Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học trong một số dịch chiết của lá và hạt cây chùm ngây

Tìm các điều kiện thích hợp chiết tách các chất trong lá và hạt chùm ngây. Định danh, xác định thành phần hóa học từ dịch chiết từ lá và hạt chùm ngây. Thăm dò hoạt tính kháng vi sinh vật của một số dịch chiết từ lá và hạt chùm ngây.Luận văn Luận văn thạc sỹ Hóa hữu cơ 2017

MỞ ĐẦU

1 LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Việt Nam nằm ở vành đai khí hậu nhiệt đới gió mùa, nhiệt độ trung bình nămkhác nhau giữa các địa phương…Nhờ có yếu tố về địa hình và khí hậu đa dạng,nước ta có thảm thực vật phong phú và có nguồn cây cối có giá trị dinh dưỡng, làmthuốc dồi dào

Việc sử dụng các loại thuốc thảo dược theo cách cổ truyền hay từ các hợp chấtnguồn gốc tự nhiên có xu hướng ngày càng tăng đã chiếm một vị trí quan trọngtrong nền y học Chế phẩm thảo dược dù chỉ có một loại dược liệu nhưng lại là hỗnhợp của nhiều hợp chất khác nhau và trong mọi trường hợp hầu hết đều chưa xácđịnh rõ hoạt chất của từng chất Vì vậy, những bài thuốc sử dụng thảo dược là đốitượng để cho các nhà khoa học nghiên cứu một cách đầy đủ về bản chất các hoạtchất có trong cây cỏ thiên nhiên

Trên cơ sở nhận thức tầm quan trọng về công dụng làm thuốc của các cây cỏhiện có ở nước ta, tôi chọn một loài cây có nhiều giá trị kinh tế đặc biệt làm thuốc,

là cây chùm ngây trong họ chùm ngây để nghiên cứu

Cây chùm ngây tên khoa học là Moringa oleifera Lam, phân bố tại nhiều quốcgia nhiệt đới và cận nhiệt đới, được biết đến và sử dụng hàng ngàn năm nay ở HiLạp, Ấn Độ, Ý… Các nghiên cứu trên thế giới cho thấy rằng, chùm ngây vừa là mộtthực phẩm, vừa là một dược liệu quý Các bộ phận như rễ, hạt, vỏ cây, quả và hoacủa cây chùm ngây có hoạt tính kích thích sự hoạt động của tim và hệ thần kinh,chống u bướu, chống oxi hóa, bảo vệ gan, chống nám Dầu chùm ngây giàuvitamin A, C và các chất béo không bão hòa, có đặc tính khử trùng và chống viêm,giúp chữa lành các vết thương ngoài da như vết cắt, vết bầm tím, bỏng, vết côntrùng cắn Lá chùm ngây được hai tổ chức thế giới WHO và FAO dùng như mộtgiải pháp ưu việt cho các bà mẹ thiếu sữa và trẻ em suy dinh dưỡng, và là giải pháplương thực cho thế giới thứ ba Hiện nay có khoảng 80 quốc gia trên thế giới trồngchùm ngây làm rau ăn

Ở Việt Nam, trước đây, cây chùm ngây được biết đến như một vị thuốc namdùng để điều trị một số bệnh thông thường trong dân gian Thế nhưng gần đây, nhờphát hiện của y học, hoa, quả và đặc biệt là lá cây chùm ngây còn là món ăn bổdưỡng cho cơ thể nên nhiều địa phương đã bắt đầu trồng, kinh doanh loại rau này.Với những tính năng đa dạng và phong phú như thế, nghiên cứu chiết tách, xácđịnh thành phần hóa học, ứng dụng các phương pháp hiện đại để xác định cấu trúc

và nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số hợp chất có trong cây chùm ngây ởViệt Nam là một hướng nghiên cứu có nhiều triển vọng, có ý nghĩa khoa học và

thực tiễn Vì vậy tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học trong một số dịch chiết của lá và hạt cây chùm ngây ” làm đề tài luận văn

tốt nghiệp của mình

2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

- Tìm các điều kiện thích hợp chiết tách các chất trong lá và hạt chùm ngây

- Định danh, xác định thành phần hóa học từ dịch chiết từ lá và hạt chùm ngây

- Thăm dò hoạt tính kháng vi sinh vật của một số dịch chiết từ lá và hạt chùmngây

3 ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI NGHIÊN CỨU

- Lá, hạt chùm ngây được thu hái tại xã Tam Đàn, huyện Phú Ninh, tỉnh QuảngNam

- Phạm vi nghiên cứu: Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết

- Xác định thành phần một số hợp chất trong dịch chiết từ lá và hạt chùm ngây

- Quá trình thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm hóa học, phòng thínghiệm vi sinh, trường Đại học Sư Phạm, Đại học Đà Nẵng

4 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

4.1 Phương pháp nghiên cứu lý thuyết

- Thu thập, tổng hợp tài liệu, tư liệu về nguồn nguyên liệu, phương pháp nghiêncứu các hợp chất tự nhiên, thành phần hóa học và ứng dụng của cây chùm ngây

- Tổng hợp tài liệu về phương pháp lấy mẫu, chiết tách và xác định thành phầnhóa học các chất từ thực vật

- Tổng hợp tài liệu về đặc điểm hình thái thực vật, thành phần hóa học và ứngdụng của cây chùm ngây.

4.2 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

- Phương pháp lấy và xử lí mẫu

- Phương pháp trọng lượng xác định độ ẩm

- Phương pháp tro hóa mẫu xác định hàm lượng hữu cơ

- Phương pháp AAS xác định hàm lượng các kim loại nặng

- Phương pháp chiết: Chiết soxhlet bằng các dung môi: n-hexan, diclometan,etyl axetat, ethanol

- Phương pháp xác định thành phần hóa học, định danh, xác định cấu trúc cáccấu tử chính bằng phương pháp sắc kí khí khối phổ (GC-MS)

- Phương pháp thăm dò hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của một số dịchchiết bằng phương pháp sinh học

5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

Những kết quả nghiên cứu sẽ góp phần cung cấp các thông tin có ý nghĩa khoahọc về thành phần hoá học và hoạt tính sinh học các chất chiết tách từ lá và hạt câychùm ngây, qua đó góp phần nâng cao giá trị ứng dụng của cây chùm ngây trongngành dược liệu

6 BỐ CỤC CỦA LUẬN VĂN

Luận văn bao gồm 81 trang, 26 bảng, 32 hình, 20 tài liệu tham khảo và 52 phụlục Ngoài phần mở đầu, danh mục bảng, hình, kết luận và kiến nghị, tài liệu thamkhảo Bố cục luận văn gồm:

Chương 1 – Tổng quan

Chương 2 – Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 3 – Kết quả và thảo luận

CHƯƠNG 1- TỔNG QUAN 1.1 KHÁI QUÁT VỀ CÂY CHÙM NGÂY

1.1.1 Phân loại khoa học

Chùm ngây hay còn gọi là chùm ngây cải ngựa, cây dùi trống, câu dầu bel có tênkhoa học là Moringa oleifera Lam, nằm trong hệ thống phân loại sau:

Loài: Chùm ngây cải ngựa Moringa oleifera Lam

Hình 1.1 Cây chùm ngây

Chi chùm ngây (Moringa) là chi duy nhất trong họ chùm ngây (Moringacese).Chi này có 13 loài, tất cả trong số chúng là các cây thân gỗ sinh sống trong khu vựcnhiệt đới và cận nhiệt đới Loài phổ biến nhất là chùm ngây Moringa oleifera Lam.Loài cây này được trồng nhiều nơi trong khu vực nhiệt đới, và loài duy nhất của chiMoringa có mặt tại Việt Nam.[1],[2]

1.1.2 Đặc điểm thực vật

Hình dáng: Chùm ngây là cây thân mộc cao cỡ trung bình, ở độ tuổi trưởng

thành cây có thể cao hàng chục mét Cây 1 năm tuổi nếu không cắt ngọn cây có thểcao tới 5-6 m và có đường kính 10 cm, 3-4 năm tuổi là cây ở độ tuổi trưởng thành.Thân cây óng chuốt, không có gai.[4], [5], [10]

Lá: Lá kép lông dài 30–60 cm, hình lông chim, màu xanh mốc; lá chét dài 12–

20 mm hình trứng, mọc đối có 6-9 đôi, lá kèm bao lấy chồi

Hoa: Cây trổ hoa vào các tháng 1–2 Hoa trắng kem, có cuống, vểnh lên, hình

dạng giống hoa đậu, rộng khoảng 2.5 cm, mọc thành chùm ở nách lá, có lông tơ,nhiều mật Bộ nhị gồm 5 nhị thụ xen với 5 nhị lép Bầu noãn một buồng do 3 lánoãn, đính phôi trắc mô.[4], [5]

Hình 1.2 Lá chùm ngây Hình 1.3 Hoa chùm ngây

Quả: Quả dạng nang treo, dài 25–40 cm, ngang 2 cm, có 3 cạnh, chỗ có hạt hơi

gồ lên, dọc theo quả có khía rãnh

Hạt: Hạt chùm ngây màu đen, tròn có 3 cạnh, tròn dẹp, to khoảng 1 cm.

Hình 1.4 Quả chùm ngây Hình 1.5 Hạt chùm ngây

1.1.3 Phân bố

Cây chùm ngây có nguồn gốc ở vùng phụ cận dãy Himalaya, tây bắc Ấn Độ, cólịch sử phát hiện và sử dụng hơn 4000 năm, nhưng ngày nay được trồng rộng rãi

ở Châu Phi, Trung Mỹ, Nam Mỹ, Đông Nam Á…

Ở Việt Nam, chùm ngây là loài duy nhất của chi chùm ngây được phát hiệnmọc hoang từ lâu đời tại nhiều nơi như Thanh Hóa, Ninh Thuận, Bình Thuận,vùng Bảy Núi ở An Giang, đảo Phú Quốc Tuy vậy, trước đây cây ít được chú ý,

có nơi trồng chỉ để làm hàng rào, và chỉ trong vài chục năm trở lại đây cây đượctrồng có chủ định và có nhiều nghiên cứu liên quan

Gỗ chùm ngây khá mềm, giòn nên thân cành dễ bị gãy trong mưa bão Do đónếu trồng cây để khai thác sử dụng người trồng thường cắt ngọn cây khi đạt độ caonhất định, vừa tiện thu hái; vừa kích thích cây đâm tược, nảy cành theo cấp số nhânnhư tán dù; vừa hạn chế thiệt hại do gãy đổ

1.2 GIÁ TRỊ SỬ DỤNG CỦA CÂY CHÙM NGÂY

1.2.1 Giá trị dinh dưỡng

Các bộ phận của cây chứa nhiều khoáng chất quan trọng, giàu chất đạm,vitamin, beta-caroten, axit amin và nhiều hợp chất phenol Cây chùm ngây cung cấpmột hỗn hợp gồm nhiều hợp chất quý hiếm như zeatin, quercetin, alpha-sitosterol,axit caffeoylquinic và kaempferol Một số nguồn nghiên cứu cho biết chùm ngây

chứa hơn 90 chất dinh dưỡng tổng hợp bao gồm 7 loại vitamin, 6 loại khoáng chất,

18 loại acid amin, 46 chất chống oxi hóa, liều lượng lớn các chất chống viêmnhiễm, các chất kháng sinh, kháng độc tố, các chất giúp ngăn ngừa và điều trị ungthư, u xơ tiền liệt tuyến, giúp ổn định huyết áp, hạ cholesterol, bảo vệ gan

Lá chùm ngây còn chứa nhiều dưỡng chất hơn cả quả và hoa, tính theo trọnglượng, trong đó vitamin C hơn cam 7 lần, vitamin A hơn cà rốt 4 lần, canxi gấp 4lần sữa, sắt gấp 3 lần cải bó xôi, đạm nhiều gấp đôi sữa chua và kali gấp 3 lần tráichuối.[13]

Trong ẩm thực, lá non và thậm chí cả lá già của chùm ngây được sử dụng đểnấu canh với thịt, tôm, nấm hoặc nấu suông, trộn salad, ăn sống, xào thịt, trứng, xaynhuyễn thành nước sinh tố Lá chùm ngây phơi khô tán bột có thể để rất lâu màkhông mất dinh dưỡng, sử dụng cho nhiều món ăn như cháo, bột trẻ em, nhào bộtbánh, pha nước uống Trái non được dùng xào, nấu canh, hầm xương, ninh súpnhư đậu cô ve và cho hương vị gần tương tự măng tây Khi già, hạt chùm ngây cóthể rang ăn như đậu phộng Rễ non của cây ăn sống hoặc làm gia vị như cảingựa (mù tạt)

1.2.2 Giá trị về y học

Rễ chùm ngây

Rễ có vị đắng, được xem như một loại thuốc bổ cho cơ thể và phổi, điều kinh,long đàm, lợi tiểu nhẹ Dịch rễ được dùng ngoài để điều trị chứng mẫn ngứa do dịứng Trong rễ và hạt cũng có chất kháng sinh pterygospermin

Pakistan dùng vỏ rễ sắc lấy nước trị đau răng, đau tai Hay rễ tươi của cây nondùng trị nóng sốt, phong thấp, gout, sung gan và lá lách.[15], [19]

Vỏ thân chùm ngây

Vỏ cây được dùng điều trị chứng thiếu vitamin C, đôi khi dùng trị tiêu chảy

Ở Ấn Độ, người ta hay dùng vỏ thân chùm ngây để trị nóng sốt, đau bao tử, đaubụng khi có kinh, sâu răng, làm thuốc thoa trị hói tóc, chữa đau cổ họng (dùngchung với hoa của cây nghệ, hạt tiêu đen), trị tiểu ra máu, trị thổ tả

Nhựa cây có công dụng giảm đau, chống sưng tấy

Bột làm từ lá tươi có khả năng cung cấp năng lượng cho cơ thể Lá cũng đượcdùng chữa sốt, viêm phế quản, viêm nhiễm mắt và tai, viêm màng cơ, diệt giun sán

và làm thuốc tẩy xổ Sản phụ ăn lá sẽ làm tăng tiết sữa Lá được chỉ định dùngchống thiếu máu, do chứa lượng sắt cao.[19]

Hoa chùm ngây

Hoa chùm ngây có giá trị y học cao như một chất kích thích, kích dục, tác nhângây sẩy thai, thông mật, dùng để chữa viêm, những bệnh về cơ, hội chứng rối loạnphân ly, khối u, sự phình to của lách, làm giảm cholesterol huyết thanh,phospholipid, trigliceride trong máu, tỉ lệ VLDL, LDL cholesterol thànhphospholipid và làm giảm chỉ số xơ vữa động mạch, giảm thành phần lipid ở gan,tim và động mạch chủ trong bệnh cao cholesterol máu ở thỏ và giảm sự thải ra cáccặn cholesterol.[18]

Quả, hạt chùm ngây

Quả dùng trị bệnh đau gan và tỳ, đau khớp, uốn ván

Hạt điều trị viêm dạ dày Dầu hạt được dùng để điều trị nấm da Nhiều nơi trênthế giới dùng bột nghiền từ hạt để khử trùng, làm trong nước.[18]

1.3 MỘT SỐ CHẤT CÓ TRONG CÂY CHÙM NGÂY

1.3.1 Vitamin E

Vitamin E là tên gọi chung để chỉ hai lớp các phân tử (bao gồm các tocopherol

và các tocotrienol) Vitamin E là một chất chống oxi hóa tốt do cản trở phản ứngxấu của các gốc tự do trên các tế bào của cơ thể

O HO

Hình 1.6 Công thức cấu tạo của vitamin E

Vai trò:

- Ngăn ngừa lão hóa: do phản ứng chống oxi bằng cách ngăn chặn các gốc tự do

mà vitamin E có vai trò quan trọng trong việc chống lão hóa

- Ngăn ngừa ung thư: kết hợp vitamin C tạo thành nhân tố quan trọng làm chậm

sự phát sinh của một số bệnh ung thư

- Ngăn ngừa tim mạch: vitamin E làm giảm các cholesterol xấu và làm tăng sựtuần hoàn máu nên làm giảm nguy cơ mắc các bệnh tim mạch

- Hệ thống miễn dịch: kích thích hệ thống miễn dịch hoạt động bình thườngbằng việc bảo vệ các tế bào,…[7]

- Axit oleic còn góp phần ngăn chặn các tế bào bạch cầu thâm nhập vào thànhmạch máu (nguyên nhân chính dẫn đến quá trình hoạt hóa màng trong tế bào)

- Axit oleic cũng có tác dụng giảm tốc độ phát triển của các vệt chất béo bằngcách loại bỏ các chất béo bão hòa khỏi màng tế bào

1.3.3 Axit n-hexadecanoic

Axit n-hexadecanoic (còn gọi là axit palmitic) là một axit béo bão hòa thườngđược tìm thấy ở cả động vật và thực vật Nó là một thành phần chính trong các loạidầu từ cây cọ, chẳng hạn như dầu cọ, dầu hạt cọ và dầu dừa

H H

Hình 1.9 Công thức cấu tạo của stigmasterol

Vai trò:

- Stigmasterol được xem như một chất trung gian trong quá trình tổng hợp cácnội tiết tố androgen, estrogen và corticoid Nó cũng được sử dụng như là tiền thâncủa vitamin D3

- Stigmasterol có tác dụng hạ đường huyết, phòng trị ung thư, bao gồm cả ungthư buồng trứng, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư vú và ung thư ruột kết

Stigmasterol đã được chứng minh rằng có thể ức chế sự suy thoái viêm xương khớp

do thoái hóa sụn và là chất chống oxi hóa mạnh.[7]

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ CÂY CHÙM NGÂY

1.4.1 Trên thế giới

Chùm ngây được xem là một cây đa dụng, rất hữu ích tại những quốc gia nghèo,

vì vậy nó được nghiên cứu rất nhiều về trồng trọt, thu hái, cũng như nghiên cứu vềcác hoạt tính y dược, giá trị dinh dưỡng… đa số các nghiên cứu được thực hiện ở

Ấn Độ, Philippines và Châu Phi Theo nghiên cứu tại Đại học Nông nghiệpFalsalabad – Pakistan: Moringa oleifera vừa là nguồn gốc dược liệu vừa là nguồnthực phẩm rất tốt Các bộ phân của cây chứa nhiều khoáng chất quan trọng và lànguồn gốc cung cấp chất đạm, vitamin, beta-caroten, axit amin và nhiều hợp chấtphenol…

Nghiên cứu tại Institute of Bioagricultural Sciences, Academica, Đài Bắc: dịchchiết từ lá và hạt chùm ngây có các hoạt tính diệt nấm gây bệnh loại Trichophytonrubrum, Trichophyton mentagrophyltes…, dầu trích từ lá chùm ngây có đến 44 hóachất

* Nghiên cứu về chống tăng huyết áp, lợi tiểu và giảm cholesterol

Các hợp chất trong cây chùm ngây rất có giá trị trong việc điều trị tim mạch vìchúng có khả năng trị bệnh tăng huyết áp và giảm mỡ trong máu, ngoài ra còn cótác dụng lợi tiểu Dịch chiết từ lá chùm ngây có tác dụng ổn định áp suất trong máu(Tạp chí sức khỏe Ấn Độ, 1962; Dahot, 1988) Các hợp chất nitrile, glycosidethiocarbamate được phân lập từ lá chùm ngây có tác dụng hạ huyết áp (Faizi vàcộng sự, 1995) và hầu hết các hợp chất này rất hiếm trong tự nhiên Một nghiên cứukhác các phân đoạn trên cao EtOH của quả chùm ngây, trích ly được các glycosidethiocarbamate và isothiocyanate có tác dụng hạ huyết áp (Faizi và cộng sự, 1995).[14]

* Nghiên cứu về chống co thắt, chống loét và bảo vệ gan

Gilani cùng cộng sự (1992, 1994) công bố lá chùm ngây có nhiều tác dụng dược

lý, hợp chất 4-[α-(L-rhamnosyloxy) benzyl]-O-methylthiocyanate trích từ dịch chiết

EtOH còn là thành phần trong thuốc chống co thắt với nguyên nhân tắc nghẽn là cáchạt sỏi của các hợp chất canxi Pal và cộng sự (1995) công bố cao EtOH của láchùm ngây có tác dụng chống lở loét và có chức năng bảo vệ gan trên chuột, dịchchiết nước lá chùm ngây cũng có khả năng chống lở loét Ruckmani và cộng sự(1998) cũng nghiên cứu cho thấy rễ chùm ngây có chức năng bảo vệ gan Ngoài ra,dịch chiết EtOH và nước của hoa chùm ngây cũng có tác dụng trị các bệnh lý vềgan do chúng có chứa Quercetin, một flavonoid có hoạt tính sinh học mạnh.[14]

* Nghiên cứu về trị khối u và chống ung thư

Makonnen cùng cộng sự (1997) đã công bố lá chùm ngây chứa nhiều thành phần

có khả năng trị khối u Đó là các hợp chất O-ethyl-4-(α-L-rhamnosyloxy)benzylcarbamate, 4-(α-L-rhamnosyloxy)benzylisothiocyanate, Niazimicin, 3-O-(6'-O-oleoyl-β-D-glucopyranosyl)-β-sitosterol đã được thử nghiệm in vitro cho kết quả làchúng có khả năng ức chế đáng kể virut kháng nguyên sớm Epstein Barr Song song

đó, Guevara cùng cộng sự (1999) cũng đã đề xuất Niazimicin là một chất có khảnăng phòng ngừa ung thư hiệu quả Bharali cùng cộng sự (2003) đã nghiên cứu dịchchiết hạt chùm ngây cho thấy khả năng chuyển hóa enzyme chống ung thư gan,chống oxi hóa và chống ung thư da ở chuột [14]

S Sreelatha & P R Padma đã thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa và xác địnhtổng hàm lượng poliphenol và tổng hàm lượng flavonoid từ dịch chiết nước từ lácây chùm ngây Hàm lượng poliphenol trong lá già và lá non tương ứng là 45.81mg/g và 36.02 mg/g trong dịch chiết nước và hàm lượng flavonoid tổng trong lá già

và lá non tương ứng là 27 mg/g, 15 mg/g.[20]

Kawo, A.H cùng cộng sự xác định hạt chùm ngây chứa 18.63% protein, 322.9mg/100 g tanin, 8.24 mg/100 g alkaloid, 9.13% saponin.[16]

* Nghiên cứu về khả năng lọc nước

Nghiên cứu tại đại học Jiwaji, Gwalior (Ấn Độ) cho thấy rằng: Hạt chùm ngây

có chứa một hợp chất “đa điện giải” (polyetronlytes) tự nhiên có thể dùng làm chấtkết tủa để làm trong nước Kết quả lọc nước: Nước đục (độ đục 15-25 NTU, chứacác vi khuẩn tạp 280-500 cfu ml-1) dùng hạt chùm ngây làm chất tạo trầm lắng và

kết tụ, đưa đến kết quả rất tốt (độ đục còn 0.3-1.5 NTU, vi khuẩn tạp còn 5 - 20 cfu

ml-1) Phương pháp lọc này rất hữu dụng tại các vùng nông thôn của các nước nghèo

và được áp dụng rộng rãi tại Ấn Độ

1.4.2 Tại Việt Nam

Trong những năm gần đây, tại Việt Nam bắt đầu có những nghiên cứu tập trungvào đối tượng chùm ngây, chủ yếu là các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạttính sinh học, tác dụng dược lý, nhằm có những biện pháp nghiên cứu, chế biến và

sử dụng hiệu quả đối tượng này Trong số đó, một số công trình nghiên cứu nổi bật

đã được công bố:

Đại học Y dược TP.HCM, 2011, cũng đã có công trình nghiên cứu về tác dụngchống oxi hóa và bảo vệ gan của các dạng cao chiết từ lá cây chùm ngây Kết quảcho thấy, cao lá chùm ngây trồng tại Việt Nam có khả năng chống oxi hóa và bảo vệgan

Trung tâm Sâm và dược liệu TP HCM, 2010 đã khảo sát được trong lá chùmngây có những hợp chất là chất béo, tinh dầu, carotenoid, flavonoid, tannin, axit hữu

cơ

Lương y Nguyễn Công Đức - giảng viên khoa Y học cổ truyền (ĐH Y Dược,TP.HCM), cho biết: Chùm ngây được dùng chữa các bệnh như: trị u xơ tiền liệttuyến - bằng cách, dùng 100 gam rễ chùm ngây tươi và 80 gam lá trinh nữ hoàngcung tươi (hoặc dùng rễ chùm ngây khô 30 gam và lá trinh nữ hoàng cung khô 20gam) Đem nấu với 2 lít nước, nấu còn lại nửa lít thuốc, uống ấm 3 lần trong ngày;trị suy nhược cơ thể, suy nhược thần kinh, giúp ổn định huyết áp, ổn định đườnghuyết, bảo vệ gan - bằng cách, mỗi ngày dùng 150 gam lá chùm ngây non rửa sạch,giã nát, thêm 300 ml nước sạch vắt lấy nước cốt (hoặc dùng máy xay sinh tố), thêm

2 muỗng canh mật ong trộn đều, chia uống 3 lần dùng trong ngày; trị tăngcholesterol, tăng lipid máu, tăng triglyxerid, hoặc làm giảm axit uric, ngăn ngừa sỏioxalate - bằng cách, mỗi ngày dùng 100 gam rễ chùm ngây tươi (hoặc 30 gam khô)rửa sạch, nấu với 1 lít nước, nấu sôi 15 phút, để uống cả ngày Ngoài ra, chùm ngâycòn có công dụng ngừa thai, đây là loại cây được đồng bào người Raglay dùng làm

thuốc ngừa thai - cứ 5 ngày thì dùng 2 nắm rễ cây chùm ngây còn tươi (150 gam)rửa sạch băm nhỏ nấu với 2 lít nước, nấu còn nửa lít thuốc, chia uống 2 lần trongngày Phụ nữ Raglay trong tuổi sinh đẻ nếu uống nước sắc rễ chùm ngây thì sẽkhông có thai Tuy nhiên, cần lưu ý, phụ nữ đang có thai thì không được dùng câychùm ngây.

Nghiên cứu tại Đại học Kỹ thuật công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh cho thấyhạt cây chùm ngây trồng và thu hái ở Việt Nam có khả năng làm giảm trên 80% độđục của nước nhân tạo, ngay cả khi độ đục ban đầu chỉ là 50 NTU Trong giới hạnkhảo sát, nước càng đục thì hiệu quả giảm độ đục của hạt chùm ngây càng cao ởcùng một ngưỡng nồng độ hạt chùm ngây, và nồng độ tối ưu cần sử dụng của dịchchiết chùm ngây gần như tuyến tính với độ đục ban đầu của nước cần xử lý Khi sửdụng hạt chùm ngây để thực hiện quá trình keo tụ với nước sông, hiệu quả giảm độđục đạt được khoảng 50% đối với nước đục trung bình (44 NTU) nhưng lên tới 76%với nước đục nhiều (170 NTU).[11]

 Nhận xét:

Trước đây khi chưa có sự xuất hiện của y học hiện đại, các phương thuốc vàcách thức điều trị bệnh hoàn toàn xuất phát từ thảo dược Người ta ước tính trên thếgiới khoảng 80% dân số sống ở các vùng nông thôn vẫn đang sử dụng đa dạng cácnguồn thực vật để chữa bệnh trong đó có cây chùm ngây

Ngày nay, có nghiều công trình nghiên cứu về thành phần cũng như tác dụngcủa cây chùm ngây trên thế giới đối với sức khỏe con người Qua các công trìnhnghiên cứu chúng ta càng thấy rõ hơn giá trị của loài cây này, từ đó mở ra khả năngkhai thác hiệu quả loài cây này trong y học hiện đại để bào chế các dạng thuốc chữabệnh hoặc thực phẩm chức năng có lợi cho sức khỏe con người

1.5 KHÁI QUÁT VỀ VI KHUẨN

1.5.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis

Bacillus subtilis (B.subtilis) được Ferdinand Cohn mô tả và đặt tên năm 1872

Về cơ bản theo phân loại, Bacillus subtilis thuộc:

có sự tồn tại của bào tử cũng như tế bào sinh dưỡng Bacillus subtilis.[9]

1.5.1.2 Đặc điểm hình thái

Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím Gram dương, kíchthước 0.5-0.8 µm x 1.5-3 µm, đứng đơn lẻ hay tạo thành chuỗi ngắn Vi khuẩn cókhả năng di động, có 8-12 tiêm mao, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vikhuẩn và nằm giữa tế bào

Bào tử Bacillus subtilis phát triển bằng cách nảy chồi do sự nứt của vỏ, khôngkháng axit, có tính chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, phóng xạ.[9]

1.5.1.3 Đặc điểm nuôi cấy

Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng có khả năng phát triển trong môitrường thiếu oxi, nhiệt độ tối ưu 37oC Bacillus subtilis thích hợp nhất với pH từ 6.8– 7.4

Hình 1.10 Vi khuẩn Bacillus subtilis

Môi trường thạch đĩa TSA: khuẩn lạc có dạng hình tròn, rìa răng cưa không đều,

có tâm sẩm màu, phát triển chậm, màu vàng xám, đường kính 3-5 mm Sau 1-4ngày bề mặt nhăn nheo màu hơi sẩm

Môi trường thạch nghiêng TSA: dễ mọc, tạo thành màu xám, rìa gợn sóng

Môi trường canh TSB: Bacillus subtilis phát triển làm đục môi trường, tạo màngnhăn, lắng cặn kết lại như vần mây ở đáy, khó tan khi lắc đều lên

1.5.1.4 Vai trò của vi khuẩn Bacillus subtilis

Bacillus subtilis tồn tại khắp nơi trong tự nhiên Tính dễ sống, dễ tồn tại cũng làlợi thế sử dụng Bacillus subtilis sản xuất chế phẩm sinh học Trong quá trình hìnhthành bào tử, Bacillus subtilis thường sản sinh những chất có hoạt tính sinh học,ứng dụng trong nhiều lĩnh vực Verschuers (2000) đã nghiên cứu và công bố vikhuẩn Bacillus subtilis đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện chất lượng nước

do vi khuẩn này đạt hiệu quả cao trong việc chuyển đổi vật chất hữu cơ thành CO2.

Do vậy, Bacillus subtilis làm giảm tích lũy chất hữu cơ và các chất hòa tan (PhạmThị Tuyết Ngân, 2007) Vi khuẩn Bacillus subtilis dùng để làm sạch môi trườngnhờ khả năng sinh các enzyme (proteaza, amylaza, xenlulaza) phân huỷ các hợpchất hữu cơ và kiểm soát sự phát triển quá mức của vi sinh vật gây bệnh do cơ chếcạnh tranh dinh dưỡng, giữ môi trường luôn ở trạng thái cân bằng sinh học.[9]

1.5.2 Vi khuẩn Escherichia coli

Escherichia coli (E.coli) được tìm thấy bởi bác sĩ nhi khoa Theodor Escherichqua những thí nghiệm lâm sàng về bệnh tiêu chảy năm 1885 Escherichia coli thuộcphân loại khoa học sau:

1.5.2.1 Đặc điểm hình thái

Vi khuẩn E.coli là một trực khuẩn hình gậy ngắn, bắt màu gram âm, có kíchthước 2-3 µm x 0.3-0.6 µm; ở môi trường nuôi cấy, trong canh khẩn giả, xuất hiệnnhững trực khuẩn dài 4-8 µm Trong cơ thể người và động vật, vi khuẩn thường cóhình cầu trực khuẩn, đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn Phần lớn vi khuẩnE.coli có khả năng di động do có lông ở xung quanh thân, không sinh nha bào, cóthể có giáp mô Nếu lấy vi khuẩn từ khuẩn nhầy để nhuộm, có thể thấy giáp mô,nhưng khi soi tươi thường không nhìn thấy được.[9]

1.5.2.2 Đặc điểm nuôi cấy

Vi khuẩn E.coli là trực khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy tiện, có thể sinh trưởng ởphổ nhiệt độ khá rộng (từ 5-40oC), nhiệt độ thích hợp nhất là 37oC và phổ pH rộng

từ 5.5-8.0

Vi khuẩn E.coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường.Khi nuôi cấy trên các môi trường, để trong tủ ẩm ở 37oC và sau 24 giờ vi khuẩn sẽphát triển:

Môi trường thạch thường: Hình thành những khuẩn lạc tròn, ướt, bóng láng,không trong suốt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đường kính từ 2-3 mm, nuôi lâu, lạckhuẩn có màu nâu nhạt và mọc rộng ra

Môi trường nước thịt: Phát triển rất nhanh, tốt, môi trường đục, để có lắng cặnmàu tro nhạt ở dưới đáy, đôi khi có màu xám nhạt, canh trùng có mùi phân thối.Môi trường MacConkey: Khuẩn lạc có màu hồng cánh sen, tròn nhỏ, hơi lồi,không nhầy, rìa gọn, không làm chuyển màu môi trường

Môi trường thạch máu: Khuẩn lạc to, ướt, lồi, viền không gọn, màu xám nhạt

1.5.2.3 Khả năng gây bệnh của E.coli

E.coli là thành viên thuộc nhóm vi khuẩn hệ bình thường của đường tiêu hóa,chiếm tỷ lệ cao nhất trong số các vi khuẩn hiếu khí (khoảng 80%) Trong điều kiệnbình thường, E.coli cư trú thường xuyên ở phần sau của ruột, khi có trong dạ dàyhay đoạn đầu ruột non của động vật Khi gặp điều kiện thuận lợi, chúng phát triểnnhanh về số lượng, độc lực, gây loạn khuẩn, bội nhiễm đường tiêu hóa và nguyên

nhân gây bệnh tiêu chảy E.coli cũng là 1 vi khuẩn gây một số bệnh như: viêmđường tiết niệu, viêm đường mật; đứng hàng đầu trong các căn nguyên gây nhiễmkhuẩn huyết E.coli là căn nguyên thường gặp trong viêm màng não, viêm phổi ở trẻ

em mới sinh E.coli còn gặp trong nhiễm trùng ngoại khoa, nhiễm trùng trong bỏng.[9]

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.1.1 Thu gom nguyên liệu

Mẫu lá và hạt chùm ngây được thu hái tại xã Tam Đàn, huyện Phú Ninh, tỉnhQuảng Nam

Hình 2.1 Lá chùm ngây Hình 2.2 Hạt chùm ngây

2.1.2 Xử lý nguyên liệu

Mẫu lá chùm ngây sau khi thu hái được xử lí sơ bộ bằng cách loại bỏ lá sâu, hư,rửa sạch, phơi khô trong bóng râm Sau đó, lá được sấy trong tủ sấy đến khô ở nhiệt

độ 50oC, xay nhỏ và bảo quản trong bình thủy tinh kín

Mẫu hạt chùm ngây sau khi thu hái, tách lấy hạt, phơi 3 nắng, sau đó tách vỏcứng, nhân hạt sấy khô trong tủ sấy ở 50oC trong nhiều giờ rồi xay nhỏ và bảo quảntrong bình thủy tinh kín

Hình 2.3 Lá chùm ngây phơi khô Hình 2.4 Bột lá chùm ngây

Hình 2.5 Nhân hạt chùm ngây Hình 2.6 Bột hạt chùm ngây

2.1.3 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu

2.1.3.1 Hóa chất

a Lựa chọn dung môi chiết

Chọn dung môi phải không hoặc ít độc, không quá dễ cháy, hòa tan được cácchất cần khảo sát, phù hợp với phương pháp mà ta tiến hành phân tích (với phươngpháp GC-MS ta phải chọn dung môi dễ bay hơi và ít phân cực…), phù hợp với điềukiện kinh tế và phải thông dụng, phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm, dung môi

có thể loại bỏ một cách dễ dàng sau khi chiết tách

Bảng 2.1 Các dung môi có độ phân cực tăng dần tùy vào hằng số điện môi và

độ nhớt

Tên dung môi

Chỉsốphâncực

Chỉ sốchiếtxuất(20oC)

Nhiệt

độ sôi(oC)

Hằng sốđiện môi

ε (ở

25oC)

Độnhớt(mN.S.m-2)

BướcsónghấpthuUV

Độ tantrongnước(%W/W)

+ n-hexan: C6H14, M = 86.16 g/mol, chất lỏng không màu, không tan trong nước,

có khối lượng riêng D = 0.6548 g/ml, = -95oC, = 69oC

+ Diclometan: CH2Cl2, M = 84.93 g/mol, chất lỏng không màu, độ hòa tan trongnước 1.3 g/ml ở 20oC, khối lượng riêng D = 1.3255 g/ml, = - 96.7oC, = 41oC.+ Etyl axetat: C4H8O2, M = 88.11 g/mol, chất lỏng không màu, độ hòa tan trongnước 8.3 g/ml ở 20oC, khối lượng riêng D = 0.8897 g/ml, = -84oC, = 77oC

+ Ethanol: C2H6O, M = 46.07 g/mol, chất lỏng không màu, tan hoàn toàn trongnước, khối lượng riêng D = 0.789 g/ml, = -114.3oC, = 78oC.

Ngoài ra còn một số hóa chất khác

Các hóa chất có nguồn gốc Trung Quốc

2.1.3.2 Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu

- Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) tại Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn

Đo lường Chất lượng II (quatest II), số 2 Ngô Quyền – Đà Nẵng

- Thiết bị đo sắc ký ghép khối phổ (GC-MS) tại Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn

Đo lường Chất lượng II (quatest II), số 2 Ngô Quyền – Đà Nẵng

- Thiết bị đo sắc ký ghép khối phổ (GC-MS) tại Trung tâm hóa dầu, khoa Hóahọc, trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên Hà Nội

Hình 2.7 Hệ thống sắc ký khí khối phổ GC-MS

- Tủ sấy (hình 2.8), Lò nung (hình 2.9)

Hình 2.8 Tủ sấy Hình 2.9 Lò nung

- Bếp cách thủy (hình 2.10), Máy cô quay chân không (hình 2.11)

Hình 2.10 Bếp cách thủy Hình 2.11 Máy cô quay chân không

- Hai bộ chiết soxhlet

Nguyên liệu ẩm có thể xem như hỗn hợp cơ học gồm chất khô tuyệt đối và nước

tự do Độ ẩm tương đối của nguyên liệu ẩm là tỉ số của khối lượng nước trên khốilượng chung của nguyên liệu ẩm, tính bằng phần trăm

Độ ẩm của nguyên liệu phải nằm trong giới hạn cho phép để đảm bảo nguyênliệu không bị mốc hay hư hỏng, thông thường độ ẩm an toàn của nguyên liệu đượcquy định không quá 13% Do đó, có thể xác định độ ẩm bằng cách:

- Sấy trong tủ sấy ở áp suất thường

- Sấy trong tủ sấy có áp suất giảm (có hút chân không)

- Sử dụng bình hút ẩm

Trong đề tài này dùng tủ sấy để sấy, dùng sức nóng làm bay hơi hết hơi nướctrong mẫu Cân trọng lượng mẫu trước và sau khi sấy khô, từ đó tính được phầntrăm nước có trong mẫu

+ Lấy vào 3 chén sứ, mỗi chén m (gam) bột lá chùm ngây

+ Sau đó, sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 100oC Cứ 3 giờ, lấy cốc ra cho vào bìnhhút ẩm đến khi cốc nguội đến nhiệt độ phòng thì tiến hành cân Và cứ tiếp tục thựchiện thao tác trên cho đến khi khối lượng giữa hai lần cân liên tiếp có sai số khôngquá 0.001 gam Cân cốc chứa mẫu m2 (gam)

c Tính toán

Độ ẩm bột lá chùm ngây được tính bằng công thức:

Trong đó, w: Khối lượng nước chứa trong nguyên liệu (%)

m: Khối lượng của nguyên liệu (gam)

m1: Khối lượng chén sứ (gam)

m2: Khối lượng nguyên liệu và chén sứ sau khi sấy (gam)

Độ ẩm chung là độ ẩm trung bình của 3 mẫu.

Phương pháp này cũng dùng để xác định độ ẩm bột hạt chùm ngây

- Các mẫu sau khi được xác định độ ẩm tiếp tục được đem đi tro hóa Đem mẫu

đi than hóa trên bếp điện và cho vào tủ nung ở 200oC trong khoảng 2 giờ, tiếp tụcnâng nhiệt độ lên 500oC tro hóa mẫu trong thời gian 4 giờ, nung xong lấy mẫu rakhỏi lò, làm nguội trong bình hút ẩm, cân và ghi lại khối lượng chén nung và tro.Tiếp tục cho cốc vào lò nung và thực hiện quá trình trên cho đến khi khối lượngliên tiếp giữa hai lần cân chênh nhau không quá 0.001 gam thì dừng, ghi giá trị m3(gam)

Sau khi tro hóa lá chùm ngây hoàn toàn, lúc này tro ở dạng mịn, có màu xámtrắng

c Tính toán:

Hàm lượng tro được tính bằng công thức:

Trong đó:

m: Là khối lượng nguyên liệu (gam)

m1: Là khối lượng của chén sứ (gam)

m3: Là khối lượng của chén sứ và lá chùm ngây sau khi tro hóa (gam)

Phương pháp này cũng dùng để xác định hàm lượng tro của bột hạt chùm ngây.

2.2.1.3 Xác định hàm lượng một số kim loại nặng

Mẫu bột lá và hạt chùm ngây sau khi tro hóa được vô cơ hóa về dạng muối vô

cơ cho dễ tan Cho toàn bộ mẫu tro hóa hòa tan trong dung dịch HNO3 đặc và địnhmức đến 100 ml Lấy dung dịch đã định mức trên đem xác định hàm lượng một sốkim loại nặng là Pb, Cu, Zn bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS)tại Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng II (quatest II), số 2 NgôQuyền – Đà Nẵng

Công thức chuyển đổi từ hàm lượng mg/l sang hàm lượng mg/kg như sau:

Trong đó: m: khối lượng mẫu bột trước khi tro hóa

2.2.2 Phương pháp chiết mẫu thực vật

2.2.2.1 Giới thiệu chung

Chiết là dùng dung môi thích hợp có khả năng hòa tan chất đang cần tách và tinhchế để tách nó ra khỏi môi trường rắn hoặc lỏng khác Thường người ta dùng mộtdung môi thấp và ít tan trong nước (vì các chất hữu cơ cần tinh chế thường ít tantrong nước), chất cần tách sẽ chuyển phần lớn lên dung môi và ta có thể dùng phễu

để tách riêng dung dịch thu được ra khỏi nước

Bằng cách lặp đi lặp lại việc chiết một số lần, ta có thể tách hoàn toàn chất cầntinh chế vào dung môi đã chọn, sau đó chưng cất loại bỏ dung môi và cất lấy chấttinh khiết ở nhiệt độ và áp suất thích hợp

Người ta cũng thường chiết một chất từ hỗn hợp rắn bằng một dung môi hoặchỗn hợp dung môi với một dụng cụ chuyên dùng đặc biệt gọi là bình chiết soxhlet.Dung môi được đun nóng, cho bay hơi liên tục và chảy vào bình chứa hỗn hợp cầnchiết tách (thường gói bằng giấy lọc), nó sẽ hòa tan chất rắn cần tinh chế và nhờmột ống xiphông, dung dịch chảy xuống bình cầu bên dưới, dung môi nguyên chấtlại tiếp tục được cất lên Phương pháp này tiết kiệm được dung môi và hiệu quảtương đối cao

2.2.2.2 Kỹ thuật chiết soxhlet

* Dụng cụ

Gồm một bình cầu A đặt trong một bếp đun có thể điều chỉnh nhiệt độ Một bộphận chứa mẫu bột dược liệu, gồm ba ống: Ống D có đường kính lớn, ở giữa đểchứa bột dược liệu; ống B có đường kính trung bình để dẫn dung môi từ bình cầu Abay lên đi vào ống D chứa bột dược liệu; ống E có đường kính nhỏ, là ống thôngnhau để dẫn dung môi từ ống D trả lại bình cầu A Trên cao nhất là ống C ngưnghơi

Kiểm tra hệ thống kín, mở cho nước chảy hoàn lưu trong ống ngưng hơi Cắmbếp cách thủy và điều chỉnh nhiệt sao cho dung môi trong bình cầu sôi nhẹ đều.Dung môi tinh khiết khi được đun nóng sẽ bốc hơi lên cao theo ống B, nhờ hệ thống

Hình 2.12 Bộ chiết soxhlet

ngưng tụ, dung môi được ngưng tụ tại ống D chứa nguyên liệu Dung môi ngấm vàobột nguyên liệu và chiết những chất hữu cơ nào có thể hòa tan vào dung môi Theoquá trình đun nóng, lượng dung môi rơi vào ống D và đồng thời cũng dâng lên trongống E Đến một mức cao nhất trong ống E, dung môi sẽ bị hút vào bình A, lực hútnày sẽ rút lượng dung môi đang chứa trong ống D.

Bếp vẫn tiếp tục đun và một quy trình mới vận chuyển dung môi theo như mô tảlúc đầu Các hợp chất được rút xuống bình cầu và nằm lại tại đó, chỉ có dung môitinh khiết là được bốc hơi bay lên để tiếp tục quá trình chiết

Sau khi hoàn tất, lấy dung môi chiết ra khỏi bình cầu A, đuổi dung môi và thuđược cao chiết

* Một số lưu ý khi dùng kỹ thuật chiết soxhlet:

+ Các hợp chất chiết được trữ trong bình cầu, đến một lúc nào đó nồng độ củachất đạt đến mức bão hòa thì cần phải thay dung môi mới

+ Tùy trường hợp, việc chiết có thể kéo dài vài ngày Muốn nghỉ, cần phải tắtbếp trước, chờ thêm khoảng 30 phút mới tắt ống nước làm lạnh ống sinh hàn

+ Khi thực hiện sự chiết với dung môi có nhiệt độ sôi thấp, phòng thí nghiệm ở

xứ nóng, cần lưu ý xem ống sinh hàn có đủ sức làm ngưng tụ hơi hay không, nếukhông, sẽ thấy bốc khí ra khỏi hệ thống từ đầu trên cao của ống sinh hàn, trongtrường hợp đó cần tìm cách nối dài thêm hệ thống sinh hàn Lưu ý đây là hệ thống

hở, phần bên trong của hệ thống thông với không khí bên ngoài nhờ ống sinh hàn,

vì thế khi nối dài ống sinh hàn không được làm ống bị bít

+ Sau khi chiết kiệt với một loại dung môi, muốn tiếp tục chiết với dung môi cótính phân cực cao hơn thì ta phải rút bao chứa nguyên liệu ra khỏi ống, mở miệngbao cho dung môi bay hết, rồi cho bao trở lại ống, rót dung môi mới vào, bắt đầuqui trình chiết mới

* Ưu, nhược điểm của phương pháp chiết soxhlet

- Ưu điểm:

+ Tiết kiệm dung môi, chỉ một lượng ít dung môi mà chiết kiệt được mẫu

+ Không tốn các thao tác châm dung môi mới và lọc dịch chiết như các kỹ thuậtkhác Chỉ cần cắm điện, mở nước hoàn lưu là thiết bị sẽ thực hiện sự chiết.

+ Chiết kiệt hợp chất trong bột nguyên liệu vì bột nguyên liệu luôn được chiếtliên tục bằng dung môi tinh khiết

- Nhược điểm:

+ Kích thước của thiết bị làm giới hạn lượng bột nguyên liệu cần chiết

+ Trong quá trình chiết, các hợp chất chiết ra từ bột nguyên liệu được trữ lạitrong bình cầu, nên chúng luôn bị đun nóng ở nhiệt độ sôi của dung môi vì thế hợpchất nào kém bền nhiệt dễ bị hư hại

+ Do toàn hệ thống của thiết bị đều bằng thủy tinh và gia công thủ công nên giáthành của một thiết bị khá cao Thiết bị bằng thủy tinh nên dễ vỡ, trong đó các bộphận của thiết bị, nhất là các nút mài được gia công thủ công nên chỉ cần làm bểmột bộ phận nào đó thì khó tìm được một bộ phận khác vừa khớp để thay thế

2.2.3 Phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử (AAS)

2.2.3.1 Giới thiệu phương pháp

Phép đo phổ hấp thụ nguyên tử là một kỹ thuật phân tích tương đối mới đã vàđang phát triển mạnh mẽ và ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa học và kỹthuật ở các nước phát triển Đối tượng của phương pháp phân tích theo phổ hấp thụ

nguyên tử là lượng nhỏ các kim loại và một số á kim trong rất nhiều đối tượng mẫu:

quặng, đất, nước khoáng, các mẫu sinh học, y học, các sản phẩm nông nghiệp, thựcphẩm, nước uống, phân bón, vật liệu.[6], [8]

Với trang thiết bị và kỹ thuật hiện nay, người ta có thể định lượng được hầu hếtcác kim loại và một số á kim đến giới hạn nồng độ cỡ ppb (nanogram) với sai sốkhông lớn hơn 15%

* Nguyên tắc phép đo:

Các nguyên tử ở trạng thái bình thường thì chúng không hấp thụ hay bức xạnăng lượng nhưng khi chúng ở trạng thái tự do dưới dạng những đám hơi nguyên tửthì chúng hấp thụ và bức xạ năng lượng Mỗi nguyên tử chỉ hấp thụ những bức xạnhất định tương ứng với những bức xạ mà chúng có thể phát ra gọi là quá trình hấp

thụ năng lượng của nguyên tử tự do ở trạng thái hơi và tạo ra phổ của nguyên tử đó.Phổ sinh ra trong quá trình này gọi là phổ hấp thụ nguyên tử Phương pháp phântích dựa trên cơ sở đo phổ hấp thụ nguyên tử của một số nguyên tố như thế được gọi

là phương pháp đo phổ hấp thụ nguyên tử [6]

* Qui trình phép đo AAS:

Để thực hiện phép đo phổ hấp thụ nguyên tử cần thực hiện các quá trình sauđây :

- Quá trình nguyên tử hóa mẫu

Mục đích của quá trình này là tạo ra đám hơi các nguyên tử tự do từ mẫu phântích với hiệu suất cao và ổn định Ta có thể nguyên tử hóa mẫu phân tích bằng ngọnlửa và bằng kỹ thuật nguyên tử hóa không ngọn lửa Đây là giai đoạn quan trọngnhất và có ảnh hưởng đến kết quả của phép đo AAS Để thu kết quả phân tích chínhxác, phải nghiên cứu và chọn lọc được các điều kiện tối ưu cho quá trình nguyên tửhóa mẫu sao cho phù hợp với từng nguyên tố phân tích trong mỗi loại mẫu cụ thể,

đó là:

+ Thành phần và tốc độ của hỗn hợp khí đốt ra tạo ngọn lửa

+ Tốc độ dẫn dung dịch mẫu

+ Chiều cao của đèn nguyên tử hóa

+ Bề dày của môi trường hấp thụ

+ Độ nhớt của dung dịch mẫu

Dung dịch phân tích và dung dịch dùng để lập đường chuẩn phải được chuẩn bịtrong cùng một điều kiện để có cùng loại thành phần hóa học, vật lý, đặc biệt làthành phần nền của mẫu, độ axit, loại axit dùng làm môi trường

- Nguồn phát bức xạ đơn sắc

Muốn thực hiện đo phổ hấp thụ nguyên tử, cần phải có nguồn phát tia bức xạđơn sắc của nguyên tố cần phân tích để chiếu qua đám hơi nguyên tử tự do Nguồnphát tia bức xạ đơn sắc phải thỏa mãn các yêu cầu sau:

+ Nguồn phát tia bức xạ đơn sắc tạo ra phải là các tia phát xạ có độ nhạy củanguyên tố phân tích Chùm tia phát xạ phải có cường độ (I0) ổn định, lặp lại trong

nhiều lần đo khác nhau trong cùng điều kiện và phải điều chỉnh được để có cường

độ cần thiết cho mỗi phép đo

+ Nguồn phát bức xạ phải tạo ra được chùm tia phát xạ thuần khiết, chỉ bao gồmmột số vạch của nguyên tố phân tích Phổ nền của nó phải không đáng kể

+ Nguồn phát tia bức xạ phải tạo ra được chùm sáng có cường độ cao, nhưngphải bền theo thời gian và không bị các yếu tố vật lý khác gây nhiễu, không bị ảnhhưởng bởi các dao động của điều kiện làm việc Ngoài ra không quá đắc và khôngquá phức tạp khi sử dụng

Quá trình ghi đo gồm hệ thống phân ly ánh sáng sau khi bị hấp thụ, detector, bộkhuếch đại và ghi đo

Nhờ một hệ thống máy quang phổ, người ta thu, phân ly và chọn vạch hấp thụnguyên tử một nguyên tố cần nghiên cứu để đo cường độ của nó Cường độ đóchính là tín hiệu hấp thụ của vạch phổ Trong một giới hạn nhất định của nồng độ,giá trị cường độ này là phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ C của nguyên tố trongmẫu phân tích Cường độ của các vạch hấp thụ sau khi được detector ghi nhận vàkhuếch đại sẽ được đưa sang hệ thống chỉ thị, ở đây nó được khuếch đại tiếp vàđược xử lý để có được cường độ thực của vạch phổ hấp thụ

2.2.3.2 Trang bị của máy quang phổ hấp thụ nguyên tử

Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử gồm các bộ phận chính sau:

- Nguồn phát tia bức xạ cộng hưởng của nguyên tố cần phân tích: Là nguồn tạo

ra chùm bức xạ đơn sắc của nguyên tố cần phân tích, nguồn này sẽ chiếu vào đámhơi nguyên tử tự do và nó phải thỏa mãn các yêu cầu trên, thường là đèn cathodrỗng (HCL) hoặc đèn phóng điện không cực (EDL)

- Hệ thống nguyên tử hóa mẫu phân tích: Bộ phận nguyên tử hóa mẫu chuyểnmẫu từ trạng thái ban đầu thành dạng hơi của các nguyên tử tự do dưới tác dụng củanhiệt độ Đám hơi nguyên tử tự do này chính là môi trường hấp thụ bức xạ và sinh

ra phổ hấp thụ nguyên tử Có hai loại kỹ thuật nguyên tử hóa mẫu:

+ Kỹ thuật nguyên tử hóa bằng ngọn lửa, sử dụng khí C2H2 và không khí nénhoặc N2O2, gọi là F-AAS

+ Kỹ thuật nguyên tử hóa ngọn lửa, sử dụng lò đốt điện, gọi là ETA-AAS.

- Hệ quang và detector: Là hệ thống trang thiết bị để thu, phân ly, chọn lọc một

số vạch thích hợp của nguyên tố cần phân tích và ghi lại nó

- Bộ phận xử lý kết quả: Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử cho phép điều khiểnhai chế độ Một là điều khiển bằng cách sử dụng bàn phím gắn trên máy tính Hai làđiều khiển thông số qua phần mềm được cài đặt trong máy tính kết nối với máyAAS

Hình 2.13 Sơ đồ máy quang phổ hấp thụ nguyên tử

2.2.3.3 Ưu, nhược điểm của phép đo phổ hấp thụ nguyên tử

* Ưu điểm

Phép đo phổ hấp thụ phân tử có độ nhạy và độ chính xác cao Trên nguyên tốhóa học có thể xác định được bằng phương pháp này với độ 10-4 – 10-5% Có thể đạttới 10-7% với kỹ thuật không ngọn lửa

Điều kiện thực hiện tương đối dễ, có thể dùng cho tất cả các phòng thí nghiệmnhỏ và vừa Có thể xác định liên tiếp nhiều nguyên tố trong cùng một mẫu Kết quảphân tích ổn định, sai số nhỏ

* Nhược điểm

Chỉ cho biết thành phần nguyên tố của chất phân tích có trong mẫu phân tích,

mà không chỉ ra được trạng thái liên kết, cấu trúc nguyên tố

2.2.4 Sắc ký, sắc ký khí (GC), sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS)

2.2.4.1 Sắc ký

Sắc ký là một kỹ thuật vật lí và hóa lí để tách và phân tích các chất trong mộthỗn hợp Cơ sở của quá trình sắc ký là các quá trình xảy ra trong cột tách khi mẫuđược nạp vào cột sắc ký Để thực hiện quá trình sắc ký có hai pha:

+ Pha động: Chất phân tích và dung môi thích hợp.

+ Pha tĩnh: thường ở dạng rắn hay lỏng, dưới dạng màng mỏng bám đều trên bề

mặt chất mang trơ chứa trong cột sắc ký

Quá trình sắc ký xảy ra trong cột chính là quá trình tương tác giữa chất phân tích

và pha tĩnh nằm trong cột Quá trình tương tác đó có thể theo các tính chất hóa línhất định, đó là sự hấp phụ, trao đổi, phân bố, rây phân tử Tương ứng ta có tên gọicác phương pháp sắc ký: sắc ký hấp phụ dựa vào tính chất hấp phụ chất phân tíchlên bề mặt pha tĩnh, sắc ký trao đổi dựa vào sự trao đổi ion cùng dấu giữa chất phântích với pha tĩnh, sắc ký phân bố dựa vào sự phân bố của chất phân tích lên phatĩnh…

Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký là quá trình sắc ký được lặp đi lặp lạinhiều lần, có thể xảy ra trên giấy, trên bản mỏng, trên cột Do vậy, khả năng táchhoàn toàn và phân tích định lượng tương đối chính xác

2.2.4.2 Sắc ký khí (GC)

Sắc ký khí là một trong những phương pháp quan trọng nhất hiện nay dùng đểtách, định lượng, xác định cấu trúc các chất, đặc biệt có ý nghĩa quan trọng trongnghiên cứu các hợp chất hữu cơ

Pha động trong GC là chất khí nên chất phân tích cũng phải được hóa hơi để đưavào cột sắc ký

Pha tĩnh có thể là chất rắn được nhồi vào cột hay 1 màng phim mỏng bám trên

bề mặt chất mang trơ, hoặc có thể tạo thành một màng mỏng bám lên mặt trong củathành cột (cột mao quản)

Tùy thuộc vào bản chất pha tĩnh ta chia thành hai loại sắc ký khí:

+ Sắc ký khí rắn (gas soild chromatography – GSC): chất phân tích được hấpphụ trực tiếp trên pha tĩnh là các tiểu phân rắn

+ Sắc ký khí lỏng (gas liquid chromatography – GLC): Pha tĩnh là một chất lỏngkhông bay hơi

Phương pháp này chỉ được giới hạn với chất có thể bốc hơi mà không bị phânhủy hay là trong khi phân hủy cho sản phẩm phân hủy xác định dưới thể hơi

Có hai loại kỹ thuật phân tích:

+ Giữa cho nhiệt độ không đổi trong suốt quá trình phân tích, phương pháp nàykhó tách hoàn toàn

+ Thay đổi nhiệt độ trong quá trình phân tích, phương pháp này tuy tốn thời giannhưng triệt để

Cấu tạo máy sắc ký khí

* Hệ thống cung cấp khí mang

Khí mang phải trơ về mặt hóa học như He, Ar, N2, CO2, H2 và lựa chọn khímang quyết định bởi detector sử dụng Hệ thống cung cấp khí mang bao gồm các bộđiều chỉnh áp suất, thiết bị đo áp suất, thiết bị đo tốc độ dòng Hệ thống khí mangcòn chứa hệ thống lọc phân tử để tách nước và chất nhiễm bẩn khác Độ tinh khiếtcủa khí phải đạt 99.95% Có thể sử dụng bình chứa khí hoặc các thiết bị sinh khí(thiết bị tách khí N2 từ không khí, thiết bị cung cấp khí H2 từ nước cất,…)

* Hệ thống tiêm mẫu

Cách thông dụng nhất để đưa mẫu vào cột là sử dụng một bơm tiêm mẫu vilượng để tiêm mẫu lỏng hoặc khí qua một đệm cao su silicon chịu nhiệt vào buồnghóa hơi Lượng mẫu bơm vào thay đổi từ 0.1-10 μl đối với cột mao quản, cột nhồil đối với cột mao quản, cột nhồilượng mẫu bơm vào có thể lớn hơn

Có 2 cách đưa mẫu vào cột: bằng tiêm mẫu thủ công hoặc tiêm mẫu tự động

* Lò cột và cột phân tích

Lò cột làm nhiệm vụ điều nhiệt cho cột sắc ký

Có 2 loại cột: cột nhồi và cột mao quản

- Cột nhồi: cột thường được làm bằng thép không rỉ, niken, thủy tinh với đườngkính 3-6 mm và chiều dài từ 1-5 m chứa các hạt chất mang rắn được phủ pha tĩnhlỏng hoặc bản thân hạt rắn là pha tĩnh được nhồi vào cột Cột nhồi thường có hiệuquả tách thấp, tuy nhiên có hệ số lưu giữ cao, dung lượng mẫu lớn

- Cột mao quản: được chế tạo từ thủy tinh oxit tinh khiết nấu chảy, có mức độliên kết cao nên bền và chịu được nhiệt độ cao đến 350°C, cột có đường kính trong0.1-0.5 mm và chiều dài 30-100 m, pha tĩnh là một lớp phim mỏng lỏng dày khoảng

từ 0.1-5 μl đối với cột mao quản, cột nhồim phủ thành trong cột hoặc các chất mang rắn phủ một lớp pha tĩnh mỏngđược gắn trên bề mặt bên trong của cột hoặc một pha tĩnh xốp của chất hấp phụ hayrây phân tử

* Đầu dò

Đầu dò dùng phát hiện tín hiệu để định tính và định lượng các chất cần phântích Có nhiều loại đầu dò khác nhau tùy theo mục đích phân tích như đầu dò ionhóa ngọn lửa, đầu dò dẫn nhiệt, đầu dò cộng kết điện tử, đầu dò quang hóa ngọnlửa, đầu dò khối phổ

* Bộ phân ghi nhận tín hiệu

Bộ phận này ghi tín hiệu do đầu dò phát hiện Đối với các hệ thống sắc ký hiệnđại, phần này được phần mềm trong hệ thống ghi nhận, lưu các thông số, sắc ký đồ,các thông số liên quan đến pic như tính đối xứng, hệ số phân giải,… đồng thời tínhtoán, xử lý các thông số liên quan đến kết quả phân tích

Hình 2.14 Sơ đồ thu gọn của thiết bị sắc ký khí

* Nguyên tắc hoạt đông

Nhờ có khí mang chứa trong bom khí (hoặc máy phát khí), mẫu từ buồng bayhơi được dẫn vào cột tách nằm trong buồng điều nhiệt Quá trình sắc ký xảy ra tạiđây Sau khi rời khỏi cột tách tại các thời điểm khác nhau, các cấu tử lần lượt đi vàodetector, tại đó chúng được chuyển thành tín hiệu điện Tín hiệu này được khuếchđại rồi chuyển sang bộ phận in và lưu kết quả (bộ hiện số, máy in hoặc máy ghi)

Trên sắc ký đồ nhận được, sẽ có tín hiệu ứng với các cấu tử được tách gọi là pic.Thời gian lưu của pic là đại lượng đặc trưng cho chất cần phân tích Diện tích pic làthước đo định lượng cho từng chất trong hỗn hợp cần nghiên cứu.

2.2.4.3 Khối phổ (MS)

* Nguyên tắc hoạt động

Dựa vào chất nghiên cứu được ion hóa trong pha khí hoặc pha ngưng tụ dướichân không bằng những phương pháp thích hợp thành những ion (ion phân tử, ionmảnh…) có số khối khác nhau, sau đó các ion này được phân tách thành những dãyion theo cùng số khối m (chính xác là theo cũng tỉ số khối trên diện tích ion, m/e) vàxác xuất có mặt của mỗi dãy ion có cùng tỉ số m/e được ghi trên đồ thị có trục tung

là xác xuất có mặt (hay cường độ vạch), trục hoành là tỉ số m/e gọi là khối phổ đồ.Phổ khối lượng được ghi lại dưới dạng vạch hay bảng, trong đó cường độ caonhất gọi là đỉnh cơ sở Đỉnh ion phân tử thường là đỉnh cao nhất, tương đương vớikhối lượng phân tử của hợp chất khảo sát

Phổ khối lượng không những cho phép xác định chính xác phân tử lượng mà căn

cứ vào các mảnh phân tử được tạo thành ta cũng suy ra được cấu trúc phân tử Xácđịnh tạo thành mảnh phụ thuộc vào cường độ liên kết tương ứng trong phân tử cũngnhư vào khả năng bền hóa các mảnh tạo thành nhờ các hiệu ứng khác nhau Cácmảnh có độ bền lớn hơn sẽ ưu tiên tạo thành, các liên kết yếu dễ bị đứt nhất Cónhững mảnh có khối lượng đặc trưng gọi là mảnh chìa khóa, chúng cho phép phântích các phổ khối lượng dễ dàng

Hai bộ phận này được ghép với nhau qua bộ kết nối với mục đích loại bớt khímang như hidro, heli để giảm áp suất của dòng khí mang và phân tử mẫu chất đivào buồng ion hóa của khối phổ.

Phần thiết bị sắc ký khí dùng mao quản, phần khối phổ sử dụng buồng ion hóavới bộ tách từ cực detector khối phổ

Hình 2.15 Sơ đồ thiết bị sắc ký khí ghép khối phổ Nguyên lí hoạt động của máy sắc ký khí ghép khối phổ

Dung môi chứa hỗn hợp các chất sẽ được tiêm vào hệ thống tại cửa tiêm mẫu.Mẫu sau đó được dẫn qua hệ thống bởi khí trơ, thường là heli, nhiệt độ ở cửa tiêmmẫu sẽ được nâng lên 300oC để mẫu trở thành dạng khí Phần vỏ ngoài của hệ thống

GC chính là một lò đặc biệt Nhiệt độ của lò này dao động từ 40oC đến 320oC Bêntrong hệ thống GC là một cuộn ống nhỏ hình trụ có chiều dài 30 m với mặt trongđược tráng bằng một loại polime đặc biệt Các chất trong hỗn hợp được phân táchbằng cách chạy dọc theo cột này

Sau khi đi qua cột sắc ký khí, các chất tiếp tục đi vào pha khối phổ, ở đây chúng

bị ion hóa, sau đó sẽ tới bộ phận lọc detector Dựa trên khối lượng, bộ lọc lựa chọnchỉ cho phép các hạt có khối lượng nằm trong một giới hạn nhất định đi qua Thiết

bị cảm ứng có nhiệm vụ đếm số lượng các hạt có cùng khối lượng Thông tin nàysau đó được chuyển đến máy tính và xuất ra kết quả gọi là phổ khối Phổ khối làmột phổ đồ phản ánh các ion với khối lượng khác nhau đi qua bộ phận lọc Máytính là bộ phận chịu trách nhiệm tính toán các tín hiệu do bộ cảm biến cung cấp vàđưa ra kết quả khối phổ

So sánh kết quả khối phổ thu được trong thí nghiệm với một thư viện phổ củacác chất đã được xác định trước Nếu tìm được chất tương ứng trong thư viện thì cóthể định danh được chất đó Nếu phép so sánh không tìm được kết quả tương ứngthì có thêm được một một dữ kiện mới và đóng góp vào thư viện cấu trúc sau khitiến hành thêm các biện pháp để xác định được chính xác loại hợp chất mới này.

2.2.5 Phương pháp thăm dò khả năng kháng vi sinh vật

2.2.5.1 Chuẩn bị dịch chiết

Tiến hành chưng ninh 10 gam mẫu bột lá (bột hạt) chùm ngây trong 120 ml cácdung môi: n-hexan, diclometan, etyl axetat, ethanol ở nhiệt độ 49oC trong vòng 24giờ Sau chưng ninh, lọc dịch chiết và cô quay còn 10 ml, thu được dịch chiết bột lá(bột hạt) chùm ngây trong các dung môi Dịch chiết được thăm dò khả năng kháng

vi sinh vật với hai chủng vi khuẩn Bacillus subtilis, vi khuẩn Escherichia coli bằngphương pháp đục lỗ thạch

2.2.5.2 Môi trường thạch dùng để thăm dò khả năng kháng vi sinh vật

Môi trường pha để nấu thạch gồm:

119oC trong 20 phút

2.2.5.3 Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật

Hoạt tính kháng vi sinh vật được xác định bằng phương pháp đục lỗ Phươngpháp như sau:

Môi trường sau khi được pha và hấp khử trùng, cho vào mỗi đĩa petri có đáyphẳng đã được rửa sạch, sấy khô và đặt lên bề mặt thật phẳng để thạch có bề dàyđồng nhất, khoảng 4 mm Thể tích môi trường khoảng 25 ml/ đĩa Để nguội ở nhiệt

độ phòng Sau khi môi trường đã đông cứng, tiến hành đục lỗ thạch Sau đó, dùngque cấy trang vô khuẩn, trang đều khuẩn lên bề mặt thạch

Dịch chiết được nhỏ vào các lỗ đã đục, sau đó mang các đĩa thạch giữ trong tủ

ấm ở 37oC Sau 24 giờ, quan sát vòng kháng khuẩn tạo thành

Quá trình được tiến hành trong tủ cấy vô trùng

2.3 SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm

Bột lá (hạt) chùm ngây

Chiết soxhlet bằng các dung môi

Xử lí sơ bộ, xay mịn

Chiết bằng

n- hexan

Chiết bằng ethanol

Dịch chiếtEthanol (lá, hạt)

Dịch chiết diclometan (lá, hạt)

Chiết bằng etyl axetat

Dịch chiếtEtyl axetat (lá, hạt)

Chiết bằng diclometan

Thăm dò hoạt tính kháng sinh

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ TIÊU HÓA LÝ VÀ ĐIỀU KIỆN CHIẾT XUẤT

3.1.1 Xác định các thông số hóa lý của nguyên liệu

m1: Khối lượng cốc (gam)

m: Khối lượng mẫu bột ban đầu (gam)

m2: Khối lượng cốc và mẫu bột sau khi sấy (gam)

ω: Độ ẩm của mỗi mẫu (%)