Phân lập, tuyển chọn và ứng dụng vi khuẩn phân giải Keratin trong chăn nuôi

CHƢƠNG 1. GIỚI THI U 1.1 Lý do chọn đề tài, lĩnh vực nghiên cứu Hàng năm, ngƣời d n Việt Nam tiêu thụ hàng triệu tấn th t gia súc, gia cầm đƣợc nuôi trong nƣớc và nhập khẩu Tính đến tháng 10 năm 2016, th t tr u đạt 86,6 nghìn tấn, tăng 1% so với c ng thời điểm năm trƣớc; sản lƣợng th t bò đạt 308,6 nghìn tấn, tăng 3,1%; sản lƣợng th t heo đạt 3,7 triệu tấn, tăng 5%; sản lƣợng th t gia cầm đạt 961,6 nghìn tấn, tăng 5,9% (Tổng cục thống kê Việt Nam, 2016) Tƣơng ứng với số lƣợng đó là hàng ngàn tấn lông gia súc, gia cầm thải loại ra môi trƣờng mà chƣa có biện pháp xử lý hiệu quả Tính đến tháng 12/2016, cả nƣớc có trên 28.000 điểm giết mổ gia súc, gia cầm ( ục Thú y, 2016) Mặc d từ năm 2005, nhà nƣớc đã ban hành nhiều văn bản về quy hoạch x y dựng các điểm giết mổ gia súc, gia cầm tập trung ác t nh cũng ch đạo đẩy mạnh quy hoạch, x y dựng các cơ sở giết mổ tập trung trên đ a bàn Tuy nhiên, cho đến nay mô hình này vẫn chƣa đƣợc triển khai mạnh ở các t nh; các cơ sở giết mổ nhỏ l vẫn còn chiếm ƣu thế Tại các cơ sở này do chƣa có quy trình xử lý chất thải, g y ô nhi m môi trƣờng trầm trọng, làm ảnh hƣởng đến các ngành sản xuất khác và sức khỏe của ngƣời d n sống quanh đó Với nguồn chất thải này, ph n và nƣớc thải có thể đƣợc xử lý b ng hầm biogas tạo khí gas để phục vụ sinh hoạt. Do lông gia súc và lông gia cầm có thành phần chính là keratin, rất khó ph n hủy (Gupta and Ramnani, 2006), lại chiếm t lệ khá lớn trong nguồn rác thải từ các lò giết mổ nên mức độ ô nhi m càng nghiêm trọng Vì vậy, việc tìm ra cách để xử lý chất thải lông tại các lò mổ gia súc gia cầm là rất cần thiết. Hiện nay, chất thải chứa keratin thƣờng đƣợc xử lý b ng các phƣơng pháp chôn và đốt, g y ô nhi m đất, mạch nƣớc ngầm và không khí (Nguy n Đình Quyến và Trần Th Lan Phƣơng, 2001). Trong keratin chứa những acid amin quan trọng có thể sử dụng làm thức ăn cho gia súc, ph n hữu cơ, gas sinh học (Nguy n Thu Hiền và ctv., 2013) Tuy nhiên, phƣơng pháp vật lý hay hóa học hiện đang đƣợc sử dụng trong các quy trình chế biến d làm phá hủy những acid amin, tiêu thụ rất nhiều năng lƣợng và tạo ra những chất g y ô nhi m cho môi trƣờng (Matikevičienė et al., 2009) o đó, tìm ra một phƣơng pháp hiệu quả để xử lý chất thải keratin là một vấn đề có ý nghĩa quan trọng đối với ngành chăn nuôi do vừa có thể tạo ra những sản phẩm có giá tr kinh tế, lại vừa có thể xử lý hiệu quả chất thải lông gia súc, gia cầm Trong những năm gần đ y, biện pháp xử lý lông gia súc, gia cầm b ng phƣơng pháp sinh học rất đƣợc quan t m và chú trọng Trên thế giới hiện có rất nhiều công trình nghiên cứu ph n giải keratin b ng vi sinh vật và đã ph n lập đƣợc rất nhiều loài vi sinh vật có khả năng ph n giải keratin nhƣ vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn (Sangali and randelli, 1999). Các phƣơng pháp chế biến bột lông vũ thủy phân b ng cách chủng vi khuẩn nhƣ Bacillus licheniformis PWD-1 đã cải thiện đƣợc tăng trƣởng của gà (William et al., 1991). Tuy nhiên, mỗi loài vi sinh vật có những điều kiện thuận lợi cho sự sinh trƣởng và phát triển khác nhau Nếu điều kiện thay đổi bất lợi g y ảnh hƣởng xấu đến vi sinh vật khiến cho vi sinh vật chết hoặc ngừng phát triển, còn nếu điều kiện thuận lợi vi sinh vật sẽ sinh trƣởng và phát triển tốt (Nguy n L n ũng và ctv., 2012) Vì vậy, khảo sát những điều kiện thuận lợi cho sự sinh trƣởng và phát triển của những chủng vi khuẩn ph n giải keratin đã đƣợc ph n lập có ý nghĩa quan trọng trong việc sử dụng những chủng vi khuẩn này vào xử lý keratin trong thực tế với hiệu quả cao nhất Điều này càng giúp việc ứng dụng biện pháp sinh học sử dụng vi khuẩn thuận lợi hơn trong việc chế biến lông gia súc gia cầm làm thành phần bổ sung trong thức ăn gia súc gia cầm từ đó giảm đƣợc ô nhi m môi trƣờng, n ng cao giá tr dinh dƣ ng của sản phẩm protein và hiệu quả về kinh tế hơn so với các phƣơng pháp vật lý và hóa học hính vì vậy, việc ph n lập, tuyển chọn và nghiên cứu quy trình nuôi cấy ph hợp cho các chủng vi khuẩn có khả năng ph n hủy lông gia súc gia cầm để tận dụng nguồn chất thải này sẽ tạo ra những sản phẩm có giá tr cao, đồng thời góp phần giải quyết hiệu quả bài toán xử lý môi trƣờng với giá thành thấp Ở Việt Nam, những năm gần đ y ch mới có một vài nghiên cứu về một số chủng vi sinh vật có khả năng ph n giải keratin từ chất thải lông gia cầm. Nguy n Đình Quyến và Trần Th Lan Phƣơng (2001) đã tiến hành phân lập đƣợc từ đất ở cơ sở giết mổ gia cầm 7 chủng xạ khuẩn và 15 chủng Bacillus có hoạt tính phân giải casein; trong đó 5 chủng xạ khuẩn và 2 chủng Bacillus có khả năng giải lông gà mạnh. Nguy n Huy Hoàng và ctv. (2010) cũng đã tiến hành phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus, Chryseobacterium,… có khả năng thủy ph n lông vũ từ một số v ng đất khác nhau ở phía Bắc Việt Nam- vùng khí hậu khá khác biệt với miền Nam Việt Nam. Những nghiên cứu này vẫn còn đang trong giai đoạn khảo sát đặc tính các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc, chƣa thấy có công bố ứng dụng các vi sinh vật này Hơn nữa, miền Nam Việt nam chiếm ƣu thế trên cả nƣớc về sự phát triển của chăn nuôi Điều này kéo theo số lƣợng lông gia súc gia cầm thải ra lớn, đồng thời nhu cầu thức ăn chăn nuôi bổ sung đạm cho vật nuôi cũng cao Xuất phát từ thực tế trên, đề tài ―Phân lập, tuyển chọn và ứng dụng vi khuẩn phân giải keratin trong chăn nuôi‖ đƣợc tiến hành.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

QUÁCH TH TH NH T M

PH N LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ỨNG DỤNG VI KHUẨN

PH N GIẢI KER TIN TRONG CHĂN NUÔI

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC

Mã ngành: 62 42 01 07

CHUYÊN ĐỀ NGHIÊN CỨU SINH

HÂN

CẦN THƠ, 2017

MỤC LỤC

Trang

LỜI ÁM ƠN ii

TÓM LƯỢ iii

ABSTRACT v

DANH SÁCH HÌNH xii

ANH SÁ H ẢNG xiv

ANH MỤ TỪ VIẾT TẮT xix

hương 1 GI I THI U 1

1.1 Lý do chọn đề tài, lĩnh vực nghiên cứu 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

1.3 Nội dung nghiên cứu 3

1 4 Những đóng góp mới của đề tài 3

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN T I LI U 5

2.1 Sơ lược về chất thải lông 5

2.2 Sơ lược về keratin 6

2.3 ác phương pháp ph n giải keratin 7

2.3.1 Phương pháp lý hóa 7

2.3.2 Phương pháp sinh học 8

2.4 Keratinase 8

2 5 ơ chế ph n giải keratin của vi khuẩn 12

2.6 Vi khuẩn ph n giải keratin 13

2.6.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 13

2 6 2 Tình hình nghiên cứu trong nước 18

2.7 ác yếu tố ảnh hưởng đến khả năng ph n giải keratin, sự tạo keratinase và mật số của vi khuẩn ph n giải keratin 18

2 7 1 Ảnh hưởng của chất dinh dư ng trong môi trường nuôi cấy 19

2 7 2 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH 22

2.7.3 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 24

2.8 Nhu cầu dinh dư ng của gia cầm 25

2.8.1 Nhu cầu về protein 25

2.8.2 Nhu cầu về năng lượng 27

2.8.3 Nhu cầu về chất xơ 27

2.8.4 Ảnh hưởng của các khẩu phần protein lên năng suất sinh trưởng và chất lượng th n th t của gà 28

2.9 ột lông gia cầm (bột lông vũ) 29

HƯƠNG 3 VẬT LI U V PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN ỨU 33

3.1 Sơ đồ khối tổng quát nội dung luận án 33

3.2 Nội dung 1: Khảo sát thực trạng chất thải lông ở các cơ sở giết mổ gia súc gia cầm tại thành phố ần Thơ, Vĩnh Long và Đồng Tháp 34

3 3 Nội dung 2: Ph n lập, tuyển chọn và nhận diện vi khuẩn hiếu khí ph n giải keratin mạnh từ chất thải chăn nuôi và chế biến gia súc, gia cầm 34

3.3.1.Vật liệu 34

3.3 2 Phương pháp nghiên cứu 37

3.3 3 Ph n tích thống kê ở nội dung nghiên cứu 2 45

3.4 Nội dung 3 Ảnh hưởng của các điều kiện môi trường nuôi cấy đến sự phát triển, khả năng ph n hủy lông và hàm lượng protein của chủng sàng được tuyển từ Thí nghiệm 1 và Thí nghiệm 2 45

3.4 1 Vật liệu 45

3.4 2 Phương pháp nghiên cứu 45

3.4.3 Ph n tích thống kê ở nội dung nghiên cứu 3 49

3.5 Ủ lông gia cầm với chủng vi khuẩn Bacillus megaterium K79 49

3 6 Nội dung 4: Nghiên cứu ứng dụng chủng vi khuẩn ph n hủy mạnh lông gia cầm được tuyển chọn để chế biến lông gà thành thức ăn bổ sung protein cho gà th t 51

3.6 1 Vật liệu thí nghiệm 51

3.6 2 Phương pháp thí nghiệm 55

3.6 3 ác ch tiêu theo d i 56

3.6 4 Ph n tích hóa học 59

3.6.5 Ph n tích thống kê nội dung 4 60 HƯƠNG 4 KẾT QUẢ V THẢO LUẬN 61 4.1 Nội dung 1: Khảo sát hiện trạng chất thải lông gia súc, gia cầm tại Thành phố ần Thơ, Vĩnh Long và Đồng Tháp 61 4.1.1 Kết quả khảo sát 61

4 1 2 ách xử lý chất thải lông ở các cơ sở giết mổ 63 4.2 Nội dung 2: Ph n lập, tuyển chọn và nhận diện vi khuẩn

hiếu khí ph n giải keratin mạnh từ chất thải

chăn nuôi và chế biến gia súc, gia cầm 64

4 2 1 Kết quả ph n lập, tuyển chọn và nhận diện một số

chủng vi khuẩn có khả năng ph n giải keratin của

lông gia cầm từ chất thải chăn nuôi và chế biến gia cầm 64

4 2 2 Kết quả ph n lập, tuyển chọn và nhận diện một số chủng

vi khuẩn có khả năng ph n giải keratin của lông gia súc từ

chất thải chăn nuôi và chế biến gia súc 70

4 2 3 Kết quả ph n lập một số chủng vi khuẩn ch u nhiệt có

khả năng ph n giải keratin 77 4.2.4 Kết quả đ nh danh các chủng vi khuẩn ph n giải keratin mạnh 84

4 2 5 y phát sinh loài và mối tương quan trình tự 16S rRNA của

vi khuẩn ph n giải keratin 91

4 3 Nội dung 3: Kết quả ảnh hưởng của các điều kiện môi trường

nuôi cấy đến sự phát triển và khả năng ph n giải

keratin của một số chủng vi khuẩn 95

4 3 1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến

sự phát triển và khả năng ph n hủy lông của 2 chủng

vi khuẩn ph n giải keratin mạnh nhất 95

4 3 2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ d ch vi khuẩn

đưa vào đến sự phát triển và khả năng ph n hủy lông của

chủng vi khuẩn Bacillus megaterium K79 và chủng vi khuẩn

Brevibacillus parabrevis Kr110 103

4.3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dư ng chứa carbon

đến sự phát triển và khả năng ph n hủy lông của chủng vi khuẩn

Bacillus megaterium K79 và chủng vi khuẩn

Brevibacillus parabrevis Kr110 106

4.3.4 Ảnh hưởng của nguồn dinh dư ng chứa nitơ

đến sự phát triển, khả năng ph n hủy lông gia súc

và hàm lượng protein hòa tan của chủng vi khuẩn

Bacillus megaterium K79 và chủng vi khuẩn

Brevibacillus parabrevis Kr110 110

4 3 5 Ảnh hưởng của thời gian đến sự ph n hủy sợi lông nguyên của 2 chủng vi khuẩn Bacillus megaterium K79 và Brevibacillus parabrevis Kr110 115

4.4 Tiềm năng ứng dụng của chủng VK ph n giải keratin trong luận án 117

4.5 Phương thức bảo quản bộ giống – các chủng vi khuẩn ph n giải keratin 119

4.6 Kiểm tra tính ổn đ nh hoạt tính sinh học của các chủng VK đã đ nh danh 119

4.7 Nội dung 3: Nghiên cứu ứng dụng dòng vi khuẩn ph n hủy mạnh lông gia cầm được tuyển chọn để chế biến lông gia cầm thành thức ăn bổ sung protein cho gà th t 120

4.7.1 Tính an toàn sinh học của chủng Bacillus megaterium K79 120

4.7.2 Sử dụng chủng Bacillus megaterium K79 để ủ lông gia cầm thành thức ăn bổ sung protein cho gà ta thả vườn 121

4.7.3 Kết quả kiểm tra Salmonella, Coliforms và E.coli trong bột lông sinh học thu được từ lông gia cầm ph n hủy bởi chủng vi khuẩn K79 122

4.7.4 Thành phần hóa học và giá tr dinh dư ng của bột lông sinh học thu được từ lông gia cầm được ph n hủy bởi chủng vi khuẩn K79 122

4 7 5 Kết quả thí nghiệm nuôi gà 125

HƯƠNG 5 KẾT LUẬN V ĐỀ NGH 131

5 1 KẾT LUẬN 131

5 2 ĐỀ NGH 131

T I LI U THAM KHẢO

PHỤ LỤ 1 Hình ảnh trong khi làm thí nghiệm;- ác phương pháp thực

hiện; - anh sách 35 nhóm vi khuẩn của hệ thống ph n loại Bergey; - Hoạt độ keratinase, tỷ lệ ph n hủy lông gia súc, arcsin tỷ lệ ph n hủy lông gia súc của các chủng vi khuẩn ph n giải keratin; - Mẫu phiếu điều tra tình hình chất thải tại các cơ

sở giết mổ gia súc – gia cầm; - Kết quả đo O 26 mẫu NA ly trích được

PHỤ LỤ 2 Khảo sát các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến

sự phát triển, tỷ lệ ph n hủy lông và hàm lượng protein hòa tan của 2 chủng vi khuẩn K79 và Kr 110

PHỤ LỤ 3 Thí nghiệm nuôi gà

PHỤ LỤ 4 Kết quả giải trình tự gen 16s RNA của một số chủng vi khuẩn

đại diện chủng vi khuẩn ph n giải keratin mạnh PHỤ LỤ 5 Thống kê tỷ lệ ph n hủy lông và hoạt độ keratinase của 429

chủng vi khuẩn bản đ a được ph n lập PHỤ LỤ 6 Thống kê khảo sát các yếu tố môi trường ảnh hưởng

đến sự phát triển, tỷ lệ ph n hủy lông và hàm lượng protein hòa tan của 2 chủng VK K79 và VK Kr110

PHỤ LỤ 7 Thống kê thí nghiệm nuôi gà

PHỤ LỤ 8 TIÊU HUẨN VI T NAM T VN 7136:2002

PHỤ LỤ 9 THÔNG TƯ 14 /2011/TT-BNNPTNT

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 2.1: ấu trúc keratin 6

Hình 2.2: ấu trúc keratinase 10

Hình 2.3: Khuẩn lạc của Streptomyces sp 14

Hình 2.4 a Hình chụp (SEM) của Fervidobacterium islandicum AW-1 b Sự ph n hủy cọng lông gà nguyên của F islandicum AW-1 17

Hình 2 5: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự ph n huỷ lông và sự phát

triển của Bacillus megaterium 24

Hình 3 1: Sơ đồ nghiên cứu 33

Hình 3 2: Sơ đồ kiểm tra khả năng ch u nhiệt của các chủng vi khuẩn đã ph n lập 40

Hình 3 3: Sơ đồ ph n nhóm vi khuẩn Gram dương và Gram âm 41

Hình 3.4: Ph n nhóm vi khuẩn hình cầu và hình que của vi khuẩn Gram âm 42

Hình 3.5: Ph n nhóm vi khuẩn hình cầu và hình que của vi khuẩn Gram dương 42

Hình 3.6: hu kỳ gia nhiệt của phản ứng P R 44

Hình 3 7: Quy trình tăng sinh khối vi khuẩn ph n hủy cơ chất chứa keratin 49

Hình 3 8: Quy trình xử lý chất thải chứa keratin làm thức ăn chăn nuôi 50

Hình 4.1: hủng VK K14 được tuyển chọn 69

Hình 4.2: Đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn bản đ a được ph n lập 85

Hình 4.3: Kết quả chạy điện di sản phẩm P R trên gel agarose của 26 chủng vi khuẩn được tuyển chọn 87

Hình 4.4: Đa dạng về loài của các chủng vi khuẩn ph n giải keratin được tuyển chọn 92

Hình 4.5: y phát sinh loài thể hiện mối liên hệ di truyền của các chủng vi khuẩn bản đ a ph n giải keratin tốt với các chủng vi khuẩn có trong Gen ank (N I) dựa vào trình tự 16S rRNA 93

Hình 4.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến mật số vi khuẩn, khả năng ph n hủy bột lông gia cầm và hàm lượng protein hòa tan của chủng vi khuẩn Bacillus megaterium K79 97

Hình 4 7: Mối tương quan giữa pH và mật số vi khuẩn của chủng K79 98 Hình 4 8: Mối tương quan giữa pH và tỷ lệ ph n hủy lông của chủng K79 98 Hình 4 9: Mối tương quan giữa pH và hàm lượng protein hòa tan của chủng

K79 98 Hình 4 10: Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến mật số vi khuẩn, khả năng ph n

hủy bột lông gia súc và hàm lượng protein hòa tan của chủng

Brevibacillus parabrevis Kr110 102

Hình 4.11: Ảnh hưởng của nồng độ d ch vi khuẩn đưa vào đến hiệu suất ph n

hủy bột lông gia cầm và hàm lượng protein của chủng VK K79 104 Hình 4 12: Ảnh hưởng của nồng độ d ch vi khuẩn đưa vào đến hàm lượng

protein hòa tan, sự phát triển và khả năng ph n hủy lông gia súc của

chủng vi khuẩn Brevibacillus parabrevis Kr110 105

Hình 4 13: Ảnh hưởng của nguồn dinh dư ng chứa carbon đến

sự phát triển và khả năng ph n hủy lông gia cầm của chủng vi

khuẩn Bacillus megaterium K79 107

Hình 4 14: Ảnh hưởng của nguồn dinh dư ng chứa carbon đến

sự phát triển, khả năng ph n hủy lông gia súc và hàm lượng protein

hòa tan của chủng vi khuẩn Brevibacillus parabrevis Kr110 109

Hình 4 15: Ảnh hưởng của nguồn dinh dư ng chứa nitơ đến mật số

của vi khuẩn, tỷ lệ ph n huỷ lông gia cầm và hàm lượng protein

hòa tan của chủng Bacillus megaterium K79 111

Hình 4 16: Ảnh hưởng của nguồn dinh dư ng chứa nitơ và nồng độ đến sự

phát triển, khả năng ph n hủy lông gia súc và hàm lượng

protein hòa tan của vi khuẩn Brevibacillus parabrevis Kr110 114

Hình 4.17: Sợi lông gà nguyên sau 10 tuần ở 2 nghiệm thức 115 Hình 4.18: (A) hất thải lông gia cầm; ( ) Lông gia cầm trước khi ủ

( ) lông gia cầm sau khi ủ 10 tuần với chủng K79 bản đ a

( ) sản phẩm bột lông sinh học thu được 121 Hình 4 19: Gà thí nghiệm nghiệm thức L5 lúc 14 tuần tuổi 130 Hình PL4.1: Sắc phổ chuỗi trình tự gen 16S rRNA chủng K14

Hình PL4.2: Sắc phổ chuỗi trình tự gen 16S rRNA chủng K15

Hình PL4.3: Sắc phổ chuỗi trình tự gen 16S rRNA chủng K79

Hình PL4.4: Sắc phổ chuỗi trình tự gen 16S rRNA chủng Kr110

Hình PL4.5: Sắc phổ chuỗi trình tự gen 16S rRNA chủng V18

Hình PL4.6: Sắc phổ chuỗi trình tự gen 16S rRNA chủng Vc39 Hình PL4.7: Sắc phổ chuỗi trình tự gen 16S rRNA chủng Vc71

D NH SÁCH BẢNG

Trang ảng 2 1: Ảnh hưởng của nguồn dinh dư ng chứa carbon đến sự ph n hủy

lông gia cầm của Bacillus megaterium F7-1 20

ảng 2 2: Ảnh hưởng của nguồn dinh dư ng chứa nitơ đến sự ph n hủy lông

gia cầm của Bacillus megaterium F7-1 21

ảng 2 3: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến mức độ phát triển của một

số chủng Bacillus trong môi trường nuôi cấy 25

ảng 2 4: Nhu cầu acid amin của gà th t ở các giai đoạn 26 ảng 2 5: Thành phần hóa học của bột lông vũ 31 ảng 2 6: So sánh tỷ lệ tiêu hóa acid amin thật của bột lông vũ với một số

thực liệu d ng cho gia cầm 32 ảng 3 1: Số lượng mẫu thu được ở các cơ sở giết mổ ở Vĩnh Long, thành

phố ần Thơ và Đồng Tháp 35 ảng 3 2: ác thiết b , dụng cụ và hóa chất được d ng trong nội dung

nghiên cứu 2 35 ảng 3 3: Môi trường ph n lập VK ph n hủy lông gia cầm cũng là môi

trường tách ròng (MT1) 36 ảng 3 4: Môi trường tăng sinh d ng cho VK ph n hủy lông gia cầm (MT2) 36 ảng 3 5: Môi trường ph n lập VK ph n hủy lông gia súc cũng là môi

trường tách ròng (MT3) 36 ảng 3 6: Môi trường tăng sinh d ng cho VK ph n hủy lông gia súc (MT4) 36 ảng 3 7: Thành phần của phản ứng P R 43 ảng 3 8: Thành phần hóa học của các thực liệu d ng trong thí nghiệm 52 ảng 3 9: ông thức phối hợp, thành phần hóa học giá tr dinh dư ng của

các khẩu phần thí nghiệm ở gà giai đoạn 5-10 tuần tuổi 53 ảng 3 10: ông thức phối hợp, thành phần hóa học giá tr dinh dư ng của

các nghiệm thức thí nghiệm ở gà giai đoạn 11-14 tuần tuổi 54 ảng 3 11: Bố trí thí nghiệm 55 ảng 3 12: L ch tiêm vaccine phòng bệnh 56

ảng 4 1: Số lƣợng cơ sở giết mổ ở thành phố ần Thơ, Vĩnh Long và

Đồng Tháp 61 ảng 4 2: ông suất các cơ sở giết mổ gia súc ở thành phố ần Thơ,

Đồng Tháp và Vĩnh Long 62 ảng 4 3: Công suất các cơ sở giết mổ gia cầm ở thành phố ần Thơ, Vĩnh

Long và Đồng Tháp 62 ảng 4 4: ách xử lý chất thải lông ở các cơ sở giết mổ ở thành phố ần

Thơ, Vĩnh Long và Đồng Tháp 63 ảng 4 5: Nguồn gốc các chủng vi khuẩn có khả năng ph n giải keratin của

lông gia cầm ph n lập đƣợc 64 ảng 4 6: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn

ph n lập đƣợc 65 ảng 4 7: Kết quả kiểm tra hoạt tính keratinase của 115 dòng VK ph n giải

keratin lông gia cầm 66 ảng 4 8: Tỷ lệ ph n hủy bột lông gia cầm của 115 chủng vi khuẩn sau một

tuần nuôi lắc ở 37oC 68 ảng 4 9: Nguồn gốc các chủng vi khuẩn ph n lập đƣợc có khả năng ph n

giải keratin lông gia súc 70 ảng 4 10: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn ph n hủy

lông gia súc ph n lập đƣợc 71 ảng 4 11: Kết quả kiểm tra hoạt tính enzyme keratinase b ng cơ chất

azokeratin của 225 chủng VK ph n giải keratin lông gia súc 72 ảng 4 12: Kết quả đánh giá khả năng ph n hủy lông gia súc của 225 chủng

VK ph n giải keratin lông gia súc 74 ảng 4.13: Kết quả kiểm tra hoạt tính enzyme keratinase b ng cơ chất

azokeratin của 89 chủng VK ch u nhiệt ph n giải keratin 78 ảng 4 14: Khả năng ch u nhiệt của 89 chủng vi khuẩn đƣợc ph n lập 79 Bảng 4.15: Khả năng ph n hủy lông gia cầm của 89 chủng vi khuẩn ch u

nhiệt sau một tuần nuôi lắc ở 45oC 81 Bảng 4.16: Khả năng ph n hủy bột lông gia cầm của 18 chủng vi khuẩn ch u

nhiệt sau một tuần nuôi lắc ở 50oC 82

Bảng 4.17: Khả năng ph n hủy lông gia cầm của 7 chủng vi khuẩn ch u nhiệt

sau một tuần nuôi lắc ở 55o

C 83 ảng 4 18: Đặc điểm của 26 chủng vi khuẩn được tuyển chọn 84 ảng 4 19: Ph n biệt các đặc tính khác nhau giữa các chi trong nhóm 18 86 ảng 4 20: Kết quả mối tương quan di truyền giữ 26 chủng vi khuẩn ph n

giải keratin đạt hiệu quả cao với các chủng vi khuẩn từ gen ank (N I) (sắp xếp theo khả năng ph n giải keratin) 88 ảng 4 21: Kết quả mối tương quan di truyền 26 chủng vi khuẩn ph n giải

keratin đạt hiệu quả cao với các chủng vi khuẩn có trong gen ank (N I) (sắp xếp theo nhóm vi khuẩn) 91 ảng 4 22: Đa dạng về loài của các nhóm vi khuẩn ph n giải keratin được

tuyển chọn 92 ảng 4.23: Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và khả năng ph n

hủy lông gia cầm của vi khuẩn Bacillus megaterium K79 96

ảng 4 24: Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và khả năng ph n

hủy lông gia súc của chủng vi khuẩn Brevibacillus parabrevis

Kr110 101 ảng 4 25: Ảnh hưởng của nồng độ d ch vi khuẩn đưa vào đến sự phát triển

và khả năng ph n hủy lông gia cầm của chủng vi khuẩn Bacillus

megaterium K79 103

ảng 4 26: Ảnh hưởng của nồng độ d ch vi khuẩn đưa vào đến sự phát triển

và khả năng ph n hủy lông gia súc của chủng vi khuẩn

Brevibacillus parabrevis Kr110 105

ảng 4 27: Ảnh hưởng của nguồn dinh dư ng chứa carbon đến sự phát triển

và khả năng ph n hủy lông gia cầm của chủng vi khuẩn Bacillus

megaterium K79 106

ảng 4 28: Kết quả ảnh hưởng của nguồn dinh dư ng chứa carbon đến sự

phát triển, khả năng ph n hủy lông gia súc (lông heo) và hàm

lượng protein hòa tan của chủng vi khuẩn Brevibacillus

parabrevis Kr110 108

ảng 4 29: Ảnh hưởng của nguồn dinh dư ng chứa nitơ đến sự phát triển và

khả năng ph n hủy bột lông gia cầm, hàm lượng protein hòa tan

của chủng vi khuẩn Bacillus megaterium K79 111

ảng 4 30: Ảnh hưởng của nguồn dinh dư ng chứa nitơ đến sự phát triển,

khả năng ph n hủy lông gia súc và hàm lượng protein hòa tan của

chủng vi khuẩn Brevibacillus parabrevis Kr110 113

ảng 4 31: Mật số vi khuẩn, khả năng ph n hủy bột lông gia cầm và hàm

lượng protein hòa tan của chủng vi khuẩn Bacillus megaterium

K79 ở tuần thứ 10 116 ảng 4.32: Mật số vi khuẩn, khả năng ph n hủy bột lông gia súc và hàm lượng

protein hòa tan của chủng vi khuẩn Brevibacillus parabrevis

Kr110 ở tuần thứ 10 116 ảng 4 33: Hoạt tính keratinase và tỷ lệ ph n hủy bột lông của chủng K79 và

chủng Kr110 117

ảng 4.34: Kết quả ph n tích mật số Salmonella, Coliforms và E.coli trong bột

lông sinh học 122 ảng 4 35: Thành phần hóa học, giá tr năng lượng, tỷ lệ tiêu hóa protein và

acid amin của bột lông sinh học thu được từ lông gia cầm được

ph n hủy bởi chủng vi khuẩn K79 123 ảng 4 36: Ảnh hưởng của thức ăn thí nghiệm lên khối lượng, tăng trọng của

gà ta Gò ông 125 ảng 4 37: Số lượng dư ng chất tiêu thụ của gà ta Gò ông 127 ảng 4 38: Ảnh hưởng của thức ăn thí nghiệm lên các ch tiêu th n th t ở các

nghiệm thức 129 ảng PL1 1: anh sách 35 nhóm vi khuẩn của hệ thống ph n loại ergey

ảng PL1 2: Hoạt độ keratinase, tỷ lệ ph n hủy lông gia cầm, arcsin tỷ lệ ph n

hủy lông gia cầm của 115 chủng vi khuẩn ph n giải keratin lông gia cầm

ảng PL1 3: Hoạt độ keratinase, tỷ lệ ph n hủy lông gia súc, arcsin tỷ lệ ph n

hủy lông gia súc của 225 chủng vi khuẩn ph n giải keratin lông gia súc

ảng PL1 4: Hoạt độ keratinase, tỷ lệ ph n hủy lông gia cầm ở nhiệt độ 45o

C, arcsin tỷ lệ ph n hủy lông gia cầm ở nhiệt độ 45o của 89 chủng

vi khuẩn ch u nhiệt ph n giải keratin lông gia cầm

ảng PL1 5: Tỷ lệ ph n hủy lông gia cầm ở nhiệt độ 50o , arcsin tỷ lệ ph n

hủy lông gia cầm ở nhiệt độ 50o của 18 chủng vi khuẩn ch u

nhiệt ph n giải keratin lông gia cầm

ảng PL1 6: Tỷ lệ ph n hủy lông gia cầm ở nhiệt độ 55o , arcsin tỷ lệ ph n

hủy lông gia cầm ở nhiệt độ 55o của 7 chủng vi khuẩn ch u nhiệt

ph n giải keratin lông gia cầm

ảng PL1 7: Mẫu phiếu điều tra tình hình chất thải tại các cơ sở giết mổ gia

súc – gia cầm

ảng PL1 8: Kết quả đo O 26 mẫu NA ly trích được

ảng PL2.1: Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển, tỷ lệ ph n hủy

lông và hàm lượng protein hòa tan của chủng vi khuẩn K79 ảng PL2 2: Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển, tỷ lệ ph n hủy

lông và hàm lượng protein hòa tan của chủng vi khuẩn Kr110 ảng PL2 3: Ảnh hưởng của nồng độ d ch vi khuẩn đưa vào đến sự phát triển,

tỷ lệ ph n hủy lông và hàm lượng protein hòa tan của chủng vi khuẩn K79

ảng PL2 4: Ảnh hưởng của nồng độ d ch vi khuẩn đưa vào đến sự phát triển,

tỷ lệ ph n hủy lông và hàm lượng protein hòa tan của chủng vi khuẩn Kr110

ảng PL2 5: Ảnh hưởng của nguồn carbon đưa vào đến sự phát triển, tỷ lệ

ph n hủy lông và hàm lượng protein hòa tan của chủng vi khuẩn K79

ảng PL2 6: Ảnh hưởng của nguồn carbon đến sự phát triển, tỷ lệ ph n hủy

lông và hàm lượng protein hòa tan của chủng vi khuẩn Kr110 ảng PL2 7: Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự phát triển, tỷ lệ ph n hủy lông

và hàm lượng protein hòa tan của chủng vi khuẩn K79 ảng PL2 8: Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự phát triển, tỷ lệ ph n hủy lông

và hàm lượng protein hòa tan của chủng vi khuẩn Kr110 ảng PL3 1: Khối lượng, tăng trọng, tiêu tốn thức ăn, hệ số tiêu tốn thức ăn

của gà ở các nghiệm thức Bảng PL3 2: Vật chất khô ăn vào, Protein thô ăn vào, bột lông ăn vào, năng

lượng ăn vào của gà ở các nghiệm thức ảng PL3 3: h tiêu khảo sát th n th t gà ở các nghiệm thức

ảng PL4 1: Nguồn gốc 26 chủng vi khuẩn ph n giải keratin mạnh

ảng PL4 2: Đặc tính sinh học của 26 chủng VK đ nh danh của đề tài

atin

D NH MỤC TỪ VIẾT TẮT

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

CFU Colony Forming Unit

CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

ddNTP Dideoxynucleotide

DMSO Dimethyl sulfoxide

DNA Deoxyribonucleic acid

dNTP Deoxy Nucleoside Triphosphate

Đ S L Đồng ng Sông ửu long

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

EtBr Ethidium Bromide

HSP Heat Shock Protein

NCBI National Center for Biotechnology Information

OD Optical Density

PCR Polymerase Chain Reaction

rDNA ribosomal Deoxyribonucleic Acid

RNA Ribonucleic Acid

rpm rotation per minute

rRNA ribosomal ribonucleic acid

TAE Tris Ammonium acetate Ethylenediaminetetraacetic acid Taq Thermus aquaticus

TE Tris Ethylenediaminetetraacetic acid

Tm melting Temperature

CHƯƠNG 1 GIỚI THI U 1.1 Lý do chọn đề tài, lĩnh vực nghiên cứu

Hàng năm, người d n Việt Nam tiêu thụ hàng triệu tấn th t gia súc, gia

cầm được nuôi trong nước và nhập khẩu Tính đến tháng 10 năm 2016, th t

tr u đạt 86,6 nghìn tấn, tăng 1% so với c ng thời điểm năm trước; sản lượng

th t bò đạt 308,6 nghìn tấn, tăng 3,1%; sản lượng th t heo đạt 3,7 triệu tấn, tăng

5%; sản lượng th t gia cầm đạt 961,6 nghìn tấn, tăng 5,9%(Tổng cục thống kê

Việt Nam, 2016) Tương ứng với số lượng đó là hàng ngàn tấn lông gia súc,

gia cầm thải loại ra môi trường mà chưa có biện pháp xử lý hiệu quả Tính đến

tháng 12/2016,cả nước có trên 28.000 điểm giết mổ gia súc, gia cầm ( ục

Thú y, 2016) Mặc d từ năm 2005, nhà nước đã ban hành nhiều văn bản về

quy hoạch x y dựng các điểm giết mổ gia súc, gia cầm tập trung ác t nh

cũng ch đạo đẩy mạnh quy hoạch, x y dựng các cơ sở giết mổ tập trung trên

đ a bàn Tuy nhiên, cho đến nay mô hình này vẫn chưa được triển khai mạnh ở

các t nh; các cơ sở giết mổ nhỏ l vẫn còn chiếm ưu thế Tại các cơ sở này do

chưa có quy trình xử lý chất thải, g y ô nhi m môi trường trầm trọng, làm ảnh

hưởng đến các ngành sản xuất khác và sức khỏe của người d n sống quanh đó

Với nguồn chất thải này, ph n và nước thải có thể được xử lý b ng hầm biogas

tạo khí gas để phục vụ sinh hoạt Do lông gia súc và lông gia cầm có thành

phần chính là keratin, rất khó ph n hủy (Gupta and Ramnani, 2006), lại chiếm

t lệ khá lớn trong nguồn rác thải từ các lò giết mổ nên mức độ ô nhi m càng

nghiêm trọng Vì vậy, việc tìm ra cách để xử lý chất thải lông tại các lò mổ gia

súc gia cầm là rất cần thiết

Hiện nay, chất thải chứa keratin thường được xử lý b ng các phương

pháp chôn và đốt, g y ô nhi m đất, mạch nước ngầm và không khí (Nguy n

Đình Quyến và Trần Th Lan Phương, 2001) Trong keratin chứa những acid

amin quan trọng có thể sử dụng làm thức ăn cho gia súc, ph n hữu cơ, gas sinh

học (Nguy n Thu Hiền và ctv., 2013) Tuy nhiên, phương pháp vật lý hay hóa

học hiện đang được sử dụng trong các quy trình chế biến d làm phá hủy

những acid amin, tiêu thụ rất nhiều năng lượng và tạo ra những chất g y ô

nhi m cho môi trường (Matikevičienė et al., 2009) o đó, tìm ra một phương

pháp hiệu quả để xử lý chất thải keratin là một vấn đề có ý nghĩa quan trọng

đối với ngành chăn nuôi do vừa có thể tạo ra những sản phẩm có giá tr kinh

tế, lại vừa có thể xử lý hiệu quả chất thải lông gia súc, gia cầm Trong những

năm gần đ y, biện pháp xử lý lông gia súc, gia cầm b ng phương pháp sinh

học rất được quan t m và chú trọng

Trên thế giới hiện có rất nhiều công trình nghiên cứu ph n giải keratin

b ng vi sinh vật và đã ph n lập được rất nhiều loài vi sinh vật có khả năng

ph n giải keratin như vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn (Sangali and randelli,

1999) Các phương pháp chế biến bột lông vũ thủy phân b ng cách chủng vi

khuẩn như Bacillus licheniformis PWD-1 đã cải thiện được tăng trưởng của gà

(William et al., 1991)

Tuy nhiên, mỗi loài vi sinh vật có những điều kiện thuận lợi cho sự sinh

trưởng và phát triển khác nhau Nếu điều kiện thay đổi bất lợi g y ảnh hưởng

xấu đến vi sinh vật khiến cho vi sinh vật chết hoặc ngừng phát triển, còn nếu

điều kiện thuận lợi vi sinh vật sẽ sinh trưởng và phát triển tốt (Nguy n L n

ũng và ctv., 2012) Vì vậy, khảo sát những điều kiện thuận lợi cho sự sinh

trưởng và phát triển của những chủng vi khuẩn ph n giải keratin đã được ph n

lập có ý nghĩa quan trọng trong việc sử dụng những chủng vi khuẩn này vào

xử lý keratin trong thực tế với hiệu quả cao nhất Điều này càng giúp việc ứng

dụng biện pháp sinh học sử dụng vi khuẩn thuận lợi hơn trong việc chế biến

lông gia súc gia cầm làm thành phần bổ sung trong thức ăn gia súc gia cầm từ

đó giảm được ô nhi m môi trường, n ng cao giá tr dinh dư ng của sản phẩm

protein và hiệu quả về kinh tế hơn so với các phương pháp vật lý và hóa học

hính vì vậy, việc ph n lập, tuyển chọn và nghiên cứu quy trình nuôi cấy ph

hợp cho các chủng vi khuẩn có khả năng ph n hủy lông gia súc gia cầm để tận

dụng nguồn chất thải này sẽ tạo ra những sản phẩm có giá tr cao, đồng thời

góp phần giải quyết hiệu quả bài toán xử lý môi trường với giá thành thấp

Ở Việt Nam, những năm gần đ y ch mới có một vài nghiên cứu về một

số chủng vi sinh vật có khả năng ph n giải keratin từ chất thải lông gia cầm

Nguy n Đình Quyến và Trần Th Lan Phương (2001) đã tiến hành phân lập

được từ đất ở cơ sở giết mổ gia cầm 7 chủng xạ khuẩn và 15 chủng Bacillus có

hoạt tính phân giải casein; trong đó 5 chủng xạ khuẩn và 2 chủng Bacillus có

khả năng giải lông gà mạnh Nguy n Huy Hoàng và ctv (2010) cũng đã tiến

hành phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus, Chryseobacterium,… có khả năng

thủy ph n lông vũ từ một số v ng đất khác nhau ở phía Bắc Việt Nam- vùng

khí hậu khá khác biệt với miền Nam Việt Nam Những nghiên cứu này vẫn

còn đang trong giai đoạn khảo sát đặc tính các chủng vi sinh vật phân lập

được, chưa thấy có công bố ứng dụng các vi sinh vật này Hơn nữa, miền Nam

Việt nam chiếm ưu thế trên cả nước về sự phát triển của chăn nuôi Điều này

kéo theo số lượng lông gia súc gia cầm thải ra lớn, đồng thời nhu cầu thức ăn

chăn nuôi bổ sung đạm cho vật nuôi cũng cao Xuất phát từ thực tế trên, đề tài

―Phân lập, tuyển chọn và ứng dụng vi khuẩn phân giải keratin trong chăn

nuôi‖ được tiến hành

1 2 Mục tiêu của đề tài

Đề tài được tiến hành nh m đạt mục tiêu sau:

Tuyển chọn và đ nh danh được một số chủng vi khuẩn từ các cơ sở giết

mổ gia súc, gia cầm của v ng Đ S L có khả năng ph n hủy hiệu quả lông gia

súc, gia cầm

Thiết kế được quy trình nuôi cấy thích hợp cho một số chủng vi khuẩn

được tuyển chọn có khả năng ph n giải keratin mạnh

Ứng dụng chủng vi khuẩn được tuyển chọn để xử lý nguồn chất thải lông

gia cầm nh m tạo thành thức ăn bổ sung protein cho ngành chăn nuôi

1.3 Nội dung nghiên cứu

Đề tài bao gồm các nội dung nghiên cứu:

Nội dung 1: Khảo sát tình trạng chất thải lông ở các cơ sở giết mổ gia

súc gia cầm tại thành phố ần Thơ, Vĩnh Long và Đồng Tháp

Nội dung 2: Ph n lập, tuyển chọn và nhận diện vi khuẩn hiếu khí phân

giải keratin mạnh từ chất thải chăn nuôi và chế biến gia súc gia cầm

Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện môi trường nuôi

cấy đến sự phát triển và khả năng ph n hủy lông gia súc gia cầm của một số

chủng vi khuẩn bản đ a được tuyển chọn

Nội dung 4: Nghiên cứu ứng dụng một chủng vi khuẩn bản đ a được

tuyển chọn để chế biến lông gia cầm thành thức ăn bổ sung protein cho vật

nuôi

1 4 Những đóng góp mới của đề tài

Là nghiên cứu đầu tiên ở Đ S L có tính hệ thống về vi khuẩn ph n giải

keratin chất thải lông gia súc gia cầm, bao gồm các kh u ph n lập, tuyển chọn,

đ nh danh, đánh giá khả năng ph n giải keratin, khảo sát điều kiện nuôi cấy tối

ưu và ứng dụng vào chăn nuôi gà th t thả vườn

Quá trình ph n lập dựa vào cơ chế trao đổi chất đặc biệt trong quá trình

tăng trưởng và phát triển của vi khuẩn ph n giải keratin chất thải lông, cấy

chuyền để sàng lọc và tuyển chọn ban đầu nguồn vi khuẩn mong muốn, là

phương pháp mới để ph n lập vi khuẩn ph n giải keratin Sự kết hợp các

phương pháp xác đ nh hoạt tính keratinase, xác đ nh khả năng ph n giải

keratin là phương pháp tin cậy để tuyển chọn nguồn vi khuẩn bản đ a phân

giải tốt keratin chất thải lông Thông qua phương pháp này kết hợp phương

pháp đ nh danh truyền thống Bergey và phương pháp sinh học ph n tử, đã

ph n lập, tuyển chọn và đ nh danh được 26/429 chủng vi khuẩn bản đ a có khả

năng ph n giải keratin mạnh làm cơ sở cho việc chọn lọc các chủng vi khuẩn

có hiệu suất ph n hủy mạnh chất thải lông gia súc gia cầm để ứng dụng xử lý

chất thải lông từ các cơ sở giết mổ gia súc gia cầm

Góp phần làm phong phú và bổ sung mới bộ sưu tập vi khuẩn có khả

năng ph n giải keratin mạnh vào bộ giống Vi sinh vật hữu ích của Viện

Nghiên cứu và Phát triển NSH để phục vụ sản xuất

Xác đ nh các môi trường nuôi cấy thích hợp cho các chủng vi khuẩn

Bacillus megaterium K79 và Brevibacillus parabrevis Kr110 bản đ a có khả

năng ph n hủy chất thải lông mạnh ở v ng Đ S L

ước đầu x y dựng các thông số ph hợp cho quy trình ứng dụng đối với

chủng Bacillus megaterium K79 có khả năng ph n hủy lông gia cầm

mạnh giúp xử lý và tận dụng phế phẩm lông gia cầm thành thức ăn bổ

sung protein cho vật nuôi ở dạng bột lông sinh học an toàn vi sinh với giá tr

dinh dư ng và khả năng tiêu hóa cao và đáp ứng được yêu cầu th n thiện với

môi trường tốt hơn so với bột lông Meko (sản phẩm thương mại)

Ngoài ra, các thông tin về phương pháp ph n lập, kết quả khảo sát và

tiềm năng ứng dụng của tập đoàn vi khuẩn ph n giải keratin mạnh có thể bổ

sung vào các giáo trình và phục vụ giảng dạy cho chuyên ngành vi sinh vật và

công nghệ sinh học

CHƯƠNG 2 TỔNG QU N TÀI LI U 2.1 Sơ lược về chất thải lông

Mỗi năm trên thế giới có khoảng hàng tỷ tấn lông vũ được thải ra từ

ngành chăn nuôi và chế biến gia cầm, g y ra vấn đề môi trường đồng thời làm

lãng phí nguồn protein (Gousterova et al., 2005) Lông chứa khoảng 90%

protein, trong đó thành phần chính là keratin Keratin là thành phần cấu tạo

chủ yếu trong lông, tóc, móng tay, móng vuốt, da, (Onifade et al., 1998)

T y thuộc vào giống vật nuôi và độ tuổi mà t lệ lông trên trọng lượng cơ thể

có sự khác nhau Đối với gia súc lớn như heo, lông chiếm từ 0,5 – 0,8% trọng

lượng cơ thể, đối với gà trưởng thành t lệ này đạt từ 5 – 7% Theo kết quả

nghiên cứu của Nguy n Nhựt Xu n ung và ctv (2015), lông chiếm tỷ lệ từ

4,6 – 5,2% khối lượng sống của gà th t công nghiệp ở tại lò mổ Thuận Trường

(Đồng Nai) Onifade et al (1998) cũng cho biết lông gia cầm chiếm tỷ lệ từ

5-7% tổng khối lượng sống của gà

Với thành phần chủ yếu là keratin (chiếm hơn 92%) khá tinh khiết đồng

thời được thải ra với một số lượng lớn (Manczinger et al., 2003), nên chất thải

lông được xem là một dạng protein có tiềm năng thay thế cho những nguồn

protein đắt tiền khác để bổ sung vào thành phần thức ăn chăn nuôi Để có thể

trở thành thức ăn chăn nuôi, chất thải lông cần trải qua nhiều giai đoạn xử lý

b ng các phương pháp vật lý và hóa học khác nhau Tại các cơ sở chế biến

hiện đại, lông vũ được nấu dưới áp suất cao, sử dụng hơi nước trực tiếp thủy

ph n một phần protein, phá hủy các cầu nối bên trong cấu trúc keratin Sau đó,

bột lông vũ đã thủy ph n sẽ được xử lý b ng men pepsin tạo ra một sản phẩm

có tính ngon miệng cao và d tiêu hóa đối với nhiều loài vật nuôi Đặc biệt đ y

là nguồn dồi dào các acid amin như leucin, arginine, cystein Tuy nhiên những

quá trình này đòi hỏi rất nhiều năng lượng và chi phí đầu tư sản xuất cũng rất

lớn ên cạnh đó, quá trình gia nhiệt và xử lý hóa học cũng làm phá hủy một

số acid amin nhạy cảm bởi nhiệt có trong thành phần lông như methionine,

lysine, tryptophan (Papadoulos and Ketelaars, 1986) và tạo ra một số acid

amin như lanthionine và lysinoalanine làm giảm đáng kể giá tr dinh dư ng

của sản phẩm tạo thành

ông nghệ vi sinh vật phát triển đã mở ra một hướng đi mới, ph n hủy

chất thải lông b ng biện pháp sinh học nhờ hoạt động của vi khuẩn nh m tạo

ra một nguồn protein có t lệ dinh dư ng c n b ng hơn, cải thiện giá tr dinh

dư ng của sản phẩm, bổ sung vào thức ăn chăn nuôi thay thế các nguồn

protein đắt tiền khác, và đồng thời còn giúp hỗ trợ xử lý các nguồn rác thải có

nhiều cơ chất chứa keratin để giải quyết vấn đề ô nhi m môi trường

2.2 Sơ lược về keratin

(a) Mặt cạnh, xoay góc 90o (b) Mặt chụp nhìn từ trên

-keratin -keratin

Hình 2.1: ấu trúc keratin (Chemical Education Digital Library, 2010) Keratin là một dạng protein chủ yếu trong các tế bào biểu mô của động

vật có xương sống và là thành phần chính cấu tạo nên biểu bì, tóc, móng, lông,

sừng… Keratin có cấu trúc dạng sợi, các chuỗi protein được cuộn chặt, gấp

nếp thành cấu trúc 3 chiều ấu trúc cơ bản bậc hai của keratin được ph n

thành hai dạng α-helix (ở tóc) và β-sheets (ở lông vũ) ác sợi keratin ở cả hai

dạng α-helix và β-sheet xoắn song song với nhau để đảm bảo độ bền ổn đ nh

của sợi (Akhtar and Edwards, 1997) α-keratin có trong tóc (kể cả lông cừu),

sừng, móng tay, móng ch n, móng và móng guốc của động vật có vú ấu tạo

là các sợi đơn protein liên kết với nhau b ng liên kết hydro β-keratin có trong

móng tay và móng vuốt của loài bò sát, họ vỏ chelonians (ba ba, r a…) và

trong lông, mỏ, móng vuốt của chim và nhím, được hình thành chủ yếu trong

các phiến beta Không giống như các chuỗi xoắn α, các phiến β được nối với

nhau b ng các cầu nối disulfide và các chuỗi bên trong được ép khá gần nhau

Keratin cũng được ph n loại thành keratin cứng và mềm dựa vào hàm

lượng lưu huỳnh Keratin cứng được tìm thấy ở các phần phụ như lông vũ, tóc,

móng guốc,… với hàm lượng cầu nối disulfide cao, bền và không thể kéo dài

Trong khi đó, keratin mềm ở da hay mô sẹo có hàm lượng cầu nối disulfide

thấp và mềm d o hơn (Voet and Voet, 1995) Sự liên kết chéo chặt chẽ nhờ

liên kết hidro, tương tác kỵ nước và các cầu nối disulfide tạo nên cấu trúc bền

vững của keratin và kháng lại sự ph n giải bởi các protease thông thường như

trypsin, pepsin hay papain Tuy nhiên, một số loài vi khuẩn vẫn có khả năng

ph n giải keratin hiệu quả nhờ vào hoạt tính của enzyme keratinase (Onifade

et al., 1998)

T nh h nh h i thá và sử ụng er tin ở Việt N m

Ở Việt Nam, cũng như trên thế giới, nguồn keratin thô vẫn chưa được

khai thác và sử dụng đáng kể; đặc biệt là lông gia cầm; phần lớn thải ra từ các

lò giết mổ đều chưa được khai thác và xử lý hiệu quả húng thường được tập

trung lại thành các đống lớn; một số được chôn lấp, một số b đốt, còn lại chưa

được xử lý, g y ô nhi m nghiêm trọng môi trường xung quanh các lò giết mổ

Hiện nay, ở nước ta cũng chưa có nhiều nghiên cứu nh m sử dụng sản phẩm

phân hủy sinh học lông gia cầm, gia súc làm nguồn thức ăn bổ sung cho chăn

nuôi; vì vậy hầu như chưa có ứng dụng nào trong thực ti n nh m xử lý theo

hướng này

2.3 Các phương pháp ph n giải keratin

2.3.1 Phương pháp lý hoá

Keratin có thể được phân giải bởi các phương pháp lý hoá như thủy phân

trong môi trường acid, môi trường kiềm ở nhiệt độ và áp suất cao Nghiên cứu

của raper (1944) là nghiên cứu đầu tiên về việc sử dụng nhiệt để cải thiện giá

tr dinh dư ng từ thức ăn nhờ ph n hủy lông gia cầm Kể từ đó, nhiều nghiên

cứu đã được thực hiện để bổ sung thông tin nh m n ng cao giá tr dinh dư ng

từ thức ăn do lông vũ thủy phân (Moritz et al., 2001)

Điều kiện chế biến có ảnh hưởng r rệt đến giá tr dinh dư ng của thức

ăn từ lông gia cầm được thủy ph n Ở áp suất thấp và thời gian thủy phân dài

có thể n ng giá tr dinh dư ng và cải thiện khả năng tiêu hoá của động vật sử

dụng thức ăn đó Thông thường, lông được thủy ph n b ng cách đun trong

một nồi áp lực trong 30 phút đến 60 phút Hiệu quả thủy ph n có thể đạt 80%

đến 85% Tuy nhiên, phương pháp này không những phá hủy một số acid

amin (methionine, lysine, histidine), còn sản sinh một số chất độc, nên khó sử

dụng sản phẩm ph n hủy theo cách này để làm thức ăn cho chăn nuôi hay tận

dụng nguồn protein cho các mục đích khác ên cạnh đó, ph n hủy lông gia

cầm theo phương pháp này còn tiêu thụ một lượng lớn năng lượng Nhiều nơi,

keratin thô được xử lý b ng cách đốt Phương pháp này tạo ra một số khí g y

ô nhi m môi trường đồng thời lãng phí nguồn protein từ keratin (Nguy n Đình

Quyến và ctv., 2001)

2.3.2 Phương pháp sinh học

Lông gia cầm được ph n hủy nhờ các vi sinh vật có hoạt tính keratinase

là một phương pháp thay thế được lựa chọn đem lại hiệu quả cao, khắc phục

được những hạn chế của các phương pháp lý hóa Người ta đã tiến hành ph n

lập đựợc các vi sinh vật bao gồm cả nấm, xạ khuẩn, vi khuẩn với nhiều chủng

có hoạt tính keratinase cao được sử dụng trong việc ph n hủy lông gia cầm và

sử dụng sản phẩm ph n hủy đó làm nguồn thức ăn bổ sung cho chăn nuôi Các

vi sinh vật được ph n lập là loài chung của nấm, xạ khuẩn và vi khuẩn như:

Doratomyces microsporus, Aspergillus sp, Alternaria radicina, Trichurus

spiralis, Stachybotrys atra, Onygena sp, Absidia sp, Rhizomucor sp ,

Stenotrophomonas sp., Bacillus licheniformis và B pumilus và Vibrio sp

Những vi sinh vật này tiết keratinase ngoại bào khi môi trường có keratin

và ph n giải keratin thành các axit amin hoặc các peptid ngắn, những chất này

được vi sinh vật sử dụng làm nguồn carbon và nitơ (Nguy n Đình Quyến và

ctv., 2001)

2.4 Keratinase

Tuy keratin là một dạng protein khó b ph n giải, nhưng thực tế ngoài tự

nhiên các dạng cơ chất chứa keratin như lông, móng, sừng,… vẫn b ph n hủy,

mặc d trong thời gian rất l u Điều này có được là do hoạt động của các vi

sinh vật (vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc) có khả năng sinh ra keratinase

Keratinase là loại enzyme ngoại bào Keratinase có khả năng ph n hủy

cơ chất chứa keratin trong tự nhiên và được ph n loại là protease với mã số là

EC 3.4.21/24/99.11 (Gupta and Rammani, 2006) Trong nghiên cứu của

Bressollier et al (1999) và Odetallah et al.(2003), keratinase cũng được đ nh

nghĩa là serine protease do nó tương đồng trình tự 97% với protease kiềm và

nó cũng b ức chế bởi các chất ức chế tương tự chất ức chế serine protein Hầu

hết các keratinase được mô tả đến nay đều thuộc loại serine protease và ch có

một vài metalloprotease cho thấy có hoạt tính ph n giải keratin ác

metalloprotease này thường được tìm thấy ở các vi khuẩn Gram m ( randelli,

2007)

ác keratinase từ vi khuẩn thường được sản xuất dưới điều kiện chìm và

lắc, ngoại trừ các chủng vi khuẩn ch u nhiệt (Nam GW et al., 2002; Rissen

and Antranikian, 2001) thì lên men chìm tĩnh Tuy nhiên, chưa có bài báo nào

nói về lên men rắn cho việc sản xuất keratinase

Keratinase được tách chiết và tinh sạch nhờ phối hợp các phương pháp:

siêu lọc, kết tủa b ng amoni sulphat, kết tủa b ng các dung môi lọc gel, sắc ký

tương tác kỵ nước và sắc ký trao đổi ion hoặc sắc ký ái lực EAE

(Diethylaminoethyl cellulose) Phương pháp áp dụng ở mức độ công nghiệp

hiện nay là lọc ph n đoạn, sau đó keratinase được tinh sạch qua các giai đoạn

sắc ký ái lực, sắc ký lọc gel ng phương pháp này, mức độ tinh sạch

keratinase từ chủng Bacillus subtilis MT 9102 tăng lên 45,9 lần so với ban

đầu, cho hoạt độ riêng đạt 4181 U/mg protein, với hiệu suất thu được 27,60%

Phương pháp sắc ký trao đổi ion thường được sử dụng để tinh sạch keratinase

Sau quá trình sắc ký trao đổi ion, người ta có thể áp dụng các kỹ thuật khác

như lọc gel, sắc ký ái lực heparin để n ng cao độ tinh sạch (Phạm Th Tr n

Châu và ctv., 2009; Đặng Th Thu và ctv., 2004)

Trọng lượng ph n tử của keratinase giới hạn từ 18 đến 200 k a tùy theo

nguồn vi sinh vật Với trọng lượng ph n tử thấp nhất là 18 k a đối với

keratinase từ S albidoflavus SK 1–02 (Chitte et al., 1999), và trọng lượng

ph n tử cao nhất 200 k a từ keratinase của Kocuria rosea và F islandicum

(Nam G.W et al., 2002; Bernal et al., 2006) Tuy nhiên, trọng lượng ph n tử

có thể cao đến 440kDa (Kim et al., 2004) nếu kể cả nguồn keratinase từ nấm

g y bệnh

Nhiệt độ tối ưu của keratinase dao động từ 30o

C đến 80°C Tuy nhiên,

keratinase từ Chrysosporium keratinophilum (Dozie et al 1994) và

Fervidobacterium islandicum AW -1 ch u nhiệt (Nam G.W et al., 2002) có

nhiệt độ tối ưu đặc biệt cao là 90o và 100° , tương ứng với một chu kỳ bán

rã của 30 phút và 90 phút Tổng quan tài liệu về độ pH và nhiệt độ cho thấy

keratinase nói chung hoạt động bền vững với pH từ 5,0 đến 13,0 (Dozie et

al.,1994.; Böckle et al 1995; Bressollier et al., 1999; Nam G.W et al., 2002;

Farag and Hassan, 2004) Giá tr hoạt độ enzyme thấp nhất ở pH = 4,0 với

keratinase từ S pactum DSM40530 (Böckle et al., 1995), và giá tr hoạt độ

enzyme cao nhất ở pH = 13,0 đối với keratinase từ Bacillus halodurans

AH-101 (Takami et al 1999) Khả năng ch u nhiệt trong 90 phút ở 100o đối với

keratinase từ F islandicum AW-1 (Nam G.W et al., 2002) và 6 giờ ở 80° đối

với keratinase nguồn gốc từ Thermoanaerobacter keratinophilus (Rissen and

Antranikian 2001)

ác ion kim loại như Ca2+

, Mg2+ và Mn2+ sẽ kích hoạt keratinase (Mukhopadhyay and Chandra, 1990; Rissen and Antranikian, 2001; Nam G.W

et al., 2002; Riffel et al., 2003) Ngược lại, hoạt động keratinase b ức chế bởi

quá trình chuyển hóa và các ion kim loại nặng u2+ (Nam G.W et al., 2002.;

Riffel et al., 2003; Thys et al., 2004), Hg2+ (Riffel et al., 2003; Thys et al.,

2004) , Ag+ (Nam G.W et al., 2002; Mukhopadhyay and Chandra, 1990), Pb +

(Mukhopadhyay and Chandra, 1990; Farag and Hassan, 2004), Zn2+ (Dozie et

al., 1994; Thys et al., 2004) , Ba2+ và Co+ ( Dozie et al., 1994); trong khi Fe2+

làm tăng thêm khả năng ph n giải keratin của C keratinophilum (Dozie et al.,

1994) Keratinase có thể b ức chế, kích hoạt hoặc bền vững trong chất tẩy rửa

và dung môi Keratinase thường bền vững trong sự hiện diện của dung môi

hữu cơ (Nam G.W et al., 2002; Riffel et al., 2003; Mitsuiki et al., 2004),

DMSO (Böckle et al., 1995; Mitsuiki et al., 2004) và Triton X-100 (Riffel et

al., 2003; Mitsuiki et al., 2004)

Hình 2.2: ấu trúc keratinase

(Kim et al., 2004)

Keratinase có tiềm năng to lớn trong việc xử lý chất thải trong ngành

công nghiệp chế biến gia cầm, ph n bón và thuộc da Ứng dụng của keratinase

còn có thể được mở rộng trong các ngành công nghiệp chất tẩy và dệt Chúng

được ứng dụng trong việc làm sạch len và sợi Trong ngành công nghiệp dệt,

tiềm năng làm sạch lông của enzyme này dẫn đến sự phát triển của công nghệ

làm sạch lông an toàn, th n thiện môi trường và những sản phẩm chăm sóc vệ

sinh cá nhân (Gupta et al., 2006) Keratinase còn được sử dụng trong sản xuất

dược phẩm, thuộc da, mỹ phẩm và các ngành công nghiệp chế biến thức ăn gia

súc

Đặc biệt là trong lĩnh vực mới như ph n hủy prion để điều tr căn bệnh

bò điên đáng sợ (Lin et al., 1995) ệnh bò điên (BSE), ệnh Scrapie ở cừu và

ệnh Creusfldt - Jakob ( J ) ở người là nhóm bệnh thoái hoá thần kinh

húng g y nên bởi protein truyền nhi m (PrPSC) húng là bệnh g y tử vong

và rất khó kiểm soát, bởi vì PrPSC có sức đề kháng với các quá trình vô tr ng

thông thường Về hoá học, PrPSC là một protein ổn đ nh, giàu cấu trúc , có

sức đề kháng với nhiệt và protease Keratinase và PrPSC có cấu trúc tương tự

nhau, cả hai đều có cấu trúc- protein và có sức đề kháng với hầu hết

protease Một thí nghiệm đã được tiến hành gần đ y ở Hà Lan cho thấy tế bào

não được chẩn đoán b ng phương pháp chuẩn là đã mắc bệnh bò điên và tế

bào não mắc bệnh bò điên này được xử lý b ng cách các mô đồng nhất được

nấu trước và được tiêu hoá bởi keratinase Kết quả là PrPSC b hoàn toàn ph n

huỷ bởi enzyme keratinase Khám phá này cho thấy có thể sử dụng

keratinase để khử các dụng cụ y tế truyền nhi m và các sản phẩm gia súc (Jan

P M Langeveld et al., 2004)

Gần đ y hơn, sản phẩm keratinase được thí nghiệm như là một enzyme

đóng vai trò là thức ăn bổ sung ở gà con cho đến khi xuất chuồng có thể tăng

thêm 100g trọng lượng và làm giảm hệ số chuyển hoá thức ăn Khi gà thiếu

nhiều protein trong khẩu phần (80% nhu cầu) thì keratinase trong khẩu phần

có thể cải thiện sinh trưởng của gà Trong 3 tuần đầu tiên, hệ số chuyển hoá

thức ăn là 2,03 đối với khẩu phần được bổ sung keratinase so với hệ số chuyển

hoá thức ăn là 2,13 đối với khẩu phần không được bổ sung Nhiều thí nghiệm

đang được nghiên cứu để thiết lập giá tr dinh dư ng của keratinase PW -1

Keratinase d ng như thức ăn bổ sung đã tạo cơ hội thương mại rộng mở cho

thức ăn chăn nuôi và sản phẩm chăn nuôi (Odetallah et al 2005)

Nhờ đặc tính keratinase phân giải keratin nhưng không làm ph n hủy

collagen, keratinase đang ngày càng được quan t m áp dụng cho quá trình tẩy

lông Keratinase hỗ trợ ph n giải keratin trong nang, do đó kéo ra sợi lông còn

nguyên vẹn mà không ảnh hưởng đến độ bền da (Macedo et al 2005;

Bressollier et al 1999; Allpress et al 2002;) Trong thực tế, một keratinase tạo

ra từ B subtilis S14 (Macedo et al 2005) đã được công bố có khả năng loại bỏ

hoàn toàn chất độc sodium sulfide trong ngành công nghiệp da Như vậy, quá

trình tẩy lông dựa trên sodium sulfide mà tạo ra một mối đe dọa ô nhi m môi

trường do tăng O có thể được thay thế b ng kỹ thuật tẩy lông sinh học nhờ

keratinase

Keratinase còn được d ng để điều tr viêm tuyến bã nhờn Nguyên nhân

cơ bản của hiện tượng viêm tuyến bã nhờn là do có quá nhiều keratin ở sợi

tóc, làm tắt nghẽn bề mặt da, chất nhờn không thể thoát ra ngoài ên cạnh đó,

keratinase từ Bacillus licheniformis (PWD) và E coli cũng đã được đưa vào

thử nghiệm và ứng dụng trong mỹ phẩm Keratinase là một trong những thành

phần của chất tẩy tế bào chết cho da mặt, rất hữu ích cho việc điều tr mụn

trứng cá vì các tế bào chết làm tắt nghẽn lỗ ch n lông, g y viêm tuyến bã

nhờn Một số loại dầu gội tr gàu cũng chứa keratinase vì hoạt tính keratinase

giúp gội sạch các tế bào chết bong tróc Enzyme này còn có thể loại bỏ mụn

cóc và các vết chai trên da Ngoài ra, ục quản lý thực phẩm và dược phẩm

Hoa Kỳ đã chấp thuận việc sử dụng keratinase để điều tr bệnh vảy nến

(Selvam and Vishnupriya, 2012)

Trong tự nhiên, hoạt tính ph n giải keratin của keratinase khá phổ biến

trong giới vi sinh vật Tuy nhiên, ch một số keratinase đạt được mục đích

thương mại Keratinase tổng hợp bởi vi khuẩn thuộc chi Bacillus đặc biệt là vi

khuẩn Bacillus licheniformis và Bacillus subtilis đã được quan t m nghiên cứu

do hoạt tính ph n giải hiệu quả keratin lông gia cầm Keratinase từ Bacillus

licheniformis PWD1 là keratinase thương mại đầu tiên từ vi khuẩn được phát

triển bởi Shih và cộng sự ở RI (North arolina) (Manczinger et al., 2003;

Thys et al., 2004)

Tóm lại, keratinase được tạo ra từ vi sinh vật đã thu hút nhiều nghiên cứu

trong thập kỷ gần đ y nhờ nhiều ứng dụng công nghiệp như trong thức ăn

chăn nuôi, ph n bón, chất tẩy rửa, tẩy lông da và dược phẩm các ngành công

nghiệp….Một trong những ứng dụng hứa hẹn nhất của keratinase từ vi khuẩn

là khả năng ph n giải keratin để sản xuất bột lông vũ làm thức ăn chăn nuôi

cho vật nuôi vừa tạo nên môi trường th n thiện vừa mang lại chi phí thấp, hiệu

quả tốt

2.5 Cơ ch ph n giải keratin của vi khuẩn

Đến nay cơ chế ph n giải sinh học keratin vẫn chưa hoàn toàn được hiểu

rõ Theo Gupta and Ramnani (2006), cơ chế ph n giải keratin liên quan đến

hoạt động phối hợp của hệ thống ph n giải protein (proteolytic) và ph n giải

sunfit (sulfitolytic) Keratinase chủ yếu tấn công vào các liên kết disulfide

(-S-S-) của cơ chất chứa keratin khi tiến hành ph n hủy chúng (Bokle et al., 1995;

Prasad et al., 2010)

Phần lớn keratin b ph n giải do tác động của keratinase tiết ra từ tế bào

vi khuẩn, tuy nhiên theo nhiều báo cáo nghiên cứu, các tế bào vi khuẩn cũng

giữ một vai trò quan trọng trong quá trình ph n hủy cơ chất chứa keratin

Những thành phần disulfide reductase, sulfite, thiosulfate và keratinase có

trong tế bào vi khuẩn giúp b gãy các cầu nối disulfide hỗ trợ cho quá trình

ph n hủy của enzyme ngoại bào được tốt hơn Như vậy, có thể nói r ng, quá

trình phân giải keratin bao gồm hai bước là phá hủy các cầu nối disulfide và

ph n hủy d y protein (Gupta and Rammani, 2006)

Hầu hết các keratinase đều sở hữu hoạt tính ph n cắt protein; tuy nhiên,

chúng không có khả năng khử các nối đôi disulfide Vì thế, sự khử các liên kết

disulfide được thực hiện bởi các enzyme disulfide reductase hoặc khả năng

oxy hóa khử của các tế bào (Böckle and Müller, 1997; Ramnani et al., 2005)

Điển hình là mặc d vài subtilisin (protein sinh ra bởi Bacillus subtilis) có

những trình tự giống với trình tự của keratinase nhưng chúng không thể ph n

giải keratin Điều này được cho là do thiếu khả năng khử nối đôi disulfide của

tế bào vi khuẩn (Evans et al., 2000) Sự hình thành nhóm thiol cũng được ghi

nhận trong quá trình sinh trưởng của vi khuẩn, cho thấy sự đóng góp của quá

trình phá hủy cầu nối disulfide trong sự ph n giải keratin lông gia cầm (Daroit

et al., 2009)

Một điều thú v được phát hiện là lượng enzyme keratinase được sản xuất

và sự ph n giải keratin không tỷ lệ thuận với nhau o đó, sự ph n giải keratin

không thể xem là dấu hiệu cho sự sinh keratinase và ngược lại với nhiều tài

liệu cho thấy thời gian keratinase được sản sinh và sự ph n giải keratin khác

nhau (Williams et al., 1990; Cheng et al., 1995; Sangali and Brandelli, 2000;

Ramnani and Gupta, 2004; Thys et al., 2004) Điều này được cho là do các cơ

chế phức tạp của sự ph n giải keratin của các vi sinh vật ác keratinase tinh

khiết thường không thể ph n giải keratin trong điều kiện vắng mặt các tác

nh n khử (Böckle et al., 1995; Riffel et al., 2003)

2.6 Vi sinh vật phân giải keratin

2.6.1 T nh h nh nghiên cứu trên th giới

Vi sinh vật có khả năng ph n giải keratin rất đa dạng Một số loài nấm,

Actinomycetes, và vi khuẩn ph n lập từ đất chôn chất thải giàu keratin cho

thấy có khả năng tổng hợp keratinase và ph n giải lông gia cầm (Riffel and

randelli, 2006) Khả năng ph n giải lông gia cầm nhờ enzyme keratinase từ

một số chủng Aspergillus fumigatus và Aspergillus flavus đã được nghiên cứu

(Santos et al., 1996) Một số loài nấm thuộc chi hrysosporium đã được các

nhà khoa học nghiên cứu và chứng minh có khả năng thủy ph n keratin ở

nhiệt độ cao Keratinase sản xuất bởi loài Chrysosporium keratinophilum có

thể hoàn tan keratin trong lactose/ môi trường muối khoáng với dimethyl

sulfoxide ở mức pH = 9,0 và nhiệt độ cao nhất là 90oC (Dozie et al., 1994)

Theo Sanghvi et al (2011) enzyme keratinase của Chrysosporium asperatum

tương đối bền ở 50o

C

Nhóm xạ khuẩn cũng có khả năng ph n giải keratin tốt Xạ khuẩn với

điển hình là Streptomyces, vi khuẩn Gram dương, hiếu khí thuộc bộ

Actinomycetales, là vi khuẩn có cấu trúc sợi nhỏ ph n nhánh như nấm Tuy

nhiên, chúng là vi khuẩn thật sự, với tế bào nh n sơ, khác với tế bào nấm nh n

thực Khi phát triển, chúng tạo thành những sợi nhánh, từ đó hình thành nên hệ

sợi, giống với hệ sợi ở một số loài nấm (Zamania et al., 2005) Khuẩn lạc của

Streptomyces phát triển chậm, có dạng nhẵn, dạng mô hoặc nếp gấp, màu

trắng, n u vàng, xám hoặc đen (Waksman and Henrici, 1943) Streptomyces

có thể chuyển hóa nhiều hợp chất khác nhau như đường, acid amin, rượu và

các hợp chất thơm b ng cách sản sinh ra enzyme thủy ph n ngoại bào

(Zamania et al., 2005) Streptomyces là chi tiêu biểu nhất trong bộ

Actinomycetales với hơn 500 loài (Hain et al., 1997) Một số chủng vi khuẩn

thuộc chi Streptomyces có khả năng ch u nhiệt và có hoạt tính keratinase có

thể phát triển và ph n giải keratin ở nhiệt độ trên 50oC (Chitte et al., 1999;

Mohamedin, 1999)

Hình 2.3: Khuẩn lạc của Streptomyces sp

(Daniel M T Tapia và Jonas Contiero, 2007) hủng Streptomyces cereus S.K1-02 có thể hoạt động tốt ở 60°

(Letourneau et al., 1998) Streptomyces albus (Nayaka et al., 2013) và

Streptomyces thermoviolaceus strain SD8 (Chitte et al., 1999) có hiệu suất

ph n giải keratin tối ưu trong khoảng nhiệt độ 40 - 60oC (Nayaka et al., 2013)

hủng Streptomycescereus 594 sản sinh protease thuộc lớp serine và

proteinase kim loại, hoạt động ở nhiệt độ khá cao, từ 55 - 80o và mức pH từ

5,0 đến 10,0 húng có thể ph n hủy lông gia cầm với hoạt độ keratinase là 80

U/mL (De Azeredo et al., 2006) Streptomyces cereus MA 18 có hoạt độ

keratinase là 2398,36 U/mg Enzyme này ph n giải keratin tốt nhất ở mức pH

8 - 10 và nhiệt độ 50 - 60°C (Panchanathan et al., 2013) Streptomyces fradiae,

Streptomyces sp A11 (Mukhopadhyay Chandra, 1990), Streptomyces pactum

(Böckle et al., 1995), Streptomyces albidoflavus (Letouneau et al., 1998) cũng

thể hiện khả năng ph n giải keratin rất hiệu quả Ngoài ra, một số chủng vi

khuẩn ưa ấm (mesophilic) cũng được mô tả cho thấy khả năng ph n giải

keratin như Streptomyces pactum DSM 40530 (Böckle et al., 1995) và

Streptomyces albidoflavus K1-02 (Bressollier et al., 1999) Khả năng ph n

giải keratin ở các vi khuẩn Streptomyces có thể liên quan đến việc các chủng

vi khuẩn này tổng hợp được các protease phổ rộng như pronase, đã được sản

xuất thương mại từ vi khuẩn Streptomyces griseus (Jurasek et al., 1974) Bên

cạnh đó, Streptomyces pactum có thể làm giảm lượng cầu nối disulfide khi

phát triển trên cơ chất lông vũ ( öckle and Müller, 1997) cho thấy loài vi

khuẩn này có thể tạo ra enzyme disulfide reductase để phục vụ sự ph n giải

keratin

Một điển hình về hai chủng xạ khuẩn Streptomyces flavis 2BG và

Microbispora aerata IM AS-11A cũng ph n giải keratin tốt, được ph n lập từ

các mẫu đất ở Nam cực và hai chủng vi khuẩn này có khả năng tạo keratinase

trong quá trình ph n hủy chất thải lông cừu (Gushterova et al., 2005)

Nổi bật hơn cả là vai trò ph n giải keratin của vi khuẩn Nhiều chủng vi

khuẩn thuộc chi Bacillus được ph n lập từ đất và lông vũ ở các cơ sở sản xuất

và chế biến gia cầm Vi khuẩn Bacillus ph n bố rộng trong tự nhiên, nhất là

trong đất, chúng tham gia tích cực vào sự ph n hủy vật chất hữu cơ nhờ vào

khả năng sinh nhiều loại enzyme ngoại bào Đ y là những vi khuẩn hình que,

Gram dương, sinh trưởng hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc và hình thành

nội bào tử hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn thuộc chi Bacillus rất đa dạng,

khuẩn lạc thường to và có màu trắng đến xám

Trong số các chủng Bacillus, chủng Bacillus sp., B licheniformis và B

subtilis được mô tả có khả năng ph n giải keratin tốt ( alaji et al., 2008; Cai

et al., 2008; Zhang et al., 2009) Khả năng ph n giải keratin hiệu quả cao như

chủng vi khuẩn Bacillus sp P45, có khả năng ph n hủy 90% lông gà sau 72h

nuôi cấy trong môi trường có bổ sung lông gà ( aroit et al., 2009) Các chủng

vi khuẩn Bacillus licheniformis 511, B subtilis 11, B subtilis 717 và B

subtilis 103 ph n lập từ nước thải tại khu công nghiệp chế biến gia cầm để

khảo sát khả năng ph n hủy lông gia cầm Các chủng vi khuẩn phân giải

keratin được ph n lập trên môi trường có bổ sung bột lông vũ: Na l (0,5 g/L),

KH2PO4 (0,4 g/L), K2HPO4 (0,3g/L), bột lông vũ (10 g/L) và agar (15 g/L)

Đối với chủng Bacillus subtilis 103 thì hàm lượng enzyme keratinase tối đa là

152 U/mLsau khi nuôi cấy 24 giờ, trong khi các chủng khác là 148 - 292

U/mL sau 48 giờ nuôi cấy (Matikevičienė et al 2009)

Trong nghiên cứu của Joshi et al (2007) đã ph n lập được chủng vi

khuẩn Bacillus sp PW-1 có khả năng ph n hủy lông vũ từ chất thải gia cầm

Vi khuẩn này được nuôi cấy trên môi trường cơ bản với lông vũ đóng vai trò

là nguồn carbon, nitơ và lưu huỳnh a chủng vi khuẩn Bacillus megaterium

SN1, Bacillus thuringenesis SN2 và Bacillus pumilus SN3 ph n lập từ bãi đất

chôn lông gia cầm có khả năng ph n hủy lông gà và lông bồ c u sau 120 giờ

nuôi cấy (Agrahari and Wadhwa, 2010)

Có rất nhiều chủng vi khuẩn phân hủy lông gia cầm được phân lập từ đất

và nước thải như là Bacillus licheniformis PWD1 (Williams et al., 1990; Lin

et al., 1995), Bacillus subtilis KS1 (Suh and Lee, 2001), Bacillus licheniformis

K-508 (Manczinger et al., 2003), Bacillus licheniformis RG1 (Ramnani and

Gupta, 2004), Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis ATCC 6633 (Zerdani et

al., 2004)

Gen kerA của Bacillus licheniformis đã được nh n chủng và giải mã trình

tự (Lin et al., 1995) Ngoài ra, các chủng như Bacillus pumilus và Bacillus

cereus cũng có khả năng tổng hợp keratinase (Ghosh et al., 2008; Kumar et

al., 2008)

Mặc d các chủng vi khuẩn ph n hủy lông vũ được ph n lập chủ yếu

thuộc chi Bacillus, nhưng kết quả của một số nghiên cứu cho thấy nhiều chi

(Burkholderia, Chryseobacterium và Pseudomonas, Microbacterium,

Xanthomonas, Clostridium,…) khác nhau có các chủng vi khuẩn có khả năng

ph n giải keratin tốt như là Aeromenas.sp, Serratia sp (Evelise et al., 2012),

Micrococcus sp., Clostridium sp (Kim et al., 2001; Lucas et al., 2003),

Xanthomonas maltophilia (De Toni et al., 2002), Arthrobacter sp (Lucas et

al., 2003), Microbacterium sp (Thys et al., 2004) và Kocuria rosea (Bernal et

al., 2006), Fervidobacterium pennavorans (Friedrich and Antranikian, 1996),

Kocuria rosea LBP-3 (Vidal et al., 2000; Bernal et al., 2006), Microbacterium

arborescens kr10 (Thys et al., 2004), các loài Vibrio sp (Sangali et al., 2000)

Nghiên cứu về Pseudomonas đã được Riffel and randelli (2006) thực hiện

qua việc tiến hành ph n lập vi khuẩn ph n giải keratin từ chất thải lông gia

cầm Trong đó, có 3 chủng vi khuẩn Gram m (thuộc chi Burkholderia,

(Microbacterium sp.)

ên cạnh đó, các chủng Chryseobacterium sp cũng được nghiên cứu là

có khả năng ph n giải keratin tốt (Riffel and Brandelli, 2002) Các loài vi

khuẩn thuộc chi Chryseobacterium là những vi khuẩn Gram m, hiếu khí,

ph n bố rộng trong tự nhiên chủ yếu trong môi trường đất và nước Đ y là

những vi khuẩn hình que, không di động và tạo ra khuẩn lạc với sắc tố vàng

đến cam đặc trưng (Calderón et al 2011)

Ngoài ra, các vi khuẩn nhóm Fervidobacterium cũng ph n giải keratin

hiệu quả Fervidobacterium là vi khuẩn Gram m, hình que th ng, tồn tại ở

dạng đơn, cặp hoặc chuỗi ngắn và không tạo bào tử húng đặc biệt ở chỗ,

nhiều tế bào sẽ tạo thành nốt phồng ở cuối đoạn, gọi là dạng cầu Ngoài ra, thể

tròn chứa nhiều đơn v tế bào chất cũng xuất hiện Fervidobacterium hấp thụ

chất dinh dư ng b ng cách d dư ng hóa năng hữu cơ, lên men nhiều loại

đường thành acetate, lactate, O2, H2 và ethanol húng có thể sinh trưởng và

phát triển ở mức nhiệt độ từ 40-80o với nhiệt độ tối ưu là 70o

C (Patelet al., 1985)

Hình 2.4: A Hình chụp (SEM) của Fervidobacterium islandicum AW-1

B Sự phân hủy cọng lông gà nguyên của F islandicum AW-1

(Yong-Jik Lee et al., 2015)

Fervidobacterium pennivorans SM 7003 là một trong những đại diện

của vi khuẩn ch u nhiệt có thể ph n giải keratin ở nhiệt độ 80oC (Friedrich and

Antranikian, 1996) Keratinase của loài Fervidobacterium pennavorans có thể

hoạt động ở mức nhiệt độ 80o trong môi trường kiềm pH=10,0 và của loài

một chủng vi khuẩn ch u nhiệt, kỵ khí, ph n hủy lông gia cầm được ph n lập ở

Indonesia là Fervidobacterium islandicum AW-1 đã cho thấy khả năng ph n

hủy lông hoàn toàn ở 70o

C và pH=7,0 Enzyme của chủng này có khả năng

ph n giải keratin cao hơn các loại protease khác và xúc tác sự cắt đứt liên kết

peptide nhanh hơn, tiếp theo sau phản ứng khử cầu nối disulfide trong keratin

ở lông gia cầm và có nhiệt độ tối ưu là 100o

C (Nam G.W et al., 2002)

2.6.2 T nh h nh nghiên cứu trong nước

Đề tài nghiên cứu về sự ph n giải keratin ở Việt Nam còn rất ít và chưa

được quan t m nhiều hất thải từ việc giết mổ gia súc, gia cầm cũng chưa có

những nghiên cứu và x y dựng quy trình xử lý hiệu quả và mang lại kinh tế

cho chăn nuôi Những năm gần đ y mới có một vài nghiên cứu về một số loại

vi khuẩn có khả năng ph n giải keratin Ở Việt Nam, một số loài vi khuẩn có

khả năng ph n giải keratin đã được ph n lập từ đất và lông vũ tại nơi giết mổ

gia cầm trên môi trường có bổ sung bột lông vũ Nguy n Đình Quyến và Trần

Th Lan Phương (2001) đã tiến hành ph n lập được từ đất 7 chủng xạ khuẩn

và 15 chủng Bacillus có hoạt tính ph n giải casein r rệt Trong đó 5 chủng xạ

khuẩn và 2 chủng Bacillus có khả năng ph n hủy lông gà mạnh mẽ

Nguy n Huy Hoàng và ctv (2010) đã tiến hành ph n lập các chủng vi

khuẩn Bacillus, hryseo terium,… từ một số v ng đất khác nhau ở phía

ắc Việt Nam Điều kiện thích hợp cho các chủng vi khuẩn này phát triển là ở

30o đến 40o trên môi trường có bổ sung bột lông vũ và khả năng thủy ph n

lông vũ đạt từ 75% đến 90% sau một tuần nuôi cấy ác chủng vi khuẩn đã

được ph n loại đ nh danh b ng các nghiên cứu đặc điểm hình thái, hóa sinh kit

API 50 H , API 20NE và trình tự gen mã hóa 16S rRNA Kết quả đ nh danh

của bốn chủng vi khuẩn có khả năng thủy ph n lông vũ mạnh nhất cho thấy

các chủng này lần lượt tương đồng với vi khuẩn Bacillus subtilis, Bacillus

megaterium và Chryseobacterium spp

Nguy n Thu Hiền và ctv (2010), Viện Khoa học và Công nghệ Việt

Nam, cũng đã phân lập được chủng vi khuẩn Chryseobacterium có khả năng

phân hủy lông vũ

Tóm lại, đã có nhiều nghiên cứu về vi khuẩn ph n giải keratin trên thế

giới, tuy nhiên có rất ít nghiên cứu về lĩnh vực này ở trong nước và đặc biệt ở

khu vực Đồng b ng Sông ửu Long chưa có nghiên cứu về vi khuẩn phân giải

keratin

2.7 Các y u tố ảnh hưởng đ n khả năng ph n giải keratin, sự tạo keratinase

và mật số của vi khuẩn ph n giải keratin

Sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn liên quan chặt chẽ với các điều

kiện môi trường bên ngoài Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên vi khuẩn

có thể là thuận lợi hoặc bất lợi Ảnh hưởng bất lợi sẽ dẫn đến tác dụng ức chế

hoặc diệt khuẩn Tác dụng ức chế của các yếu tố môi trường làm tế bào ngừng

ph n chia, ngừng sinh trưởng Nếu các yếu tố đó được loại khỏi môi trường, vi

sinh vật tiếp tục sinh trưởng và phát triển Khi có mặt các yếu tố diệt khuẩn, vi

khuẩn ngừng sinh trưởng, phát triển và chết nhanh chóng ác yếu tố thuận lợi

giúp cho vi khuẩn sinh trưởng, phát triển tốt, tăng khả năng ph n hủy cơ chất

và sinh ra enzyme nhiều nhất (Nguy n L n ũng và ctv., 2012)

ác yếu tố môi trường tác dụng lên vi sinh vật được chia thành 3 loại

chính: yếu tố vật lý, yếu tố hóa học, yếu tố sinh học là yếu tố nào nhưng

khi đã tác động bất lợi lên vi sinh vật thì thường g y tổn hại đến cấu trúc quan

trọng cho sự sống của vi sinh vật, những tổn hại đó dẫn đến phá hủy chức

năng hoạt động của từng bộ phận và làm vi sinh vật chết Những yếu tố bất lợi

có thể g y ra những tác hại chủ yếu cho vi sinh vật như: phá hủy thành tế bào,

biến đổi tính thấm của màng tế bào chất, thay đổi đặc tính keo của chất

nguyên sinh, kìm hãm hoạt tính enzyme, hủy hoại các quá trình tổng hợp

(Nguy n L n ũng và ctv., 2012) Vì vậy, việc khảo sát và đánh giá ảnh

hưởng của các điều kiện môi trường lên vi khuẩn ph n giải keratin là cần thiết

cho những nghiên cứu và ứng dụng vi khuẩn ph n giải keratin vào trong thực

tế

2.7 1 Ảnh hưởng của chất dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy

Để tăng trưởng mỗi vi khuẩn sử dụng các chất dinh dư ng cần thiết trong

môi trường cho sự hình thành các bào quan và cũng như là nguồn năng lượng

duy trì cho các hoạt động tế bào

Nguồn dinh dưỡng chứa carbon

arbon là thành phần chính trong cơ thể vi khuẩn, hầu hết các thành phần

tế bào đều được cấu tạo có thành phần carbon ác hợp chất của carbon cũng

là nguồn năng lượng quan trọng và cần thiết cho vi khuẩn tồn tại và phát triển

như lipid và glucose Nguồn carbon hữu cơ cần thiết cho vi khuẩn rất đa dạng

từ các loại đơn giản như glucose, fructose, sucrose, tinh bột, cellulose và acid

amin đến các chất phức tạp như dầu mỏ, nhựa d o, naphthalene, lipid và

protein T y theo từng loài vi khuẩn mà có những nguồn carbon thích hợp để

sinh trưởng và phát triển (Nguy n L n ũng và ctv., 2012)

Theo Wang JJ, Shih J.C.H (1999), sự có mặt của glucose và sucrose

trong môi trường nuôi cấy làm ức chế sự phát triển và khả năng sinh

keratinase của vi khuẩn, nguyên nh n có thể là do chúng kìm hãm sự biểu hiện

của gene keratinase của vi khuẩn áo cáo tổng hợp của Kumar and Takagi

(1999) cũng ch ra sự ức chế khả năng sinh các protease kiềm của vi sinh vật

thông qua sự kìm hãm các sản phẩm d hóa của glucose Santos et al (1996)

báo cáo r ng việc thêm vào glucose trong môi trường nuôi cấy đã làm giảm

khả năng ph n giải keratin

ảng 2 1: Ảnh hưởng của nguồn dinh dư ng chứa carbon đến sự ph n hủy lông

gia cầm của Bacillus megaterium F7-1

Nguồn

carbon

(0,1%, w/v)

Tỷ lệ ph n huỷ lông gia cầm (%)

Nguồn carbon (0,1%, w/v)

Tỷ lệ ph n huỷ lông gia cầm (%)

(Nguồn eun-Tae Park et al., 2009)

Với r đường 1% đã thúc đẩy sự hoạt động của keratinase ph n hủy lông

gia cầm ở chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis MZK-3 trong kết quả nghiên

cứu của Mohammad et al (2007)

Khi sử dụng lipid, parafin, dầu mỏ để làm nguồn carbon nuôi cấy một

số loại vi khuẩn phải thông khí mạnh để cho từng giọt nhỏ có thể tiếp xúc

được với thành tế bào từng vi sinh vật

Ngoài ra để hỗ trợ vi khuẩn sản xuất keratinase, có thể d ng một số cơ

chất tự nhiên làm nguồn carbon: bột bắp, r đường, cám mì, cám gạo, cám

bắp,… (Ramnani et al., 2004)

Nguồn dinh dưỡng chứa nitơ

Vi khuẩn cần có đủ nitơ để tổng hợp các acid amin, protein, acid nh n,

lipid, carbohydrate và các coenzyme cần thiết cho tế bào vi khuẩn Ch một số

vi khuẩn tự dư ng (thuộc nhóm ammon hoá, nhóm nitrate hoá) d ng muối

ammone, muối nitrate làm nguồn năng lượng Nguồn nitơ thường được vi

khuẩn sử dụng là protein và các sản phẩm ph n huỷ của protein ( peptone,

peptide, aminoacid ), muối ammone, nitrate, nitơ ph n tử (N2), purine,

pyrimidine, urea, amine, amide, cyanide (Nguy n L n ũng và i Th Việt

Hà, 2009) NH3 là nguồn nitơ phổ biến nhất với vi sinh vật Nhiều loại vi

khuẩn có thể sử dụng NO3- thông qua sự khử tạo thành NO2- và cuối c ng là

NH3 để đáp ứng nhu cầu tổng hợp các hợp chất tế bào chứa nitơ như acid amin

(Clemens and Charles, 2008) T y theo đặc điểm dinh dư ng của từng loài vi

khuẩn mà cần có các dạng nitơ khác nhau

ác nguồn nitơ hữu cơ như: bột đậu nành, cám mì, casein, peptone,

tryptone, yeast extract, gelatin, sữa không béo,… và các nguồn nitơ vô cơ như:

urea, NH4NO3, NH4Cl, NO2-, NO3-… thích hợp cho các vi khuẩn ph n giải

keratin sinh trưởng và phát triển, sản sinh nhanh enzyme keratinase thúc đẩy

quá trình ph n hủy lông gia cầm Sangali and randelli (2000) sử dụng nguồn

nitơ bổ sung là yeast extract và NH4 l cho hiệu quả ph n hủy keratin đáng kể

ột đậu nành cũng được biết đến như là chất hỗ trợ tốt cho sự sinh enzyme

keratinase của vi khuẩn ph n giải keratin (Cheng et al., 1995; Gradišar et al.,

2000) Williams et al (1990) có nghiên cứu cho kết quả NH4 l kích thích sự

phát triển của vi khuẩn

Theo nghiên cứu của Mohammad Shahnoor Hossain et al (2007), NH4Cl

được bổ sung với nồng độ 0,1% cho kết quả là việc tạo enzyme keratinase của

vi khuẩn tăng thêm 12% Trong trường hợp bổ sung cả r đường và NH4 l với

nồng độ lần lượt 1% và 0,1%, sự ph n hủy lông gia cầm của chủng vi khuẩn

Bacillus licheniformis MZK-3 đạt hiệu quả cao

ảng 2 2: Ảnh hưởng của nguồn dinh dư ng chứa nitơ đến sự ph n hủy lông gia

cầm của Bacillus megaterium F7-1

Nguồn nitơ

(0,02%, w/v)

Tỷ lệ ph n huỷ lông gia cầm (%)

Nguồn nitơ (0,02%, w/v)

Tỷ lệ ph n huỷ lông gia cầm (%)

(Nguồn eun-Tae Park et al., 2009)

ột đậu nành cũng được biết đến như là chất cảm ứng cho sự sinh

enzyme (Cheng et al., 1995; Gradišar et al., 2000) Theo Kumar C.G and H

Takagi (1999) trong môi trường chứa ion ammonium khả năng tổng hợp

enzyme của vi khuẩn b giảm đi dẫn đến khả năng sử dụng nguồn dinh dư ng

của vi khuẩn thấp nên mật số vi khuẩn không cao

Nồng độ cơ chất chứa keratin

Trong nhiều trường hợp, keratin kích thích cho hoạt động ph n hủy

keratin Cheng et al (1995) báo cáo r ng nồng độ cơ chất lông ở 1% (w/v) thể

hiện các hoạt động sinh enzyme keratinase cao nhất đối với B licheniformis

PWD-1 Kết quả tương tự cũng được báo cáo cho Bacillus sp FK46

(Suntornsuk and Suntornsuk, 2003) Theo nghiên cứu của Geun-Tae Park and

Hong-Joo Son (2009), hoạt động của enzyme mạnh nhất khi nồng độ bột lông

đạt 1 6% (w/v)

2.7.2 Ảnh hưởng của nhi t độ và pH

Nhiệt độ là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và tồn

tại của tế bào vi khuẩn Khi nhiệt độ tăng, các phản ứng của enzyme trong tế

bào vi khuẩn gia tăng do đó sự sinh trưởng của vi khuẩn cũng tăng nhanh lên

Sự gia tăng của nhiệt độ làm cho protein, acid nh n, các chất trong tế bào cũng

như các bộ phận khác của tế bào nhạy cảm với nhiệt độ cao có thể trở nên hư

hại mất chức năng hoạt động o đó thông thường nếu nhiệt độ tăng dần thì sự

tăng trưởng và biến dư ng của vi sinh vật cũng tăng theo đến một nhiệt độ

nhất đ nh thì giữ ổn đ nh và không tăng nữa Nhưng nếu nhiệt độ tăng cao hơn

nữa thì hoạt động của vi sinh vật rơi xuống đến mức không Mỗi vi khuẩn đều

có mức độ thích nghi ở khoảng nhiệt độ khác nhau ó nhóm vi khuẩn ch u

lạnh dưới 0o có khả năng sống và tồn tại được và cũng có những nhóm vi

sinh vật có thể sống trong những điều kiện 70oC - 100o (Phạm Văn Kim,

2000) Mỗi vi khuẩn có những khoảng nhiệt độ thích hợp nhất cho sự phát

triển và sinh trưởng của chúng Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên vi khuẩn

để có thể tạo được những điều kiện tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn

Tương tự, sự tồn tại và phát triển của vi khuẩn b ảnh hưởng rất nhiều từ

pH của môi trường sống pH là độ acid hoặc bazơ trong dung d ch được chia

ra thành 14 mức độ khác nhau từ 0 đến 14 Khi giá tr pH giảm dần đến 0, tính

acid của dung d ch tăng, ngược lại khi giá pH tăng dần đến 14, thì tính bazơ

của dung d ch tăng Mặt khác, tính acid mạnh hoặc bazơ cao có thể g y mất

chức năng enzyme và làm hư hại các chất khác trong tế bào vi khuẩn ảnh

hưởng đến sự phát triển và mật số vi khuẩn

Nhiệt độ cho sự sinh tổng hợp keratinase n m trong khoảng từ 28-50°

và pH môi trường nuôi cấy là pH 6,0 – 9,0 hỗ trợ sự sinh tổng hợp keratinase

và sự ph n hủy lông gia cầm ở hầu hết các vi khuẩn Giá tr pH kiềm được cho

là kích thích sự ph n giải keratin do làm biến đổi các cystine thành lathionine

khiến cho keratinase d dàng tiếp cận cơ chất Theo Sinoy et al (2011), các

chủng vi khuẩn thuộc chủng Bacillus sp phát triển thuận lợi trong khoảng

nhiệt độ 30o

C – 40o và pH tối ưu là 6,0 – 8,0 h ng hạn như Geun-Tae Park

et al.(2009) phát hiện vi khuẩn Bacillus megaterium F7-1 phát triển tối ưu

cũng như hoạt tính keratinase cao nhất ở nhiệt độ 25-40°C và pH 7,0-11,0

Tương tự, chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis MZK-3 phát triển và sinh

enzyme keratinase tốt nhất ở điều kiện pH 8,0 và nhiệt độ 40° trong nghiên

cứu của Mohammad et al.(2007)

Trong khi đó, cũng có một số vi khuẩn thuộc chi Bacillus cũng có khả

năng ch u nhiệt cao hơn 40o như vi khuẩn Bacillus megaterium ph n lập từ

đất có khả năng sản xuất keratinase ở nhiệt độ, pH tối ưu là 50oC và pH 9,0

(Venkata et al., 2013) Trong nghiên cứu của Sivakumar et al (2013) về môi

trường nuôi cấy tối ưu đối với vi khuẩn Bacillus cereus TS1 cũng ghi nhận là

vi khuẩn này tạo ra lượng keratinase cao nhất ở 50oC ên cạnh đó, enzyme từ

vi khuẩn Bacillus cereus H10 có hoạt tính keratinase tối ưu ở nhiệt độ 59° và

pH 7,5 (Kun et al., 2011) Theo báo cáo về sự tối ưu hóa phương pháp sản

xuất keratinase, vi khuẩn ch u nhiệt Bacillus sp J 99 có thể ph n giải keratin

mạnh nhất ở 65o

C và pH 10,0 (Pushpalata S Kainoor and G R Naik, 2010)

Tương tự, Bo Xu et al (2009) đã ph n lập được một chủng vi khuẩn mới được

đ nh danh là Bacillus licheniformis K-19 ch u được nhiệt độ cao (30 – 90o

C)

và pH rộng (6,0 – 10,0) với nhiệt độ tối ưu là 60o và pH tối ưu từ 7,5 – 8,0

Onuoha et al (2011) đã chọn ra chủng vi khuẩn Bacillus sp 4 có khả năng

ph n hủy lông vũ cao, pH tối ưu của chủng vi khuẩn này là 10,0

Ngoài chi Bacillus, các vi khuẩn khác như là chủng vi khuẩn

Chryseobacterium sp kr6 cũng có khả năng ph n hủy lông tốt, phát triển tối

ưu và có hoạt động ph n hủy lông vũ hiệu quả cao ở nhiệt độ 30° và pH 8,0

(Riffel et al., 2003) Tương tự, các chủng vi khuẩn thuộc họ Vibrionaceae từ

một cơ sở sản xuất gia cầm ở razil được ghi nhận là có nhiệt độ tối ưu cho sự

phát triển ở 30°C và cũng tại nhiệt độ này lượng enzyme keratinase và các

protein hòa tan được tạo ra nhiều nhất (Sangali et al., 1999) ũng trong

nghiên cứu của Sangali and randelli (2000), sự phát triển của Vibrio sp kr2

gia tăng trong môi trường nuôi cấy ở mức pH trung bình từ 7,0 (hoặc 6,0) đến

8,0 sau 72 giờ nuôi cấy Sự tăng pH trong môi trường nuôi cấy là đặc điểm

quan trọng xuất hiện c ng với sự ph n giải keratin của vi khuẩn Kumar et al

(2008) giải thích về việc tăng pH của môi trường nuôi cấy là do các sản phẩm

của ammonia qua việc khử amin của peptid và acid amin từ việc ph n giải

keratin, sự gia tăng pH cũng là đặc trưng của vi khuẩn phát triển trong môi

trường bột lông

ên cạnh những chủng vi khuẩn ph n giải keratin phát triển thuận lợi

trong khoảng nhiệt độ 30o

C – 40oC và pH tối ưu là 6,0 – 8,0, cũng có một số chủng vi khuẩn ch u nhiệt cao và pH >8,0 hoặc pH< 6,0 và tạo keratinase hiệu

quả như là chủng Streptomyces cereus S.K1-02 có thể hoạt động tốt ở 60°

(Letourneau et al., 1998) Streptomyces albus (Nayaka et al., 2013) và

Streptomyces thermoviolaceus strain SD8 (Chitte et al., 1999) có hiệu suất

phân giải keratin tối ưu trong khoảng nhiệt độ 40 - 60oC (Nayaka et al., 2013)

hủng Streptomyces cereus 594 sản sinh protease thuộc lớp serine và

proteinase kim loại, hoạt động ở nhiệt độ khá cao, từ 55 - 80o và mức pH

5,0 – 10,0 húng có thể ph n hủy lông gia cầm với hoạt độ keratinase là 80

U/mL (De Azeredo et al., 2006) Streptomyces cereus MA 18 có hoạt độ

keratinase là 2398,36 U/mg Enzyme này phân giải keratin tốt nhất ở mức pH

8,0 – 10,0 và nhiệt độ 50 - 60°C (Panchanathan et al., 2013)

Fervidobacterium có thể sinh trưởng và phát triển ở mức nhiệt độ từ

40-80o với nhiệt độ tối ưu là 70oC (Patel et al., 1985) hủng Fervidobacterium

islandicum AW-1 đã cho thấy khả năng ph n hủy lông hoàn toàn ở 70oC và

pH 7,0 Enzyme của chủng này có khả năng ph n giải keratin cao hơn các loại

protease khác và xúc tác sự cắt đứt liên kết peptide nhanh hơn, tiếp theo sau

phản ứng khử cầu nối disulfide trong keratin ở lông gia cầm và có nhiệt độ tối

ưu là 100o

C (Nam G.W et al., 2002) Cũng có một vài vi khuẩn có thể sống

trong những điều kiện pH khắc nghiệt như Thermoplasma một vi khuẩn cổ

sống trong những mỏ than pH 1,0-2,0 Những vi khuẩn khác ưa kiềm có thể

phát triển ở pH 8,5-11,5 như những loài vi khuẩn sống ở các suối nước nóng

có pH trên 10,0

2.7.3 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy

Trong nghiên cứu của Geun-Tae Park et al (2009), Bacillus megaterium

F7-1 ph n hủy lông gà hoàn toàn sau 7 ngày nuôi cấy (hình 2 6)

Hoạt độ keratinase ; pH ; Tỷ lệ ph n hủy lông ; Mật số vi khuẩn

Hình 2 5: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự ph n hủy lông và sự phát

triển của Bacillus megaterium (Nguồn eun-Tae Park et al., 2009)

Thời gian nuôi cấy (ngày)

ảng 2 3: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến mức độ phát triển của một số chủng

Bacillus trong môi trường nuôi cấy

hủng vi khuẩn Mức độ phát triển của vi khuẩn

trong môi trường nuôi cấy

Đánh giá

6 giờ 8 giờ

Bacillus licheniformis MZK-4 +++ ++++ Nhanh

Bacillus licheniformis MZK-5 +++ ++++ Nhanh

Brevibacillus borstelensis MZK-6 + ++ hậm

Bacillus licheniformis ATCC 9945a + ++ hậm

Th nghiệm đượ th hiện 3 lần ở nhiệt độ 37 o trong 6 đến 8 giờ

(Mozammel et al., 2005) Trong nghiên cứu của Kumar et al.(2008), Bacillus pumilus ph n hủy

gần 60% lông bò sau 16 ngày nuôi cấy

2.8 Nhu cầu dinh dưỡng của gia cầm

2.8 1 Nhu cầu về protein

Theo i Xu n Mến (2007) protein cần thiết cho duy trì tương đối thấp,

vì thế yêu cầu protein trước hết t y thuộc vào lượng cần thiết cho mục đích

sản xuất Để đáp ứng nhu cầu protein thì các acid amin thiết yếu phải được

cung cấp đủ lượng và tổng lượng nitơ trong khẩu phần phải đủ và ở dạng thích

hợp để đảm bảo tổng lượng acid amin không thiết yếu

Khi phối hợp khẩu phần thức ăn trong chăn nuôi động vật nói chung và

chăn nuôi gia cầm nói riêng, cần chú ý sử dụng các loại thực liệu có giá tr

sinh học cao để c n đối các thực liệu có giá tr sinh học thấp Đồng thời bổ

sung các acid amin tổng hợp để có một khẩu phần c n đối hoàn ch nh Sự ngộ

độc protein sẽ xảy ra khi khẩu phần có chứa từ 30% protein trở lên ( ương

Thanh Liêm, 2003) Ngược lại nếu không cấp đủ protein, cơ thể sẽ thiếu

nguyên liệu cho nhu cầu duy trì và tăng trưởng đồng thời sức đề kháng của gia

cầm cũng giảm

2.8.1.1 Nhu cầu acid amin ở gia cầm

Hiện có 22 acid amin trong protein của cơ thể gia cầm và tất cả là cần

thiết cho chức năng sinh lý Về dinh dư ng, các acid amin có thể được chia

thành hai loại: những loại acid amin mà gia cầm không thể tổng hợp đủ để đáp

ứng yêu cầu trao đổi chất (acid amin thiết yếu) và những loại gia cầm có thể