Xây dựng phương pháp định lượng pantoprazol trong huyết tương bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Xuất phát từ yêu cầu thực tế và với mong muốn xây dựng phương pháp xác định nồng độ pantoprazol trong huyết tương nhằm phục vụ cho công tác điều trị và đánh giá tương đương sinh học các

TRẦN THỊ THÚY DIỆU

MSV: 1101077

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG PANTOPRAZOL TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016

TRẦN THỊ THÚY DIỆU

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG PANTOPRAZOL TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Bộ môn Hóa Dược - Trường Đại học Dược

Hà Nội, Trung tâm Tương đương sinh học - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương, thầy cô và các anh, các chị đã tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận

Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô, các cán bộ Trường Đại học Dược

Hà Nội, những người đã trang bị cho em rất nhiều kiến thức trong suốt quá trình học tập để em có được thành quả ngày hôm nay

Xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè - những người đã luôn ở bên động viên, cổ vũ và giúp đỡ em trong cuộc sống

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2016

Sinh viên

Trần Thị Thúy Diệu

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về Pantoprazol 2

1.1.1 Công thức hóa học 2

1.1.2 Tính chất hóa lý 2

1.1.3 Cơ chế tác dụng, dược động học, chỉ định của PAN 2

1.1.4 Một số chế phẩm trên thị trường 3

1.1.5 Một số phương pháp định lượng PAN trong dịch sinh học 4

1.2 Tổng quan về HPLC và thẩm định phương pháp định lượng thuốc trong dịch sinh học 5

1.2.1 Tổng quan về HPLC 5

1.2.2 Thẩm định phương pháp định lượng thuốc trong dịch sinh học 9

CHƯƠNG 2: ĐIỀU KIỆN THỰC NGHIỆM, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

2.1 Điều kiện thực nghiệm 11

2.2 Nội dung nghiên cứu 13

2.3 Phương pháp nghiên cứu 13

2.4 Phương pháp xử lí kết quả 19

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT 20

3.1 Kết quả xây dựng phương pháp định lượng 20

3.2 Kết quả thẩm định phương pháp phân tích 27

3.3 Bàn luận 40

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41

4.1 Kết luận 41

4.2 Kiến nghị 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO DI ỄN ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR ẦN H ƯNG ĐẠ O TP.QUY NH ƠN www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com Di ễn đà n hỗ tr ợ giáo dụ c : Đ /C 1000B Tr ần H ư ng Đ ạo Tp Quy Nh ơn

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

QC : Mẫu kiểm tra chất lượng (Quality Control Samples)

LQC : Mẫu kiểm tra nồng độ thấp (Lower Quality Control Samples) MQC : Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình (Middle Quality Control Samples)

HQC : Mẫu kiểm tra nồng độ cao (High Quality Control Samples)

MeCN : Acetonitril MeOH : Methanol SKĐ : Sắc ký đồ Cmax : Nồng độ đỉnh T1/2 : Thời gian bán thải

UV–VIS : Tử ngoại – khả kiến (Ultra violet – Visble)

US–FDA : Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ

(United States of American Food and Drug Administration) EMA : Cơ quan quản lý thuốc Châu âu (European Medicine Agency)

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.2 Một số nghiên cứu định lượng pantoprazol trong dịch sinh học 4

3.4 Kết quả thẩm định độ đúng, độ chính xác trong ngày 31

3.8 Độ ổn định dung dịch nội chuẩn trong thời gian ngắn 35 3.9 Độ ổn định dung dịch chuẩn pantoprazol gốc dài ngày 35 3.10 Độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ đông – rã 36 3.11 Độ ổn định của mẫu huyết tương ở nhiệt độ phòng trong thời gian ngắn 37 3.12 Độ ổn định của nồng độ 90 ng/mL ở nhiệt độ phòng trong thời gian

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

3.7 SKĐ của PAN và IS trong pha động MeCN: đệm phosphat pH 7,3

3.14 SKĐ mẫu huyết tương trắng chứa IS và PAN nồng độ 30 ng/ml 27

ĐẶT VẤN ĐỀ Loét dạ dày - tá tràng là bệnh khá phổ biến ở nước ta và trên thế giới Hiện nay, đây đang là bệnh đứng đầu về tỉ lệ mắc trong số các bệnh về đường tiêu hóa.

Trên thế giới, ước tính khoảng 10% dân số mắc bệnh ở mọi lứa tuổi, không phân biệt giới tính, tỉ lệ mắc bệnh ở người lớn cao hơn trẻ em và hàng năm tăng khoảng 0,2% [18] Có nhiều nhóm thuốc điều trị loét dạ dày - tá tràng như nhóm thuốc kháng acid, nhóm thuốc kháng H2, nhóm thuốc ức chế bơm proton Trong đó, nhóm thuốc ức chế bơm proton tác dụng nhanh, hiệu quả, tỷ lệ làm lành vết loét có thể đạt tới 95% sau tám tuần điều trị Thuốc ít ảnh hưởng đến khối lượng dịch vị, sự bài tiết pepsin, yếu tố nội dạ dày và sự co bóp dạ dày[1] Do đó, nhóm thuốc này được sử dụng rất nhiều trong các phác đồ điều trị loét dạ dày - tá tràng

Pantoprazol là thuốc thuộc nhóm ức chế bơm proton, thuốc dung nạp tốt, ít

để lại tác dụng phụ nên là một trong những thuốc đang được sử dụng phổ biến tại Việt Nam Để có được liều sử dụng hợp lý cho từng đối tượng bệnh nhân thì việc kiểm soát nồng độ hoạt chất này trong huyết tương là rất cần thiết Ngoài ra, việc giám sát chất lượng thuốc cũng như đánh giá tương đương sinh học thuốc chứa pantoprazol là vô cùng quan trọng nhằm nâng cao chất lượng thuốc và giúp bác sĩ lựa chọn được các thuốc an toàn, hiệu quả, kinh tế Tuy vậy, hiện nay ở nước ta vẫn chưa có một quy trình chuẩn, phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm để định lượng pantoprazol trong huyết tương

Xuất phát từ yêu cầu thực tế và với mong muốn xây dựng phương pháp xác định nồng độ pantoprazol trong huyết tương nhằm phục vụ cho công tác điều trị và đánh giá tương đương sinh học các chế phẩm chứa hoạt chất pantoprazol chúng tôi

tiến hành thực hiện đề tài : “Xây dựng phương pháp định lượng Pantoprazol trong huyết tương bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” với 2 nội dung

chính:

1 Xây dựng phương pháp định lượng pantoprazol trong huyết tương bằng phương pháp HPLC

2 Thẩm định phương pháp đã xây dựng, đề ra quy trình phân tích thường quy

để định lượng pantoprazol trong huyết tương theo tiêu chuẩn US-FDA và EMA

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ PANTOPRAZOL

1.1.1 Công thức hóa học

- Pantoprazol (PAN) có công thức phân tử : C16H14F2N3O4S

- Khối lượng phân tử : 383,37

- Công thức cấu tạo :

- Tên khoa học : 5- (Diflomethoxy) – 2 – [( 3, 4- dimethoxypyridin – 2- yl) methanesulfinyl] – 1H- 1,3 – benzodiazole [9,11,12]

1.1.2 Tính chất hóa lý

- Bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng

- Khó tan trong nước, log P = 2,18

- Rất dễ bị phân hủy trong môi trường acid, thường thấy ở dạng muối natri ngậm 1,5 phân tử nước

- Hấp thu UV do có liên kết đôi liên hợp [3,12,14]

1.1.3 Cơ chế tác dụng, dược động học, chỉ định của pantoprazol

* Cơ chế tác dụng:

Sau khi được hấp thu, PAN tích lũy trong ống tiết acid của tế bào thành dạ dày

Ở đây, nó gắn kết với nhóm sulfhydryl của hệ enzyme H+/ K+ - ATPase trên bề mặt tiết gastrin của tế bào vách, gây ra sự ức chế tiết acid cơ bản và tiết acid do kích thích PAN có thể ức chế sự tiết acid dạ dày mà không kể đến bản chất của kích thích (acetylcholin, histamin, gastrin…) [1,2,20]

dùng liều duy nhất Thức ăn làm tăng thời gian hấp thu nhưng không làm thay đổi

Cmax và diện tích dưới đường cong AUC của PAN

- Phân bố: 98% PAN gắn kết với protein huyết tương Thể tích phân bố khoảng 0,17 l/kg, phân bố chủ yếu trong dịch ngoại bào

- Chuyển hoá: PAN được chuyển hoá chủ yếu ở gan nhờ enzym CYP2C19 của cytochrom P450 để thành demethylpantoprazol

- Thải trừ: Chất chuyển hoá bài tiết chủ yếu qua nước tiểu (80%), lượng còn lại thải trừ qua mật và phân T1/2 khoảng 1 giờ và kéo dài trong suy gan, ở bệnh nhân

xơ gan là 3 - 6 giờ.Vì vậy, cần xem xét hiệu chỉnh liều cho bệnh nhân suy gan [1,2,14,20]

* Chỉ định

- Loét dạ dày - tá tràng

- Bệnh trào ngược dạ dày - thực quản

- Hội chứng tăng tiết acid (hội chứng Zollinger Ellison)

- Dự phòng loét dạ dày - tá tràng do dùng thuốc chống viêm không steroid, do stress [1,2,20]

1.1.4 Một số chế phẩm trên thị trường Các chế phẩm có chứa PAN trên thị trường chủ yếu ở dạng: bột pha tiêm truyền tĩnh mạch, viên nang tan trong ruột hàm lượng 40mg [1] Ngoài ra còn một

số dạng như viên nén, viên giải phóng kéo dài đáp ứng nhu cầu đa dạng của người

sử dụng Một số chế phẩm chứa PAN trên thị trường được trình bày cụ thể tại bảng 1.1 [19]

Bảng 1.1: Một số chế phẩm PAN trên thị trường STT Dạng bào chế Tên biệt dược H/lượng Nhà sản xuất

1 Viên nén bao tan

trong ruột

Bio-panto 40mg Biodeal Laboratories

2 Bột đông khô pha

1.1.5 Một số phương pháp định lượng pantoprazol trong dịch sinh học Hiện nay, định lượng PAN nguyên liệu có thể sử dụng phương pháp đo quang hoặc phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Định lượng PAN trong dịch sinh học có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau như HPLC, điện di mao quản, phóng xạ miễn dịch Tuy nhiên, phương pháp định lượng bằng HPLC vẫn được nhiều nghiên cứu sử dụng nhất do có nhiều ưu điểm Một số phương pháp định lượng PAN trong huyết tương bằng HPLC được trình bày ở bảng 1.2

Bảng 1.2: Một số nghiên cứu định lượng PAN trong dịch sinh học

PMS-Pantoprazol 40mg Pharmascience Inc

Điều kiện sắc ký

1 [17]

Huyết tương chó

Tủa protein bằng acetonitril

Omeprazol

Diamosil C18 (250 mm×4 mm)

Acetonitril:

10mM amoni acetat pH 6,0 Tốc độ dòng:

1ml/phút

UV,

λ 290nm

2 [6]

Huyết tương người

Tủa protein bằng acetonitril-methanol=

50:50 (v:v)

Rofecoxib

Chromasil C18 (250 mm x 4.6 mm)

Acetonitril : đệm phosphat

pH 3,15 =

42 :58 (v/v) Tốc độ dòng:

1ml/phút

UV,

λ 272nm

3 [10]

Huyết tương người

Tủa protein bằng methanol (MeOH)

Omeprazol

Diamosil ODS C18 (150mm×4,6mm)

Acetonitril:

đệm phosphat

pH 6,8 = 32:68 (v/v) Tốc độ dòng:

Nhận xét:

Phương pháp 1, 2 và 3: Xử lý mẫu bằng phương pháp tủa protein trong dung môi MeCN, MeOH đơn giản, dễ thực hiện Tuy nhiên, nền mẫu phức tạp, mẫu chưa sạch, pic của chuẩn không tách được hoàn toàn pic tạp trên sắc ký đồ, không thuận lợi cho quá trình phân tích mẫu

Ngoài ra, với phương pháp 2 dùng nội chuẩn là rofecoxib, là một thuốc NSAID cấu trúc không có nhiều điểm tương đồng với pantoprazol nên dùng làm nội chuẩn là chưa thực sự hợp lý

Dựa trên sự tham khảo các tài liệu đã được công bố và dựa vào tính chất lý hóa của PAN, chúng tôi dự kiến xây dựng phương pháp định lượng PAN trong huyết tương bằng phương pháp HPLC với detector UV-VIS có sử dụng chất nội chuẩn phù hợp đáp ứng yêu cầu độ đúng, độ chính xác cao của phương pháp phân tích trong dịch sinh học, dễ thực hiện với điều kiện hiện có tại các phòng kiểm nghiệm của Việt Nam

1.2 TỔNG QUAN VỀ HPLC VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG THUỐC TRONG DỊCH SINH HỌC

1.2.1 Tổng quan về HPLC

1.2.1.1 Khái niệm chung

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng ở áp suất cao Quá trình sắc ký xảy ra theo cơ chếphân bố [4,5]

* Pha động:

Pha động là dung môi rửa giải chất phân tích ra khỏi cột sắc ký Yêu cầu của pha động:

- Trơ với pha tĩnh và bền vững theo thời gian

- Hòa tan chất cần phân tích

- Có độ tinh khiết cao

- Nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký

- Có tính kinh tế và đảm bảo môi trường [5,16]

* Phân loại sắc ký: dựa theo độ phân cực của pha động và pha tĩnh mà chia làm

2 loại:

- Sắc ký pha thuận: Pha tĩnh phân cực, pha động là dung môi ít phân cực hơn

Trong sắc ký pha thuận thì chất ít phân cực nhất được rửa giải đầu tiên Khi tăng độ phân cực của pha động, thời gian lưu giảm dần

- Sắc ký pha đảo: Pha tĩnh không phân cực, pha động phân cực hơn Trong sắc

ký pha đảo thì các chất phân cực nhất được rửa giải đầu tiên Khi tăng độ phân cực của pha động thì thời gian lưu tăng dần [4,5]

1.2.1.2 Cấu tạo máy HPLC

Hệ thống HPLC đơn giản, bao gồm các bộ phận chính sau:

* Hệ thống cấp dung môi:

Hệ thống cấp dung môi thường bằng thủy tinh, đôi khi bằng thép không gỉ

Dung môi chạy sắc ký được lọc qua màng lọc (thường dùng màng lọc cỡ 0,45 µm)

và đuổi khí hòa tan

* Bơm:

Để bơm pha động vào cột sắc ký, bơm này phải điều chỉnh được áp suất (thường 0– 400 bar) để đẩy pha động qua hệ thống với một tốc độ dòng ổn định, phù hợp với quá trình sắc ký

* Bộ phận tiêm mẫu:

Để đưa mẫu phân tích vào cột, có thể tiêm mẫu bằng tay hay tiêm mẫu bằng

hệ thống tiêm tự động

* Cột sắc ký:

Quá trình tách các chất diễn ra ở cột Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ

với hóa chất, chịu được áp suất cao đến vài trăm bar Cột sắc ký có nhiều cỡ khác

nhau tùy thuộc vào mức độ và mục đích của quá trính sắc ký

Là bộ phận phát hiện chất phân tích Tùy theo bản chất của các chất cần phân tích mà sử dụng detector thích hợp bao gồm các loại sau: Detector hấp thụ UV - VIS, detector phổ phát xạ nguyên tử, detector huỳnh quang [4,5]

1.2.1.3 Một số thông số đặc trưng trong phân tích pic của HPLC

* Thời gian lưu t R

Là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi pic đến detector

Thời gian lưu càng lớn, chất tan càng bị lưu giữ mạnh, thời gian phân tích kéo dài Nếu tR quá nhỏ thì khả năng tách kém [4,5]

* Hệ số chọn lọc α

Đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất A và B, người ta dùng hệ số chọn lọc α :

α = = = Qui ước : Chất B là chất bị lưu giữ mạnh hơn chất A nên α >1

Để tách riêng 2 chất thường chọn 1,05 ≤ α ≤ 2,0 [4,5]

* Hệ số đối xứng của pic F

F = Trong đó: W: chiều rộng của pic đo ở 1/20 chiều cao của pic a: khoảng cách từ chân đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép

đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic [4,5]

* Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N

Hiệu lực cột được đo bằng thông số số đĩa lý thuyết N của cột:

Trong đó: W1/2 là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh pic

W là chiều rộng của pic đo ở đáy pic [4,5]

* Hệ số bất đối AF

Để đánh giá tính bất đối xứng của pic người ta dùng hệ số bất đối:

AF = Trong đó: b là nửa chiều rộng sau pic đo ở chiều cao bằng 1/10 chiều cao pic

a là nửa chiều rộng trước pic đo ở chiều cao bằng 1/10 chiều cao pic[4,5]

* Độ phân giải R s

Là đại lượng đo mức độ tách của hai chất trên một cột sắc ký (ví dụ A và B)

Trong đó:

t(R)A; t(R)B : thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (A và B)

WA; WB : độ rộng pic đo ở các đáy pic

W1/2A; W1/2B: độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic

Yêu cầu: RS > 1; giá trị tối ưu Rs = 1,5 [4,5]

1.2.1.4 Một số phương pháp định lượng bằng HPLC

Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng

độ của chất phân tích tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic Có 4 phương pháp thường được sử dụng trong sắc ký: phương pháp chuẩn ngoại, phương pháp chuẩn nội, phương pháp thêm chuẩn và phương pháp chuẩn hóa diện tích

Do đặc điểm của nền mẫu huyết tương có chứa nhiều thành phần khác nhau nên các phương pháp định lượng hoạt chất trong huyết tương thường có giai đoạn

xử lý chiết tách hoạt chất, loại bỏ các yếu tố ảnh hưởng nên gây ra rất nhiều sai số

Hiện nay, phương pháp chuẩn nội được sử dụng nhiều nhất để định lượng thuốc trong huyết tương do phương pháp này có thể hạn chế được các sai số vừa nêu trên

và các sai số gây ra do máy móc và kỹ thuật

Phương pháp chuẩn nội:

* Nguyên tắc: thêm vào cả mẫu chuẩn và mẫu thử lượng bằng nhau của một

chất tinh khiết rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện Chất được thêm này gọi là nội chuẩn

* Yêu cầu với chất nội chuẩn:

- Trong cùng điều kiện sắc ký, chất nội chuẩn phải được tách hoàn toàn và có thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất cần phân tích trong mẫu thử

- Có cấu trúc hóa học tương tự chất thử

- Có nồng độ xấp xỉ với nồng độ chất thử

- Không phản ứng với bất kỳ thành phần nào của mẫu thử

- Phải có độ tinh khiết cao và dễ kiếm

* Phương pháp chuẩn hóa nhiều điểm:

Chuẩn bị một dãy chuẩn có chứa lượng chất chuẩn khác nhau nhưng cùng chứa một lượng nội chuẩn Tiến hành sắc ký và ghi lại đáp ứng pic, từ đó vẽ đường

chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa tỷ số diện tích (chiều cao) pic của chuẩn trên nội chuẩn với tỷ số nồng độ chuẩn trên nội chuẩn Song song tiến hành sắc ký mẫu thử cũng được thêm chuẩn với lượng như trên Tính tỷ số diện tích ( chiều cao ) pic của chất thử trên diện tích ( chiều cao ) pic của chất nội chuẩn rồi dựa vào đường chuẩn tìm nồng độ của chất thử [4,5]

1.2.2 Thẩm định phương pháp định lượng thuốc trong dịch sinh học

1.2.2.1 Khái niệm

Thẩm định một phương pháp phân tích dược chất trong dịch sinh học là quá trình xác định bằng nghiên cứu trong phòng thí nghiệm những đặc điểm đặc trưng của phương pháp để đảm bảo phương pháp đó đạt yêu cầu khi ứng dụng phân tích thực tế

1.2.2.2 Một số phương pháp chiết tách thường dùng cho định lượng thuốc trong dịch sinh học

Do dịch sinh học chứa nhiều thành phần khác nhau nên khác với định lượng các dạng bào chế hay định lượng nguyên liệu, định lượng dược chất trong dịch sinh học thì khâu xử lý mẫu đóng vai trò rất quan trọng, nó có tính quyết định đến kết quả phân tích Hiện nay thường áp dụng 3 phương pháp chính để xử lí mẫu huyết tương là :

- Phương pháp chiết pha rắn: là quá trình tách chất phân tích từ mẫu bằng chất rắn, sau đó rửa giải bằng dung môi thích hợp

- Phương pháp kết tủa protein: là quá trình loại protein trong mẫu bằng tác nhân gây tủa protein như acid mạnh (percloric, tricloracetic, trifluoracetic) hoặc dung môi (MeOH, MeCN)

- Phương pháp chiết lỏng - lỏng: là kỹ thuật chuyển chất phân tích hòa tan trong một dung môi sang dung môi thứ hai không hòa tan trong dung môi thứ nhất

1.2.2.3 Nội dung thẩm định

* Tính chọn lọc – đặc hiệu

Độ chọn lọc hay tính đặc hiệu thể hiện khả năng phương pháp phân tích có thể xác định (định tính - định lượng) chất cần phân tích, không bị nhầm lẫn bởi các thành phần khác có trong mẫu thử như các chất nội sinh, chuyển hóa, sản phẩm phân hủy hay các thuốc uống cùng [7,8,13,15]

* Đường chuẩn và khoảng tuyến tính

Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa đáp ứng của pic (diện tích hay chiều cao) và nồng độ thuốc trong dịch sinh học Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ từ

thấp nhất đến cao nhất trong đường chuẩn có đáp ứng tuyến tính Đường chuẩn phải gồm ít nhất 6 nồng độ chất chuẩn pha trên cùng một mẫu dịch sinh học [7,8,13,15]

* Giới hạn định lượng dưới ( LLOQ)

Mẫu chuẩn có nồng độ thấp nhất trên đường chuẩn (1/30-1/10 Cmax) thường

* Tỷ lệ thu hồi

Tỷ lệ thu hồi là tỷ lệ hoạt chất thu được sau khi mẫu được chiết tách theo qui trình đã chọn so với mẫu có cùng nồng độ không qua chiết tách, được pha trong dung môi phù hợp [7,8,13,15]

* Độ ổn định

Độ ổn định của mẫu phân tích trong dịch sinh học cần được đánh giá trong quá trình xử lý và bảo quản mẫu Mẫu phân tích phải đảm bảo ổn định trong thời gian dự kiến đủ cho phân tích hết mẫu thử

Đánh giá độ ổn định gồm:

- Độ ổn định của dung dịch nội chuẩn gốc và dung dịch gốc: Độ ổn định thời

gian ngắn ở nhiệt độ phòng, độ ổn định thời gian dài

- Độ ổn định của dung dịch làm việc: Độ ổn định thời gian ngắn ở nhiệt độ

phòng, độ ổn định thời gian dài

- Độ ổn định của mẫu dịch huyết tương: sau 3 chu kỳ đông - rã, ở nhiệt

độ phòng trong thời gian ngắn, trong thời gian dài, sau xử lý [7,8,13,15]

CHƯƠNG 2 : PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐIỀU KIỆN THỰC NGHIỆM 2.1.1 Nguyên liệu, hóa chất, dung môi Các hóa chất, dung môi, mẫu huyết tương trắng dùng trong nghiên cứu được trình bày ở bảng 2.1, bảng 2.2, bảng 2.3

Bảng 2.1: Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu

Bảng 2.2: Các hóa chất dùng trong nghiên cứu

Bảng 2.3: Các mẫu huyết tương trắng trong nghiên cứu

01 13PN00493 Viện huyết học – truyền máu TW -35oC ± 5oC

02 13PN00196 Viện huyết học – truyền máu TW -35oC ± 5oC

03 13PN00237 Viện huyết học – truyền máu TW -35oC ± 5oC

04 13PN00343 Viện huyết học – truyền máu TW -35oC ± 5oC

05 13PN00083 Viện huyết học – truyền máu TW -35oC ± 5oC

06 13PN00228 Viện huyết học – truyền máu TW -35oC ± 5oC

07 15P006178 Viện huyết học – truyền máu TW -35oC ± 5oC

2.1.2 Dụng cụ, thiết bị Các máy móc, thiết bị dùng trong nghiên cứu được trình bày ở bảng 2.4

Bảng 2.4: Các thiết bị dùng trong nghiên cứu

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu, Nhật

Tủ lạnh sâu -35oC ± 5oC Sanyo MDF – 236, Nhật

Tủ lạnh bảo quản chất chuẩn Haier, Trung Quốc

Bình định mức, pipet class A Prolabo, Pháp

Hệ thống máy sắc ký lỏng HPLC - Shimadzu gồm: Interface CBM - 2A; bơm cao áp LC - 20AT; bộ phận tiêm mẫu tự động SIL - 20AC; Detector DAD SPD -M20A; buồng ổn nhiệt cột CTO - 20A; phần mềm điều khiển và xử lý kết quả LC Solution Shimadzu

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Xây dựng phương pháp định lượng pantoprazol trong huyết tương bằng HPLC: lựa chọn phương pháp xử lí mẫu, điều kiện sắc ký, lựa chọn nội chuẩn cho phép định lượng PAN trong mẫu với độ chính xác thích hợp

- Thẩm định phương pháp về các chỉ tiêu: Tính chọn lọc - đặc hiệu, đường chuẩn và khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, độ đúng, độ chính xác, hiệu suất chiết, độ ổn định

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Chuẩn bị các mẫu huyết tương tự tạo

2.3.1.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc, nội chuẩn gốc

- Dung dịch chuẩn gốc: hòa tan chất chuẩn PAN trong methanol (MeOH) để thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ PAN chính xác khoảng 1000 µg/mL

- Dung dịch nội chuẩn gốc: hòa tan chất chuẩn lansoprazol trong MeOH để thu được dung dịch nội chuẩn gốc có nồng độ khoảng 1 mg/mL

2.3.1.2 Chuẩn bị mẫu đường chuẩn

- Từ dung dịch chuẩn gốc trong MeOH, chuẩn bị 2 dung dịch chuẩn làm việc trong huyết tương (CC1 và CC2) có nồng độ PAN lần lượt khoảng 4000 ng/mL và

Bảng 2.5: Chuẩn bị đường chuẩn Mẫu Nồng độ (ng/mL) VHTtrắng (L) VCC1 (L) VCC2 (L)

2.3.1.3 Chuẩn bị mẫu kiểm tra

Chuẩn bị một dung dịch chuẩn gốc khác có nồng độ PAN chính xác khoảng

1000 µg/mL Từ dung dịch chuẩn gốc, chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc (QC1,

QC2) trong huyết tương có nồng độ PAN chính xác khoảng 4000 ng/mL và 1000 ng/mL

Tiến hành pha loãng QC1 và QC2 với huyết tương trắng để thu được các mẫu LQC (90 ng/mL), MQC (1800 ng/mL), HQC (3500 ng/mL) như ở bảng 2.6

Bảng 2.6: Chuẩn bị mẫu kiểm tra

- Lựa chọn bước sóng phát hiện

- Lựa chọn cột sắc ký

- Lựa chọn pha động

- Lựa chọn tốc độ dòng

- Lựa chọn chất nội chuẩn

Từ kết quả khảo sát, lựa chọn những điều kiện sắc ký thích hợp để có thể tiến hành định lượng PAN trong huyết tương bằng phương pháp HPLC với detector DAD

2.3.2.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu huyết tương

Dựa vào các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát phương pháp xử lí mẫu, chiết tách PAN từ huyết tương trên các mẫu chuẩn PAN hòa tan trong huyết tương trắng bằng các phương pháp như:

- Tủa protein với các tác nhân gây tủa là các dung môi hữu cơ như: MeOH, MeCN, acid perclorid

- Chiết lỏng - lỏng với các dung môi khác nhau: chloroform, tert butyl methyl ether

2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích

2.3.3.1 Tính đặc hiệu - chọn lọc

Tiến hành phân tích sắc ký các mẫu: Huyết tương trắng với 6 mẫu có nguồn gốc khác nhau và huyết tương trắng có pha chuẩn PAN ở nồng độ 30 ng/mL và IS

So sánh các sắc ký đồ thu được từ việc phân tích các mẫu trên

Phương pháp đạt yêu cầu khi thỏa mãn điều kiện sau:

- Pic của chất phân tích và IS phải đảm bảo được nhận diện rõ ràng, tách hoàn toàn khỏi các pic tạp có trong mẫu ( hệ số bất đối ~ 1; độ phân giải (Rs) giữa pic của chất phân tích, pic IS với pic gần nhất phải lớn hơn 1,5)

- Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chất phân tích, đáp ứng pic của từng mẫu phải gấp ít nhất 5 lần đáp ứng pic của mẫu trắng tương ứng

- Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của IS, đáp ứng pic của từng mẫu phải gấp ít nhất 20 lần đáp ứng pic của mẫu trắng tương ứng [7,8,13,15]

2.3.3.2 Đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính

Pha loãng dung dịch chuẩn làm việc với huyết tương trắng để được các dung dịch có nồng độ như sau: 30 - 100 - 500 - 1000 - 2000 - 2500 - 3000 - 4000 ng/mL

Tiến hành phân tích các mẫu, mỗi nồng độ phân tích 5 lần Từ đáp ứng pic của các chất tại các nồng độ, xác định tương quan giữa đáp ứng pic với nồng độ đã pha

Xây dựng phương trình hồi quy và xác định hệ số tương quan r Từ phương trình hồi quy đã xây dựng, tính lại nồng độ của từng mẫu, xác định độ đúng của mỗi nồng độ

Phương pháp đạt yêu cầu khi thỏa mãn điều kiện sau:

- Độ đúng so với giá trị thực của các nồng độ phải từ 85% - 115%, trừ tại điểm LLOQ được chấp nhận 80% - 120%

- Có ít nhất 75% số điểm trong dãy chuẩn đạt được tiêu chuẩn trên, trong đó LLOQ và ULOQ phải đạt tiêu chuẩn

- Khoảng tuyến tính: có hệ số tương quan r ≥ 0,98 [7,8,13,15]

2.3.3.3 Giới hạn định lượng dưới

Tiến hành khảo sát mẫu chuẩn PAN ở nồng độ khoảng 30 ng/mL Dựa theo đường chuẩn pha trong huyết tương trắng tiến hành trong cùng điều kiện, tính lại nồng độ của các mẫu vừa khảo sát

Nồng độ chuẩn thấp nhất được chấp nhận là LLOQ nếu thoả mãn điều kiện sau:

- Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chất phân tích, đáp ứng pic trung bình của mẫu LLOQ phải gấp ít nhất 5 lần đáp ứng pic trung bình của mẫu trắng

- Độ đúng của từng mẫu phải đạt từ 80% - 120% so với nồng độ thực

- Độ chính xác CV ≤ 20% [7,8,13,15]

2.3.3.4 Độ đúng

Chuẩn bị các mẫu QC trong huyết tương có nồng độ theo bảng 2.6

Chuẩn bị một đường chuẩn trong cùng điều kiện Phân tích các mẫu theo phương pháp cần đánh giá Ghi lại sắc ký đồ và đáp ứng pic Tính lại nồng độ các mẫu QC theo đường chuẩn Xác định độ đúng của phương pháp bằng cách so sánh nồng độ phân tích được so với nồng độ thực đã pha

Phương pháp đạt yêu cầu khi thỏa mãn điều kiện sau: Độ đúng trung bình của từng lô mẫu phải nằm trong khoảng 85% - 115% nồng độ thực đã pha [7,8,13,15]

2.3.3.5 Độ lặp lại trong ngày và giữa các ngày( độ chính xác)

Chuẩn bị các lô mẫu QC tương tự như ở mục xác định độ đúng Xác định kết

quả định lượng các mẫu QC theo đường chuẩn tiến hành trong cùng điều kiện

Xác định độ lặp lại trong ngày bằng cách tính toán độ lệch CV giữa giá trị các lần định lượng của mỗi nồng độ được phân tích trong cùng một ngày

Xác định độ lặp lại giữa các ngày bằng cách tính toán độ lệch CV giữa giá trị các lần định lượng của mỗi nồng độ được phân tích trong ít nhất 3 ngày khác nhau

Phương pháp đạt yêu cầu khi thỏa mãn điều kiện sau: Độ lặp lại giữa các nồng

độ phân tích được của mỗi lô mẫu có giá trị CV ≤ 15% [7,8,13,15]

2.3.3.6 Tỷ lệ thu hồi

Tiến hành sắc ký các lô mẫu QC bao gồm LQC, MQC, HQC trong dịch sinh học, mỗi lô mẫu gồm ít nhất 6 mẫu độc lập Song song tiến hành sắc ký các lô mẫu

QC trong pha động (phân tích định lượng trực tiếp không qua giai đoạn chiết tách)

Tỷ lệ thu hồi của nội chuẩn được xác định bằng cách so sánh đáp ứng của PAN và IS trong các mẫu QC pha trong dịch sinh học (có qua chiết tách) với đáp ứng của PAN và IS trong các mẫu QC pha trong pha động (không qua chiết tách)

Phương pháp đạt yêu cầu khi thỏa mãn điều kiện sau:

- Tỷ lệ thu hồi tại các nồng độ khác nhau không được quá 15%

- Giá trị CV giữa các đáp ứng của chất phân tích và IS trong các mẫu QC có qua chiết tách ở mỗi nồng độ phải ≤ 15%

- Giá trị CV giữa các đáp ứng của chất phân tích và IS trong các mẫu QC không qua chiết tách ở mỗi nồng độ phải ≤ 5% [7,8,13,15]

2.3.3.7 Độ ổn định  Độ ổn định dung dịch nội chuẩn làm việc thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng

Chuẩn bị dung dịch nội chuẩn làm việc và bảo quản ở nhiệt độ phòng trong một thời gian nhất định (khoảng 5 giờ) Phân tích, so sánh nồng độ của dung dịch nội chuẩn sau bảo quản với nồng độ của dung dịch mới pha tương ứng

Nồng độ dung dịch sau bảo quản phải sai khác với nồng độ dung dịch mới pha không quá 2%

 Độ ổn định dung dịch chuẩn gốc dài ngày

Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc và bảo quản ở nhiệt độ 2oC - 8oC trong một thời gian nhất định (khoảng 6 ngày) Phân tích, so sánh nồng độ của dung dịch chuẩn PAN gốc sau khi bảo quản ở nhiệt độ 2oC - 8oC những khoảng thời gian nhất định (khoảng 6 ngày) với nồng độ của dung dịch mới pha tương ứng

Nồng độ dung dịch sau bảo quản phải sai khác với nồng độ dung dịch mới pha không quá 2%

 Độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ đông - rã

Khảo sát độ ổn định sau ba chu kỳ đông - rã thực hiện trên 2 nồng độ LQC và HQC Bảo quản mẫu ở nhiệt độ -35oC ± 5oC và để rã đông ở nhiệt độ phòng Sau khi tan chảy hoàn toàn, để mẫu trở lại đông lạnh trong 12-24 giờ Lặp lại chu kì đông - rã 2 lần nữa Sau 3 chu kỳ đông - rã, tiến hành phân tích xác định nồng độ PAN có trong mẫu So sánh với kết quả xác định nồng độ PAN có trong các mẫu tiến hành phân tích ngay sau khi pha (nồng độ ban đầu)

Nồng độ PAN trong mẫu sau 3 chu kỳ đông - rã phải sai khác với nồng độ ban đầu không quá 15% và giá trị CV giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15%

 Độ ổn định của mẫu huyết tương ở nhiệt độ phòng trong thời gian ngắn

Phân tích mẫu huyết tương ở 2 nồng độ LQC và HQC sau khi đã rã đông và để

ở nhiệt độ phòng một thời gian nhất định (khoảng 5 giờ), so sánh với nồng độ mẫu được xử lý ngay sau khi rã đông

Nồng độ PAN trong mẫu được xử lý sau khi bảo quản một thời gian nhất định

ở nhiệt độ phòng phải sai khác với nồng độ mẫu xử lý ngay không quá 15% và giá trị CV giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15%

* Độ ổn định của mẫu huyết tương thời gian dài

Bảo quản mẫu huyết tương ở 2 nồng độ LQC và HQC ở nhiệt độ -35oC ±

5oC, phân tích mẫu tại thời điểm ban đầu và sau từng khoảng thời gian bảo quản nhất định khoảng sau 30, 53, 68 ngày So sánh nồng độ của mẫu huyết tương sau khi bảo quản với nồng độ của mẫu tại thời điểm ban đầu

Nồng độ PAN trong mẫu sau khi bảo quản một thời gian nhất định phải sai khác với nồng độ ban đầu không quá 15% và giá trị CV giữa các kết quả định lượng

ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15%

 Độ ổn định của mẫu sau xử lý (trong auto-sampler)

So sánh nồng độ của mẫu ở nồng độ LQC và HQC bảo quản trong sampler sau một thời gian xác định (khoảng 25 giờ) và nồng độ của mẫu tiêm ngay sau xử lý

auto-Nồng độ mẫu sau khi bảo quản một thời gian xác định trong auto-sampler sai khác với nồng độ mẫu tiêm ngay không quá 15% và giá trị CV giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15%

2.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ KẾT QUẢ

- Giá trị trung bình, độ đúng, độ lệch chuẩn tương đối, phương trình hồi quy,

hệ số tương quan hồi quy xác định bằng phần mềm Microsoft Excel 2010

- Nồng độ của PAN trong huyết tương được xác định dựa vào phương trình hồi quy biểu diễn mối tương quan giữa tỉ lệ diện tích pic và nồng độ của mỗi chất được xây dựng trong mỗi ngày phân tích