Đi ̣nh lượng đồng thời acetaminophen, loratadin, dextromethophan HBr trong thuốc rhumenol flu 500 bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM LIỄU THANH NHÀN ĐI ̣NH LƯỢNG ĐỒNG THỜI ACETAMINOPHEN, LORATADIN VÀ DEXTROMETHOPHAN HYDROBROMIT TRONG THUỐC RHUMENOL FLU 500 BẰNG PHƯƠNG PH

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

LIỄU THANH NHÀN

ĐI ̣NH LƯỢNG ĐỒNG THỜI ACETAMINOPHEN, LORATADIN VÀ DEXTROMETHOPHAN HYDROBROMIT TRONG THUỐC RHUMENOL FLU 500 BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VÀ PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ PHÂN TỬ

Chuyên ngành : Hóa phân tích

Mã số: 60.44.01.18

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC VẬT CHẤT

Hướng dẫn khoa học : PGS.TS Mai Xuân Trường

THÁI NGUYÊN - NĂM 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này

là trung thực và chưa hề được sử dụng trong bất cứ mô ̣t công trình nào

Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này

đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc

Xác nhận của giảng viên hướng dẫn

PGS TS Mai Xuân Trường

Thái Nguyên, tháng 04 năm 2016

Tác giả luận văn

Liễu Thanh Nhàn XÁC NHẬN CỦA KHOA HÓA HỌC

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn, tác giả đã nhận được nhiều sự quan tâm, động viên và giúp đỡ của các thầy giáo, cô giáo, bạn

bè và gia đình

Tác giả bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

Khoa Hóa ho ̣c, Phòng đào tạo - Trường Đại học Sư phạm - Đa ̣i ho ̣c Thái Nguyên, các thầy cô giáo tham gia giảng dạy đã cung cấp những kiến thức giúp tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Đặc biệt tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo PGS.TS Mai Xuân Trường người đã tận tình hướng dẫn chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu, thực hiện và hoàn thành luận văn

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè những người đã luôn bên tôi, động viên và khuyến khích tôi trong quá trình thực hiện

đề tài nghiên cứu của mình

Với khối lươ ̣ng công viê ̣c lớn , thời gian nghiên cứu có hạn, khả năng nghiên cứu còn ha ̣n chế , chắc chắn luận văn không thể tránh khỏi những thiếu sót Tác giả rất mong nhận được các ý kiến đóng góp chân thành từ các thầy giáo, cô giáo và bạn đọc

Xin chân thành cảm ơn !

Thái Nguyên, tháng 04 năm 2016

Tác giả

Liễu Thanh Nhàn

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục các từ viết tắt của luận văn iv

Danh mục các bảng của luận văn v

Danh mục các hình của luận văn vi

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Tổng quan về acetaminophen, loratadin và dextromethophan HBr 2

1.1.1 Acetaminophen 2

1.1.2 Loratadin 4

1.1.3 Dextromethophan HBr 6

1.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 8

1.2.1 Nguyên tắc của phương pháp HPLC 8

1.2.2 Các đại lượng đặc trưng của quá trình sắc ký 9

1.2.3 Hệ thống máy HPLC 12

1.3 Kết quả xác định một số chất 12

1.3.1 Kết quả xác định một số chất theo phương pháp HPLC 12

1.3.2 Kết quả xác định một số chất theo phương pháp quang phổ hấp

thụ phân tử 22

Chương 2 THỰC NGHIỆM 25

2.1 Nội dung nghiên cứu 25

2.1.1 Phương pháp HPLC 25

2.1.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử 25

2.2 Phương pháp nghiên cứu 26

2.2.1 Phương pháp nghiên cứ u lý thuyết 26

2.2.2 Phương pháp thực nghiê ̣m 26

2.3 Đánh giá độ tin cậy của quy trình phân tích 27

2.3.1 Giới hạn phát hiện (LOD) 27

2.3.2 Giới hạn định lượng (LOQ) 27

2.3.3 Đánh giá độ tin cậy của phương pháp 27

2.3.4 Đánh giá kết quả phép phân tích theo thống kê 29

2.4 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 29

2.4.1 Thiết bị 29

2.4.2 Dụng cụ 29

2.4.3 Hóa chất 30

2.4.4 Chế phẩm Rhumenol Flu 500 30

2.5 Chuẩn bị các dung môi để hòa tan mẫu 30

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Phương pháp HPLC 32

3.1.1 Xây dựng điều kiện để xác định đồng thời 3 chất ACE, LOR và DEX 32

3.1.2 Đánh giá phương pháp định lượng 35

3.1.3 Xác định ACE, LOR và DEX trong thuốc Rhumenol Flu 500 và kiểm tra độ đúng bằng phương pháp thêm chuẩn 40

3.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử 43

3.2.1 Khảo sát phổ hấp thụ phân tử của ACE, LOR và DEX 43

3.2.2 Khảo sát sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của ACE, LOR và DEX vào pH 44

3.2.3 Khảo sát sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của ACE, LOR và DEX theo thời gian 44

3.2.4 Khảo sát sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của ACE, LOR và DEX theo nhiệt độ 46

3.2.5 Khảo sát khoảng tuyến tính tuân theo định luật Bughe – Lambe – Bia của ACE, LOR và DEX Xác định chỉ số LOD và LOQ 47 3.2.6 Khảo sát và đánh giá độ tin cậy của phương pháp nghiên cứu trên các mẫu tự pha 54 3.2.7 Xác định hàm lượng ACE , LOR và DEX trong thuốc Rhumenol Flu 500 và đánh giá độ đúng củ a phép phân tích theo phươn g pháp thêm chuẩn 61

KẾT LUẬN 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CỦA LUẬN VĂN

Dextromethophan hydrobromit Dextromethorphan hydrobromide DEX

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu

năng cao

High Performance Liquid

DANH MỤC CÁC BẢNG CỦA LUẬN VĂN

Trang

Bảng 3.1 Giá trị các đại lượng đặc trưng 36

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát thời gian lưu 36

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát diện tích pic 37

Bảng 3.4 Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của ACE, LOR và DEX 38

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát độ lặp lại 39

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát độ đúng 42

Bảng 3.7 Kết quả phân tích thuốc Rhumenol Flu 500 44

Bảng 3.8 Độ hấp thụ quang của ACE, LOR và DEX ở các giá trị pH 44

Bảng 3.9 Sự phụ thuô ̣c độ hấp thụ quang của ACE, LOR và DEX theo thời gian 45

Bảng3.10 Sự phụ thuô ̣c độ hấp thụ quang của ACE, LOR và DEX theo nhiệt độ 46

Bảng 3.11 Độ hấp thụ quang của dung dịch ACE ở các giá trị nồng độ 48

Bảng 3.12 Kết quả xác đi ̣nh LOD và LOQ của ACE 50

Bảng 3.13 Sự phụ thuô ̣c đô ̣ hấp thụ quang của LOR theo nồng độ 51

Bảng 3.14 Kết quả tính LOD và LOQ của LOR 52

Bảng 3.15 Sự phụ thuô ̣c đô ̣ hấp thụ quang của DEX theo nồng độ 53

Bảng 3.16 Kết quả tính LOD và LOQ của DEX 54

Bảng 3.17 Pha chế các dung di ̣ch hỗn hợp ACE và LOR 55

Bảng 3.18 Kết quả tính nồng đô ̣, sai số của ACE và LOR trong hỗn hợp 55

Bảng 3.19 Pha chế các dung di ̣ch hỗn hợp ACE và DEX 56

Bảng 3.20 Kết quả tính nồng đô ̣, sai số của ACE và DEX trong hỗn hợp 57

Bảng 3.21 Pha chế các dung di ̣ch hỗn hợp LOR và DEX 58

Bảng 3.22 Kết quả tính nồng đô ̣, sai số của LOR và DEX trong hỗn hợp 58

Bảng 3.23 Pha các dung dịch chuẩn ACE, LOR, DEX và hỗn hợp 59

Bảng 3.24 Kết quả tính nồng độ, sai số của ACE, LOR và DEX 60

Bảng 3.25 Kết quả tính nồng độ, sai số ACE, LOR và DEX trong mẫu thuốc Rhumenol Flu 500 62 Bảng 3.26 Thành phần các dung dịch chuẩn ACE, LOR và DEX thêm vào dung dịch mẫu thuốc Rhumenol Flu 500 64 Bảng 3.27 Kết quả xác định độ thu hồi của ACE, LOR và DEX trong mẫu thuốc Rhumenol Flu 500 64

DANH MỤC CÁC HÌNH CỦA LUẬN VĂN

Trang

Hình 3.1 Sắc ký đồ của ACE (500 µg/mL) 33

Hình 3.2 Sắc ký đồ của LOR (5 µg/mL) 33

Hình 3.3 Sắc ký đồ của DEX (15 µg/mL) 34

Hình 3.4 Sắc ký đồ của DEX (1), ACE (2) và LOR (3) 35

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của ACE 38

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của LOR 39

Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của DEX 39

Hình 3.8 Phổ hấp thụ của các dung dịch chuẩn ACE, LOR và DEX 43

Hình 3.9 Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của ACE, LOR và DEX theo thời gian 45

Hình 3.10 Sự phụ thuô ̣c đô ̣ hấp thụ quang của ACE , LOR và DEX theo nhiê ̣t đô ̣ 47

Hình 3.11 Phổ hấp thụ quang của ACE ở các nồng độ 0,1  50,0 g/mL 48

Hình 3.12 Đường hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang A vào nồng đô ̣ của ACE 49

Hình 3.13 Phổ hấp thụ quang của LOR ở các nồng độ 0,1  50,0 g/mL 50

Hình 3.14 Đường hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang A vào nồng độ LOR 51

Hình 3.15 Phổ hấp thụ quang của DEX ở các nồng độ 0,1  50,0 g/mL 52

Hình 3.16 Đường hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang A vào nồng đô ̣ DEX 53

MỞ ĐẦU

Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kỹ thuật, ngành công nghệ dược phẩm cũng phát triển một cách nhanh chóng Các nhà sản xuất dược phẩm đã áp dụng nhiều phương thức sản xuất và chế biến tiên tiến để tổng hợp ra nhiều loại dược phẩm có tính năng vượt trội Nhiều loại thuốc hỗn hợp như cảm cúm, hạ sốt, nhức đầu, ho… với những thành phần khác nhau ngày càng được sản xuất và sử dụng rộng rãi ở nước ta Việc định lượng các hoạt chất trong các loại thuốc hỗn hợp theo tiêu chuẩn nhà sản xuất là rất quan trọng vì chỉ cần thay đổi một lượng nhỏ thành phần hoạt tính của thuốc cũng có thể ảnh hưởng đến sức khỏe của hàng nghìn, hàng triệu người sử dụng thuốc

Do đó việc đánh giá đúng chất lượng sản phẩm một cách nhanh chóng, chính xác, an toàn và hiệu quả thì công tác kiểm nghiệm để xác định các thành phần của thuốc bằng các phương pháp hiện đại có độ chính xác cao ngày càng được quan tâm Nhiều phương pháp có độ lặp và độ chính xác cao đã được ứng dụng Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis) kết hợp với kỹ thuật tính toán và ứng dụng phần mềm máy tính đã bước đầu được nghiên cứu và cho nhiều ưu điểm như độ nhạy, độ lặp, độ chính xác, độ tin cậy của phép phân tích, phân tích nhanh, tiện lợi [3], [5]

Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi chọn đề tài : "Đi ̣nh lượng đồng thời acetaminophen, loratadin, dextromethophan HBr trong thuốc Rhumenol Flu 500 bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử”

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về acetaminophen, loratadin và dextromethophan HBr

1.1.1 Acetaminophen

1.1.1.1 Giới thiệu chung

- Tên tiếng Anh: Acetaminophen (tên khác: Paracetamol)

- Công thức phân tử: C8H9O2N

- Khối lượng mol phân tử: 151,17 (g/mol)

- Công thức cấu tạo:

- Tên IUPAC: N-(4-hydroxyphenyl) acetamit hoặc p-hydroxy acetanilit hoặc 4-hydroxy acetanilit[1]

1.1.1.2 Tính chất

- Acetaminophen là chất bột kết tinh màu trắng, không mùi, vị đắng nhẹ

- Khối lượng riêng: 1,263 g/cm3

- Nhiệt độ nóng chảy: 1690C

- Trong môi trường axit, acetaminophen hấp thụ quang cực đại tại bước

sóng 245nm, trong môi trường kiềm, acetaminophen hấp thụ cực đại tại bước sóng 257 nm

- Phổ hấp thụ hồng ngoại của acetaminophen có các đỉnh đặc trưng ở các

vòng benzen làm giảm tính bazơ của nhóm amit và làm tăng tính axit của nhóm hydroxyl

1.1.1.3 Dược lý cơ chế tác dụng

Acetaminophen là chất chuyển hóa có hoạt tính của phenacetin, thuộc nhóm thuốc giảm đau hạ sốt Acetaminophen làm giảm đau bằng cách làm tǎng ngưỡng đau Thuốc làm hạ sốt thông qua tác động trên trung khu điều nhiệt của não

Acetaminophen được dùng để làm giảm tạm thời sốt, nhức và đau do cảm lạnh thông thường và các nhiễm virus khác Thuốc cũng được dùng để giảm đau đầu, đau lưng, đau rǎng, nhức cơ Acetaminophen làm giảm đau trong viêm khớp nhẹ nhưng không có tác dụng trên tình trạng viêm, đỏ và sưng khớp Gần đây thuốc được cho là có hiệu quả ngang với thuốc chống viêm không steroit trong làm giảm đau khớp gối do viêm xương khớp

1.1.1.4 Một số phương pháp đã được áp dụng để định lượng acetaminophen

• Phương pháp đo quang

Nguyên tắc: Dựa vào khả năng hấp thụ tử ngoại của phân tử acetaminophen trong metanol hấp thụ quang cực đại tại bước sóng 245 nm và trong môi trường kiềm hấp thụ quang cực đại tại bước sóng 257 nm Tính kết quả dựa vào giá trị

độ hấp thụ quang đo được và độ hấp thụ riêng hoặc so sánh với chất chuẩn

• Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Dựa vào khả năng phân bố khác nhau của acetaminophen trên pha tĩnh và

pha động, quá trình sắc ký sẽ thực hiện được

Theo dược điển Việt Nam IV, định lượng acetaminophen sử dụng: Cột thép không gỉ (250 mm x 4,6 mm; 5 µm)

Pha động: hỗn hợp gồm 375 thể tích dung dịch dinatri hydrophotphat 1,79%,

375 thể tích dung dịch natri dihydrophotphat 0,78% và 250 thể tích metanol có chứa 0,46% của dung dịch tetra-butylamoni hydroxit 40%

Nhiệt độ cột: 350C

Thể tích tiêm mẫu 20 µL

Dectector UV, bước sóng hấp thụ 245 nm[1]

1.1.2 Loratadin

1.1.2.1 Giới thiệu chung

- Tên tiếng Anh: Loratadine

- Công thức phân tử: C22H23ClN2O2

- Khối lượng mol phân tử: 382,88 (g/mol)

- Công thức cấu tạo:

- Tên IUPAC: Ethyl4-(8-chloro-5,6-dihydro-11H-benzo [5,6] cyclohepta [1,2-b] pyridin-11-ylidene) piperidine-1-carboxylate

Loratadin là thuốc kháng histamin 3 vòng có tác dụng kéo dài đối kháng

có chọn lọc trên thực thể H1 ngoại biên và không có tác dụng làm dịu trên thần kinh trung ương Loratadin thuộc nhóm đối kháng thực thể H1 thế hệ thứ hai (không an thần) Loratadin có tác dụng làm nhẹ bớt triệu chứng của viêm mũi và viêm kiết mạc dị ứng do giải phóng histamin

Loratadin có tác dụng chống ngứa và nổi mày đay liên quan tới histamin Tuy nhiên, loratadin không có tác dụng bảo vệ hoặc trợ giúp lâm sàng đối với

trường hợp giải phóng histamin nặng như choáng phản vệ Trong trường hợp đó điều trị chủ yếu là dùng adrenarin và corticostroit Thuốc kháng histamin không

có vai trò trong điều trị hen Những thuốc đối kháng histamin H1 thế hệ thứ hai (không an thần) như: terfenadin, astmizol, loratadin không phân bố vào não, khi dùng thuốc với liều thông thường Loratadin không có tác dụng an thần, ngược lại với tác dụng phụ an thần của các kháng histamin thế hệ thứ nhất Để điều trị viêm mũi dị ứng và mày đay, loratadin có tác dụng nhanh hơn astemizol và có tác dụng như azatadin, cetirizin, clopheninamin, clemastin, terfenadin và mequitazin Loratadin có tần suất tác dụng phụ, đặc biệt đối với hệ thần kinh trung ương, thấp hơn những kháng histamin thuộc thế hệ thứ hai khác

Vì vậy, dùng loratadin ngày một lần có tác dụng nhanh, đặc biệt không có tác dụng an thần, là thuốc lựa chọn đầu tiên để trị viêm mũi dị ứng và mày đay

Có thể kết hợp loratadin với pseudoephedrin hydroclorit để làm nhẹ bớt triệu chứng ngạt mũi trong điều trị viêm mũi dị ứng có kèm ngạt mũi

1.1.2.4 Một số phương pháp đã được áp dụng để định lượng loratadin

• Phương pháp quang phổ tử ngoại đạo hàm

Tác giả Nguyễn Minh Trí và cộng sự đã định lượng đồng thời loratadin và pseudoephedrin sunfat bằng phương pháp phổ tử ngoại đạo hàm Kết quả cho khoảng tuyến tính 0,015-0,035 mg/mL với loratadin và 0,025-0,84 mg/mL với pseudoefedrin, độ chính xác tương ứng cho hai chất là 99,46% (RSP=0,72%) và 100,6% ( RSP=0,58%) [11]

• Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC)

Dựa vào khả năng phân bố khác nhau của loratadin trên pha tĩnh và pha động, quá trình sắc ký sẽ thực hiện được

1.1.3.1 Giới thiệu chung

- Tên tiếng Anh: Dextromethorphan hydrobromide

- Công thức phân tử: C18H25NO.HBr.H2O

- Khối lượng mol phân tử: 370,3 (g/mol)

- Công thức cấu tạo:

dextromethophan HBr không có tác dụng giảm đau và nói chung rất ít tác dụng

an thần

Dextromethophan HBr được dùng giảm ho nhất thời do kích thích nhẹ ở phế quản và họng như cảm lạnh thông thường hoặc hít phải các chất kích thích Thuốc không có tác dụng long đờm

Với liều điều trị, tác dụng chống ho của thuốc kéo dài được 5-6 giờ Độc tính thấp, nhưng với liều rất cao có thể gây ức chế hệ thần kinh trung ương

1.1.3.4 Một số phương pháp đã được áp dụng để định lượng Dextromethophan HBr

• Phương pháp phổ hấp thụ phân tử UV-Vis sử dụng thuật toán

• Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Dựa vào khả năng phân bố khác nhau của dextromethophan HBr trên pha tĩnh và pha động, quá trình sắc ký sẽ thực hiện được

Theo dược điển Việt Nam IV, định lượng dextromethophan HBr sử dụng: Cột C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 µm)

Pha động: natri docusate 0,007M và amoni nitrat 0,007M trong hỗn hợp axetonitril: nước (tỉ lệ 70:30 về thể tích) Điều chỉnh đến pH=3,4 bằng axit axetic băng (Merk)

Tốc độ dòng 1 mL/phút

Thể tích tiêm mẫu 20 µL

Dectector UV, bước sóng hấp thụ 280 nm

1.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

HPLC là chữ viết tắt của 4 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước kia gọi là sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography)

Phương pháp này ra đời từ những năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt

1.2.1 Nguyên tắc của phương pháp HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp tách một hỗn hợp chất lỏng dựa trên sự phân bố chúng giữa hai pha, một pha đứng yên gọi là pha tĩnh, một pha di chuyển gọi là pha động Do ái lực hấp thụ và giải hấp thụ khác nhau của các hợp phần có trong mẫu phân tích với pha tĩnh và pha động mà chúng di chuyển dọc theo pha tĩnh (cột sắc ký) tốc độ khác nhau nên lần lượt đi ra khỏi cột

1.2.1.1 Pha tĩnh

Pha tĩnh là chất nhồi cột để làm nhiệm vụ tách 1 hỗn hợp chất phân tích

Nó là những chất rắn, xốp, kích thước hạt rất nhỏ, đường kính cỡ hạt từ 3÷10m, diện tích bề mặt thường từ 50÷500 m2

/g

- Trơ và bền vững với các điều kiện của môi trường sắc ký

- Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong điều kiện sắc ký nhất định

- Tính chất bề mặt phải ổn định (đặc biệt là đặc trưng xốp của nó)

- Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt

- Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất

1.2.1.2 Pha động

Pha động là dung môi dùng để rửa giải chất tan (chất cần phân tích) ra khỏi cột tách để thực hiện quá trình sắc ký Đây là một yếu tố rất linh động và dễ dàng thay đổi Nó có thể là một dung môi hoặc hỗn hợp nhiều dung môi trộn lẫn với nhau theo những tỉ lệ nhất định Nó có thể là dung dịch hoặc các muối có chứa các chất đệm, chất tạo phức Nói chung mỗi loại sắc ký sẽ có các hệ dung môi rửa giải riêng để có được hiệu quả phân tách tốt nhất

- Không hòa tan hay làm mòn pha tĩnh

- Hòa tan được chất cần phân tích

- Bền vững theo thời gian

- Có độ tinh khiết cao

- Phải nhanh đạt các cân bằng trong sắc ký

- Có độ nhớt thấp để tránh áp suất dội lại cao

- Phù hợp với các loại detector dùng để phát hiện các chất phân tích

- Có tính kinh tế và không khan hiếm

1.2.2 Các đại lƣợng đặc trƣng của quá trình sắc ký

1.2.2.1 Thời gian lưu

Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị nồng độ cực đại và cho ra pic trên sắc ký đồ

,

R

t = tR - t0

Trong đó:

tR : thời gian lưu trữ của một chất

t’R: thời gian lưu thực (thời gian lưu hiệu chỉnh)

t0 : thời gian chết (thời gian không lưu trữ)

1.2.2.2 Hệ số phân bố

Trong quá trình sắc ký luôn có sự phân bố của chất tan giữa pha động và pha tĩnh Sự phân bố này đặc trưng bởi cân bằng phân bố với hệ số phân bố được tính theo công thức sau:

K = Trong đó:

K’=

Trong đó :

K’: hệ số dung lượng

Nếu K’ nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém Nếu K’ lớn thì pic bị doãng

Trong thực tế K’ từ 1 - 5 là tối ưu

1.2.2.4 Hệ số chọn lọc

Hai chất chỉ được tách ra khi chúng có giá trị α khác nhau, hệ số chọn lọc cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký

α = = = = Trong đó:

α: hệ số chọn lọc

Thường phân tích trong điều kiện  trong khoảng 1,5 đến 2

1.2.2.5 Số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết

Hiệu lực cột thường biểu thị qua hai thông số: Số đĩa lý thuyết (N) hoặc chiều cao đĩa lý thuyết (H)

Số đĩa lý thuyết N được tính theo các công thức:

N = 16× hoặc N = 5,54×

Trong đó:

W: chiều rộng pic ở đáy pic

W1/2: chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của pic

Chiều cao của đĩa lý thuyết được tính theo công thức:

H=

N L

Trong đó:

L: chiều cao cột sắc ký

Với một điều kiện sắc ký nhất định, chiều cao đĩa lý thuyết (H) và số đĩa

lý thuyết (N) là hằng định đối với mỗi chất phân tích (Trong thực tế N nằm trong khoảng 2500 đến 5500)

1.2.2.5 Độ phân giải

Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trong điều kiện sắc ký đã cho Độ phân giải của hai pic cạnh tranh được tính theo 1 trong 3 công thức sau:

Trong đó:

RS: là độ phân giải

tRA, tRB: thời gian lưu tương ứng của chất A, chất B

W1/2(A), W1/2(B): Chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao pic của chất A, chất B

WA, WB: Chiều rộng pic ở đáy pic

α: Hệ số chọn lọc

1.3.1 Kết quả xác định một số chất theo phương pháp HPLC

Trên thế giới nói chung và ở nước ta nói riêng, phương pháp HPLC được ứng dụng nhiều trong phân tích các chế phẩm về dược cũng như hỗn hợp các chất vô cơ, hữu cơ Các kết quả đều cho thấy phương pháp có độ tin cậy cao

Năm 2003, M.M Mabrouk và cộng sự đã định lượng loratadin và pseudoephedrin sunfat trong dược phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng pha đảo RP-LC và quang phổ đạo hàm Đây là phương pháp có độ nhạy cao, đơn giản và chính xác để xác định thuốc chống dị ứng loratadin và thuốc thông mũi pseudoephedrin sunfat Phương pháp tách loratadin và pseudoephedrin sunfat trên cột BondaPak C18 bằng cách sử dụng pha động là hỗn hợp metanol: H2O:

axit photphoric: amoni dihydrophotphat (tỷ lệ 220: 300: 2: 3g theo V / V / V / W), 60 và 40% axetonitril, tốc độ dòng 2 mL/phút với bước sóng phát hiện là

247 nm Các đồ thị hiệu chuẩn tuyến tính trong khoảng 5-100 μg/mL cho loratadin và 120-1200 μg/mL cho pseudoephedrin sunfat, giới hạn phát hiện là 0,5 μg/mL và 60 μg/mL tương ứng cho loratadin và pseudoephedrin sunfat Phương pháp này đã được áp dụng thành công cho việc xác định đồng thời loratadin và pseudoephedrin sunfat cũng như riêng loratadin trong các dạng bào chế dược phẩm khác nhau [26]

Năm 2005, tác giả Thái Duy Thìn và cộng sự đã sử dụng phương pháp HPLC:

- Nghiên cứu định lượng acetaminophen, ibuprofen bằng phương pháp HPLC với điều kiện: Cột Richrosorb RP18 (250mm x 4mm; 10μm), pha động là hỗn hợp axetonitril và dung dịch axit photphoric 0,1% (tỉ lệ 60: 40 về thể tích), tốc độ dòng là 1 mL/phút, detector UV đặt ở bước sóng 214 nm, thể tích tiêm mẫu 20 μL Kết quả thu được: sai số tương đối của ibuprofen và acetaminophen là 0,81% và 1,03%; độ thu hồi của ibuprofen và acetaminophen

là 98,4% và 98% [15]

- Định lượng acetaminophen, axit mefenamic bằng phương pháp HPLC với điều kiện: Cột Lichrosorb RP18 (250 mm x 4,6 mm; 10 μm) Pha động là hỗn hợp axetonitril- nước- tetrahydrofuran (tỉ lệ 3:8:9 về thể tích) Tốc

độ dòng là 1 mL/phút Detector UV đặt ở bước sóng 279 nm Thể tích tiêm mẫu

20 μL Kết quả thu được: sai số tương đối của acetaminophen, axit mefenamic

là 0,51% và 1,42%; độ thu hồi của acetaminophen, axit mefenamic là 98,16%

và 99,16% [15]

- Định lượng acetaminophen, cafein bằng phương pháp HPLC với điều kiện: Cột Lichrosorb RP18 (250mm x 4,6mm; 10μm) Pha động là hỗn hợp metanol- nước (tỉ lệ 35:65 về thể tích) Tốc độ dòng là 1 mL/phút Detector UV đặt ở bước sóng 279 nm Thể tích tiêm mẫu 20 μL Kết quả thu được: sai số

tương đối của acetaminophen, cafein là 0,54% và 1,07%; độ thu hồi của acetaminophen, cafein là 98,8% và 99,5% [15]

- Định lượng acetaminophen, quinin sunfat bằng phương pháp HPLC với điều kiện: Cột Lichrosorb RP18 (250mm x 4,6mm; 5μm) Pha động

là hỗn hợp metanol- axit axetic- dietylamin (tỉ lệ 650:350:1 về thể tích) Tốc

độ dòng là 1 mL/phút Detector UV đặt ở bước sóng 235 nm Thể tích tiêm mẫu 20 μL Kết quả thu được: sai số tương đối của acetaminophen, quinin sunfat là 1,16% và 1,887%; độ thu hồi của acetaminophen, quinin sunfat là 99,0% và 99,3% [15]

- Định lượng acetaminophen, phenylpropaolamin HCl, clorphenylamin maleat bằng phương pháp HPLC với điều kiện: Cột C18 (250mm x 4,6mm; 5μm) Pha động là hỗn hợp nước- axetonitril- trietylamin (tỉ

lệ 968:30:2 về thể tích) Tốc độ dòng là 1,2 mL/phút Detector UV đặt ở bước sóng 216 nm đo phenylpropaolamin HCl và clorphenylamin maleat 244 nm đo acetaminophen Thể tích tiêm mẫu 20 μL Nhiệt độ cột ở nhiệt độ phòng Kết quả thu được: sai số tương đối của acetaminophen, phenylpropaolamin HCl và clophenylamin maleat là 0,47% và 0,67% và 1,19%; độ thu hồi dao động từ 99,61% đến 100,65% [15]

- Định lượng acetaminophen, ephedrin HCl, theophyllin, phenobarbital bằng phương pháp HPLC với điều kiện: Cột lichrosorb RP18 (250mm x 4mm; 10μm) Pha động là hỗn hợp metanol-dung dịch đệm photphat

pH 3,5 (tỉ lệ 38:62 về thể tích) Tốc độ dòng là 1,0 mL/phút Detector UV đặt ở bước sóng 240 nm Thể tích tiêm mẫu 20 μL Kết quả thu được với diện tích pic, độ lặp lại và độ đúng nằm trong giới hạn cho phép [15]

- Định lượng acetaminophen, bromhexin HCl, pseudoephedry HCl, clorpheniramin maleat và cafein bằng phương pháp HPLC với điều kiện: Cột lichrosorb Si60 (250mm x 4mm; 5μm) Pha động là hỗn hợp metanol-dung dịch đệm amoninitrat pH 9,5 (tỉ lệ 45:6 về thể tích) Tốc độ dòng là 1,5 mL/phút khi

đo pseudoephedry HCl, clorpheniramin maleat; 1,0 mL/phút khi đo cafein và

bromhexin HCl; 1,0 mL/phút khi đo acetaminophen Detector UV đặt ở bước sóng 257 nm với pseudoephedry HCl, clorpheniramin maleat và acetaminophen; 298 nm với cafein và bromhexin HCl Thể tích tiêm mẫu 20

μL Kết quả thu được với diện tích pic, độ lặp lại và độ đúng nằm trong giới hạn cho phép [15]

Năm 2007, Dina T El-Sherbinya đã định lượng đồng thời loratadin và desloratadin trong các chế phẩm dược sử dụng phương sắc ký lỏng hiệu năng cao Việc tách 2 chất này được thực hiện với bước sóng phát hiện ở 247 nm, tốc

độ dòng là 1 mL/phút, pha động gồm sodium dodecyl sunfat 0,1 M, 1% octanol, 10% n-propanol và 0,3% trietylamin trong axit photphoric 0,02M pH 3,0 Phương pháp này tách tốt loratadin và desloratadin trong dược phẩm với hệ số phân giải là 3,85 Phương pháp này đòi hỏi thời gian xử lý mẫu nhanh (10 phút),

độ lặp lại của phương pháp RSD <2,0% [18]

Năm 2009, bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), tác giả Fegade và cộng sự đã định lượng đồng thời acetaminophen và piroxicam trong thuốc viên Sử dụng cột Eurosphere-100 C18 (250mm x 4,6 mm; 5 μm) với pha động là hỗn hợp metanol: nước (tỉ lệ 70:30 về thể tích) Tốc độ dòng 1,0 mL/phút và bước sóng đo quang ở 227 nm Thời gian lưu của piroxicam và acetaminophen tương ứng là 2,52 và 5,48 phút Phương pháp này đã có độ chính xác, độ tuyến tính, độ tin cậy, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng theo tiêu chuẩn ICH và USP Các nghiên cứu khảo nghiệm cho thấy độ thu hồi acetaminophen và piroxicam trong phạm vi 99÷101% thu được ở các nồng độ khác nhau Phương pháp này được áp dụng thành công với việc xác định xác định đồng thời cả hai chất trong phòng thí nghiệm cũng như trong dược phẩm

thương mại [19]

Năm 2011, Ulavapalli và cộng sự đã định lượng thành công psuedoephedrin, fexofenadin và loratadin trong dược phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Việc tách các chất được thực hiện bằng cách sử dụng

là dung dịch đệm photphat (KH2PO4) 0.01M pH 3,0; kênh B là axetonitril, từ 0-5 phút đầu với tỷ lệ là 80:60 về thể tích; 5-10 phút tiếp điều chỉnh tỷ lệ ở 60:20 về thể tích; từ 10 đến 15 phút tỉ lệ là 80:20 về thể tích; 15-17 phút tỉ lệ là 20:80 về thể tích và 17-20 phút tỷ lệ là 80:80 về thể tích Tốc độ dòng là 0,60 mL/phút và bước sóng đo quang ở 210 nm Thời gian lưu của psuedoephedrin, fexofenadin

và loratadin tương ứng là 4,3 phút; 10,4 phút và 17,0 phút Độ tuyến tính của phương pháp trong khoảng từ 5 μg/mL đến 100 μg/mL và hệ số tương quan đều nằm trong giới hạn (không nhỏ hơn 0,999) Phương pháp được phát triển để áp dụng rộng rãi cho việc định lượng đồng thời psuedoephedrin, fexofenadin và loratadin ở dạng bào chế dược phẩm [32]

Năm 2011, Lohar V.R và các cộng sự đã định lượng thành công acetaminophen, cafein, pseudouphedrin HCl, dextromethophan HBr và loratadin trong thuốc viên bằng phương pháp RP-HPLC Phương pháp sử dụng pha động gồm dung dịch đệm natri heptan sunphonat và axetonitril (tỷ lệ 95: 5 về thể tích), tốc độ dòng chảy là 1 mL/phút Hệ thống HPLC Shimadzu LC 2010 với cột Inertsil ODS 3V (5 cm x 4,6 mm; 3 μm), bước sóng đo quang là 205 nm Thời gian lưu của acetaminophen là 3,5 phút; caffein là 5,5 phút; pseudoephedrin HCl

là 8 phút; dextromethophan HBr là 14 phút và loratadin là 15 phút Độ thu hồi của acetaminophen, caffein, pseudoephedrin HCl, dextromethophan HBr và loratadin nằm trong khoảng 98% đến 102% Đây là phương pháp đơn giản, chính xác, độ lặp lại cao do đó phù hợp cho phân tích thường xuyên các loại thuốc ở dạng bào chế viên nén [25]

Năm 2011, Đỗ Thị Thu Hường định lượng thành công acetaminophen, dextromethophan HBr và loratadin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với cột pha đảo C18 (150 mm x 4,6 mm; 5 µm) Pha động là hỗn hợp axetonitril: đệm kali dihydrophotphat pH=2,9 (tỷ lệ 25:75 về thể tích) Tốc độ dòng là 1,4 mL/phút Detector UV đặt ở bước sóng 215 nm Thể tích bơm mẫu là 20 µL Nhiệt độ cột đo ở nhiệt độ phòng Kết quả thu được: thời gian lưu của

acetaminophen, dextromethophan HBr và loratadin lần lượt là 3,5; 6,62 và 11,29 phút [5]

Năm 2011, P.Narmad và cộng sự đã định lượng thành công cetrizin HCl

và dextromethophan HBr trong dược phẩm dạng xi-rô bằng phương pháp HPLC

Sử dụng máy HPLC Shimadzu Prominence LC20AT với cột Kromasil C18 (250

mm X 4,6 mm; 5 µm) Pha động gồm dung dịch đệm kali dihydrophotphat 0,01 M pH được điều chỉnh tới 4,0 bằng axit photphoric và một hỗn hợp dung môi axetonitril và metanol (tỉ lệ 2: 3 về thể tích) Tốc độ dòng chảy 1,0 mL/phút Detector UV đặt ở bước sóng 220 nm Phương pháp này có độ tuyến tính, độ chính xác cao theo chuẩn ICH Nồng độ giới hạn phát hiện của phương pháp trong phạm vi 1,5 μg/mL tới 2000 μg/mL cho cả cetrizin HCl và dextromethophan HBr Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng là 0,5 μg/mL và 1,5 μg/mL tương ứng cho cả hai chất Phương pháp này đã được áp dụng để định lượng cetrizin HCl và dextromethophan HBr trong dược phẩm dạng xi-rô [28]

Năm 2013, tác giả Nguyễn Thành Lộc đã định lượng đồng thời acetaminophen và ibuprofen bằng phương pháp HPLC với điều kiện: Cột RP-18 (220 mm x 4,4 mm; 5 µm) Pha động là hỗn hợp axetonitril : H3PO4 0,1 M (tỷ lệ 97:3 về thể tích) Tốc độ dòng là 0,7 mL/phút Detector UV đặt ở bước sóng 224

nm Thể tích bơm mẫu là 20 µL Kết quả thu được: độ thu hồi của acetaminophen và ibuprofen là 96,03% và 94,48% [8]

Năm 2013 tác giả Vũ Duy Long đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để xác định đồng thời acetaminophen, clopheniramin maleat và phenylephrin HCl trong các dược phẩm nói chung và thuốc TIFFY nói riêng bằng cách sử dụng pha động là hỗn hợp đệm NaH2PO4 0,05 M : axetonitril (tỉ lệ 93:07 về thể tích); Thể tích bơm mẫu là 20 µL với tốc độ dòng chảy pha động là 1,5 mL/phút, sử dụng loại cột C18, bước sóng đo quang 215 nm và ở nhiệt độ là

30oC Các chất acetaminophen, clopheniramin maleate và phenylephrin HCl

acetaminophen là 8,62 phút, thời gian lưu của clopheniramin maleat là 2,78 phút

và thời gian lưu của phenylephrin HCl là 3,27 phút Độ thu hồi của acetaminophen là 99,7%; độ thu hồi của clopheniramin maleat là 99,5%; và độ thu hồi của phenylephrin HCl là 98,8% [7]

Năm 2013, Kotaiah.Paidipal và Kamasapy.SK bằng phương pháp HPLC

đã định lượng đông thời dextromethophan hydrobromit, phenylephrin hydroclorit và triprolidin hydroclorit bằng phương pháp HPLC trong thuốc dạng viên nén Sử dụng cột Kromasil C18 (250mm x 4,6mm; 5μm) Pha động gồm metanol : axetonitril : dung dịch đệm kali dihydrophotphat 0,1M (tỉ lệ 75:15:10

về thể tích), điều chỉnh để pH tới 6,8 bằng NaOH Tốc độ dòng 1,0 mL/phút Thời gian lưu của dextromethophan hydrobromit, phenylephrin hydroclorit và triprolidin hydroclorit tương ứng là 2,547; 3,783 và 6,017 phút Phạm vi tuyến tính cho dextromethophan hydrobromit, phenylephrin hydroclorit và triprolidin hydroclorit tương ứng là 48-112, 24-56 và 16-14 µg/mL Độ thu hồi của dextromethophan hydrobromit, và phenylephrin hydroclorit và triprolidin hydroclorit trong dược phẩm đều lớn hơn 98% và độ lệch chuẩn tương đối của chúng là 2,0% Giới hạn phát hiện là 3,71; 1,90 và 0,52 µg/mL tương ứng cho dextromethophan hydrobromit, phenylephrin hydroclorit và triprolidin hydroclorit Phương pháp có thể áp dụng để định lượng đồng thời ba chất trên trong dược phẩm với số lượng lớn và trong dạng bào chế kết hợp khác [24]

Năm 2013, Husen Al-Akraa và cộng sự đã định lượng đồng thời pseudoephedrin HCl, clopheniramin maleat, và dextromethophan HBr bằng phương pháp HPLC trong các chế phẩm dược có chứa thuốc thông mũi, thuốc

ho an thần và thuốc kháng histamin sử dụng clodiazepoxit, sử dụng đầu dò photo-diode tại bước sóng 203 nm, cột BDS Hypersil C18 (250 mm × 4,6 mm; 5 μm) Pha động gồm axetonitril : nước (tỉ lệ 60:40 về thể tích), nước có chứa sodium dodecyl sunfat và trietylamin hydroclorit, điều chỉnh pH = 2,5 với axit octhophotphoric 0.01M và kali dihydrophotphat 0.01M Tốc độ dòng chảy 1,0 mL/phút Phạm vi tuyến tính của nồng độ là 20÷2000; 6÷2400; 2÷160 và

15÷1200μg/mL với (R2> 0,9991) tương ứng pseudoephedrin HCl, clopheniramin maleat, và dextromethophan HBr và độ thu hồi 97,0-102,4% Giới hạn phát hiện (LOD) 0,33; 0,09; 0,12 và 0,03μg/mL, và giới hạn định lượng (LOQ) 1,10; 0,30; 0,40 và 0,10 μg/mL tương ứng cho pseudoephedrin HCl, clopheniramin maleat

và dextromethophan HBr Các phương pháp RP-HPLC đề xuất đã được áp dụng thành công cho việc xác định các hợp chất khác nhau trong các chế phẩm dược không bị ảnh hưởng bởi các tá dược [22]

Năm 2013, P.L.Paseesth và cộng sự đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để định lượng đồng thời ambroxol HCl và loratadin dưới dạng dược phẩm bào chế dạng viên nén Sử dụng cột Symmetry C18 (4,6 mm x 250 mm; 5 μm) Phương pháp này đã được thực hiện trong chương trình gradient nồng độ sử dụng pha động là hỗn hợp kali dihydrophotphat 0,02M: axetonitril (30:70 v/v) điều chỉnh pH=5 bằng axit ortho photphoric loãng Tốc độ dòng chảy được điều chỉnh về 1,0 mL/phút Detector UV đặt ở bước sóng 245 nm Thời gian lưu của ambroxol HCl và loratadin tương ứng là 2,25 và 7,58 phút Đường chuẩn tuyến tính trong khoảng nồng độ của 100-300μg/mL cho ambroxol HCl và 50-150μg/mL cho loratadin [30]

Năm 2014, Parag Bhortake đã định lượng đồng thời acetaminophen, phenylephrin hydroclorit và dextromethophan hydrobromit trong dược phẩm bằng phương pháp HPLC Việc tách được thực hiện bằng cách sử dụng một pha động gồm dung dịch đệm (muối natri của axit butan sunphonic):axetonitril Tốc

độ dòng là 1,5 mL/phút Phương pháp được thực hiện trên cột Shimadzu LC

2010 HPLC có detector UV phát hiện ở bước sóng 272 nm Pha tĩnh được sử dụng là Inertsil C18 (4,6 mm x 250 mm; 5 μm), nhiệt độ cột được duy trì ở 30°C Thời gian lưu giữ đã được tìm thấy là 5 phút cho acetaminophen, 3 phút cho phenylephrin hydroclorit và 15 phút cho dextromethorphan hydrobromit Các đỉnh pic đẹp, tách rời nhau và không bị ảnh hưởng bởi các tá dược Độ thu hồi của acetaminophen, phenylephrin hydroclorit và dextromethophan hydrobromit

Năm 2014, Muhammad Abdul.Qadir đã định lượng đồng thời metyl parben, propul paraben, loratadin trong kháng histamin bằng phương pháp HPLC tách sắc ký sử dụng gradient rửa giải với 0,01 mol/L Pha động gồm dung dịch kali photphat và một hỗn hợp metanol-axetonitril (tỉ lệ 1:1 về thể tích) Các cột được sử dụng là purosphersao C8 (15cm x 4,6mm; 5 µm) duy trì ở 25°C với tốc độ dòng chảy của 1 mL/phút, detector UV phát hiện ở bước sóng 254 nm Phương pháp có độ tuyến tính, độ chính xác cao theo chuẩn ICH Thời gian lưu của metyl parben, propul paraben, loratadin tương ứng là 2,4; 3,6 và 8,7 phút Các đường cong hiệu chuẩn tuyến tính cho việc khảo nghiệm trên phạm vi nồng

độ 120÷180 μg/mL, 12÷18 μg/mL và 80÷120 μg/mL tương ứng metyl parben, propul paraben và loratadin Độ thu hồi (%) lần lượt là 101,87 ±0,097÷101,93 ± 0,049 cho metyl parben, 101,64 ± 0,19÷101,60 ± 0,310 cho propul paraben và 101,36 ± 0,309÷101,31 ± 0,471 cho loratadin Các giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) tương ứng cho metyl parben là 7,155 μg/mL; 21,682 μg/mL; propul paraben 0,065 μg/mL; 0,199 μg/mL; loratadin là 0,464 μg/mL; 1,406 μg/mL [27]

Zahid A.Chaudhary ứng dụng phương pháp HPLC để định lượng dextromethophan hydrobromit và quinidin sunphat trong dược phẩm, phương pháp đã được thực hiện bằng kỹ thuật isocratic trên một pha đảo ngược: với cột ODS C18 (250mm X 4,6 mm; 5 mm kích thước hạt) và detector UV phát hiện ở bước sóng 234 nm, pha động gồm hỗn hợp đệm photphat (pH 4,5): metanol (tỉ lệ 55: 45 về thể tích), tốc độ dòng chảy 1,0 mL/phút Thời gian lưu trung bình cho dextromethophan hydrobromit và quinidin sunphat tương ứng là 3,6 và 5,5 phút Khoảng nồng độ tuyến tính là 10÷30 μg/mL và 5÷15μg/mL tương ứng cho dextromethophan hydrobromit và quinidin sunphat Hệ số tương quan được tìm thấy tương ứng là 0,995 và 0,997 cho dextromethophan hydrobromit và quinidin sunphat Có nghĩa khảo nghiệm đã được phát hiện là 99,5% và 97,00% cho dextromethophan hydrobromit và quinidin sunphat tương ứng Các phương pháp

đã được xác nhận theo chuẩn ICH, LOD & LOQ và các kết quả được tìm thấy là

thỏa đáng, do đó phương pháp này có độ nhạy tốt cho định lượng dextromethophan hydrobromit và quinidin sunfat Các phương pháp phân tích cũng được áp dụng trong các phòng thí nghiệm thông thường Nó cũng có thể được áp dụng cho kiểm tra, kiểm soát chất lượng cho các loại thuốc ở dạng viên nang [33]

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đã được Hatice Caglar và cộng sự

dùng để xác định đồng thời pseudoephdrin HCl, pheniramin maleat, acetaminophen, guaifenisin, maleat pyrilamin, clorpheniramin maleat, triprolidin HCl, dextromethophan HBr, diphenhydramin HCl trong dược phẩm Sử dụng cột Nucleodur C18 cột (250 x 4,0 mm; 5μm) Pha động gồm metanol: hỗn hợp đệm (tỉ lệ 38:62 về thể tích) ở nhiệt độ phòng, với tốc độ dòng chảy là 0,75 mL/phút Bước sóng phát hiện ở 210 nm Tuyến tính trên một phạm vi nồng độ của 0,2÷250 μg/mL cho acetaminophen; 0,5÷250 μg/mL cho pseudoephdrin HCl

và pheniramin maleat, 1÷250 μg/mL cho guaifenisin; 2,5÷250 μg/mL cho clorpheniramin maleat và triprolidin HCl; 5÷250 μg/mL cho pyrilamin maleat và diphenhydramin HCl; 10÷20 μg/mL cho dextromethophan HBr với hệ số tương quan lớn hơn 0,9993 Độ lệch chuẩn tương đối đều nhỏ hơn 4% Phương pháp này đã được áp dụng thành công cho các chất trên trong nhiều thuốc ho khác nhau và các chế phẩm như xi rô và viên nén [21]

Phương pháp HPLC-UV được Alagar Raja ứng dụng để tách và định lượng acetaminophen, dextromethophan hydrobromit và doxylamin succinat trong dược phẩm Máy RP-HPLC sử dụng cột Waters C18 (250 mm x 4,6 mm; 5μm), pha động gồm dung dịch đệm kali dihydrophotphat, pH được điều chỉnh đến 3,5 ± 0,05 với axit o-photphoric (A) và axetonitril (B), A:B tỉ lệ là 85:15 về thể tích trong 15,0 phút đầu, và sau đó nó đã được duy trì ở tỉ lệ 70:30 cho mười phút tiếp theo và cuối cùng trong mười phút cuối cùng nó được duy trì ở mức 85:15; tốc độ dòng chảy là 1,2 mL/phút Cột nhiệt độ được đặt ở nhiệt độ môi trường, bước sóng UV-phát hiện cố định tại 270 nm Acetaminophen tuyến tính

hydrobromit trong phạm vi 5÷15 μg/mL và doxylamin succinat trong phạm vi của 3,125÷9,375 μg/mL Phương pháp chính xác để xác định khảo nghiệm là dưới 2,0% RSD Độ thu hồi dao động từ 98%-102% Phương pháp này rất hữu ích trong việc kiểm soát chất lượng của dược phẩm [17]

1.3.2 Kết quả xác định một số chất theo phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử

Trên thế giới nói chung và ở nước ta nói riêng, phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis) được ứng dụng nhiều trong phân tích các chế phẩm

về dược và kết quả đều cho thấy phương pháp có độ tin cậy cao

Năm 2011, Lê Ngọc Anh xác định thành công acetaminophen, loratadin

và dextromethophan HBr trong thuốc viên nén hapacol-CF bằng phương pháp trắc quang Điều kiện tối ưu để xác định đồng thời acetaminophen, loratadin và dextromethophan HBr trong hỗn hợp : Khoảng bước sóng thích hợp để quét phổ từ 210-285 nm, bước sóng ứng với độ hấp thụ quang cực đại của dung dịch acetaminophen λmax=244 nm, loratadin λmax=273 nm và dextromethophan HBr λmax=278nm; trong môi trường axit HCl 0,1M độ hấp thụ quang của acetaminophen, loratadin và dextromethophan HBr ổn định và đạt cực đại; khoảng thời gian tối ưu để tiến hành thí nghiệm đo quang là 30 đến 60 phút sau khi pha và tại nhiệt độ 250C Kết quả thu được: xác định được LOD, LOQ và khoảng tuyến tính của acetaminophen: 1,3÷25 μg/mL, loratadin: 1,3÷80 μg/mL, dextromethophan HBr: 0,6÷100 μg/mL độ thu hồi của acetaminophen từ 101,08% đến 102,08%; loratadin từ 92,9% đến 99,45%; dextromethophan HBr

từ 99,78% đến 102,24% [3]

Năm 2012, Siladitya Behera và các cộng sự xác định thành công

acetaminophen thuốc viên nén sử dụng phương pháp UV-Vis Điều kiện tối ưu

để xác định acetaminophen: Khoảng bước sóng thích hợp để quét phổ từ

200-400 nm, bước sóng ứng với độ hấp thụ quang cực đại của dung dịch acetaminophen λmax = 243 nm Khoảng thời gian tối ưu để tiến hành thí nghiệm

đo quang là trong khoảng 8 giờ, ở nhiệt độ phòng Kết quả thu được: khoảng

tuyến tính độ hấp thụ quang của acetaminophen là 0,00 đến 150,0 μg/mL, độ thu hồi của acetaminophen từ 98,54% đến 99,13% [31]

Năm 2013, Đào Thị Lan Phương xác định thành công dextromethophan HBr, clopheninamin maleat và guaifenesin trong thuốc viên methophan bằng phương pháp trắc quang Điều kiện tối ưu để xác định đồng thời

dextromethophan HBr , clopheninamin maleat và guaifenesin trong hỗn hợp : Khoảng bước sóng thích hợp để quét phổ từ 210-285 nm, bước sóng ứng với độ hấp thụ quang cực đại của dung dịch dextromethophan HBr λmax=278nm, clopheninamin maleat λmax=264nm và guaifenesin λmax=273nm; trong môi trường axit HCl 0,1M độ hấp thụ quang của dextromethophan HBr, clopheninamin maleat và guaifenesin ổn định và đạt cực đại; khoảng thời gian tối ưu để tiến hành thí nghiệm đo quang là 30 đến 60 phút sau khi pha và tại nhiệt độ phòng Kết quả thu được: xác định được LOD, LOQ và khoảng tuyến tính của dextromethophan HBr: 0,5÷100μg/mL, clopheninamin maleat: 0,2÷50μg/mL, guaifenesin: 0,1÷50μg/mL độ thu hồi của dextromethophan HBr

từ 96,60% đến 101,08%, clopheninamin maleat từ 98,70% đến 102,03%, guaifenesin từ 99,01% đến 103,00% [11]

Năm 2014, Vũ Duy Long xác định thành công đồng thời acetaminophen, clopheninamin maleat và phenylephin hydroclorit trong thuốc TIFFY Điều kiện tối ưu để xác định đồng thời acetaminophen , clopheninamin maleat và phenylephin hydroclorit trong hỗn hợp : Khoảng bước sóng thích hợp để quét phổ từ 210-290 nm, bước sóng ứng với độ hấp thụ quang cực đại của dung dịch acetaminophen λmax = 244 nm, clopheninamin maleat λmax = 264 nm và phenylephin hydroclorit λmax = 273 nm trong môi trườ ng axit HCl 0,1M Khoảng thời gian tối ưu để tiến hành thí nghiệm đo quang là từ 20 đến 90 phút sau khi pha và có thể tiến hà nh thí nghiê ̣m ở nhiê ̣t đô ̣ phòng Kết quả thu được: khoảng tuyến tính độ hấp thụ quang của acetaminophen là 0,2 đến 30,0 μg/mL, clopheninamin maleat là từ 0,2 đến 40,0 μg/mL và phenylephin hydroclorit là từ

phenylephin hydroclorit là từ 99,1% đến 99,6% và của clopheninamin maleat là

từ 98,1% đến 100,7% [7]

Năm 2014, Jain Pritam và cộng sự đã xác định thành công dextromethophan HBr bằng phương pháp UV-Vis Điều kiện tối ưu để xác định dextromethophan HBr trong hỗn hợp : Khoảng bước sóng thích hợp để quét phổ từ 200-400 nm, bước sóng ứng với độ hấp thụ quang cực đại của dung dịch dextromethophan HBr λmax = 281 nm trong môi trườ ng axit HCl 0,1M Kết quả thu được: khoảng tuyến tính độ hấp thụ quang của dextromethophan HBr là 30,0 đến 80,0 μg/mL với hệ số tương qua R2=0,999, độ thu hồi của dextromethophan HBr từ 99,2% đến 101,76% [20]

Năm 2014, K.B Shalini và các cộng sự đã xác định thành công loratadin dạng bào chế trong thuốc viên Điều kiện tối ưu để xác định loratadin trong thuốc: Khoảng bước sóng thích hợp để quét phổ từ 200-400 nm, bước sóng ứng với độ hấp thụ quang cực đại của dung dịch loratadin λmax = 250 nm sử dụng axetonitril làm dung môi Kết quả thu được: khoảng tuyến tính độ hấp thụ quang của loratadin 4-24 μg/mL với hệ số tương quan là 0,999, độ thu hồi của loratadin

từ 80% đến 120%, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) tương ứng là 0,57 và 1,9 μg/mL [23]

Năm 2015, Bùi Đức Ngọc xác định thành công đồng thời acetaminophen , cafein trong thuốc panadol extra và hapacol extra Điều kiện tối ưu để xác định đồng thời acetaminophen , cafein trong hỗn hợp : Khoảng bước sóng thích hợp

để quét phổ từ 210-290 nm, bước sóng ứng với độ hấp thụ quang cực đại của dung dịch acetaminophen λmax = 243 nm, cafein λmax = 272 nm trong môi trườ ng axit HCl 0,1M Khoảng thời gian tối ưu để tiến hành thí nghiệm đo quang là từ

30 đến 40 phút sau khi pha và có thể tiến hành thí nghiê ̣m ở nhiê ̣t đô ̣ phòng Kết quả thu được: khoảng tuyến tính độ hấp thụ quang của acetaminophen là 0,2 đến 30,0 μg/mL, cafein 0,2 đến 30,0 μg/mL, độ thu hồi của acetaminophen từ 96,8% đến 99,6%, của cafein là từ 94,8% đến 98,9% [9]

Chương 2 THỰC NGHIỆM

2.1 Nội dung nghiên cứu

Áp dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis) để xây dựng quy trình xác định đồng thời ACE, LOR và DEX trong thuốc Rhumenol Flu 500 trên thị trường

Khảo sát để lựa chọn các điều kiện sắc ký:

- Bước sóng thích hợp để phát hiện đồng thời 3 chất

- Pha động: thành phần, tỷ lệ pha động, tốc độ dòng

Đánh giá quy trình sắc ký đã xây dựng được:

- Khảo sát tính thích hợp của hệ thống

- Khảo sát khoảng tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của các chất

- Khảo sát độ chính xác của phương pháp

- Khảo sát độ đúng của phương pháp

Xác định đồng thời ACE, LOR và DEX trong thuốc Rhumenol Flu 500 theo phương pháp HPLC

2.1.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử

- Tiến hành quét phổ từ 200 nm đến 900 nm để xác định kiểm tra lại bước sóng hấp thụ quang cực đại của các dung dịch ACE, LOR và DEX

- Khảo sát sự ổn định độ hấp thụ quang của ACE, LOR và DEX theo môi trường nền, pH, thời gian, nhiệt độ để lựa chọn khoảng thời gian, nhiệt độ và pH thích hợp khi thực hiện các phép đo quang

- Khảo sát khoảng tuyến tính của ACE, LOR và DEX từ đó xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

- Định lượng đồng thời ACE, LOR và DEX trong các mẫu tự pha để xác

đi ̣nh các sai số khi tỷ lê ̣ hàm lượng ACE, LOR và DEX khác nhau

- Xây dựng quy trình phân tích mẫu thuốc Rhumenol Flu 500, từ đó đánh giá độ tin cậy của phương pháp thông qua việc tính toán độ đúng và độ lặp lại của phép đo

- Định lượng đồng thời ACE, LOR và DEX t rong mẫu thuốc Rhumenol Flu 500 Đánh giá độ tin cậy của phương pháp thông qua xác đi ̣nh độ thu hồi

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pha ́ p nghiên cứ u lý thuyết

Nghiên cứ u tài liê ̣u trong và ngoài nước về xác đi ̣nh ACE , LOR và DEX trong hỗn hợp từ đó lựa cho ̣n phương pháp xác đi ̣nh ACE , LOR và DEX phù hợp

2.2.2 Phương pha ́ p thực nghiê ̣m

2.2.2.1 Phương pháp HPLC

Nghiên cứu các điều kiên tối ưu cho phương pháp HPLC để định lượng đồng thời ACE, LOR và DEX

Xử lý thống kê các kết quả thu được

2.2.2.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử

- Pha chế dung dịch chuẩn ACE , LOR và DEX và hỗn hợp của chúng

- Xác định các điều kiện tối ưu cho phép đo quang ACE, LOR và DEX

- Tiến hành xác đi ̣nh đồng thời 2 chất trong các mẫu giả tự pha

- Tiến hành xác đi ̣nh đồng thời 3 chất trong các mẫu giả tự pha

- Tiến hành xác đi ̣nh đồng thời 3 chất trong mẫu thuốc Rhumenol Flu 500

- Sử dụng phương pháp lọc Kalman (bằng chương trình đã lập)

2.3 Đánh giá độ tin cậy của quy trình phân tích

2.3.1 Giới hạn phát hiện (LOD)

LOD được coi là nồng độ thấp nhất của chất nghiên cứu mà hệ thống phân tích cho tín hiệu phát hiện phân biệt với tín hiệu nền Trong phân tích trắc quang LOD tính theo phương trình hồi quy có công thức như sau :

LOD = 3.SD

Trong đó:

LOD: giới hạn phát hiện

SD: độ lệch chuẩn của tín hiệu trên đường chuẩn

B: độ dốc của đường chuẩn chính là độ nhạy của phương pháp

2.3.2 Giới hạn định lượng (LOQ)

LOQ được coi là nồng độ thấp nhất của chất nghiên cứu mà hệ thống phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích khác, có ý nghĩa định lươ ̣ng với tín hiệu nền và đạt độ tin cậy tối thiểu  95%, thông thường người ta sử dụng công thức:

10.SDLOQ =

B (2.2) Trong đó:

LOQ: giới hạn định lượng

2.3.3 Đánh giá độ tin cậy của phương pháp

- Đánh giá độ đúng của phương pháp đối với các hỗn hợp ACE, LOR và DEX tự pha chế thông qua sai số tương đối RE Sai số tương đối của các phép phân tích đối với mẫu chuẩn tự pha chế thông qua việc tính tỷ số giữa độ sai lệch của nồng độ tính toán được với nồng độ thực đã biết của mẫu theo công thức:

RE%: sai số tương đối của phép xác định nồng độ các cấu tử

C0 (µg/mL): nồng độ đã biết của dung di ̣ch ACE, LOR và DEX trong hỗn hợp

- Đánh giá độ đúng của phương pháp đối với các mẫu thuốc nghiên cứ u thông qua độ thu hồi bằng phương pháp thêm chuẩn Độ thu hồi (Rev) được tính theo công thứ c sau:

Re = C - T 100%

a

a C

Ci : các giá trị nồng độ (µg/mL) của dung dịch ACE, LOR và DEX tính được lần thứ i;

: giá trị nồng độ thực của mẫu;

C: giá trị nồng độ trung bình tính được sau n lần xác định;

k : số bậc tự do

2.3.4 Đánh giá kết quả phép phân tích theo thống kê

Khoảng tin cậy của phép xác định nồng độ được tính theo công thức:

X: giá trị trung bình của tập số liệu các kết quả nghiên cứu

S: độ lệch chuẩn, được tính theo công thức (2.5)

N: số phép đo

2.4 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

2.4.1 Thiết bị

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Hitachi L-2000 với detector UV-Vis

L-2420 của Khoa Hóa học, Trường Đa ̣i ho ̣c Sư pha ̣m – Đại học Thái Nguyên

- Máy quang phổ UV – 1700 Shimadzu của Khoa Hóa học , Trường Đa ̣i học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên, có khả năng quét phổ trong khoảng bước sóng 190nm – 900 nm, có kết nối máy tính

- Cốc thủy tinh, phễu thủy tinh, ống nghiệm

- Chương trình lọc Kalman tính toán đồng thời nồng độ các cấu tử [13]

- Màng lọc 0,45µm

2.4.4 Chế phẩm Rhumenol Flu 500

Thành Phần:

2.5 Chuẩn bị các dung môi để ho ̀a tan mẫu

Để hòa tan các mẫu nghiên cứu, chúng tôi đã sử dụng các dung môi sau:

- Dung dịch đệm (H3PO4 - KH2PO4)