lượng nuôi thủy sản thế giới, với 8% giá trị (FAO, 2008) Trong thời gian 2002 – 2004, tốc độ tăng trưởng hàng năm của nghề nuôi cá biển là 9,6% (FAO, 2006)

Cá chẽm (Lates calcarrifer) là đối tượng được nuôi phổ biến ở nhiều nước thuộc

khu vực Châu Á – Thái Bình Dương, đặc biệt ở các nước trong khu vực Đông Nam Á

Cá chẽm bắt đầu được nghiên cứu sản xuất giống nhân tạo tại Thái Lan năm 1971, thành công năm 1975 Từ năm 1981, nghề nuôi cá chẽm ở Thái Lan phát triển mạnh, sau đó mở rộng sang các nước khác trong khu vực như Phillipine, Đài Loan, Singapore, Malaysia (Copland & Grey, 1987; Boonyaratpalin, 1997) Tại Úc, nghiên cứu sản xuất giống nhân tạo cá chẽm bắt đầu từ năm 1983 - 1985, năm 1986 đã hình thành các trại sản xuất giống cá chẽm đầu tiên (Tucker et al., 2002)

Sản lượng cá chẽm nuôi trên thế giới bắt đầu được FAO thống kê từ những năm đầu thập niên 60 Trong 10 năm (2005 – 2014) tổng sản lượng cá chẽm đánh bắt và

nuôi trồng lần lượt đạt 919.398 tấn và 549.084 tấn, với giá trị trung bình là 3,7

USD/kg Sản lượng cá chẽm của thế giới tăng liên tục và theo kết quả thống kê của FAO thì đến năm 2014, sản lượng cá chẽm của thế giới đạt 101.956 tấn đối với đánh bắt và 71.581 tấn với nuôi trồng

Bảng 1.1 Sản lượng cá chẽm thế giới giai đoạn 2005 - 2014

Năm Sản lượng đánh bắt (tấn) Sản lượng nuôi (tấn)

Hình 1.1 Tỷ lệ % tổng sản lượng cá chẽm (Lates calcarifer) nuôi trong 50 năm

của các nước trong khu vực (Nguồn: FishStat plus - FAO)

1.2.1.2 Các hình thức nuôi cá chẽm thương phẩm

Cá chẽm được nuôi với nhiều hình thức khác nhau như, nuôi quảng canh, bán thâm canh, nuôi đơn, nuôi ghép…Trong thực tế có 2 loại hình nuôi cá chẽm chính là: nuôi cá trong ao đìa và nuôi cá trong lồng, bè

* Nuôi cá chẽm trong ao

Có hai dạng nuôi cá chẽm thương phẩm trong ao: nuôi đơn và nuôi ghép Ao nuôi cá chẽm thường có hình chữ nhật, diện tích 0,2 – 2 ha, sâu từ 1,2 – 1,5 m Ở Úc,

1959-2009

8

hình thức nuôi cá ao được khuyến cáo nên thả nuôi ở mật độ sao cho có thể đạt 10 tấn

cá thu hoạch/ha (với cá thu hoạch đạt 0,5 kg/con, mật độ cá khi thu hoạch: 2 con/m2) (Schipp, 1996)

Dạng nuôi ghép cá chẽm với cá rô phi, mục đích sử dụng cá rô phi ăn thức ăn thừa của cá chẽm, nhằm hạn chế ô nhiễm môi trường Đồng thời, cá rô phi đẻ nhiều, cá

rô phi con sẽ là thức ăn cho cá chẽm, giảm chi phí thức ăn (Trần Vĩ Hích, 2014)

* Nuôi cá chẽm trong lồng

Hình thức nuôi cá biển bằng lồng đã rất phổ biến ở các nước Thái Lan, Hồng Kông, Malaysia, Singapore và Indonesia Đây là hình thức nuôi đơn giản và đem lại lợi nhuận cao hơn so với hình thức nuôi trong ao (Schipp et al., 2007) Lồng nuôi được

cố định dưới đáy biển hoặc thả nổi trên mặt nước Lồng cố định là một dạng lồng đơn giản được tạo bởi sự cố định của một lồng lưới vào nền đáy nhờ 4 cọc tre hay cọc gỗ Loại lồng này chỉ phù hợp cho việc nuôi cá ở các hồ, vịnh nông và biên độ thủy triều thấp như hồ Songkhla, Thái Lan

Hình thức nuôi cá chẽm bằng lồng có một số ưu điểm hơn so với nuôi ao như chi phí xây dựng cơ bản thấp hơn, mật độ nuôi cá cao hơn mà không cần các thiết bị cung cấp khí oxy Việc bắt cá để phân cỡ, phòng trị bệnh hay thu hoạch đều rất dễ dàng Khi điều kiện môi trường nuôi bất lợi, việc di chuyển lồng nuôi đến địa điểm mới có thể thực hiện được hơn so với nuôi cá trong ao đìa Tuy nhiên, cá nuôi lồng thường lớn chậm hơn cá nuôi ao vì cá phải mất nhiều năng lượng do bơi liên tục để chống lại sự đẩy đi của dòng chảy Những thiệt hại do sự khắc nghiệt của môi trường nuôi như sóng, bão dễ đem đến những tổn thất lớn (Trần Vĩ Hích, 2014)

Ở nước Úc còn hiện hành hai loại hình nuôi cá chẽm thương phẩm khác là: nuôi

cá chẽm bằng bể trong nhà, phổ biến ở những vùng có khí hậu lạnh, nhiệt độ không thuận lợi cho nuôi ngoài trời, nguồn nước dùng cho loại hình nuôi cá chẽm trong nhà chính là nguồn nước nóng tự nhiên (nước ngọt) Năng suất nuôi của loại hình này thường đạt khoảng 15 kg/m3, đôi khi lên đến 100 kg/m3 (Tucker et al., 2002) Một loại hình nuôi khác cũng đã được thực hiện ở Úc, đó là nuôi cá bằng lồng đặt trong ao Với kiểu nuôi cá bằng lồng đặt trong ao, kích cỡ lồng thường sử dụng là 8 m3 (2x2x2 m), đôi khi cũng gặp kích thước lồng lớn hơn, có thể tích đến 150 m3 Tổng diện tích

9

lồng nuôi trong ao tại Queensland tăng từ 3.757 m2 năm 1999 lên 16.161 m2 năm

2001 (Lục Minh Diệp, 2010)

1.2.2 Tình hình nuôi cá chẽm (Lates calcarifer) thương phẩm ở Việt Nam

Cá chẽm là đối tượng được nuôi quảng canh ở Viê ̣t Nam từ lâu, nguồn giống được lấy từ tự nhiên hoă ̣c nhâ ̣p từ Thái Lan Đến năm 1999, khoa Nuôi trồng Thủy sản, Trường Đại học Nha Trang đã sản xuất giống cá chẽm thành công (Nguyễn Duy Hoan & Võ Ngọc Thám, 2000), đánh dấu thời kỳ phát triển cho nghề nuôi cá chẽm ở Việt Nam Từ cuối năm 2003, cá chẽm đã được sản xuất giống thành công ở quy mô thương mại và cung cấp giống cho nghề nuôi cá chẽm thương phẩm ở Việt Nam Hàng năm, cơ sở nghiên cứu của Trường Đại học Nha Trang sản xuất được 0,8 – 1 triệu cá chẽm giống cỡ 2 – 3 cm cung cấp cho các tỉnh Bến Tre, Bạc Liêu, Cà Mau, Kiên Giang, Hải Phòng, Quảng Ninh và các tỉnh thuộc Nam Trung Bộ Hiện nay, cơ sở sản xuất giống này đã chuyển giao công nghệ cho cá đẻ và cung cấp trứng đến các cơ sở sản xuất giống tư nhân ở các tỉnh như: Khánh Hòa, Ninh Thuận, Phú Yên, Bình Định, Kiên Giang Điều này góp phần thúc đẩy nghề nuôi cá chẽm phát triển nhanh chóng hơn trong những năm qua (Trần Vĩ Hích, 2014)

Cũng giống như mô ̣t số nước khác trong khu vực, ở Viê ̣t Nam cá chẽm được nuôi dưới 2 hình thức chính là nuôi ao và nuôi lồng bè, trong đó hình thức nuôi ao phổ biến hơn Ở Viê ̣t Nam cũng có mô ̣t số đă ̣c trưng riêng là hầu hết các ao nuôi cá chẽm

là các ao được tận dụng từ ao nuôi tôm bi ̣ bỏ hoang do dịch bê ̣nh, ngoại trừ mô ̣t số Công ty lớ n như Vĩnh Hoàn - Đồng Tháp; Va ̣n Đức - Bến Tre; Australis - Khánh

Hòa Một vài năm gần đây, cá chẽm đã được đưa vào nuôi lồng trên biển ở các tỉnh Quảng Ninh, Phú Yên, Khánh Hòa, Vũng Tàu…Thức ăn sử dụng nuôi cá chẽm thương phẩm hiện nay chủ yếu vẫn là cá tạp, do đó dễ gây ô nhiễm môi trường và là điều kiện để cá chẽm dễ bị nhiễm các loài giun sán có vòng đời phức tạp như sán lá song chủ (Lục Minh Diệp, 2010)

10

1.3 Nghiên cứu ký sinh trùng ở cá chẽm (Lates calcarifer) nuôi

1.3.1 Thành phần loài ký sinh trùng ký sinh ở cá chẽm (Lates calcarifer) được phát hiện và công bố trên thế giới

Cho đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu và công bố về thành phần giống

loài KST ký sinh ở trên và trong cơ thể loài cá chẽm (Lates calcarifer) được nuôi chủ

yếu ở các nước thuộc châu Á (Bảng 1.2)

Bảng 1.2 Thành phần giống loài ký sinh trùng ở cá chẽm (Lates calcarifer)

đã được phát hiện và công bố trên thế giới

TT Tên giống & loài KST Cơ quan

ký sinh Vùng địa lý Tác giả, năm công bố Ngành trùng lông bơi Ciliophora

1 Trichodina japoniaca Mang Ấn Độ Anlan & Robir (2005)

2 Trichodina sp Da, mang Malaysia

Ruangpan (1982);

Leong & Wong (1987); Leong & Wong (1990)

3 Trichodina spp Mang Thái Lan Ruangpan (1988)

4 Cryptocaryon sp Da, mang

Thái Lan, Malaysia, Singapore

Tookwibas (1989);

Ruangpan (1982);

Leong & Wong (1990)

5 Cryptocaryon irritans Da, mang Thái Lan Ruangpan (1988)

6 Henneguya sp Mang Thái Lan Ruangpan (1982)

7 Epistylis sp Da, mang Thái Lan Ruangpan (1982)

8 Zoothamnium sp Da, mang Thái Lan Ruangpan (1982)

11 Diplectanum latesi Mang Malaysia,

Sigapore Ruangpan (1982)

12 Diplectanum penanggi Mang Malaysia Leong & Wong (1986);

11

Liang & Leong (1991)

13 Pseudohabdosynochus

Leong & Wong (1990); Liang & Leong (1991)

14 Transversotrema laruei Da Philippine Velasquez (1962)

15 Lecithochirium

neopacifium Dạ dày Philippine

Velasquez (1962); Velasquez (1975); Leong & Wong (1987)

16 Lecithochirium sp Dạ dày Malaysia,

Singapore

Ruangpan (1982) Ruangpan (1988)

17 Pseudometadena

Philippine, Malaysia, Sigapore

Velasquez (1962); Ruangpan (1982); Leong & Wong (1987); Leong & Wong (1990)

18 Bucephalus

polymorphus Ruột Philippine Velasquez (1975)

19 Bucephalus margaritae Ruột Malaysia Leong & Wong (1987)

20 Allopocotyle serani Ruột Malaysia Leong & Wong (1987)

21 Helicometra nemia Ruột Malaysia Leong & Wong (1987)

Ngành giun tròn Nemathelminthes

22 Rhipidocotyle sp Ruột Malaysia Leong & Wong (1987)

Singapore

Ruangpan (1982); Ruangpan (1988)

24 Rhaphudascaris sp Ruột Malaysia Leong & Wong (1987)

Ngành chân khớp Arthropoda

25 Caligus sp Mang, Da Malaysia Leong & Wong (1986)

26 Lernanthropus latis Mang Malaysia,

Thái Lan

Ho & Do (1985); Leong & Wong (1987); Leong & Wong (1990);

Ho & Kim (2004)

Singapore Ruangpan (1988)

12

Bảng 1.2 đã thể hiện sự phong phú và đa dạng về thành phần giống loài KST ký sinh ở cá chẽm nuôi ở các quốc gia khác nhau thuộc Châu Á Trong đó, có một số giống loài ký sinh trùng thường ký sinh ở cá chẽm với tỷ lệ và cường độ nhiễm cao và

gây bệnh nguy hiểm cho loài cá này, như loài KST đơn bào Cryptocaryon sp gây bệnh đốm trắng, một số giống loài sán lá đơn chủ (Monogenea) như loài Diplectanum latesi, Pseudohabdosynochus latesi, Neobenedenia melleni ký sinh ở mang và da cá có thể làm cá chết hàng loạt nếu nhiễm ở mức độ cao, các loài giáp xác như Caligus sp., Lernanthropus latis ký sinh ở da và mang cũng có thể làm cá chẽm chết nhiều nếu bị

cảm nhiễm với cường độ cao

1.3.2 Nghiên cứu ký sinh trùng trên cá chẽm (Lates calcarifer) ở Việt Nam

Khi nghiên cứu về bệnh do KST ký sinh ở cá chẽm nuôi, Đỗ Thị Hòa và cộng sự (2008) đã công bố về một số bệnh ở cá chẽm nuôi mà tác nhân gây ra là ký sinh trùng ngoại ký sinh, như bệnh sán lá da do các KST thuộc lớp sán lá đơn chủ - Monogenea

như các loài Neobenedenia melleni, Neobenedenia girellae (Monogenea ký sinh ở da của cá; Bệnh sán lá mang do KST thuộc các giống loài Pseudorhabdosynochus, Diplectanum và Haliotrema (Monogenea) ký sinh ở mang cá và bệnh rận cá do một

số giống KST thuộc giáp xác, như Caligus, Lernanthropus (Copepoda) ký sinh Các

ký sinh trùng này khi cảm nhiễm ở cá chẽm với cường độ và tỷ lệ cảm nhiễm cao đã gây ra bệnh nguy hiểm cho loài cá nuôi này

Võ Thế Dũng và cộng sự (2012) đã xuất bản quyển sách “Ký sinh trùng ký sinh ở

cá mú và cá chẽm Việt Nam” Quyển sách giới thiệu với 59 loài ký sinh trùng thuộc 41 giống, 32 họ, 18 bộ, 9 lớp của 6 ngành, đặc biệt có 3 loài lần đầu được bắt gặp ở khu vực Đông Nam Á, 5 giống và 19 loài lần đầu được công bố ở Việt Nam Trong cuốn sách này đã giới thiệu 14 loài KST tìm thấy ký sinh trên cá chẽm nuôi ở Việt Nam, đó

là các loài Trichodina sp., Ambiphrya sp., Cryptocaryon sp và Ceratomyxa sp (thuộc động vật đơn bào - Protozoa), Diplectanum grouperi (thuộc sán lá đơn chủ - Monogenea ), Bucephalus polymorhus, Lecithochirium neopacifium, Pseudometadena celebesensis, Transversotrema patialense (thuộc sán lá song chủ - Digenea), Tylocephalum sp (thuộc sán dây - Cestoidea), Cucullanus sp (thuộc giun tròn - Nematoda), Zeylanicobdella arugamensis (thuộc lớp đỉa - Hirudinea), Caligus epidemicus và Lernanthropus latis (thuộc lớp giáp xác - Crustacae)

13

1.3.3 Nghiên cứu về sán lá song chủ ký sinh ở cá biển

Sán lá song chủ - Digenea thuộc ngành giun dẹp (Platyhelminthes) có giai đoạn trưởng thành hoàn toàn sống ký sinh ở trong cơ thể động vật có xương sống, trong đó

có cá, là những KST có vòng đời phức tạp, phát triển qua nhiều giai đoạn ấu trùng và cần có 1 hoặc 2 ký chủ trung gian trong vòng đời của các loài sán này Trong nghề nuôi cá biển thâm canh, sán lá song chủ có thể gây tác động xấu tới sức khỏe của vật nuôi nếu chúng cảm nhiễm ở các nội quan quan trọng như máu, gan, thận và ruột của

cá với tỷ lệ và cường độ nhiễm cao Tùy theo từng loài sán lá song chủ khác nhau mà

cá có thể là ký chủ cuối cùng hoặc là ký chủ trung gian thứ hai, với các loài SLSC có

cá lá ký chủ trung gian thì ở giai đoạn trưởng thành chúng sẽ ký sinh ở người và động vật trên cạn, gây ra các bệnh nguy hiểm như bệnh sán lá gan, sán lá phổi hay sán lá ruột ở người (Đỗ Thị Hòa và cộng sự, 2004)

Từ năm 1929, Dogiel (1882-1955) đã phát triển “Phương pháp nghiên cứu ký sinh trùng đồng bộ ở cá”, công trình này đã mở ra một hướng phát triển mới cho nghiên cứu các khu hệ KST trên cá và các bệnh do KST gây ra ở cá, trong đó có nhiều công trình đã nghiên cứu và công bố về thành phần giống loài sán lá song chủ ký sinh

ở cá Trong thời kỳ này phải kể đến các công trình nghiên cứu về giáp xác - Crustacae

ký sinh (Pillai,1985; Kabata, 1985, 1992); Nghiên cứu về sán dây - Cestoidea ký sinh (Khalil et al.,1994; Palm, 2004); Về giun tròn - Nemathelminthes (Anderson et al.,1976); Nghiên cứu về sán lá song chủ - Digenea ký sinh ở cá biển (Möller & Anders, 1986) Các công trình này đã đề cập đến hình thái cấu tạo, vòng đời và đặc điểm phân bố của chúng ở cá nước lợ và mặn nên có giá trị tham khảo cao Gibson & Bray (1979) đã xuất bản quyển sách về SLSC thuộc bộ phụ Hemiuroidea ký sinh ở cá biển và cá nước ngọt, đây là công trình có giá trị vì các tác giả đã xây dựng khóa phân loại, thuật ngữ và chu kỳ phát triển của các loài SLSC ở 14 họ sán thuộc bộ phụ Hemiuroidea

Paradiznik et al (2007) đã nghiên cứu về sán lá song chủ ký sinh ở một số loài cá biển sống ở vùng biển bắc Adriatic, Slovenia trong suốt 10 năm, từ 1993 – 2003, công trình này đã phát hiện và công bố 22 loài sán lá song chủ với tỷ lệ nhiễm là 25,16%,

trong đó có một số loài sán được các tác giả mô tả rất chi tiết như: Hemiurus appendiculatus, Aphanurus stossichi, Lecithochirium musculus, Lecithaster atherinae,

mới và 2 loài mới, đồng thời nhất trí rằng các loài có tên khoa học là Transversotrema koliensis, T laruei, T chackai, và T soparkari đã công bố chỉ là tên đồng nghĩa của loài Transversotrema patialense (Cribb et al., 1992)

Bray và nhóm nghiên cứu của ông cũng có nhiều công bố về sán lá song chủ ký sinh ở cá biển phân bố ở nước Úc và ở nhiều vùng biển khác nhau trên thế giới Ông

đã phát hiện được 29 loài sán lá song chủ ký sinh trên cá biển phân bố ở phía đông

Canada, trong đó có 10 loài mới với khoa học, gồm Plagioporus idoneus, Helicometra plovmornini, H insolita, C nicolli, A opisthorchis, Neophasis oculatus, Diphterostomum microacetabulum, Deretrema pycnorganum, Progonus muelleri and Gonocerca phycidis (Bray et al., 1979) Trên một số loài cá biển ở phía nam Ấn Độ

Dương, các tác giả này đã phát hiện được một số loài sán lá song chủ thuộc 4 họ:

Dinurinae, Elytrophallinae, Glomericirrinae và Plerurinae ký sinh, bao gồm: Dinurus longisinus, Ectenurus trachuri, Erilepturus tiegsi, Tubulovesicula angusticauda, Elytrophalloides oatesi, Elytrophalloides humerus, Lecithocladium angustiovum, Glomericirrus amadai, Plerurus digitatus, Synapto-bothrium sp (Bray et al., 1990)

Những năm tiếp theo, cũng trên các loài cá này tác giả đã mô tả các loài sán lá song

chủ khác nhau thuộc giống Lecithochirium, đó là: L genypteri, L magnus, L parafusiforme, L macrorchis, Leithochirium sp., L kawakawa, Lecithochirium sp., L gymnapisti, L jaffense, Lecithochirium sp (Bray và cộng sự, 1991) Gần đây, Bray & Palm đã phát hiện được 3 loài sán lá song chủ thuộc họ Bucephalidae là Rhipidocotyle danai từ cá thu rắn (Thyrsitoides marleyi), loài R jayai từ cá sú vàng (Otolithoides biauritus ) và loài Prosorhynchus platycephali từ cá chai (Sunagocia otaitensis) (Bray

& Palm, 2009)

15

Hollis và Manter (1957) đã phát hiện 13 loài sán lá song chủ đã nhiễm trên cá biển ở vùng bờ của Thái Bình Dương thuộc Mexico, trong đó có 9 loài và 2 giống mới được mô tả chi tiết Arai (1962) cũng nghiên cứu khu hệ sán lá song chủ trên cá biển ở

Mexico và đã phát hiện 23 loài SLSC, trong đó có 3 loài mới, đó là: Metadena magdalenae, Monorcheides alexanderi và Pleorchis magniporus Dyer et al (1986) đã

phát hiện và công bố 252 loài SLSC, thuộc 155 giống và 76 họ ký sinh ở 1019 con cá biển phân bố ở quần đảo phía Tây và Nam của Puerto Rico từ năm 1972 đến năm

1984 Ngoài ra, các tác giả này còn cho biết, các loài SLSC này đều có mức độ cảm nhiễm thấp ở cá biển, nhưng có tính đặc hữu ký chủ rất cao

Trong cuốn sách viết về sán lá song chủ ký sinh trên các loài cá biển phân bố ở vùng Jamaica, có 148 loài SLSC thuộc 43 họ ký sinh trên 982 mẫu cá thuộc 112 loài

cá biển khác nhau đã được giới thiệu (Nahhas & Carlson, 1994) Bullard & Overstreet

(2006) đã phát hiện và mô tả chi tiết loài sán song chủ Psettarium anthicum sp., thuộc

họ Sanguinicolidae ký sinh ở tim cá bớp Rachycentron canadum Tương tự như vậy,

có 5 loài SLSC khác là Elytrophalloides oatesi, Parahemiurus merus, Aponurus laguncula, Ectenurus virgules và Lecithocladium cristatum ký sinh ở loài cá chai Percophis brasiliensis cũng đã được công bố bởi Braicovich et al (2009)

Ở Châu Á, Yamaguti là nhà khoa học đã công bố nhiều công trình nghiên cứu về các loài KST ký sinh trên cá biển Khi nghiên cứu các loài cá biển của Nhật Bản, tác giả

đã phát hiện 45 loài sán lá song chủ (Yamaguti, 1941) Đến năm 1952, Yamaguti tiếp

tục công bố về 26 loài sán lá song chủ, trong đó có loài Pseudometadena celebesensis

ký sinh ở ruột cá chẽm Trong một cuốn sách xuất bản năm 1971, Yamaguti đã biên tập

và giới thiệu 1.796 loài sán lá song chủ ký sinh ở động vật có xương sống trong đó có cá biển (Yamaguti, 1971)

Valasquez (1962) đã phát hiện và mô tả 5 loài sán lá song chủ thuộc họ Hemiuridae ký sinh trong dạ dày và ruột của một số loài cá ở biển Philippine, trên cá

chẽm tác giả thông báo bắt gặp loài Lecithochirium neopacifium ký sinh ở ruột Đ ế n

năm 1975, trong cuốn sách “Sán lá song chủ ký sinh trên cá ở Philippine” Valasquez đã mô tả chi tiết 23 loài sán lá song chủ mới, thuộc 15 giống khác nhau (Valasquez, 1 9 7 5 )

Salam et al (1990) nghiên cứu ở cá mú mỡ (Epinephelus tauvina) thuộc vùng

biển vịnh Ả Rập, lần đầu tiên phát hiện và mô tả loài sán lá song chủ mới

Gonapodasmius epinepheli (Didymozoidae) Tại vùng biển này, Nahhas & Calson

(1994) đã phát hiện và công bố một số loài SLSC ký sinh trên cá biển, trong đó có 2

loài mới với khoa học là Cryptogonimus sphericus và Paracryptogonimus ramadani

(Cryptogonimidae) Nahhas & Sey (2002) đã phát hiện được 8 loài SLSC thuộc họ

Hemiuroidea ký sinh trên cá biển, các loài đã phát hiện là Allostomachicola secundus (Srivastava, 1937) Yamaguti, 1958, Ectenurus trachuri, Erilepturus hamati (Yamaguti, 1934), Lecithocladium angustiovum Yamaguti, 1953, Lecithochirium acutum Chauhan, 1945, Aponurus laguncula Looss, 1907, Lecithaster indicus Srivastava, 1935, Aphanurus stossichii (Monticelli, 1891) Looss, 1907 Shih et al (2004) đã nghiên cứu 37 loài cá biển phân bố ở Đài Loan và thông báo rằng, có 17 loài

cá, chiếm 45,9% số loài cá đã kiểm tra bị nhiễm sán lá song chủ Các tác giả đã phát hiện được 16 loài sán lá song chủ thuộc 11 giống và 8 họ, trong đó có tới 7 loài thuộc

họ Hemiuridae

Một số loài sán lá song chủ có giai đoạn trưởng thành ký sinh và gây bệnh ở người và động vật trên cạn thường có nguồn gốc từ động vật thủy sản, như loài sán lá

song chủ Heterophyopsis continua đã được các nhà khoa học Hàn Quốc tập trung

nghiên cứu (Chai et al., 1984; Chai & Lee, 2002; Chai et al., 2005)

So với các nước trên thế giới, những nghiên cứu về KST ở Việt Nam, đặc biệt là sán lá song chủ ký sinh trên cá biển còn hạn chế Đỗ Thị Hòa và cộng sự (2004) đã công bố kết quả nghiên cứu KST ký sinh trên một số loài cá có giá trị kinh tế khai thác được trên vùng biển Phú Khánh (nay là Khánh Hòa) trong thời gian từ 1978 - 1980, đã phát hiện được 80 loài KST, trong đó có 29 loài sán lá song chủ Arthur và Bùi Quang

Tề (2006) công bố 453 loài KST ký sinh ở cá nước ngọt, lợ và mặn, trong đó có 112 loài sán lá song chủ Những năm gần đây, khi nghề nuôi cá biển đã phát triển ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu của Võ Thế Dũng về SLSC và ấu trùng metacercaria

của sán lá song chủ ký sinh ở cá mú đen - Epinephelus coicoides và cá mú mè -

17

Epinephelus bleekeri, kết quả đã phát hiện được 6 loài sán lá song chủ, 2 loại ấu trùng metacercaria của SLSC ký sinh ở các loài cá mú thuộc giống Epinephelus spp và 2 loài sán lá song chủ ký sinh trên cá chẽm - Lates calcarifer (Võ Thế Dũng và cộng sự,

2010a; 2010b; 2012)

Mặc dù trên thế giới và Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu về sán lá song chủ ký sinh trên cá biển, trong đó có cá chẽm, nhưng trong các nghiên này việc phân loại định danh các giống loài sán chủ yếu dựa theo phương pháp truyền thống, căn cứ vào hình dạng và cấu tạo của sán để phân loại, với phương pháp này đôi lúc dẫn đến những sai sót, nhầm lẫn khi phân loại KST, đặc biệt khi nhận biết các loài khác nhau trong cùng 1 giống hay dẫn đến 1 loài nhưng lại được đặt các tên gọi khác nhau Do vậy, gần đây nhiều nhà khoa học đã sử dụng các kỹ thuật về di truyền phân

tử để có thể phân loại KST dựa trên các đặc điểm di truyền (gen)

1.4 Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong phân loại sán lá song chủ

1.4.1 Hệ thống học phân tử và hệ thống học truyền thống

Hệ thống học truyền thống chủ yếu sử dụng các đặc điểm về hình thái và cấu tạo

để so sánh và định loại Nhưng các tính trạng hình thái thường biến đổi rất phức tạp nên đôi khi việc xác định sự giống hay khác nhau của sinh vật gặp nhiều khó khăn Việc phân biệt đặc điểm tương đồng với đặc điểm tương tự trong hệ thống học truyền thống là không dễ dàng, nhất là các bậc phân loại thấp Vì vậy, hệ thống học truyền thống phải sự dụng các đặc điểm, các khóa phân loại riêng cho mỗi nhóm sinh vật nhất định Hệ thống học phân tử đã sử dụng các đặc điểm của phân tử ADN và protein để

so sánh Các biến đổi phân tử đơn giản hơn các biến đổi hình thái Mặt khác các biến đổi phân tử trong bộ gen của sinh vật ít bị ảnh hưởng bởi điều kiện môi trường Ưu điểm của phương pháp này là có tính thống nhất cao, sử dụng chung cho cả sinh giới Nhược điểm là chưa tiện dụng khi nghiên cứu và ứng dụng trong thực tế và chưa hình thành một hệ thống phân loại riêng Vì vậy, sự kết hợp giữa hệ thống học phân tử và

hệ thống học truyền thống sẽ đem lại kết quả tốt hơn Phương pháp sinh học phân tử thường được sử dụng để giải quyết một số vấn đề mà hệ thống học truyền thống còn gặp khó khăn (Đặng Tất Thế, 2005)

Trong nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam, bệnh và tác hại của bệnh là nguyên nhân chính gây tổn thất lớn cho người nuôi, ảnh hưởng đến nền kinh tế của đất nước Bên

18

cạnh những bệnh do virus, vi khuẩn và nấm, thì những bệnh do KST ký sinh cũng đã gây ra những khó khăn không nhỏ cho động vật thủy sản nuôi, ngoài ra những KST này còn có thể lây truyền ký sinh gây bệnh ở người và động vật trên cạn Trong những năm qua đã có nhiều công trình nghiên cứu được công bố về khu hệ ký sinh trùng ký sinh ở cá nước ngọt, nước lợ và nước mặn ở Việt Nam (Bùi Quang Tề và cộng sự,

1995, 1999; Nguyễn Thị Muội & Đỗ Thị Hòa, 1980, 1986; Đỗ Thị Hòa và cộng sự, 2008; Võ Thế Dũng và cộng sự, 2010a, 2010b và 2012) Tuy nhiên, trong các công trình nghiên cứu này, việc phân loại ký sinh trùng đều được thực hiện bằng phương pháp truyền thống, dựa vào hình thái, cấu tạo nên dễ gây nhầm lẫn, nhiều loài KST cùng giống rất khó phân loại chính xác vì chúng có những đặc điểm phân loại rất giống nhau Vì vậy, với tiến bộ của kỹ thuật sinh học phân tử, những khó khăn này có thể dần dần được giải quyết

1.4.2 Các chỉ thị phân tử thường sử dụng trong nghiên cứu di truyền

Gen ribosome: Các gen khác nhau có thể cung cấp dữ liệu về mối quan hệ phát sinh loài Các gen của ADN ribosome mã hóa cấu trúc RNA của ribosome, có xu hướng xảy ra ở sinh vật nhân thật như là một loạt các đơn vị lặp đi lặp lại, mỗi đơn vị chứa ba vùng mã hóa (5,8S ~ 150 bp, 18S, ~ 2.000 bp, 28S, ~ 4.500 bp) ngăn cách bởi các đoạn chèn giữa gen (Hình 1.2) Tốc độ tiến hóa khác nhau giữa các gen và đoạn chèn đã cung cấp thông tin hữu ích cho các nghiên cứu ở các mức độ khác nhau Đoạn chèn giữa gen, nằm giữa gen 18S và gen 28S và ngăn cách bởi tiểu phần 5,8S, là khu vực ít bảo tồn nhất được sử dụng trong các nghiên cứu, cho đến nay trên giun dẹp

Hình 1.2 Hệ gen ribosome của sinh vật nhân thực

(Nguồn: htpp://thuviensinhhoc.com)

Chủ yếu là vì lý do lịch sử, gen mã hóa tiểu đơn vị 18S (có trình tự bảo tồn nhất trong các gen ribosome), đã được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa của ngành giun dẹp Gen 5,8S của ribosome với số lượng nhỏ trong

mã hóa 37 gen và thường có chiều dài ít hơn 20.000 bp ở động vật (Avise, 1994), với 2 chức năng chủ yếu: mã hóa nhiều thành phần của ti thể và mã hóa cho một số protein tham gia vào chuỗi chuyền điện tử (Lee et al., 2013).

Hình 1.3 ADN ti thể sán lá ruột Haplorchis taichui, bao gồm 22 gen tRNA, 2 gen

rRNA, và 12 vùng mã hóa protein (Nguồn: Lee et al., 2013)

Gen ti thể thường tích lũy biến dị ở mức cao hơn so với hệ gen của nhân, do đó

dữ liệu từ bộ gen này sẽ hữu ích hơn cho các nghiên cứu về sự phân hóa loài mới ADN ti thể được cho là có nguồn gốc tiến hóa (evolutionary origin) khác nhau ADN ti thể theo giả thuyết có nguồn gốc từ bộ gen dạng vòng (circular genomes) của

vi khuẩn được tiến hóa bởi các tổ tiên xa xưa của sinh vật nhân thật ngày nay Một ti thể chứa khoảng 2 - 10 bản copy của ADN ti thể Trong tế bào của cơ thể sống, phần lớn protein hiện diện trong ti thể (số lượng khoảng 1.500 loại khác nhau ở động vật có vú) được mã hóa bởi ADN nhân (nuclear ADN), nhưng bên cạnh đó, gen của 1 số trong chúng được chuyển sang nhân ở tế bào nhân thật trong quá trình tiến hóa Ti thể

di truyền theo dòng mẹ và hệ gen ti thể có số lượng gen ít hơn hệ gen nhân, không có

1.4.3 Ứng dụng sinh học phân tử trong phân loại sán lá song chủ

1.4.3.1 Nghiên cứu phát sinh loài của sán lá song chủ ký sinh trên cá

Ngành Platyhelminthes (giun dẹp) là một trong những ngành lớn, đa dạng và phân hóa sớm nhất trong giới động vật Giun dẹp cho thấy sự đa dạng lớn trong giải phẫu học, môi trường sống, lịch sử vòng đời và kích thước, loài dài nhất là loài sán

dây Diphylhbothrium latunt dài tới 20 m cho đến các loài hầu như không thể nhìn thấy

bằng mắt thường Chúng cũng thể hiện tính đa dạng di truyền đáng kể trong trình tự gen 18S rRNA khi so sánh với đơn vị phân loại cao hơn của động vật có xương sống (Riutort et al., 1993)

Mặc dù có vai trò quan trọng, hệ thống phân loại của ngành giun dẹp và đặc biệt mối tương quan của các nhóm ký sinh trùng vẫn còn nhiều tranh cãi Lịch sử tiến hóa của giun dẹp vẫn còn nhiều bí ẩn vì thông tin rời rạc, đặc điểm hình thái, sinh lý và chu kỳ sống phức tạp, và bởi vì chúng là động vật thân mềm nên rất ít hóa thạch còn sót lại Xây dựng hệ thống phát sinh loài hợp lý cũng sẽ cung cấp những hiểu biết về nguồn gốc của ký sinh trùng và chia sẻ lịch sử tiến hóa của giun dẹp ký sinh (Blair et al., 1996)

Nghiên cứu cấu tạo giải phẫu đã cung cấp những thông tin trong hệ thống phân loại giun dẹp Tất cả các nhóm KST giống nhau ở khía cạnh cấu trúc và sự phát triển của lông mao biểu bì, cơ quan bám, tế bào ngọn lửa và tinh hoàn Ngoài ra, đơn vị phân loại các lớp biểu bì của ấu trùng được thay thế ở cá thể trưởng thành bởi một lớp

21

biểu bì syncitial (Ethes, 1984; 1985; 1986) Các nghiên cứu dựa trên dữ liệu phân tử từ gen 18S rRNA cũng chứng tỏ một nguồn gốc duy nhất cho các nhóm ký sinh (Rohde

et al., 1993,1994; Baverstock et al., 1991; Blair et al., 1993)

Toàn bộ trình tự gen 18S rRNA (1.970bp) được đánh giá là một nguồn thông tin hữu ích trong nghiên cứu phát sinh loài của sán lá song chủ bằng cách sử dụng các trình tự từ 8 loài Rất ít thông tin phát sinh loài đã được tìm thấy trong khu vực bảo tồn của gen 18S rRNA (chiếm hơn một nửa chiều dài) Hầu hết các thông tin đến từ các vùng biến dị và đặc biệt là từ vùng V4 (chiếm khoảng 16%) (Nelles et al., 1984) Dữ liệu từ vùng gen này hỗ trợ cho việc xác định các nhóm loài sán lá song chủ Mặc dù vùng gen V4 có khả năng là vùng gen đích của nhiều nghiên cứu trong tương lai nhưng bản thân vùng gen này (và có lẽ cả gen 18S) dường như không cung cấp thông tin về quá trình tiến hóa ban đầu của các loài sán lá song chủ (Brook et al., 1989; Gibson, 1987; Pearson, 1992; Blair et al., 1996) Một số họ sán đã được đề xuất như

là nhóm gần gũi với sán lá song chủ (Gibson, 1987), tuy nhiên mối quan hệ này vẫn chưa được giải quyết triệt để (Blair et al., 1996)

Blair et al (1993) tiến hành nghiên cứu mối quan hệ di truyền của 8 loài sán lá song chủ thuộc họ Gyliauchenidae thông qua việc sử dụng đoạn gen 18S RNA bằng cách đánh giá sự tương đồng và khoảng cách di truyền Kết quả nghiên cứu này đã chứng minh rằng một số loài sán thuộc họ Gyliauchenidae có quan hệ gần gũi với các loài thuộc họ Lepocreadiidae

Tương tự như vậy, Carranza et al (1997) đã tiến hành phân tích dựa trên toàn bộ

trình tự gen 18S của 13 loài thuộc lớp giun dẹp có tiêm mao - Tubelarria và so sánh với các trình tự từ ngân hàng gen (GenBank) Kết quả cho thấy bộ Catenulida tạo thành một nhánh độc lập và thể hiện như là một nhánh gần gũi với các nhóm còn lại của Bilateria Các nhóm còn lại của ngành giun dẹp Platyhelminthes (Rhabditophora), trong đó bao gồm các KST, tạo thành một nhóm đơn ngành (monophyletic) gần gũi với Protostomes Trong ngành Rhabditophora, phân tích cho thấy (1) mối quan hệ chặt chẽ giữa các bộ Macrostomida và Polycladida, tạo thành một nhóm gần gũi rõ ràng đối với các họ còn lại, (2) KST thuộc ngành Platyhelminthes xuất hiện sớm trong sự phát triển của nhóm và tạo thành một nhóm gần gũi với một nhánh mà mối quan hệ tiến hóa vẫn chưa được giải quyết (Nemertodermatida, Lecithoepitheliata, Prolecithophora, Proseriata, Tiicladida, và Rhabdocoela, (3) Seriata là nhánh đa ngành (Paraphyletic)

22

Fernandez et al (1998a) đã nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa phân tử của 5 loài

sán song chủ thuộc họ Campulidae là: Campula oblonga, Zalophotrema atlanticum, Hadwenius tursionis, Oschmarinella rochebruni, Orthosplanchnus fraterculus và 1 loài thuộc họ Nasitrematidae: Nasitrema globicephalae dựa trên sự so sánh trình tự

ADN ti thể Cũng trong năm này, tác giả đã sử dụng gen 18S để nghiên cứu mối quan

hệ di truyền giữa các loài sán lá song chủ thuộc các họ: Campulidae, Fasciolidae và Acanthocolpidae ký sinh trên cá, trong khi các đặc điểm hình thái của các họ này rất giống nhau, rất khó phân biệt Kết quả nghiên cứu cho thấy họ Campulidae rất gần với

họ Acanthocolpidae (Fernandez et al., 1998b)

Littlewood et al (1999) đã sử dụng toàn bộ trình tự gen 18S rRNA của 82 loài giun dẹp sống ký sinh và các loài giun dẹp sống tự do thuộc ngành giun dẹp Platyhelminthes và từ 19 loài động vật không xương sống bậc thấp để phân tích các mối quan hệ phát sinh loài của ngành Platyhelminthes Kết quả cho thấy Neodermata

là đơn ngành và các loài thuộc lớp sán lá song chủ (Trematoda), sán lá đơn chủ (Monogenea) và sán dây (Cestoda) là các nhóm đồng dạng Nhóm gần gũi của Neodermata là tất cả các bộ khác như Neoophora Kalyptorhynchia, Typhloplanida, Dalyclliida và Temiiocephalida

Litvaitis et al (1999) đã khảo sát trình tự của vùng gen D3 - D6 của gen 28S rRNA để xây dựng mối quan hệ tiến hóa trong ngành giun dẹp Platyhelminthes Mặc

dù, Neodermata xuất hiện như là một nhóm đơn ngành, Monogenea lại thể hiện như một nhóm đa ngành (p < 0,0001) Xét mối quan hệ khác trong nhóm, Neodermata cho thấy Trematoda thể hiện là một đơn vị phân loại đơn ngành Các đơn vị phân loại của Cestodaria (gồm Amphilinidae và Gyrocotylidae) và Eucestode thể hiện là các nhóm

có quan hệ gần gũi

Olson et al (2003) đã sử dụng toàn bộ trình tự của gen 18S RNA ribosome (18S rRNA), và một phần (vùng gen D1 - D3) của gen 28S ribosome gen (28S rRNA) để xây dựng cây phát sinh loài của 163 loài sán lá song chủ, đại diện cho 77 họ và có 7 loài thuộc họ Aspidogastridae làm nhóm ngoại Kết quả cho thấy, sán lá song chủ tạo thành một nhánh phân đôi gồm bộ Brachylaimoidea, Diplostomoidea và

Schistosomatoidea và phần còn lại của Digenea (Plagiorchiida), trong đó Bivesiculata

và Transversotremata hình thành hai dòng cơ bản nhất

23

Choudhury et al (2007) sử dụng gen 18S rRNA và 28S rRNA để xem xét mối

quan hệ di truyền của 3 loài sán song chủ thuộc họ Allocreadiidae là Crepidostomum cooperi, Bunodera mediovitellata, và Polylekithum ictaluri với trình tự gen của 79 loài

sán khác từ ngân hàng gen

Hình1.4 dưới đây là một ví dụ cụ thể về việc kết hợp giữa sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử và hình thái học để xác định chính xác mối quan hệ giống loài của sán lá song chủ (Blair et al., 1998)

Hình 1.4 Cây phát sinh loài của các loài sán song chủ dựa trên gen 18S rRNA

A là phân loại bằng sinh học phân tử; B là phân loại bằng hình thái học

(Blair et al., 1998)

Các đoạn chèn giữa các gen có trình tự ít bảo tồn hơn so với các vùng mã hóa, do

đó cung cấp thông tin ở một cấp độ thấp hơn (loài/giống) Đối với các loài sán thuộc

bộ Schistosomes, bao gồm cả sán máu ở con người, trình tự từ những đoạn chèn này cho thấy mối quan hệ tiến hóa rất rõ ràng và phù hợp với kết luận dựa trên dữ liệu hình

dạng và giải phẫu (Després et al., 1992) Tuy nhiên, Schulenburg et al (1999) phát

hiện sự tương đồng về trình tự gen tại hơn một nửa của đoạn chèn giữa gen tại đầu 3’

Sự tương đồng trình tự cho thấy có sự liên quan với sự bảo tồn của cấu trúc bậc 2 Vì

24

vậy, sự tương đồng có thể do cùng nguồn gốc tổ tiên, không phải là sự tiến hóa cơ hội Nhóm tác giả đề xuất nên sử dụng đoạn gen này cho các nghiên cứu mối về quan hệ

tiến hóa ở cấp độ cao hơn

1.4.3.2 Phân loại sán lá song chủ ký sinh ở cá bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Khi so sánh đoạn chèn ITS2 ở các quần thể và các loài sán lá song chủ thuộc họ Fasciolidae ký sinh ở cá Nhật Bản, các tác giả thông báo rằng, kết quả giải trình tự

ADN đã xác định được 4 cá thể thuộc loài Fasciola hepatica, 2 cá thể thuộc loài Fasciola gigantic, 1 cá thể thuộc loài Fasciola magna và 1 cá thể của Fasciola sp Trình tự ADN của các loài có sự khác nhau chỉ là 2,8%, giữa 2 loài F hepatica và F gigantic, 13,2% giữa 2 loài F hepatica và F magna, trình tự gen của Fasciola sp ở

Nhật Bản tương tự với loài F gigantic (Adlard et al., 1993)

Blair et al (1998) đã nghiên cứu phân loại sán song chủ thuộc bộ Hemiuroidea

bằng phương pháp hình thái học, kết hợp với kỹ thuật sinh học phân tử Các tác giả đã xác định rằng, không có sự khác nhau đáng kể giữa phân loại hình thái học và sinh học phân tử Kết quả thể hiện bộ Hemiuroidea gồm 2 nhánh: nhánh 1 gồm các họ Accacoeliidae, Derogenidae, Didymozoidae, Hirudinellidae, Sclerodistomidae, Syncoeliidae và nhánh 2 gồm hai họ Hemiuridae và Lecithasteridae

Nghiên cứu sán lá song chủ ký sinh ở 7 loài cá thuộc họ cá hồng Lutjanidae (Perciformes) ở khu vực Ấn Độ - Thái Bình Dương đã phát hiện 2 loài sán lá song chủ

Siphoderina manilensis (Velasquez, 1961; Miller & Cribb, 2008) và S marina

(Hafeezullah Siddiqi, 1970) (Miller & Cribb, 2008) Tuy nhiên, khi phân tích dựa trên đặc điểm hình thái và giải trình tự ADN ribosome, Miller et al (2010) đã xếp 2 loài

đã nêu trên vào một giống mới Euryakaina: E manilensis và E marina Hai loài trên

rất giống nhau về mặt hình thái, cấu tạo, nhưng dữ liệu trình tự gen và vùng sinh thái cho thấy chúng là 2 loài cận giống (cryptic species)

Khi khảo sát trình tự gen của 36 cá thể sán lá song chủ mang hình dạng cấu tạo

của loài Transversotrema haasi Witenberg, 1944, ký sinh ở 16 loài cá thuộc họ bàng

chài Labridae, họ cá mó Scaridae, họ cá điêu hồng Haemulidae và họ cá hè Lethrinidae sống trong các rạn san hô ở đảo Lizard và Heron (phía Tây nước Úc) Kết quả cho thấy có 4 kiểu gen khác biệt: kiểu gen thứ nhất có liên quan với ba cá thể sán

ký sinh trên cá bàng chài Labridae tại đảo Heron; kiểu thứ hai liên quan với tám cá thể

25

sán ký sinh ở cá mó Scaridae tại đảo Heron; kiểu thứ ba với hai cá thể ở cá mó Scaridae từ Ningaloo và kiểu thứ tư với hai cá thể ký sinh trên cá hè Lethrinidae và một cá thể trên cá điêu hồng Haemulidae từ đảo Lizard Như vậy, qua khảo sát trình tự

gen thì có tới 3 loài mới thuộc giống Transversotrema đã được phát hiện là T elegans

ký sinh ở cá bàng chài, loài T igantica ký sinh ở cá mó và loài T lacerta ký sinh ở cá

điêu hồng và cá hè được ghi nhận (Hunter et al., 2010)

1.4.3.3 Nghiên cứu vòng đời sán lá song chủ trên cá

Sán lá song chủ (Digenea) là những KST có chu kỳ phát triển phức tạp, phát triển qua nhiều giai đoạn ấu trùng: tiêm mao trùng (miracidium), bào trùng (sporocyst), redia, ấu trùng hình tim (cercaria) và hậu ấu trùng (metacercaria) Trong vòng đời của sán này đòi hỏi phải có 1 hoặc 2 ký chủ trung gian, ký chủ trung gian thứ nhất thường

là động vật thân mềm như ốc, hoặc động vật 2 mảnh vỏ, ký chủ trung gian thứ hai thường là cá và ký chủ cuối cùng có thể là các loài cá dữ (cá ăn cá) hay là động vật có xương sống trên cạn có dùng cá làm thức ăn như người và gia súc gia cầm (Đỗ Thị Hòa và cộng sự, 2004)

Hình 1.5 Sự phát triển vòng đời của sán lá gan nhỏ

(Nguồn: viendinhduong.vn)

Nghiên cứu vòng đời của sán lá song chủ (Digenea) là một nội dung cần thiết, nhằm xác định các giai đoạn phát triển ấu trùng của sán lá và các loại ký chủ trung gian cần phải có để khép kín vòng đời của từng loài sán Tuy nhiên, tìm hiểu vòng đời của sán lá song chủ là một công việc không đơn giản, vì các giai đoạn ấu trùng của sán song chủ thường có kích thước rất nhỏ, hình dạng và cấu tạo các cơ quan chưa hoàn thiện, do vậy rất khó phát hiện ra nó trong nội tạng KCTG thứ nhất và KCTG thứ hai,

trùng của loài sán Cryptocotyle lingua, trong đó ấu trùng cercaria được tìm thấy trong loài ốc Littorina littorea và khi cảm nhiễm vào cá sau 8 tuần đã thu được ấu trùng

metacercaria, ấu trùng metacercaria qua 8 tuần phát triển thành sán trưởng thành Tác

giả này cũng đã mô tả vòng đời phát triển của loài sán Derogenes varicus

(Hemiuridae) và kết luận rằng, ấu trùng cercaria của loài sán này ký sinh trong ốc sên

Natica spp., ký chủ trung gian thứ 2 của loài sán này là loài giáp xác chân chèo Calanus finmarchicus (copepoda) và ký chủ cuối cùng là cá tuyết Sagitta spp (Koie,

1986; 1990) Tương tự như vậy, vòng đời của nhiều loài sán khác nhau cũng đã được

tác giả này tìm hiểu và thông báo, như loài sán Mesorchis denticulatus (Koie, 1987), hai loài sán Lecithaster gibbosus và Brachyphallus crenatus (Koie, 1992a, 1992b) Matin (1950) đã mô tả vòng đời phát triển của loài sán Parasitictodora hancocki ký sinh ở loài cá biển Gallus domesticus, sự phát triển ấu trùng của loài sán này, từ giai

đoạn sporocyst đến ấu trùng nang metacercaria được mô tả và đo đạc rất chi tiết

Ngoài ra, chu kỳ phát triển của bốn loài sán khác là Centrocestus formosanus, Stellantchasmus falcatus, Haplorchis taichui và H yokogawai thuộc họ Heterophyidae

ký sinh ở cá biển ở Hawaii cũng đã được tác giả này thông báo

Một số nhà khoa học khác đã ứng dụng kỹ thuật phân tử để xác định quá trình phát triển, tiến hóa của các loài sán lá song chủ Các gen ribosome của hệ gen ti thể, đặc biệt là các đoạn chèn giữa gen – Internal Transcribed Spacer (ITS), cho phép phân biệt sự khác biệt giữa các loài sán lá song chủ có mối quan hệ gần gũi và đã được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu các mối quan hệ giữa một số loài giun dẹp ký sinh (Blair

et al., 1996; Bartoli et al., 2000) Việc nghiên cứu các giai đoạn ấu trùng của sán lá song chủ ký sinh ở KCTG thứ nhất là động vật thân mềm (ốc hay động vật hai mảnh vỏ) được sử dụng phương pháp mô học và hình thái học (Cheng & Burton, 1965; Khamdan, 1998; Silva et al., 2002; Laruelle et al., 2002) Đã xuất hiện các dạng bệnh