Nghiên cứu định lượng levetiracetam trong huyết tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Dựa trên điều kiện trang thiết bị hiện có và tham khảo tài liệu [13] [14] [16] [22], chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu định lượng Levetiracetam trong huyết tương người bằng phươ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016

Mã sinh viên: 1101288

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG

LEVETIRACETAM TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học tôi đã được Ban giám hiệu nhà trường và các thầy, cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội tận tình giảng dạy và giúp đỡ trong suốt quá trình học tập tại trường Sau một thời gian thực hiện đề tài với rất nhiều nỗ lực và cố gắng, khi khóa luận này được hoàn thành là lúc tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình tới những người đã quan tâm, hướng dẫn

và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận

Trước tiên, với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin trân trọng gửi lời cảm

ơn tới PGS.TS Nguyễn Tường Vy và Ths Tạ Mạnh Hùng- Giám đốc Trung tâm

Đánh giá Tương đương sinh học - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, là những người đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi chân thành cảm ơn Ban Giám đốc - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương

và Trung tâm Đánh giá Tương đương sinh học - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương đã tạo điều kiện cho tôi được thực hiện đề tài tại đây Tôi xin tỏ lòng

biết ơn đến toàn thể các anh, chị trong Trung tâm Đánh giá Tương đương sinh học

đã tạo điều kiện giúp đỡ, luôn tận tình giải đáp những thắc mắc trong công việc và

đã hết lòng giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới những người thân trong gia đình tôi, cùng toàn thể bạn

bè, những người luôn sát cánh, chia sẻ, động viên và giúp đỡ tôi trong quá trình học

tập và nghiên cứu

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2016

MỤC LỤC

Trang

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ……… 3

1.1.LEVETIRACETAM ……… 3

1.1.1 Công thức cấu tạo và tính chất lý hóa……… 3

1.1.2 Tác dụng dược lý và dược động học……… 4

1.1.3 Chỉ định - chống chỉ định……… 4

1.1.4 Một số chế phẩm trên thị trường……… 5

1.1.5 Các phương pháp định lượng Levetiracetam……… 5

1.2 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO……… 7

1.2.1 Khái niệm……… 7

1.2.2 Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC……… 8

1.2.3 Một số thông số cơ bản của quá trình sắc ký……… 8

1.2.4 Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký……… 11

1.2.5 Phương pháp định lượng bằng HPLC……… 14

1.3 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRONG DỊCH SINH HỌC 15 1.3.1 Khái niệm……… 15

1.3.2 Các chỉ tiêu thẩm định……… 15

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ - NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 DI ỄN ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR ẦN H ƯNG ĐẠ O TP.QUY NH ƠN www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com Di ễn đà n hỗ tr ợ giáo dụ c : Đ /C 1000B Tr ần H ư ng Đ ạo Tp Quy Nh ơn

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU 19

2.1.1 Nguyên liệu, hóa chất, dung môi……… 19

2.1.2 Dụng cụ, máy móc, thiết bị……… 20

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU……… 20

2.2.1 Xây dựng phương pháp HPLC định lượng LEVET trong huyết tương……… 20

2.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích……… 21

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… 21

2.3.1 Chuẩn bị mẫu huyết tương tự tạo chứa LEVET……… 21

2.3.2 Xây dựng phương pháp phân tích……… 22

2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích……… 23

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 28 3.1 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG LEVET TRONG HT 28 3.1.1 Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký và nội chuẩn……… 28

3.1.2 Khảo sát và lựa chọn điều kiện tách chiết Levetiracetam 32

3.1.3 Quy trình phân tích Levetiracetam trong huyết tương……… 33

3.2 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 34

3.2.1 Tính chọn lọc - đặc hiệu 34

3.2.2 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính 36

3.2.3 Giới hạn định lượng dưới (LLOQ) 36

3.2.4 Độ đúng - Độ chính xác……… 37

3.2.5 Tỷ lệ thu hồi 38

3.2.6 Độ ổn định của hoạt chất trong HT……… 39

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44

4.1 KẾT LUẬN 44

4.2 KIẾN NGHỊ ……… 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO DI ỄN ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR ẦN H ƯNG ĐẠ O TP.QUY NH ƠN www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com Di ễn đà n hỗ tr ợ giáo dụ c : Đ /C 1000B Tr ần H ư ng Đ ạo Tp Quy Nh ơn

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

(High Performance Liquid Chromatography)

(High Quality ControlSample)

(Liquid Chromatography Mass Spectrometry)

(Lower Quality Control sample)

(The United States Food and Drug Administration)

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

ĐẶT VẤN ĐỀ

Động kinh là một tình trạng bệnh lý của não do nhiều nguyên nhân khác nhau gây ra với bệnh cảnh rất phức tạp và đa dạng Bệnh này có thể gặp ở mọi tuổi, mọi giới Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tỷ lệ người mắc bệnh động kinh trên thế giới khoảng 0,5% dân số, thay đổi tùy theo từng quốc gia, từng vùng, từng dân tộc Tại Việt Nam khoảng 2% dân số mắc bệnh và trong đó có đến 60% số bệnh nhân là trẻ em [8] [9] [12] [17] Tổ chức Y tế thế giới WHO và Liên đoàn Quốc tế chống động kinh ILAE (International League Against Epilepsy) xác định:

“Động kinh là tình trạng tái diễn ít nhất hai cơn động kinh trở lên cách nhau trên 24 giờ, không phải do sốt cao và các nguyên nhân cấp tính khác như các rối loạn chuyển hóa, ngừng thuốc hay rượu đột ngột gây nên” [17] [23].Bệnh động kinh đang được xem là vấn đề thời sự với chuyên ngành tâm thần thần kinh Mặc dù là một nhóm bệnh lý rất nặng của hệ thần kinh nói chung, của não nói riêng, tuy nhiên nếu điều trị sớm và phù hợp, số trường hợp khỏi bệnh chiếm tỷ lệ cao [1] [4] [8]

Trên thế giới, động kinh có thể được điều trị bằng bằng thuốc kháng động kinh hoặc phẫu thuật đối với một số cá thể [12] Tại Việt Nam số lượng bệnh nhân động kinh được điều trị thành công bằng phương pháp phẫu thuật còn rất ít, hầu hết phải dùng thuốc kháng động kinh kéo dài

điều trị bệnh động kinh có hiệu quả và mới được Cơ quan quản lý Thuốc và thực phẩm Mỹ (US-FDA) cấp phép đăng ký lưu hành năm 2008 Levetiracetam (LEVET) có cấu trúc hóa học không giống với các thuốc điều trị động kinh khác hiện có và là thuốc chống co giật mới trên thị trường Dược phẩm Việt Nam nên chi phí điều trị hiện tương đối cao Để giảm gánh nặng điều trị cho bệnh nhân và cộng đồng, một số doanh nghiệp dược trong nước đã và đang nghiên cứu sản xuất các thuốc generic chứa dược chất LEVET Vì vậy, nhu cầu nghiên cứu về sinh khả dụng

và tương đương sinh học các thuốc này là cần thiết để chứng minh các thuốc

generic có hiệu quả điều trị tương đương với thuốc biệt dược gốc Dựa trên điều kiện trang thiết bị hiện có và tham khảo tài liệu [13] [14] [16] [22], chúng tôi đã tiến

hành đề tài: “Nghiên cứu định lượng Levetiracetam trong huyết tương người bằng phương pháp sắc kỷ lỏng hiệu năng cao” với mục tiêu xây dựng một phương

pháp phân tích LEVET trong huyết tương có đủ độ nhạy, độ chính xác và phù hợp cho các nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng (SKD) và tương đương sinh học (TĐSH) các thuốc chứa hoạt chất levetiracetam Để đạt được mục tiêu này, đề tài thực hiện các nội dung:

1 Khảo sát, xây dựng phương pháp định lượng levetiracetam trong huyết tươngbằng phương pháp HPLC

2 Thẩm định phương pháp xây dựng theo quy định của US-FDA

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 LEVETIRACETAM 1.1.1 Công thức cấu tạo và tính chất lý hóa

1.1.1.1 Công thức cấu tạo

- Khối lượng phân tử: 171,19372 g/mol

- Tên khoa học: (-)-(S)-α-Ethyl-2-oxo-1-pyrrolidin acetamid [21]

Công thức cấu tạo của LEVET được trình bày ở Hình 1.1

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của levetiracetam [21]

1.1.1.2 Tính chất hóa lý

- Levetiracetam là chất bột, màu trắng đến trắng tinh, không mùi, vị đắng

- Độ tan: Tan nhiều trong nước (104,0 g/100 mL), dễ tan trong cloroform (65,3 g/100 mL) và methanol (53,6 g/mL), tan trong ethanol (16,5 g/mL), ít tan trong acetonitril (5,7 g/100 mL) và thực tế không tan trong n-hexan [18]

của LEVET chưa được biết rõ Ở động vật, LEVET không bảo vệ chống lại được cơn co giật đơn độc do dòng điện hoặc hóa chất Thuốc chỉ bảo vệ rất ít kích thích dưới mức tối đa và các test ngưỡng, nhưng bảo vệ được cơn co giật toàn thể thứ phát sau co giật cục bộ do hai hóa chất gây co giật tạo ra, có những đặc tính giống như phức hợp co giật cục bộ thứ phát toàn thể ở người LEVET cũng có đặc tính ức chế ở mô hình chuột đã được làm giảm ngưỡng kích thích, tương tự người bị cơn động kinh cục bộ phức hợp

LEVET không có ái lực với các thụ thể benzodiazepin, acid gama-aminobutyric (GABA), glycin hay N-methyl-D-aspartat (NMDA) Thuốc tác dụng thông qua một

vị trí gắn đặc hiệu của mô não, đó là protein 2A của túi synap (protein SV2A) Sự gắn kết này có thể hồi phục, bão hòa và có tính chất chọn lọc lập thể LEVET chỉ gắn khu trú vào màng tế bào synap ở hệ TKTW mà không gắn vào các mô ngoại vi

LEVET ức chế sự bùng phát nhưng không ảnh hưởng tới kích thích thần kinh bình thường, vì thế thuốc ngăn ngừa có chọn lọc tính đồng bộ quá mức của sự bùng phát dạng động kinh và sự lan truyền của cơn động kinh [2]

1.1.2.2 Dược động học

Khi dùng đường uống, thuốc nhanh chóng hấp thụ từ ống tiêu hóa với sinh khả dụng xấp xỉ 100%, nồng độ tối đa trong máu thường đạt được trong vòng 1,3 giờ và trạng thái cân bằng đạt được sau 2 ngày Tỉ lệ thuốc liên kết protein huyết tương thấp, ít hơn 10% Thể tích phân bố khoảng 0,7 lít/kg Khoảng 25% liều dùng được hydroxy hóa thành chất chuyển hóa không có hoạt tính LEVET không có ái lực cao với các CYP isoenzym và cũng không ức chế các isoenzym này Khoảng 95% liều dùng được thải trừ qua nước tiểu dưới dạng nguyên vẹn ban đầu và chất chuyển hóa Nửa đời thải trừ huyết tương của LEVET khoảng 6-8 giờ ở người lớn và trẻ em trên 12 tuổi, có thể ngắn hơn ở trẻ nhỏ LEVET được bài xuất qua sữa mẹ, thuốc có thể được thải trừ ra khỏi cơ thể nhờ thẩm tách máu [2]

Levetiracetam là một dẫn chất tương tự piracetam, được sử dụng trong điều trị động kinh LEVET dùng phối hợp với các thuốc khác để:

toàn thể thứ phát ở người lớn và trẻ em từ 1 tháng tuổi trở lên

bị bệnh động kinh rung giật cơ thiếu niên

em từ 12 tuổi trở lên bị bệnh động kinh toàn thể tiên phát

Ngoài ra, LEVET có thể được sử dụng đơn độc trong điều trị cơn động kinh cục

bộ, có hoặc không kết hợp với cơn động kinh toàn thể thứ phát ở người lớn và trẻ

em từ 16 tuổi trở lên [2]

1.1.3.2 Chống chỉ định

Quá mẫn với LEVET hoặc các dẫn chất của pyrolidon [2]

1.1.4 Một số chế phẩm trên thị trường

Các chế phẩm LEVET trên thị trường chủ yếu dùng ở dạng viên nén hàm lượng

250, 500, 750 hoặc 1000 mg; viên nén giải phóng kéo dài: 500, 750 mg; dung dịch uống 100 mg/mL (chai 150 mL, 300 mL); dung dịch pha truyền 100 mg/mL x 5 mL [2] Theo thống kê của Cục Quản lý dược và Tổng công ty dược Việt Nam hiện trên thị trường dược phẩm Việt Nam có hơn 50 sản phẩm thuốc chứa hoạt chất LEVET, toàn bộ các sản phẩm này đều chưa có số liệu chứng minh TĐSH với thuốc biệt dược gốc Keppra do công ty U.C.B Co., Ltd - Nhật Bản sản xuất [24]

1.1.5 Các phương pháp định lượng Levetiracetam

Trong công thức cấu tạo của LEVET không có vòng thơm hay các nối đôi liên hợp, chỉ có một số dị tố (N, O), nên hấp thụ UV-VIS kém và không có phổ huỳnh quang Do vậy, định lượng LEVET trong huyết tương bằng phương pháp HPLC với các detector phổ dụng như UV hoặc huỳnh quang gặp nhiều khó khăn Hiện nay, để định lượng LEVET trong dịch sinh học đa số các tác giả sử dụng phương pháp sắc

ký lỏng khối phổ (LC-MS) Tuy vậy, phương pháp LCMS kỹ thuật phân tích phức tạp, thiết bị phân tích có giá trị kinh tế cao không phổ biến tại nhiều phòng thí

nghiệm ở nước ta Do vậy, khó có thể áp dụng được Một số phương pháp HPLC định lượng LEVET trong dịch sinh học đã được công bố tuy nhiên có độ nhạy không cao, không áp dụng được cho các nghiên cứu SKD/TĐSH thuốc LEVET

Một số phương pháp định lượng LEVET trong HT người được trình bày ở Bảng 1.1

Bảng 1.1 Một số nghiên cứu định lượng LEVET trong HT người

Phương pháp xử lý mẫu Điều kiện sắc ký TLTK

Chiết lỏng - lỏng bằng

ethylacetat

- Pha động: Acetonitril : nước, tỷ lệ 20 : 80

- Chuẩn nội: Lamivudin

detector khối phổ (UPLC-MS) có độ nhạy cao, thời gian phân tích ngắn (thời

gian lưu của LEVET là 0,8 phút và IS là 1,2 phút) thích hợp cho các nghiên cứu DĐH của LEVET Tuy nhiên phương pháp UPLC-MS hiện nay chỉ có thể thực hiện được tại một số ít phòng thí nghiệm hiện đại vì thiết bị phức tạp

và chi phí phân tích cao Do thiết bị phân tích không phổ biến nên chúng tôi không lựa chọn phương pháp này để định lượng LEVET trong HT người

đối phức tạp gồm 2 kỹ thuật tủa protein với acid và chiết lỏng - lỏng bằng cyclohexan Tuy vậy, giới hạn định lượng của phương pháp không cao (1,0 µg/mL) không phù hợp để định lượng LEVET trong HT người tham gia các nghiên cứu SKD/TĐSH

lượng tốt (khoảng 0,1 µg/mL) tuy nhiên phương pháp xử lý mẫu rất phức tạp gồm hai bước tủa protein với hỗn hợp dung môi MeOH, acid perchloric và muối kẽm sulphat sau đó tiếp tục chiết SPE để loại tạp Kỹ thuật chiết SPE có chi phí cao khó áp dụng tạo các phòng thí nghiệm của nước ta

Dựa trên sự tham khảo các tài liệu đã được công bố và dựa vào tính chất lý hóa của LEVET, chúng tôi dự kiến xây dựng phương pháp định lượng LEVET trong

HT bằng phương pháp HPLC với detector UV-VIS bằng cách cải tiến các phương pháp HPLC đã được công bố của các tác giả Phương pháp xây dựng sử dụng chất nội chuẩn phù hợp đáp ứng yêu cầu độ đúng, độ chính xác cao của phương pháp phân tích trong dịch sinh học, dễ thực hiện với điều kiện hiện có tại các phòng kiểm nghiệm của Việt Nam

1.2 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 1.2.1 Khái niệm

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng ở áp suất cao Pha tĩnh có thể là chất rắn được bao trên bề mặt một chất mang rắn, hoặc là chất mang rắn đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các

nhóm hữu cơ Quá trình sắc ký xảy ra theo cơ chế: Hấp phụ, phân tán, trao đổi ion, loại cỡ hay tương tác hóa học trên bề mặt [5], [7]

1.2.2 Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC

1.2.2.1 Hệ thống bơm

Để bơm pha động vào cột sắc ký, bơm này phải điều chỉnh được điều chỉnh được

áp suất (thường 0-400 bar) để đẩy pha động qua hệ thống với một tốc độ dòng ổn định, phù hợp với quá trình sắc ký

1.2.2.2 Bình chứa dung môi và hệ thống xử lí dung môi

Bình chứa dung môi thường bằng thủy tinh, đôi khi bằng thép không gỉ Dung môi cần được lọc loại các hạt (thường dùng màng lọc cỡ lỗ 0,45µm) và đuổi khí hòa tan trong dung môi (thường dùng máy siêu âm đuổi khí)

1.2.2.3 Bộ phận tiêm mẫu

Để đưa mẫu phân tích vào cột có thể tiêm mẫu bằng tay hay tiêm mẫu bằng hệ thống tiêm mẫu tự động Thể tích tiêm được xác định nhờ vòng chứa mẫu (tiêm tay) hay microsyringe tiêm trong hệ tiêm mẫu tự động

1.2.2.4 Cột sắc ký

Cột là bộ phận có thể coi là quan trọng nhất của hệ thống sắc ký vì ở cột xảy ra quá trình phân tách các chất Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hóa chất, chịu được áp suất cao tới vài trăm bar

Cột có nhiều cỡ khác nhau, tùy theo mức độ và mục đích của quá trình sắc ký

Nhìn chung, các cột phân tích thường có chiều dài từ 10-25cm, đường kính 2-5mm

1.2.2.5 Bộ phận phát hiện

Là bộ phận phát hiện chất phân tích Tùy theo bản chất của các chất cần phân tích mà sử dụng detector thích hợp, hiện nay có các loại detector sau: Detector hấp thụ UV-VIS, detector phổ phát xạ nguyên tử, detector huỳnh quang [5], [7]

1.2.3 Một số thông số cơ bản của quá trình sắc ký

1.2.3.1 Thời gian lưu t R và thể tích lưu V R

*Thời gian lưu (t R ): Là thời gian cần để một chất di chuyển từ nơi tiêm mẫu qua cột

sắc ký, tới detertor và cho píc trên sắc ký đồ tính từ lúc tiêm đến lúc xuất hiện đỉnh

của píc Xác định thời gian lưu để định tính các chất trên sắc ký đồ, với một chất

Trong một phép phân tích còn có thời gian lưu hiệu chỉnh hay thời gian lưu thực

phân tích kéo dài

* Thể tích lưu (V R ): Thể tích lưu (VR) là thể tích dung môi đi qua cột cần để dichuyển chất từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho píc trên sắc ký đồ

Trên thực tế, thể tích lưu là lượng tổng cộng pha động tính từ lúc tiêm mẫu đến khi ra khỏi hệ thống [5], [7]

1.2.3.2 Hệ số phân bố K

Hệ số phân bố (K) là hệ số phân bố ở trạng thái cân bằng xác định tốc độ trung bình của mỗi vùng chất tan do pha động vận chuyển khi nó qua cột

S M

C k C



Hệ số phân bố K phụ thuộc vào: Bản chất chất tan, bản chất pha động, bản chất pha tĩnh và nhiệt độ cột.Trị số K càng lớn thì sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm [5]

1.2.3.3 Hệ số dung lượng k’

Hệ số dung lượng k’ cho biết khả năng phân bố của chất phân tích trong hai pha

và được tính theo sức chứa của cột:

Hệ số dung lượng k’ phụ thuộc: Bản chất hai pha, bản chất chất tan, nhiệt độ, đặc điểm cột, thể tích pha động và pha tĩnh Trong phân tích thường chọn cột, pha động

và các điều kiện phân tích sao cho: 1≤ k ’≤8 [5], [7]

1.2.3.4 Hệ số chọn lọc α

Đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất A và B, người ta dùng hệ số chọn lọc α :

' ( ) '

F a



Trong đó:

W: Chiều rộng của píc đo ở 1/20 chiều cao của píc

a: Khoảng cách từ chân đường vuông góc hạ từ đỉnh píc đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao píc [5], [7]

1.2.3.6 Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N

Hiệu lực cột được đo bằng thông số: Số đĩa lý thuyết N của cột:

W: Chiều rộng của píc đo ở đáy píc [5], [7]

1.2.3.7.Độ phân giải R s của cột

Là đại lượng đo mức độ tách của hai chất trên một cột sắc ký (ví dụ A và B)

1 2

Trong đó:

1.2.4 Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký

1.3.4.1 Lựa chọn pha tĩnh cho HPLC

Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột, là yếu tố quan trọng quyết định sự tách của một hỗn hợp nhiều chất Tùy vào độ phân cực của pha tĩnh và pha động sắc ký được chia thành 2 loại:

- Sắc ký pha thuận: Pha tĩnh phân cực, pha động không phân cực, chất phân tích thường là các chất phân cực hoặc là các chất có thể phân cực

- Sắc ký pha đảo: Pha tĩnh ít phân cực, pha động phân cực, chất phân tích thường

là các chất có thể phân cực hoặc ít phân cực

hợp chất cao phân tử (cellulose) hay trên mạch carbon Trong sắc ký hấp phụ pha đảo: Pha tĩnh trên nền silica (Hình 1.2) có nhiều ưu việt được sử dụng nhiều nhất

Hình 1.2 Gốc siloxan

Có thể phân loại chất nhồi cột theo gốc siloxan:

tích các chất ít hoặc không phân cực [15]

- Với R là các nhóm ít phân cực như octyl, octadecyl, phenyl, được điều chế bằng cách alkyl hóa các nhóm -OH bề mặt silica trung tính bằng các gốc alkyl (-R) của

nước được thay thế bằng các gốc -R kỵ nước nên bề mặt trở nên ít phân cực Silica

đã alkyl hóa được sử dụng trong sắc ký hấp phụ pha đảo để phân tích các chất phân cực, ít phân cực hay sắc ký tạo cặp ion [5]

Tuy vậy do hiệu ứng lập thể nên những nhóm -OH tự do chưa được thay thế trong cấu trúc của pha tĩnh có thể gây ảnh hưởng xấu đến quá trình tách sắc ký tùy theo môi trường pH phân tích Trong môi trường acid mạnh, pH < 2 thì có sự phân

ly các nhóm ether ra khỏi nền Lúc này cột sẽ mất hoạt tính dẫn đến chất cần phân tích không thể tương tác với cột Trong môi trường base (pH>7), các nhóm -OH trong cột sẽ tương tác với chất tan có tính base Tương tác này khác với kiểu tương

những đỉnh ra khác nhau hay là hiện tượng kéo đuôi làm cho việc tích phân tính diện tích hay chiều cao píc có độ chính xác không cao Một trong những cách khắc

hexametyldisizan (ít sử dụng hơn) để tương tác với nhóm -OH này Cấu trúc pha liên kết của cột LC-DB được trình bày ở hình 1.3

Hình 1.3 Cấu trúc pha tĩnh cột LC-DB

Có một cách khác để loại trừ bớt sự ảnh hưởng của nhóm -OH mà không cần tương tác với nó là thay những nhóm methyl của -Si(CH3)2-C18 bằng những nhóm thế lớn hơn như isopropyl để những nhóm này sẽ che chắn đi những nhóm -OH, được trình bày ở hình 1.4:

Hình 1.4.Cấu trúc cột có gốc Isopropyl Ngoài ra, trong một số trường hợp còn ghép lên dây C18 một số nhóm phân cực

để tăng thêm độ phân cực của dây C18 làm cột có khả năng tách chọn lọc hơn đối với những hợp chất phân cực mạnh [5] [7] [15]

1.3.4.2 Lựa chọn pha động cho HPLC

Pha động là dung môi để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột sắc ký và là yếu tố thứ hai quyết định hiệu suất phân tích của một hỗn hợp Trong sắc ký pha đảo, pha động là dung môi phân cực như: Nước, methanol, acetonitril… hoặc hỗn hợp của chúng Các dung môi này có thể hòa tan thêm một lượng nhỏ acid hay base hữu cơ

Pha động trong HPLC ảnh hưởng tới rất nhiều thông số của quá trình sắc ký như:

phân tích, lựa chọn pha động thích hợp là rất quan trọng

+ Yêu cầu của 1 pha động

- Trơ với pha tĩnh và bền vững theo thời gian

- Hòa tan được chất cần phân tích

- Có độ tinh khiết cao

- Nhanh đạt trạng thái cân bằng trong quá trình sắc ký

- Có tính kinh tế và không gây ô nhiễm môi trường

+ Các yếu tố quan trọng của pha động ảnh hưởng đến kết quả

- Bản chất của dung môi để pha pha động

+ Chọn đệm - pH: Trong sắc ký hấp phụ mà chất tan có tính chất acid hoặc base

thường phải sử dụng đệm ở pha động để ổn định pH cho quá trình sắc ký Giá trị pH thích hợp sẽ làm tăng hiệu lực tách của sắc ký

+Tốc độ dòng của pha động: Sau khi có pha tĩnh, pha động, pH thích hợp, để tăng

hiệu lực tách của quá trình phải chọn tốc độ pha động phù hợp, đảm bảo việc tách các chất phân tích được tốt nhất mà đạt hiệu quả cao về thời gian và kinh tế [15]

1.3.4.3 Lựa chọn Detector

Khi pha động rửa giải các chất ra khỏi cột sẽ ghi nhận bởi detector chuyển thành tín hiệu và được ghi trên SKĐ Detector phổ biến nhất là detector UV - VIS Tùy theo chất cần phân tích mà người ta đặt các bước sóng phát hiện khác nhau [15]

1.2.5.2 Phương pháp định lượng và cách tính kết quả trong HPLC

Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: Nồng

độ của chất phân tích tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích píc của nó

Có 4 phương pháp định lượng hay được sử dụng trong sắc ký: Phương pháp chuẩn ngoại, phương pháp chuẩn nội, phương pháp thêm chuẩn, phương pháp chuẩn hóa diện tích Hiện nay, phương pháp chuẩn nội được sử dụng nhiều nhất để định lượng thuốc trong huyết tương Phương pháp chuẩn nội khắc phục được những nhược điểm của phương pháp chuẩn ngoại, giúp hạn chế tối đa những sai số có thể gây ra do máy móc, kỹ thuật nhất là với những qui trình xử lý mẫu phức tạp và các mẫu có hàm lượng chất cần định lượng thấp

+ Nguyên tắc phương pháp chuẩn nội: Thêm cả vào mẫu chuẩn và mẫu thử những

lượng bằng nhau của một chất tinh khiết (chất chuẩn nội) rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện

+ Nguyên tắc lựa chọn chất nội chuẩn:

- Trong cùng điều kiện sắc ký, chất IS phải được tách hoàn toàn và có thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất cần phân tích trong mẫu thử

- Có cấu trúc hóa học tương tự như chất thử

- Có nồng độ xấp xỉ với nồng độ chất thử

- Không phản ứng với bất kỳ thành phần nào của mẫu thử

- Phải có độ tinh khiết cao và dễ kiếm

Trong phương pháp chuẩn nội có 2 phương pháp là: Chuẩn hóa 1 điểm và chuẩn hóa nhiều điểm Để chuẩn hóa nhiều điểm: Chuẩn bị một dãy chuẩn ít nhất là 5 mẫu

có nồng độ chất chuẩn khác nhau nhưng tất cả cùng chứa một lượng chuẩn nội bằng nhau.Tiến hành chạy sắc ký các mẫu, ta xây dựng đường chuẩn biểu diễn sự tương

Phân tích dược chất trong dịch sinh học là cơ sở để đánh giá SKD và TĐSH trực tiếp và chính xác nhất Mẫu sinh học thường có chứa nhiều tạp là các chất chất nội sinh (các muối vô cơ, lipid, protein và chất chuyển hóa) và sự khác nhau giữa các cá thể, lượng mẫu ít, nồng độ chất phân tích thường rất thấp Do vậy, phương pháp phân tích sinh học phải được thẩm định trước khi áp dụng vào phân tích mẫu để đảm bảo độ tin cậy [11], [19]

pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học của US-FDA và EMA [20] [25]

Tính chọn lọc - đặc hiệu được coi là đạt khi kết quả thu được trên SKĐ cho các đáp ứng píc thỏa mãn đồng thời các điều kiện sau:

- Píc của chất phân tích và IS phải đảm bảo được nhận diện rõ ràng, tách được hoàn toàn khỏi píc tạp và đáp ứng các yêu cầu: Hệ số kéo đuôi T ≤ 2,0; độ phân giải

- Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chất phân tích, đáp ứng píc của từng mẫu LLOQ phải gấp ít nhất 5 lần đáp ứng píc của mẫu trắng tương ứng

- Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của IS, đáp ứng píc của từng mẫu LLOQ phải gấp ít nhất 20 lần đáp ứng píc của mẫu trắng tương ứng

1.3.2.2 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính

Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa các đáp ứng của píc (diện tích hay chiều cao) và nồng độ chất cần phân tích trong dịch sinh học Mối quan hệ này phải được đánh giá bằng phương trình hồi quy, thu được từ phương pháp phân tích hồi quy (phương pháp bình phương nhỏ nhất)

Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ từ thấp nhất đến cao nhất trong một đường chuẩn có đáp ứng tuyến tính Đường chuẩn gồm:

1 mẫu trắng (dịch sinh học không có chuẩn và IS)

1 mẫu zero (dịch sinh học có chuẩn nội, không có chuẩn)

6 mẫu non-zero (dịch sinh học có bổ sung chuẩn và IS) có nồng độ chất chuẩn pha trong cùng một mẫu dịch sinh học, bao phủ toàn bộ dãy nồng độ mong muốn

Khoảng tuyến tính phải bao gồm toàn bộ khoảng nồng độ của các mẫu phân tích

Tính chất tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi quy: y = ax + b với hệ số tương quan tuyến tính r, thu được từ phương pháp phân tích hồi quy (phương pháp bình phương tối thiểu) Trong khoảng nồng độ cần khảo sát, đường chuẩn phải

- Độ đúng so với giá trị thực của các nồng độ phải đạt từ 85-115%, trừ tại điểm LLOQ được chấp nhận 80% -120%

- Có ít nhất 75% số điểm trong dãy chuẩn đạt được tiêu chuẩn trên, trong đó LLOQ và nồng độ cao nhất phải đạt tiêu chuẩn

- Có hệ số tương quan r ≥ 0,99

1.3.2.3 Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)

LLOQ là nồng độ thấp nhất trên đường chuẩn có thể định lượng được với độ đúng và độ chính xác chấp nhận được Do đó giá trị LLOQ thể hiện độ nhạy, độ đúng và độ chính xác của phương pháp

Mẫu được chấp nhận là LLOQ nếu thỏa mãn: Đáp ứng ở nồng độ này ít nhất phải bằng 5 lần đáp ứng của mẫu trắng Píc của chất cần phân tích có thể nhận biết, nằm tách riêng và có thể tái lập với độ đúng từ 80 - 120%

1.3.2.4 Độ đúng - độ chính xác

* Độ đúng (accuracy): Độ đúng của phương pháp phân tích là mức độ gần sát

của kết quả phân tích với giá trị thực của mẫu đã biết Giá trị này phải nằm trong khoảng 85 - 115% và 80 - 120% đối với điểm gần giới hạn định lượng dưới

* Độ chính xác (precision): Độ chính xác của phương pháp phân tích là mức độ

thống nhất giữa các kết quả riêng biệt khi quy trình được áp dụng lặp đi lặp lại nhiều lần trên cùng 1 mẫu thử đồng nhất Độ chính xác bao gồm độ lặp lại trong ngày và độ lặp lại khác ngày, được biểu thị bằng giá trị của hệ số biến thiên CV(%)

Trong đánh giá TĐSH, độ chính xác của phương pháp bao gồm độ lặp lại

(repeatability) ở những thời điểm khác nhau (trong ngày và khác ngày) và độ tái lặp (reproducibility) Phương pháp xác định độ lặp lại là thực hiện phân tích trên một

mẫu thử đồng nhất n lần (n ≥ 5) cùng một lúc và trong cùng một thời điểm hoặc khác ngày Xác định độ hệ số biến thiên CV giữa các lần thử Yêu cầu CV ≤ 15%,

riêng điểm gần giới hạn định lượng dưới cho phép CV ≤ 20%

1.3.2.5 Tỷ lệ thu hồi

Tỷ lệ thu hồi là tỷ lệ hoạt chất thu được sau khi mẫu được chiết tách theo qui trình đã chọn so với mẫu có cùng nồng độ không được xử lý qua chiết tách được pha trong dung môi phù hợp (thường sử dụng dung môi pha động) Về mặt lý thuyết, chỉ tiêu này không bắt buộc phải đánh giá Tuy nhiên, nên tiến hành đánh giá tỷ lệ thu hồi đặc biệt với các trường hợp xử lý mẫu bằng chiết lỏng - lỏng hoặc chiết pha rắn (SPE) Để xác định tỷ lệ thu hồi của phương pháp nên tiến hành trên 3 mẫu có nồng độ nằm trong khoảng đường chuẩn đã khảo sát, mỗi nồng độ tiến hành

ít nhất 3 lần Tỷ lệ thu hồi không nên vượt quá 110% và không nên quá thấp; giá trị

CV < 15% đối với mỗi nồng độ và tỷ lệ thu hồi trung bình tại mỗi nồng độ không khác nhau quá ± 15%

1.3.2.6 Độ ổn định

Độ ổn định của mẫu phân tích trong dịch sinh học cần được đánh giá trong lúc xử

lý, phân tích và bảo quản mẫu Mẫu phân tích phải đảm bảo ổn định trong thời gian

dự kiến đủ cho phân tích hết mẫu thử Do đó trong thẩm định phương pháp cần xác định các loại độ ổn định sau:

- Độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc, nội chuẩn gốc bao gồm: độ ổn định ở điều kiện nhiệt độ phòng, độ ổn định ở điều kiện bảo quản dài ngày, độ ổn định của dung dịch pha loãng (nếu có)

- Độ ổn định của mẫu huyết tương bao gồm:

+ Độ ổn định sau 3 chu kì đông - rã đông

+ Độ ổn định thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng đối với dung dịch mẫu thử sau khi đã xử lý (chiết tách)

+ Độ ổn định thời gian dài để đông lạnh của mẫu thử trong khoảng thời gian

dự định

+ Độ ổn định của mẫu sau xử lý (trong autosampler):

Độ ổn định của mẫu thử được đánh giá trên các mẫu tự tạo, bảo quản ở điều kiện lạnh ( thường ở -2 đến -8°C) [11] [19] [20]

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ - NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU 2.1.1 Nguyên liệu, hóa chất, dung môi

Các hóa chất, dung môi, mẫu huyết tương trắng dùng trong nghiên cứu được trình bày ở bảng 2.1, bảng 2.2, bảng 2.3

Bảng 2.1 Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu

Bảng 2.2 Các hóa chất dùng trong nghiên cứu

Hóa chất Độ tinh khiết Nơi sản xuất

Bảng 2.3 Các mẫu huyết tương trắng dùng trong nghiên cứu

2.1.2 Dụng cụ, máy móc, thiết bị

Các dụng cụ, máy móc, thiết bị dùng trong nghiên cứu được trình bày ở bảng 2

Bảng 2.4 Các thiết bị đã dùng trong nghiên cứu