NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ CÁC ĐẶC TÍNH NÔNG SINH HỌC VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG VIRUS CỦA CON LAI SOMA KHOAI TÂY (DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN

NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ CÁC ĐẶC TÍNH NÔNG SINH HỌC VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG VIRUS CỦA CON LAI SOMA KHOAI TÂY (DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN)

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHOAI TÂY (DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN)

Giáo viên hướng dẫn : GS.TS Nguyễn Quang Thạch

KS.Vũ Thị Hằng Sinh viên thực hiện : Vũ Thị Lan

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và kính trọng tới GS

TS Nguyễn Quang Thạch, người đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện đề tài tạiViện sinh học nông nghiệp

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới cán bộ phòng Thí nghiệmCNSH Khoai tây - Viện Sinh học Nông nghiệp – Trường Đại học Nôngnghiệp Hà Nội, đặc biệt là KS Vũ Thị Hằng đã nhiệt tình hướng dẫn và tạođiều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian thực tập tại đây

Xin cảm ơn sâu sắc các thầy cô giáo Viện Đại học Mở Hà Nội, đặcbiệt là các thầy cô khoa Công nghệ sinh học đã trang bị cho tôi những kiếnthức vô cùng bổ ích, giúp tôi có nền tảng thực hiện tốt đề tài này

Cuối cùng, tôi xin dành lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn luôn ởbên, động viên, an ủi tôi trong quá trình tôi thực hiện đề tài

Hà nội, ngày 25 tháng 5 năm 2011

Sinh viên

Vũ Thị Lan

CÁC KÍ TỰ VIẾT TẮT

 AFLP-Amplified Fragment length polymorphism

 BC (Back cross)

 NST Nhiễm sắc thể

 PLRV Potato leafroll luteovirus PLRV

 PVA Potato A potyvirus

Lời cảm ơn i

Các kí tự viết tắt ii

Mục lục iii

Danh mục các bảng vi

Danh mục các đồ thị viii

Danh mục các hình ix

MỞ ĐẦU 1

I Đặt vấn đề 1

II Mục đích và yêu cầu 2

1 Mục đích 2

2 Yêu cầu 2

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu chung về cây khoai tây 3

1.1.1 Nguồn gốc 3

1.1.2 Phân loại 3

1.1.4 Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh của cây khoai tây 6

1.1.5 Giá trị dinh dưỡng của cây khoai tây 8

1.2 Tình hình sản xuất, tiêu thụ khoai tây trên thế giới và ở Việt nam 9

1.3 Bệnh virus ở khoai tây 11

1.3.1 Tìm hiểu về virus hại khoai tây và hậu quả do virus gây ra 11

1.3.2 Giải pháp khắc phục 16

1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 19

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 19

1.4.2 Một số nghiên cứu về dung hợp tế bào trần trên đối tượng cây khoai tây ở Việt Nam .21

PHẦN II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 23

2.1.1 Đối tượng 23

2.1.2 Vật liệu 23

2.1.3 Địa điểm 23

2.1.4 Thời gian nghiên cứu 23

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Đánh giá độ bội của một số dòng cây tái sinh 24

2.2.2 Các thí nghiệm đánh giá sự sinh trưởng, phát triển và hình thành năng suất trong điều kiện chậu vại và khả năng hình thành năng suất trong hai điều kiện trồng trọt (khí canh và địa canh) 24

2.2.3 .Đánh giá khả năng kháng virus PVY thông qua lây nhiễm nhân tạo, test ELISA và chỉ thị phân tử (PCR) 26

2.2.4 Đánh giá chỉ tiêu hóa sinh 28

2.2.5 Xử lý số liệu 30

PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Kết quả đánh giá độ bội của các dòng cây tái sinh 31

3.2 .Kết quả đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của các dòng bố mẹ và con lai soma trong điều kiện chậu vai và khả năng hình thành năng suất trong hai điều kiện trồng trọt (khí canh và địa canh) 33

3.2.1 .Đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của các dòng bố mẹ và con lai soma trong điều kiện chậu vại 33

3.2.2 .Đánh gía năng suất của hai dòng con lai triển vọng là H76 và H79 trong điều kiện khí canh và đất 52

3.3 Kết quả đánh giá khả năng kháng virus PVY thông qua phương pháp lây nhiễm nhân tạo, test ELISA và chỉ thị phân tử 57

3.3.1 Phương pháp lây nhiễm nhân tạo và test ELISA 57

3.3.2 Phương pháp chỉ thị phân tử 61

3.4 Phân tích một số chỉ tiêu hóa sinh đánh giá chất lượng củ của tổ hợp PA41+PA15/H76 và H79 63

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Sản lượng khoai tây trên thế giới, 1991-2007 9

Bảng 1.2: Diện tích , sản lượng và năng suất khoai tây của các châu lục trong các năm 2006-2007 9

Bảng 1.3: Diện tích, năng suất, sản lượng và khoai tây giống ở Việt Nam 10

Bảng 1.4: Nhóm virus chính hại khoai tây (Beemster và DeBokx 1987; Burton 1989; Brunt et al 1996) 13

Bảng 3.1: Chiều cao trung bình các thời kỳ theo dõi của tổ hợp lai H76 và H79 34

Bảng 3.2: Chiều cao trung bình cây qua các thời kỳ theo dõi của tổ hợp PB208+ PB186/ H21-1 36

Bảng 3.3: Chiều cao trung bình các thời kỳ theo dõi của tổ hợp PA16+ PB186/ H81-2 37 Bảng 3.4: Số lá trung bình ở các thời kỳ theo dõi của tổ hợp lai PA41+PA15/ H79 và H76 .39

Bảng 3.5: Số lá trung bình ở các thời kỳ theo dõi của tổ hợp lai PB208+PB186/ H21-1.40 Bảng 3.6: Số lá trung bình ở các thời kỳ theo dõi của tổ hợp lai PA16+PB186/ H81-2 .41 Bảng 3.7: Đường kính thân trung bình các thời kỳ theo dõi của tổ hợp lai PA41+PA15/H76 và H79 43

Bảng 3.8: Đường kính thân trung bình các thời kỳ theo dõi của tổ hợp lai PB208+PB186/ H21-1 44

Bảng 3.9: Đường kính thân trung bình các thời kỳ theo dõi của tổ hợp lai PA16+PB186/H81-2 44

Bảng 3.10: Năng suất và các yếu tố hình thành năng suất của các dòng khảo sát 46

Bảng 3.11: Phân loại cấp củ sau thu hoạch với các giống khoai tây khảo sát 49

Bảng 3.12 : Đặc điểm hình thái củ 50

Bảng 3.13: Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất 53

Bảng 3.14: Đặc điểm hình thái củ và phân loại cấp củ 54

Bảng 3.15: Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất 55

Bảng 3.16: Đặc điểm hình thái củ và phân loại củ 56

Bảng 3.17: Kết quả test Elisa kiểm tra tính kháng virus PVX các con lai và bố mẹ trước

khi lây nhiễm nhân tạo 57

Bảng 3.18: Trình tự sắp xếp của các mẫu khoai tây vào giếng ELISA 58

Bảng 3.19: Kết quả test Elisa kiểm tra tính kháng virus PVY của các dòng lai và bố mẹ trước khi lây nhiễm nhân tạo 59

Bảng 3.20: Trình tự sắp xếp của các mẫu khoai tây vào giếng ELISA 59

Bảng 3.21: Trình tự sắp xếp của các mẫu khoai tây vào giếng ELISA 60

Bảng 3.22: Bảng tóm tắt đặc tính kháng virus PVY của dòng lai và “bố mẹ” 63

Bảng 3.23: Các chỉ tiêu hóa sinh 64

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ Đồ thị 3.1: Kết quả xác định độ bội của mẫu nhị bội A15 (2n=2x=24) 32

Đồ thị 3.2: Kết quả độ bội của các dòng tái sinh (2n=4x=48) 32

Đồ thị 3.3: Biểu đồ thể hiện chiều cao trung bình các thời kỳ theo dõi của tổ hợp lai PA41+PA15/H76 và H79 34

Đồ thị 3.4: Biểu đồ thể hiện chiều cao trung bình cây qua các thời kỳ theo dõi của tổ hợp PB208+ PB186/ H21-1 36

Đồ thị 3.5: Biểu đồ thể hiện chiều cao trung bình các thời kỳ theo dõi của tổ hợp PA16+ PB186/ H81-2 38

Đồ thị 3.6: Biểu đồ thể hiện số lá trung bình ở các thời kỳ theo dõi của tổ hợp lai PA41+PA15/ H79 và H76 40

Đồ thị 3.7: Biểu đồ thể hiện số lá trung bình ở các thời kỳ theo dõi của tổ hợp lai PB208+PB186/ H21-1 41

Đồ thị 3.8: Biểu đồ thể hiện số lá trung bình ở các thời kỳ theo dõi của tổ hợp lai PA16+PB186/ H81-2 42

Đồ thị 3.9: Biểu đồ thể hiện động thái tăng trưởng đường kính thân của các dòng khảo sát 45

Đồ thị 3.10: Biểu đồ thể hiện các yếu tố cấu thành năng suất của các giống khoai tây khảo sát 48

Đồ thị 3.11: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ các cấp củ của các giống khoai 49

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.6: Sự sinh trưởng và khả năng tạo củ của con lai H79 và H76 trong điều kiện

MỞ ĐẦU

I Đặt vấn đề

Khoai tây (Solanum tuberosum L.) là loại cây lương thực chủ lực, chỉ

sau lúa mỳ, lúa gạo và ngô [30] Với đặc điểm là thời gian sinh trưởng ngắn,

dễ thích ứng với nhiều vùng khí hậu, cho hiệu quả kinh tế và giá trị dinhdưỡng cao, đặc biệt có ý nghĩa đối với những nước nghèo và nước đang pháttriển Hiện nay, khoai tây được sử dụng dưới nhiều dạng khác nhau như ăntươi, salát, nấu súp,… từ đó con người đã chế biến ra hàng trăm món ăn khácnhau, thơm ngon, rẻ tiền

Ở Việt Nam, ngành chế biến khoai tây đang phát triển mạnh mẽ Sảnxuất khoai tây chế biến là hướng đi tiềm năng trong công nghiệp thực phẩm ởViệt Nam Nhưng vấn đề sản xuất khoai tây ở Việt Nam đang gặp nhiều trởngại trong đó trở ngại lớn nhất là giống khoai tây bị thoái hóa do nhiễm cácloại virus, chất lượng khoai tây chưa đáp ứng được yêu cầu của giống khoaitây chế biến Để giải quyết vấn đề này thì công cuộc chọn tạo giống là khôngthể thiếu Tuy nhiên bộ NST của khoai tây trồng trọt là tứ bội (2n=4x=48) nêngây khó khăn cho công tác chọn tạo giống cổ điển như lại tạo, đột biến, chọnlọc (Kuckuck và cộng sự, 1985), các kỹ thuật này vấp phải những khó khăn

về mặt di truyền Trên cơ sở bộ genom tứ bội (2n=4x=48) tạo ra tỷ lệ phân lylớn sau lai tạo, khiến quá trình chọn lọc sau đấy rất khó khăn với một quầnthể rất lớn Quá trình chọn tạo giống mới tốn rất nhiều công sức và thời gian.Mặt khác trong quá trình lai tạo cũng đánh mất dần các tính trạng quý củacây Trước những khó khăn đó cùng sự phát triển như vũ bão của công nghệsinh học, đặc biệt với sự xuất hiện và ứng dụng của kỹ thuật dung hợp tế bàotrần (dung hợp protoplast) đã vạch ra một giải pháp đúng đắn rút ngắn thờigian chọn tạo giống Con đường dung hợp protoplast là con đường có hiệuquả nhất để khắc phục được khó khăn trong quá trình lai tạo hữu tính khác

loài hoặc khác chi Kỹ thuật này cũng cho phép tạo ra sự tái tổ hợp gen ởnhững loài đa bội hoặc có cơ quan sinh sản hữu tính kém phát triển.

Áp dụng khoa học kỹ thuật tiên tiến Viện Sinh học Nông nghiệp đã

tiến hành phương pháp dung hợp tế bào trần để tạo ra dòng khoai tây phù hợp

với yêu cầu chế biến và có khả năng kháng virus Các nghiên cứu về dunghợp tế bào trần đã đạt được các kết quả có ý nghĩa, tái sinh được cây hoànchỉnh từ dung hợp tế bào trần Để hoàn thiện quá trình nghiên cứu tạo con laisoma, tạo giống khoai tây kháng bệnh virus bằng kỹ thuật trên ta cần nghiêncứu đánh giá, so sánh đặc tính nông sinh học và tính kháng virus của các con

lai soma và các dòng bố mẹ trong điều kiện in vivo Vì vậy, chúng tôi thực

hiện đề tài: “Nghiên cứu đánh giá các đặc tính nông sinh học và khả năng

kháng virus của con lai soma khoai tây (dung hợp tế bào trần)”

II Mục đích và yêu cầu

1 Mục đích

- Đánh giá các con lai soma và các dòng bố mẹ về các đặc tính nôngsinh học, các chỉ tiêu chất lượng củ và khả năng kháng virus (PVY) bằng lâynhiễm nhân tạo và test ELISA và chỉ thị phân tử

.2 Yêu cầu

- Xác định độ bội của các con lai soma tái sinh.

- Đánh giá sự sinh trưởng, phát triển, năng suất của các con lai soma

trong điều kiện in vivo

- Đánh giá được khả năng kháng virus PVY của con lai soma và cácdòng bố mẹ bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo, test ELISA

- Đánh giá khả năng kháng virus PVY của các con lai Soma và cácdòng bố mẹ bằng chỉ thị phân tử

- Đánh giá được các chỉ tiêu chất lượng (hàm lượng đường khử, hàmlượng đường tổng số, hàm lượng tinh bột, hàm lượng vitamin C) của các conlai soma và các dòng bố mẹ

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về cây khoai tây

1.1.1 Nguồn gốc

Cây khoai tây (Solanum tuberosum) là một cây trồng cổ đại Các bằng

chứng về khảo cổ học, lịch sử và ngôn ngữ học cũng như thực vật học đềuchứng minh rằng khoai tây có nguồn gốc từ Nam Mỹ Nhiều loài khoai tâyhoang dại còn tồn tại tới ngày nay, đặc biệt ở dãy Andes thuộc Peru, Bolivia

Hà Tây (Hồ Hữu An, 2005)[1] Hiện nay, khoai tây được trồng tập trung chủ

yếu ở Đồng Bằng Sông Hồng, Sapa, Đà Lạt những vùng có khí hậu mát mẻ,

ôn hòa… (Đỗ Kim Chung, 2003)[3].

1.1.2 Phân loại

Khoai tây (Solanum tuberosum L.) thuộc loài S tuberosum, chi

Solanum, họ cà Solanaceae, bộ Solanales, phân lớp Asteridae, lớpMagnoliopsida, ngành Magnoliophyta

Theo J.G.Hawkerkks (1991), khoai tây được phân thành 18 nhóm,trong đó có 68 loài hoang dại, chỉ có 8 loài trồng trọt, chia thành 4 nhóm chủ

yếu dựa vào số lượng NST (Tạ Thu Cúc ,2007)[2].

 Nhóm 1: Diploids : 2n = 2x = 24.

S.x arjanhuiri juz.et Buk

S gomiocalyx juz.et Buck

S stenotomum Juz.et Buk

S phueja Juz.et Buk.

Trong các loài trên, loài S phueja Juz.et Buk có ý nghĩa lớn nhất với

Ở các thân ngầm dưới mặt đất (còn gọi là tia củ) cũng có khả năng ra

rễ, nhưng rễ ngắn và ít phân nhánh Bộ rễ phân bố chủ yếu trên đất canh tác 0

– 40 cm, nhưng cũng có rễ ăn sâu tới 1.5 – 2m.( Tạ Thu Cúc ,2007)[2]

* Thân:

Thân khoai tây mọc thẳng, đôi khi có cấu tạo zích zắc, có 3-4 cạnh,cao trung bình từ 40-70cm đến 1-1,2m Phụ thuộc vào giống, thời kỳ chăm

sóc… mà chiều cao cây có thể khác nhau Thân thường có màu xanh hoặcxanh nhạt hay đậm, đôi khi có màu phớt hồng hoặc tím…tùy thuộc vào giống

* Lá:

Lá hình thành và hoàn thiện theo sự tăng trưởng của cây, bản lá to, lákép xẻ lông chim, có 3 – 7 đôi mọc đối xứng qua trục và một lá lẻ trên cùngthường lớn hơn gọi là lá chét đỉnh, màu sắc lá phụ thuộc vào giống, thời vụ,điều kiện chăm sóc mà có thể màu xanh, xanh đậm hoặc xanh nhạt, …

* Hoa:

Hoa khoai tây thường mọc tập trung trên một chùm hoa Nó thuộc loạihoa lưỡng tính và có cấu tạo 5 : 5 : 5, cuống ngắn Màu sắc hoa thường trắng,cũng có thể là phớt hồng, tím, hồng, vàng hoặc đỏ v.v phụ thuộc vào từngloại và giống

*Củ:

Củ khoai tây còn có tên gọi là thân củ hay thân ngầm bởi củ được hình thành

là do thân phát triển dưới đất, trong điều kiện bóng tối Hình dạng củ khoai tây cóthể là tròn, elíp, tròn dài, đôi khi hình vuông Màu sắc củ tuỳ thuộc vào từng giống,

có thể là màu trắng, trắng nhạt, vàng, hay vàng nhạt v.v

* Mầm:

Mầm khoai tây phát triển từ điểm sinh trưởng của mắt củ, là cơ quansinh sản vô tính của khoai tây Màu sắc của mầm khác nhau phụ thuộc vào từnggiống có thể màu trắng hoặc màu tím, khi gặp ánh sáng mầm có màu xanh

1.1.4 Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh của cây khoai tây

* Nhiệt độ:

Nhiệt độ trong vụ trồng khoai tây là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến

sự phát triển của cây và năng suất củ Nhiệt độ trong vụ trồng bình quân là

16oC – 18oC là thích hợp và cho năng suất cao nhất Các thời kỳ sinh trưởngkhác nhau sẽ yêu cầu điều kiện nhiệt độ khác nhau

Hạt nảy mầm ở nhiệt độ tối thiểu 12oC –15oC và nhiệt độ thích hợp nhất

là 18oC – 22oC Nhiệt độ lớn hơn 25oC làm mầm phát triển chậm và dễ thối

Thời kỳ phát triển tia củ yêu cầu thời gian chiếu sáng ngắn để thúc

đẩy hình thành thân và củ (Mai Thạch Hoành ,2003)[5].

* Độ ẩm:

Khoai tây là cây có bộ rễ ăn nông, tiềm năng năng suất cao nên để câykhoai tây sinh trưởng, phát triển tốt cần phải cung cấp nước thường xuyên.Các thời kỳ sinh trưởng khác nhau yêu cầu về nước cũng khác nhau:

Thời kỳ trồng đến xuất hiện tia củ đảm bảo độ ẩm tối thiểu 60-80%.Thời kỳ phát triển củ cần thường xuyên giữ ẩm độ ẩm đất là 80%.Thiếu nước hoặc thừa nước đều ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng của

cây (Mai Thạch Hoành ,2003)[5]

của củ (Trương Văn Hộ, 1990)[4].

* Sâu bệnh:

+ Các loại bệnh virus hại khoai tây:

Có nhiều bệnh virus hại khoai tây, đến nay các nhà khoa học đã xácđịnh được các loài chủ yếu như sau:

Virus Y (Potato Virus Y)

Virus X (Potato Virus X)

Virus A (Potato Virus A)

Virus M (Potato Virus M)

Virus S (Potato Virus S)

Biện pháp chủ yếu là phòng là chính, như sử dụng các giống chốngchịu virus, tiêu diệt những côn trùng truyền bệnh như rầy rệp; khi phát hiệncây bị bệnh, ta nhổ bỏ rồi dùng vôi bột rắc vào vị trí đó

- Bệnh mốc sương hại khoai tây:

Bệnh do nấm Phytophthora infestans DB gây ra và rất phổ biến ở các

vùng trồng khoai tây Ban đầu bệnh xuất hiện trên lá, trên cành khoai tây cácvết nhỏ màu nâu Khi vết bệnh loang ra trên nhiều lá, lá cây héo, rũ xuống, cómàu đen, khô dòn Khi thời tiết ẩm, có sương buổi sáng, ở dưới chung quanhvết bệnh xuất hiện các đám nấm màu trắng

Khi bệnh xuất hiện thì phun thuốc Boocdo và các loại thuốc có đồng

- Bệnh đốm vàng:

Bệnh do nấm Macrosporium Solani Ell-et Mart gây nên Bệnh rất phổ

biến ở các vùng trồng khoai tây Bệnh tạo thành các vết bệnh lớn hình trònhoặc có cạnh, màu nâu đậm Trên bề mặt vết bệnh có các vòng đồng tâm rất

rõ và các đám bào tử nấm màu đen nhạt

Khi bệnh xuất hiện phun thuốc Boodo và các loại thuốc có gốc đồng

* Sâu xám, sâu xanh, rệp,nhện đỏ

Sâu ăn lá, phá hoại chủ yếu ở giai đoạn cây con

Dùng thuốc Basudin hạt rắc vào đất hoặc dùng Diazinon, Decis phunvào gốc cây để trừ sâu xám

Rệp, nhện chích hút cây, làm cây còi cọc, kém phát triển Dùng thuốcRidolmin

1.1.5 Giá trị dinh dưỡng của cây khoai tây

Khoai tây được ví như “kho báu’’ngoài yếu tố thuộc nhóm thực phẩmcao cấp, ngoài thành phần dinh dưỡng trong củ phong phú và đa dạng baogồm: tinh bột, protein, lipit, các loại vitamin ( B1, B2, B3, B6, PP, C), các

chất khoáng, các axitamin tự do[30] Thì nó còn có nhiều tính chất đáng quý

khác như: dễ trồng, dễ mọc, không đắt, chất lượng cao, … phong phú về giátrị sử dụng: chế biến được nhiều món ăn, làm thuốc chữa bệnh (bệnh viêm

loét dạ dày, hành tá tràng, bệnh thần kinh, bỏng, quai bị (ykhoanet.com)[30].

Khoai tây còn là cây dễ thích nghi, năng suất cao, thích ứng với chi phí đầuvào thấp Mọi bộ phận trên củ khoai tây đều có giá trị dinh dưỡng

Theo nguồn: United States Department of Agriculture, National Nutrient Database, 2008 cho biết thành phần dinh dưỡng trong 100 gam củ

khoai tây sau khi luộc cả vỏ và nướng

Bên cạnh giá trị lương thực, thực phẩm, thức ăn gia súc, khoai tây còn

là nguồn nguyên liệu cho nhiều ngành công nghiệp (Nguyễn Quang Thạch,

1993)[10], nguyên liệu trong ngành dược phẩm, cũng như sử dụng khoai tây làm mỹ phẩm (Đỗ Kim Chung2003)[3] Do đó khoai tây được khẳng định là

rất quan trọng đối với con người

1.2 Tình hình sản xuất, tiêu thụ khoai tây trên thế giới và ở Việt nam

Theo công bố của tổ chức nông lương quốc tế (FAO) và Trung tâmkhoai tây quốc tế (C.I.P) cho thấy tình hình sản xuất khoai tây của thế giới từnăm 1990-2007 đã có những bước tiến đáng kể Sản lượng khoai tây thế giới

từ 279,32 (1990) tăng lên 320,67 triệu tấn (2007)

Bảng 1.1: Sản lượng khoai tây trên thế giới, 1991-2007

Nước 1991 1993 1995 1997 1999 2001 2003 2005 2007

triệu tấn

Phát triển 183.13199.31177.47174.63165.93166.93160.97159.97 159.89Đang phát triển 84.86 101.95108.50128.72135.15145.92152.11160.01 165.41Thế giới 267.99301.26285.97303.35301.08312.85313.08319.98 325.30

Bảng 1.2: Diện tích , sản lượng và năng suất khoai tây của các châu lục

sản lượng (tấn)

Năng suất (tấn/ha )

Diện tích (ha)

Sản lượng (tấn)

Năng suất (tấn/ha )

Châu Phi 1.499.687 16.420.729 10,95 1.503.145 16.308.530 10,84 Châu Á 9.143.495 131.286.18

320.671.96

Liên Hiệp Quốc tuyên bố năm 2008 là năm quốc tế về khoai tây cơquan đặc trách về lương thực và nông nghiệp của Liên Hiệp Quốc đang hợptác với Hiệp Hội các nhà trồng Khoai Tây Quốc Tế tổ chức hội nghị ở thành

phố Cusco của Peru để bàn về những lợi ích của việc sản xuất khoai tây[30].

Sản xuất khoai tây tại Việt Nam đã đạt đỉnh điểm vào những năm 1979

và 1980 sau đó giảm dần Một trong những nguyên nhân chủ yếu dẫn đếnnăng suất thấp và diện tích trồng giảm dần là do thiếu nguồn củ giống tốt (tỷ

lệ nhiễm bệnh virus cao, già sinh lý và độ thuần chủng thấp)

Năm 2005 mức nhu cầu tiêu dùng khoai tây của Việt Nam vào khoảng530.000 tấn, dự báo năm 2010 nhu cầu tiêu dùng khoai tây sẽ tăng lên 710.000tấn Từ năm 2007 đến năm 2010 và những năm tiếp theo nhu cầu thị trườngkhoai tây đã tăng nhiều hơn Năm 2010: Phát triển diện tích cây khoai tây lên

50.000ha, sản lượng ước tính khoảng 20.000 tấn[30] Đây là cơ hội đối với

nông dân sản xuất khoai tây, đặc biệt là vùng đồng bằng sông Hồng có cơ hội

đầu tư sản xuất mặt hàng này[30] Hiện nay trung tâm giống cây trồng Trung

ương đã nhập nội, lai tạo một số giống khoai tây có triển vọng cho năng suất

cao đang được đưa vào sản xuất để nâng cao năng suất cây khoai tây[30].

Bảng 1.3: Diện tích, năng suất, sản lượng và khoai tây giống ở Việt Nam

Thế giới

Năm

Diện tích (ha) 28,022 30,000 32,102 33,887 34,000 35,000Năng suất (tấn/

Tổng sản lượng

(tấn) 315,950 315,950 377,472 362,371 365,000 370,000Khoai tây giống

(cây rau, 2007)

Tuy nhiên, vấn để sản xuất cũng còn gặp nhiều khó khăn trong quátrình sản xuất cũng như chọn tạo giống Giống khoai tây thường bị thoái hóa

do điều kiện ngoại cảnh và đặc biệt là hiện tượng thoái hóa do virus Chínhđiều đó đã thúc đẩy các nhà khoa học tìm ra các giải pháp ngăn chặn hiệntượng này Từ năm 1991 – 1997, Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Minh Tấn,Nguyễn Thị Kim Thanh đã có hàng loạt những công bố kết quả nghiên cứunhằm hoàn chỉnh quy trình sản xuất khoai tây giống có kích thước nhỏ sạchbệnh, tiến tới hoàn chỉnh hệ thống sản xuất giống khoai tây sạch bệnh có chất

lượng cao ở Việt Nam (Nguyễn Thị Kim Thanh, 1998)[13],[12].

Năm 2004, Viện Sinh học Nông nghiệp – Trường Đại học Nôngnghiệp I đã kết hợp với Bộ môn Sinh lý thực vật – Trường Đại học Nôngnghiệp I tiến hành xây dựng và đưa ra một hệ thống sản xuất giống khoai tâyhoàn toàn sạch bệnh

Để chủ động khắc phục tình trạng nhiễm virus trên khoai tây năm

2010 Viện sinh học nông nghiệp đã tạo ra dòng khoai tây mới bằng phươngpháp protoplast, dòng mới đã được trồng thử nghiệm và cho kết quả rất tốt

1.3 Bệnh virus ở khoai tây

1.3.1 Tìm hiểu về virus hại khoai tây và hậu quả do virus gây ra

Bệnh virus là bệnh rất nguy hiểm, khi xâm nhập vào cây, virus sẽ tấncông vào các tế bào, các cơ quan làm thay đổi các quá trình trao đổi chất củacây, qua đó sẽ làm ảnh hưởng lớn đến năng suất Khi cây bị nhiễm viruskhông thể chữa, chỉ có thể nhổ cây bị hại vứt xa nguồn nước và nơi trồng Bởi

vì virus tồn tại ở các mô sống nên virus rất nguy hiểm đối với những câytrồng nhân giống vô tính bằng củ tiếp tục nhân lên ở các thế hệ sau Ngoài rabệnh virus còn được lan truyền do côn trùng hoặc tiếp xúc cơ giới

Theo (Vũ Triệu Mân ,1978)[6] và một số tác giả khác cho rằng: virus

đã làm ảnh hưởng rất lớn đến năng suất và phẩm chất khoai tây, đặc biệt làvirus PVY làm giảm năng suất từ 50% - 90% Chính vì vậy, đến nay dù có

nhiều tác nhân gây bệnh hại khoai tây nhưng virus vẫn là nguyên nhân chủyếu làm giảm năng suất kinh tế một cách trầm trọng.

Theo Ross (1961), khoai tây là ký chủ của khoảng 60 loài virus Ông phát hiện ra virus là nguyên nhân gây nên hiện tượng thoái hóa giống khoai tây Theo nghiên cứu của Nguyễn Thơ, Nguyễn Phương Đại, Hà Minh trung,

Vũ Triệu Mân (1972 - 1986)[8] về virus khoai tây ở Miền Bắc Việt Nam cho

thấy: Bệnh virus khoai tây ở Việt Nam do 7 loài virus gây hại chính Đó là:

Virus Y khoai tây (PVY)

Virus X khoai tây (PVX)

VirusA khoai tây (PVA)

Virus S khoai tây (PVS)

Virus M khoai tây (PVM)

Virus cuốn lá khoai tây (PLRV)

Virus khảm Aucuba khoai tây (PAMV)

Năm 1991 Ủy Ban Quốc Tế về phân loại virus (ICTV–InternationalCommittee on Taxonomy of Viruses) đã xây dựng hệ thống dữ liệu về cácnhóm virus gồm đặc điểm của từng nhóm và hệ thống hóa số liệu đo lường(số hóa) các loại virus đó

Với loài S Tuberosum L phát hiện tác nhân virus gây bệnh chính

như sau

Bảng 1.4: Nhóm virus chính hại khoai tây (Beemster và DeBokx 1987; Burton 1989; Brunt et al 1996)

(PVS)

Mã ICTV 39.0.0.1.0.012 57.0.1.0.058 57.0.1.0.056 57.0.1.057 56.0.1.0.018 14.0.1.0.025 14.0.1.026

Trong nhóm virus gây hại trên khoai tây ở Việt Nam thì virus PVY gâyhại lớn nhất rồi đến virus PVA, PVM, PVS Trong khi đó ở các nước Châu

Âu (Balan) virus PLRV gây hại lớn nhất, làm giảm năng suất khoảng 90% ỞUcraina thì virus PVM gây hại nặng nhất Sự gây hại nặng hay nhẹ này phụthuộc vào đặc điểm sinh thái của từng vùng đặc biệt là sự có mặt của môi giớitruyền bệnh (nhất là Rệp muội)

Đặc điểm một số virus chính hại khoai tây:

Virus Y

Virus Y thuộc nhóm Potyvirus có dạng sợi mềm, dài khoảng 720 –

730 *11 nm, có cấu trúc xoắn gây bệnh khảm nhăn khoai tây

Virus này gây triệu chứng khảm nhăn lá, trên một só giống gây ra hiệntượng chết gân lá thâm nâu từng đoạn ở mặt dưới lá non, trên thân, trên cành.Cây bị bệnh thường còi cọc chậm lớn,lá co hẹp về chiều dài và ngang

Virus này truyền bệnh qua môi giới là Rệp thuộc họ Aphididae, Rệptruyền bệnh theo kiểu không bền vững (non persistent) Tức là rệp trích hútvào cây bệnh hút dịch chứa virus trong khoảng 30s – 5min sau đó tiếp xúc vớicây khỏe để truyền bệnh từ 30 – 60s cho tới 24h

Virus này gây thiệt hại tới khoảng 80% năng suất của khoai tây

Virus A

Virus A thuộc nhóm Potyvirus có dạng sợi mềm, dài khoảng 730

*15 nm (Brandes và panl, 1957) Triệu chứng của bệnh gây nên hiện tượngkhảm lá co rút gợn sóng ở mặt lá, một vài giống khoai tây có hiện tượngchết đỉnh sinh trưởng Khi lây hỗn hợp virus sẽ gây hiện tượng lá nhănmạnh và nhiều hơn

Virus truyền lan qua tiếp xúc cơ học và môi giới là rệp theo kiểukhông bền vững Thường virus này truyền bởi 7 loài rệp họ Aphididae trong

đó Aphis frangulae, Aphis nasturtii là những loài rệp chủ yếu truyền bệnh

Virus A gây thiệt hại về năng suất khoảng 40% Ở Việt Nam virus nàyxuất hiện ít và gây thiệt hại không lớn trên cây khoai tây.

Virus X

Virus X thuộc nhóm Potexvirus có dạng sợi mềm, dài khoảng 480

-580 *18 nm (B Bercks, 1970) Virus X gây ra bệnh khảm lá, khảm hoa Khinhiễm nhiều loại virus thường gây triệu chứng rất nặng gây xoăn lá Virus Xkhông truyền bằng côn trùng, truyền bằng tiếp xúc cơ học

Thiệt hại do virus này gây ra khoảng 10% Ở Việt Nam thấy virus nàygây hại phổ biến trên khoai tây

Những thiệt hại do virus gây ra trên khoai tây đã làm giảm đáng kểnăng suất củ khoai tây Nguồn giống ngày một thoái hóa, giảm tính đa dạng,giảm khả năng chống chịu và gây giảm chất lượng Trước tình hình đó, Cácnhà nghiên cứu tiến hành những tìm hiểu mới nhằm tạo ra những giống khoaitây tốt, đặc biệt là khả năng kháng bệnh virus Dựa trên ứng dụng của Côngnghệ sinh học trong chọn tạo giống Đặc biệt là ứng dụng của kỹ thuật dunghợp protoplast tạo nguồn khoai tây kháng bệnh virus đã thu được những kếtquả đáng tin cậy

Virus khoai tây được đánh giá là một tác nhân gây bệnh nguy hiểm,làm giảm năng suất và chất lượng khoai tây nghiêm trọng Ở Anh khoai tây

bị nhiễm virus gây thất thoát 30 – 50 triệu pound mỗi năm Theo Hull (1984).Theo Banttari et al (1993) khi củ khoai tây bị nhiễm virus PVY hoặc PLRVdẫn tới năng suất giảm 80%

Virus được lan truyền qua vector, tiếp xúc cơ giới… Từ đó xâm nhậpvào cây làm thay đổi hệ thống gen của tế bào ký chủ theo hướng nhân nhanhcủa phân tử virus, làm rối loạn quá trình trao đổi chất của cây, ảnh hưởng tớinăng suất và phẩm chất của cây trồng Vì vậy rất nguy hiểm với cây trồngnhân giống vô tính

Hiện nay, với mục đích kiểm soát sâu hại và tạo ra củ sạch viruscon người thường sử dụng thuốc trừ sâu Nhưng việc sử dụng tràn lanthuốc trừ sâu không những không có hiệu quả trừ bệnh mà còn làm tăngtính kháng của côn trùng truyền bệnh virus, ngoài ra còn ảnh hưởng tiêucực đến hệ sinh thái nông nghiệp và môi trường sống xung quanh Cho nênhướng đi theo con đường tạo giống khoai tây kháng virus, kháng côn trùngtruyền bệnh được xem là giải pháp tối ưu Hướng đi này đang nhận được sựquan tâm, chú ý của nhiều nhà nghiên cứu nhằm bảo vệ cây khoai tây nóiriêng và cây trồng nói chung.

1.3.2 Giải pháp khắc phục

Virus là nguyên nhân gây hại rất lớn đối với khoai tây, đã làm thiệt hạiđến năng suất Vì vậy, để giảm thiệt hại do virus gây lên, nước ta cũng nhưcác nước khác đã có những biện pháp khắc phục hiện tượng thoái hoá giống

do virus, được tiến hành theo nhiều phương pháp khác nhau:

Biện pháp nhập nội

Biện pháp tự sản xuất củ giống sạch bệnh trong nước

Biện pháp sản xuất hạt lai, trồng khoai tây bằng hạt

Biện pháp chọn lọc vệ sinh quần thể

Áp dụng biện pháp bảo quản lạnh để làm chậm sự già hoá

Trồng vụ khoai tây muộn để rút ngắn thời gian bảo quản củ giống Những biện pháp trên cũng phần nào hạn chế được sự thoái hoá giốngkhoai tây, vì vậy để khắc phục hiện tượng thoái hoá giống hiện nay đã cónhững biện pháp như:

- Nhập nội củ giống sạch bệnh

- Tạo ra giống sạch virus bằng công nghệ tách meristerm

- Tạo ra giống kháng virus bằng công nghệ chuyển gen; công nghệdung hợp tế bào trần

Ngày nay kỹ thuật dung hợp tế bào trần là phương pháp tối ưu nhất để

tổ hợp các gen của khoai tây dại vào khoai tây trồng khắc phục hiện tượng bấtthụ khi lai hữu tính: Đối với hướng tạo giống khoai tây kháng virus bằngdung hợp tế bào trần giữa hai hay nhiểu dòng mang đặc tính kháng tỏ ra cónhiều ưu điểm: Tổ hợp được bộ genome của cả hai bố mẹ tạo thành một cấutrúc genome dị hợp tử mới, không có sự biệt lập trong quá trình giảm phân,rút ngắn thời gian chọn tạo, khắc phục những rào cản về mặt di truyền tronglai hữu tính… Cho nên trở thành công cụ đầy hứa hẹn phục vụ chương trìnhchọn tạo giống cây khoai tây kháng virus

Mặt khác, trong tự nhiên tồn tại khá nhiều nguồn gen kháng virus,theo một số nghiên cứu đã xác định có khoảng 206 loài khoai tây dại mang

củ, 7 loài nguyên thủy và một loài khoai tây trồng Solanum spp, cũng như

một số loài dại không mang củ có đặc tính kháng virus tốt (Spooner và

Hijmans , 2001) Trong số đó dòng S etuberosum có đặc tính kháng cao với

bệnh virus PVY, PVA…(Valkonen et al, 1992b; Thieme et al, 2000)[26], S.

tarnii rất kháng với dòng virus PVY (Thieme et al, 2003), loài khoai tây S cardiophyllum Lindl và S etuberosum Lindl thuộc chi Pinnatisecta và Etuberosa (Hawkes, 1990) thể hiện tính kháng cao với nấm Phytophthora infestans (Hanneman và Bamberg 1986) Chúng được thu thập và thăm dò về

tính kháng virus và tác nhân gây bệnh khác kể cả sâu hại Một số nghiên cứu

về khoai tây ở Châu Âu khẳng định 90% loài khoai tây dại trong quỹ gen thuthập là nguồn gen kháng mới có ý nghĩa Đây là nguồn gen kháng quan trọngphục vụ chương trình chọn tạo giống khoai tây kháng virus bằng dung hợp tếbào trần Nếu lai tạo giống theo phương pháp truyền thống giữa những dòngdại có tính kháng virus và dòng trồng thường gặp rào cản về mặt di truyền,thời gian chọn tạo lâu

Dung hợp tế bào trần là phương pháp hữu hiệu để đưa nguồn gen đó

vào quỹ gen của loài S Tuberosum, vượt qua được tính không tương hợp

trong lai hữu tính và sự phân tách gen trong chương trình chọn tạo giống

(Millam et al, 1995) Sự dung hợp giữa tế bào trần của loài khoai tây dại

không có củ S Brevidens với loài khoai tây trồng S Tuberosum tạo con lai

soma biểu hiện tính kháng cao với một số nhóm virus và kháng vector truyềnbệnh (Austin et al, 1985b; Fish et al, 1987; Gibson et al, 1988; Pehu et al,

1990; Vankonen et al, 1994b)[21],[26].

Tùy thuộc vào thành phần gen của con lai soma mà biểu hiện một sốcác biến đổi về tính trạng hình thái và phản ứng lại sự xâm nhiễm virus PVXbởi vector (Thieme et al, 2000) Một số con lai soma được lai lại thành côngvới dòng khoai tây trồng mà vẫn biểu hiện tính kháng (Willliams et al, 1992;

Helges et al, 1993; Thieme et al, 2002) Hàng loạt con lai soma của S etuberosum và S tuberosum và dòng BC1 thể hiện kháng tốt với PVY (Novy

và Helgeson, 1994b) và tính rất kháng với PVX (Gavlirenco et al, 2003).Nghiên cứu của Polgar et al (2002) đã tạo được 150 dòng lai soma giữa thứ

khoai tây Hungari và S brevidens cùng một vài thế hệ BC Kết quả cho thấy

rằng tất cả con lai và hầu hết dòng BC biểu hiện mức kháng cao với virusPVY và PLRV

Theo nghiên cứu của Thieme et al (2008) cho biết loài khoai tây dại

S tarnii là nguồn gen kháng quan trọng với cả sâu hại và bệnh hại, biểu hiện tính rất kháng với virus PVY, tính kháng cao với nấm Phytopthera infestans Khi đó tiến hành lai soma với một số dòng khoai tây trồng thuộc loài S tuberosum để tạo thể lai mới kế thừa tính kháng từ dòng khoai tây dại S tarnii.

Trong số các phương pháp tạo giống khoai tây kháng virus thì phươngpháp lai soma có nhiều ưu điểm và hiệu quả hơn cả Về phương pháp lai hữutính gặp nhiều khó khăn về mặt di truyền, tốn thời gian chọn tạo Đối vớiphương pháp chuyển gen cũng gặp không ít rắc rối bởi khi chuyển gen khángvirus vào cây chúng có thể không biểu hiện tính kháng (Cockerham, 1970;Ross, 1986; Jones 1990; Mendoza et al, 1990) mà còn xuất hiện các sản phẩm

phụ (protein) từ gen chuyển gây rối loạn hoạt động của cây chủ Nhược điểmcủa phương pháp chuyển gen là mang tính kháng đặc hiệu dòng virus, dễ bịphá vỡ tính kháng khi lây nhiễm virus với nồng độ cao, chỉ có ý nghĩa vớinhóm virus lây nhiễm cơ giới mà không có hiệu quả với nhóm virus truyền quatuyến nước bọt của côn trùng (Anderson et al, 1989; Stark và Beachy, 1989)

Để có thể giải quyết vấn đề bệnh virus của cây khoai tây, cần áp dụngnhiều biện pháp khác nhau, trong đó ưu tiên giải pháp tạo giống kháng vectortruyền bệnh virus và kháng trực tiếp dòng virus

1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Hầu hết khoai tây trồng hiện nay thuộc nhóm cây tứ bội (2n=4x=48),

do đó muốn dung hợp ở mức nhị bội cần giảm độ bội xuống trước khi tiếnhành lai soma bằng kỹ thuật nuôi cây bao phấn

Sự ra đời của sơ đồ tạo giống tổng hợp phân tích Wenzel et al (1979) [28] là bước ngoặt phối hợp trong việc sử dụng phối hợp các phương pháp

kinh điển và hiện đại vào công tác giống khoai tây Bước cuối cùng của sơ đồtạo giống này là sự dung hợp của hai tế bào trần nhị bội (2x) để tạo con laisoma tứ bội (4x) Thể tứ bội này có thể được nhân vô tính và trở thành một

giống ổn định (Diemling, 1989)[16] Mặt khác thông qua dung hợp tế bào

trần hàng rào lai tạo giữa các cây xa nhau về mặt di truyền cũng được khắcphục

Những năm 1960 Cocking đã tách thành công các tế bào trần riêngbiệt từ mô đỉnh rễ cà chua Tiếp sau đấy Takebe et al (1968)[21] ở việnnghiên cứu virus thực vật, Aobacho, Chiba/Nhật Bản đã cải tiến kỹ thuậttrên và lần đầu tiên tách được lượng lớn các tế bào trần từ mô tế bào thịt

lá của Nicotiana tabacum Đây là tiền đề quan trọng cho sự tái sinh thành

công cây thuốc lá từ tế bào trần của Nitschothyama (1971); Takebe et al(1971)[21] Tiếp sau đó là hàng loạt kết quả tách và tái sinh tế bào trần

nhiều thực vật thành công Trong đó, cây khoai tây đầu tiên tái sinh thànhcông từ tế bào trần với công trình của Shepard và Toten (1977) rồiBinding et al (1978)[15] Đồng thời với những nghiên cứu về tái sinh tếbào trần, vấn đề dung hợp tế bào trần cũng được đặt ra

Việc nghiên cứu tái sinh tế bào trần khoai tây được rất nhiều tác giảquan tâm (Binding và Nehls, 1977; Binding et al, 1978; Bokemaln và Roest,1983; Schuchman, 1985)[15] Theo hướng giáo sư Wenzel đã đề xuất , cáccông trình nghiên cứu về dung hợp tế bào trần cũng dần được tăng lên Công

trình nổi tiếng của Melchers et al (1978) về lai soma giữa loài khoai tây S tuberosum và cà chua lycopersicom esculentum là một mở đầu về hàng loạt

các nghiên cứu về dung hợp giữa loài khoai tây dại với khoai tây trồng vốnkhông thể tiến hành bằng con đường lai hữu tính Butenko và Kuchko (1980)

đã tiến hành dung hợp tế bào trần S tuberosum với S chacoense mang đặ tính

kháng virus PLRV (Browwn và Thomas ,1979) tạo con lai soma mang đặctính rất kháng với dòng virus PLRV Nhiều tác giả (Barsby et al, 1984;Austin et al, 1985; Helgeson et al, 1986; Fish et al, 1987)[22] đã tập trung

nghiên cứu sử dụng S brevidens như một ”partner” nghiên cứu vì giống này

chống chịu với rất tốt với virus PVX và PVY Khi đó các ông tiến hành lai

soma giữa S brevidens với loài khoai tây trồng S tuberosum nhằm tạo con lai

mang đặc tính kháng hai loại virus đó

Việc xác định các con lai soma hetezygote là rất cần thiết sau dung hợp

tế bào trần Trước tiên cần xác định độ bội của các thể lai, tiếp đó bằng cácphương pháp di truyền như AFLP, RAPD, RELP, PCR, Isozym… có thể xácđịnh chính xác con lai soma hetezygote tổ hợp bộ genome của cả bố và mẹdung hợp Ngoài ra, để xác định con lai soma, một số tác giả đề xuất vànghiên cứu thành phần, hàm lượng alkaloid trong cây lai

Nghiên cứu của Pehu et al (1990) về dung hợp protoplast giữa S tuberosum và S brevidens đã tạo con lai soma thành công Để xác định con

lai soma ông tiến hành phân tích thành phần SGAA (Steroidal GlycoalkaloidAglycone) của cây lai Kết quả cho thấy các thành phần alkaloid của bố mẹ

bao gồm solanidine và slanthrene của S tuberosum, tomatidine của S brevidens (Laurila et al 1996) đều có mặt trong cây lai So sánh với bố mẹ, cho biết thành phần SGAA trong cây lai cao hơn so với S tuberosum nhưng

hàm lượng thấp vào khoảng 20 mg/ 100g tươi

N.Q.Thach, U Frei và G Wenzel (1993)[23] đã tạo thành công con

lai soma mang đặc tính kháng virus giữa các nhóm khoai tây thuộc loài

Solanum tuberosum L, xác định con lai soma bước đầu đánh giá độ bội bằng

phương pháp đếm nhiễm sắc thể, sau đó tiến hành phấn tích isozym esterase

và peroxidase (Deimling et al 1988)[16], kỹ thuật RFLP (Enzyme cắt là

EcoRI) Kết quả cho thấy các con lai đều có sự biểu hiện của 2 allele trội đơngen Rx và Ry từ bố mẹ dung hợp (partners)

Với tổ hợp lai điển hình giữa S tarnii (2n=2x=24) và S etuberosum

cv Delikat đã được dung hợp xung điện thành công Con lai soma tạo thành

được xác định độ bội bằng máy Flowcytometry, xác nhận con lai somahetezygote bằng kỹ thuật SSR, chỉ thị AFLP và phân tích đa hình isozym.Những cây lai soma đều biểu hiện tính rất kháng với dòng virus PVY và

kháng nấm P infestans rất tốt qua phản ứng siêu nhạy (HR-hypersensitive

reaction) Thế hệ BC1 và BC2 cũng biểu hiện tính kháng virus và kháng nấmcao, không những vậy tính kháng này rất bền vững ở cả con lai và thế hệ BC(Ramona Thieme; Elena Rakosy–Tican; Tatjana Gavrilenko; Thomas Thieme

kháng virus và bệnh cũng như một số sâu hại nguy hiểm khác.

Trên đối tượng cây khoai tây, đã cải tạo nguồn gen của một số dòngkhoai tây trồng, loại bỏ hoàn toàn bệnh virus của một số dòng khoai tây nhưKT2, giống khoai tây Thường Tín (Ackersegen)…bằng việc ứng dụng côngnghệ sinh học thực vật gồm các kỹ thuật nuôi cấy mô (nuôi cấy meristem…) vàcác kỹ thuật phân tử khác

Nghiên cứu dung hợp tế bào trần cây khoai tây không còn mới mẻ,các nhiên cứu đang được tiến hành khá thành công tại Viện Sinh Học NôngNghiệp–Trường ĐHNNHN do GS.TS Nguyễn Quang Thạch và TS.Nguyễn Phương Thảo chủ trì đề tài “Tạo giống khoai tây kháng bệnh virusbằng dung hợp tế bào trần” giai đoạn 2006 – 2011 Nghiên cứu đã bướcđầu thành công ở quy trình tách, dung hợp, nuôi cấy và tái sinh protoplastcủa các dòng khoai tây nhị bội phục vụ cho chương trình chọn tạo giốngkhoai tây kháng bệnh virus Quá trình nghiên cứu đã đóng góp nhiều thànhcông và góp phần cải tạo nguồn gen khoai tây trồng, phát triển sản xuấtkhoai tây giống sạch bệnh virus

PHẦN II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng

Khảo sát 9 dòng khoai tây gồm các dòng bố mẹ (nguồn gốc tại CHLB Đức) và các con lai soma được dung hợp tại Viện sinh học Nông nghiệp năm 2009

Cây in vitro được nuôi cấy trong môi trường MS.

Cây khoai tây bị nhiễm virus ở ngoài đồng ruộng

Cây chỉ thị: cây thuốc lá

Hoá chất dùng để lây nhiễm nhân tạo virus PVY (Phụ lục 1)

Hoá chất dùng để chạy ELISA (Phụ lục 2)

Hóa chất tách AND và chạy PCR (phụ lục3, 4, 5)

Hóa chất và dụng cụ dùng làm thí nghiệm hóa sinh (phụ lục 6)

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Đánh giá độ bội của một số dòng cây tái sinh

Phương pháp đánh giá độ bội bằng cách định lượng DNA nhân thôngqua máy xác định độ bội Flow Cytometry

Quy trình đánh giá mức đa bội của tế bào thực vật (phụ lục 7):

2.2.2 Các thí nghiệm đánh giá sự sinh trưởng, phát triển và hình thành năng suất trong điều kiện chậu vại và khả năng hình thành năng suất trong hai điều kiện trồng trọt (khí canh và địa canh)

2.2.2.1 Đánh giá sự sinh trưởng phát triển và hình thành năng suất của các dòng

bố mẹ và con lai trong điều kiện chậu vại

Khoai tây được trồng bằng giá thể xơ dừa

Thời vụ: Vụ đông năm 2010

Khoai tây được trồng vào ngày 16/12/2010 và thu hoạch vào ngày23/3/2011 tại nhà lưới Viện Sinh học Nông Nghiệp – Trường Đại học Nôngnghiệp Hà Nội

Thí nghiệm khảo sát có lặp lại: mỗi dòng 30 cây

Các chỉ tiêu theo dõi: Định kỳ 15 ngày 1 lần

- Động thái tăng trưởng chiều cao cây (cm): Đo trực tiếp từ gốc đếnđỉnh sinh trưởng

-Động thái tăng trưởng số lá trên cây (lá): Tổng số lá có trên cây tạithời điểm theo dõi

- Động thái tăng trưởng đường kính thân (cm): đo bằng thước panme,

đo phần to nhất của thân

- Đặc điểm củ: Hình dạng củ, số mắt trên củ, độ sâu mắt củ, màu sắc

vỏ củ, màu sắc ruột củ

- Năng suất và các yếu tố hình thành năng suất:

+ Khối lượng củ trung bình trên cây (g/cây)= Tổng khối lượng củ/Tổng số lượng cây thu hoạch

+ Khối lượng trung bình củ (g/củ) = Tổng khối lượng củ/ Tổng số củthu hoạch

+ Số lượng củ trung bình/khóm = Tổng số lượng củ/ Tổng số lượng câythu hoạch

- Năng suất thực thu (g/m2) = Khối lượng củ/cây (g/cây) x phần trăm

củ đạt tiêu chuẩn (củ đạt tiêu chuẩn có Φ> 1,5cm)

- Năng suất lý thuyết (g/m2) = Khối lượng củ/cây (g/cây) x 20 (20 là sốcây rồng trên 1m2)

- Phân loại củ sau thu hoạch (theo đường kính củ (Φ)): 2,5cm, 2,5- 3,5cm

<1,5cm,1,5-2.2.2.2 Đánh giá năng suất trong hai điều kiện trồng trọt (khí canh và địa canh)

.* Điều kiện khí canh

- Đặc điểm củ: Hình dạng củ, số mắt trên củ, độ sâu mắt củ, màu sắc vỏ

củ, màu sắc ruột củ

- Năng suất và các yếu tố hình thành năng suất:

+ Khối lượng củ trung bình trên cây(g/cây) = Tổng khối lượng củ/Tổng số lượng cây thu hoạch

+ Khối lượng trung bình củ (g/củ) = Tổng khối lượng củ/ Tổng số củthu hoạch

+ Số lượng củ trung bình/khóm = Tổng số lượng củ/ Tổng số lượngcây thu hoạch

- Năng suất thực thu (g/m2) = Khối lượng củ/cây (g/cây) x phần trăm

củ đạt tiêu chuẩn (củ đạt tiêu chuẩn có Φ> 1,5cm)

- Năng suất lý thuyết (g/m2) = Khối lượng củ/cây (g/cây) x 20 (20 là sốcây rồng trên 1m2)

- Phân loại củ sau thu hoạch ((theo đường kính củ (Φ)): 2,5cm, 2,5- 3,5cm

<1,5cm,1,5-* Điều kiện địa canh

- Đặc điểm củ: Hình dạng củ, số mắt trên củ, độ sâu mắt củ, màu sắc

vỏ củ, màu sắc ruột củ

- Năng suất và các yếu tố hình thành năng suất:

+ Khối lượng củ trung bình trên cây (g/cây) = Tổng khối lượng củ/Tổng số lượng cây thu hoạch

+ Khối lượng trung bình củ (g/củ) = Tổng khối lượng củ/ Tổng số củthu hoạch

+ Số lượng củ trung bình/khóm = Tổng số lượng củ/ Tổng số lượng câythu hoạch

- Năng suất thực thu (g/m2) = Khối lượng củ/cây (g/cây) x phần trăm

củ đạt tiêu chuẩn (củ đạt tiêu chuẩn có Φ> 1,5cm)

- Năng suất lý thuyết (g/m2) = Khối lượng củ/cây (g/cây) x 20 (20 là sốcây rồng trên 1m2)

- Phân loại củ sau thu hoạch ((theo đường kính củ (Φ)): <1,5cm, 2,5cm, 2,5- 4,0cm

1,5-2.2.3 Đánh giá khả năng kháng virus PVY thông qua lây nhiễm nhân tạo, test ELISA và chỉ thị phân tử (PCR)

2.2.3.1 Đánh giá khả năng kháng virus bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo và test ELISA

Thí nghiệm được tiến hành trong nhà màn cách ly: trồng chín dòngkhoai tây bố mẹ và con lai có nguồn gốc từ cây nuôi cấy mô trên giá thể xơdừa trộn lẫn với đất, cùng với giống thuốc lá làm cây chỉ thị

Sau khi trồng 20 ngày, cây đã sinh trưởng phát triển ổn định tiến hànhkiểm tra độ sạch virus PVY của chín dòng nghiên cứu và các cây chỉ thị bằngphản ứng (DAS – ELISA)

25 ngày sau khi trồng tiến hành lây nhiễm nhân tạo

20 ngày sau khi lây nhiễm tiến hành kiểm tra virus trên con lai bằng(DSA-ELISA) (phụ lục 7).

* Phương pháp lây nhiễm nhân tạo

Cách lây nhiễm dựa theo mô tả của Hill (1984) và Kado (1972)(Phụ lục 8)

* Phương pháp test ELISA

Double Antibody Sandwich (DAS) Enzyme – linked imunosorbentassay (ELISA) (Phụ lục 9)

2.2.3.2 Đánh giá khả năng kháng virus bằng phương pháp chỉ thị phân tử

Phương pháp đánh giá tính kháng virus ở mức độ phân tử dựa trên việc

sử dụng cặp mồi chung đặc hiệu của gen kháng đó, nhằm phát hiện sự có mặtcủa gen kháng, cụ thể là gen Ry sto-gen kháng PVY có mặt trong con lai soma

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp tách chiết vàtinh sạch DNA tổng số của GS Hans – Joerg Jacobsen trường Đại họcHannover (Phụ lục 10)

Sau khi tách chiết DNA xong tiến hành kiểm tra độ nguyên vẹn củaDNA tổng số bằng điện di trên gel agarose 1% Tiếp đó thực hiện thí nghiệmchạy phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu và cuối cùng kiểm tra sự có mặtcủa gen kháng bằng kỹ thuật điện di phát hiện vạch băng

Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) và điện di sản phẩm PCR

Cặp mồi STM 003-111 nhằm phát hiện gen kháng virus PVY

2.2.4 Đánh giá chỉ tiêu hóa sinh

* Định lượng đường khử ( phương pháp iod-Ixekutz)

Nguyên liệu: Dịch chiết được chuẩn bị theo phương pháp Bertrand( phụ lục 12)

Tiến hành: lấy 2 bình tam giác:bình 1(đối chứng),bình 2( thí nghiệm).Cho vào bình 1: 5ml nước cất , bình 2: từ 2-5ml dịch chiết đường, chovào mỗi bình 10ml K3Fe(CN)6 0,05N Đun sôi 1 phút trên bếp điện, để nguội.Cho vào mỗi bình 10ml hỗn hợp (ZnSO4+ KI), 10ml CH3COOH10%

Chuẩn độ bằng Na2S2O3 0,05N cho đến màu vàng rơm Thêm 3 giọttinh bột (dung dịch chuyển màu xanh), chuẩn độ tiếp cho tới khi có màu trắngsữa hoàn toàn

* Định lượng đường tổng số.

Để xác định toàn bộ đường trong mẫu, chúng ta phải tiến hành thủyphân để chuyển dạng đường không khử thành dạng đường khử (chủ yếu làdisaccarit thành monosaccarit) sau đó tiến hành xác định đường khử thủyphân theo phương pháp định lượng đường khử (Ixekutz)

Nguyên liệu: Dịch chiết được chuẩn bị theo phương pháp Bertrand( phụ lục 12)

Tiến hành: Lấy 10ml dịch chiết đường thêm vào 2ml HCl 6N Đặttrên bếp cách thủy nhiệt độ 700-800C trong thời gian 20 phút Thỉnh thoảng

lắc đều các đường kép đã được thủy phân thành đường đơn Sau khi để nguội,cho vào bình 3 giọt phenolphtalein 1% trong cồn 96oC Trung hòa lượng axitcòn dư bằng dung dịch NaOH 10% cho đến khi có mầu hồng Làm chua lạibằng dung dịch CH3COOH 10% cho đến khi mất màu Dùng nước cất để lênthể tích đến vạch, được dịch chứa đường khử Sau đó xác định đường nhưphương pháp (Ixekutz).

(chú ý khi tính kết quả cần chú ý tới hệ số pha loãng)

* Định lượng tinh bột (phương pháp thủy phân bằng axit)

Nguyên tắc: Dưới tác dụng của axit tinh bột được thủy phân hoàntoàn thành đường glucose Định lượng đường khử, suy ra hàm lượng tinh bột

Nguyên liệu: 2g củ khoai tây

Tiến hành: Nghiền 2g nguyên liệu, nghiền nhỏ, trộn đều chuyển sangcốc Cho vào cốc 100ml nước cất, khuấy đều từ 45-60 phút Sau đó lọc bằngphễu có giấy lọc Tráng cốc và rửa tinh bột nhiều lần bằng nước cất để loạitoàn bộ đường khử khỏi tinh bột

Chuyển phễu lọc chứa tinh bột sang bình 250ml, dùng đũa thủy tinhnhỏ chọc thủng giấy lọc, chuyển tinh bột xuống bình cầu bằng nước cất (80-100ml) Sau đó cho 125ml HCl 25% vào bình Đặt bình vào nồi cách thủy sôi,đun nóng từ 3-4h, thỉnh thoảng lắc đều Sau khi kết thúc thủy phân tinh bột,làm nguội bình, trung hòa dịch thủy phân bằng NaOH 10%, dùng giấy quỳthử sao cho dung dịch thủy phân không thừa kiềm Sau đó thêm 1-2 giọt HCl25% để dung dịch thủy phân đã được trung hòa có độ axit yếu Chuyển toàn

bộ dung dịch sang bình định mức 100ml, dùng nước cất định mức tới mứccủa bình Khuấy đều, lọc dung dịch ,dung dịch lọc trong suốt, để định lượngđường khử

* Định lượng vitamin C (phương pháp chuẩn độ bằng iot)

Nguyên lý: Vitamin C có thể khử dung dịch iot Dựa vào lượng iot bịkhử bởi vitamin C có trong mẫu suy ra hàm lượng vitamin C