Tạo chủng vi khuẩn e coli có khả năng sản xuất lycopene ứng dụng trong công nghệ thực phẩm

Lycopene đã được sản xuất thương mại bằng tổng hợp hóa học, lên men hoặc tách từ các nguồn có sẵn trong tự nhiên [33].. Con đường sinh tổng hợp lycopene từ tiền chất DMAPP trải qua các b

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Lycopene là sắc tố màu đỏ cam thuộc nhóm carotenoid được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm Trong tự nhiên lycopene có trong các loại quả như cà chua, cà rốt, gấc Sắc tố này có khả năng bảo vệ tế bào khỏi sự oxi hóa làm chậm quá trình phát triển của một số bệnh ung thư tiền liệt tuyến, ruột kết, thực quản và ngăn ngừa bệnh tim mạch [27] Cơ thể con người không có khả năng tự tổng hợp được lycopene mà chỉ hấp thu chất này từ thực phẩm hoặc dược phẩm chứa lycopene Nghiên cứu đã chỉ ra mối tương quan giữa tiêu thụ cà chua mà trong đó có chứa lycopene với ung thư, nghiên cứu cho thấy nhóm người sử dụng khẩu phần ăn nhiều cà chua có tỷ lệ mắc ung thư thấp hơn [59]

Lycopene đã được sản xuất thương mại bằng tổng hợp hóa học, lên men hoặc tách từ các nguồn có sẵn trong tự nhiên [33] Tuy nhiên những phương pháp này có những nhược điểm nhất định như tạo nhiều chất thải gây ô nhiễm môi trường, phụ thuộc thời vụ, hiệu quả kinh tế thấp Vì vậy việc sử dụng vi sinh vật để tổng hợp lycopene thân thiện với môi trường và đem lại hiệu quả kinh tế cao đang được quan tâm nghiên cứu [39]

Lycopene được tổng hợp từ tiền chất isoprenoid là IPP và đồng phân DMAPP [11] Con đường sinh tổng hợp lycopene từ tiền chất DMAPP trải qua các bước chuyển hóa dưới sự xúc tác của các enzyme isopentenyl diphosphate isomerase, geranylgeranyl pyrophosphate synthetase, phytoene synthase, phytoene

dehydrogenase được mã hóa bởi các gen tương ứng là idi, crtE, crtB, crtI [66] E coli là vật chủ thích hợp cho quá trình sản xuất lycopene vì nó có hệ thống công cụ

di truyền mạnh cho quá trình trao đổi chất [52]

E coli không chứa các gen tham gia trực tiếp vào quá trình sinh tổng hợp

carotenoid mà nó chứa các gen mã hóa cho các enzyme tham gia sinh tổng hợp nên các tiền chất IPP, DMAPP và FPP đóng vai trò trọng tâm trong con đường sinh tổng

hợp carotenoid [39] Do đó để tạo chủng E coli có khả năng sản xuất lycopene thì

cần thiết phải đưa 3 gen crtE, crtB, crtI vào tế bào vật chủ E coli Một trong những

vi khuẩn có thể cung cấp gen carotenoid là Pantoea ananatis [65] E coli tự nhiên

chỉ tổng hợp đủ lượng IPP cho hoạt động tế bào, quá trình tổng hợp lycopene trong

E coli sẽ tiêu tốn IPP Với mục tiêu giữ cân bằng IPP cho vật chủ, gen idi mã hóa

IPP được đưa vào [22]

Từ các cơ sở trên chúng tôi thực hiện đề tài “Tạo chủng vi khuẩn E coli có khả năng sản xuất lycopene ứng dụng trong công nghệ thực phẩm”, nhằm tạo ra

một nguồn sản xuất lycopene mới và tạo cơ sở để sản xuất các carotenoid khác

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Tách dòng và xác định trình tự các gen carotenoid từ vi khuẩn Pantoea ananatis và gen idi từ vi khuẩn E coli Thiết kế vector biểu hiện pR-iEIB chứa các gen idi, crtE, crtI, crtB dựa trên nền tảng pRSET-A

- Thiết kế vector biểu hiện pR-iEIB chứa các gen idi, crtE, crtI, crtB dựa trên

nền tảng pRSET-A

- Biến nạp vector pR-iEIB vào chủng vi khuẩn E coli BL21, biểu hiện 4 gen idi, crtE, crtI, crtB tạo lycopene

3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Tách dòng và xác định trình tự các gen crtE, crtI, crtB từ vi khuẩn

P.ananatis và gen idi từ vi khuẩn E.coli

- Nhân dòng gen idi sử dụng cặp mồi đặc hiệu bằng phản ứng PCR từ vi khuẩn

E coli Nhân dòng gen carotenoid crtE, crtI, crtB sử dụng cặp mồi đặc hiệu bằng phản ứng PCR từ vi khuẩn P ananatis

- Tạo dòng các gen: Gắn gen vào vector tách dòng pLUG bằng enzyme T4

DNA ligase, biến nạp vector tái tổ hợp vào chủng E coli DH5α khả biến Chọn lọc

dòng bằng phương pháp cắt enzyme giới hạn Xác định trình tự gen bằng phương pháp giải trình tự

Nội dung 2: Thiết kế vector biểu hiện pRSET-iEIB chứa các gen idi, crtE, crtI,

crtB Dựa trên cơ sở phân tử của con đường sinh tổng hợp lycopene trong vi khuẩn

E coli và nền tảng vector pRSET-A cùng với các gen đã được tách dòng ở trên,

thiết kế vector pRSETA-iEIB

Nội dung 3: Biến nạp vector pR-iEIB vào E coli BL21(DE3) Cảm ứng biểu hiện 4

gen idi, crtE, crtI, crtB tạo lycopene màu hồng đỏ

Nội dung 4: Định tính định lượng lycopene thu được bằng phương pháp sắc ký

lỏng cao áp (HPLC)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Nhóm chất carotenoid

1.1.1 Cấu trúc và tính chất của carotenoid

Carotenoid là nhóm sắc tố tự nhiên tạo ra màu vàng, da cam và đỏ, được tổng hợp từ vi khuẩn, nấm, tảo đến thực vật bậc cao [34] Chúng được cấu tạo từ nhiều phân tử isoprenoid, vì vậy còn được gọi là polyprenoid Carotenoid được tạo thành với sự kết hợp hai phân tử geranylgeranyl diphosphate (20 cacbon) tạo khung gồm

40 phân tử cacbon Khung cacbon này được biến đổi tạo ra nhiều carotenoid khác nhau bằng cách: vòng hóa một hoặc cả hai đầu của phân tử tạo ra các nhóm kết thúc

ở hai đầu phân tử khác nhau; thêm các nhóm chứa oxy vào phân tử; thay đổi các mức hydro hóa

Cấu trúc phân tử carotenoid chứa các liên kết đơn đôi xen kẽ, tính chất này quy định hình dạng phân tử, phản ứng hóa học, hấp thụ ánh sáng và tạo màu của các carotenoid Liên kết đôi trong chuỗi polyene của carotenoid tồn tại ở hai dạng đồng

phân là -trans hoặc –cis [12]

Căn cứ vào cấu trúc hóa học, carotenoid được chia làm hai nhóm Nhóm thứ nhất gồm các hợp chất hydrocacbon mạch thẳng hoặc bị vòng hóa ở một hoặc cả hai đầu phân tử (β-carotene, α-carotene, γ-carotene, lycopene…) Nhóm thứ hai bao gồm những dẫn xuất của các hydrocarbon carotenoid (xanthophyll, lutein, α-

cryptoxanthin và β-cryptoxanthin, zeaxanthin, canthaxanthin và astaxanthin) [10]

Carotenoid có cấu trúc phân tử dạng chuỗi polyene liên hợp, chuỗi polyene liên hợp là một hệ thống giàu electron, nhạy cảm với sự tấn công của các chất hóa học có ái lực với điện tử Do đó, carotenoid có khả năng phản ứng mạnh với oxi và các gốc tự do [9]

1.1.2 Vai trò của carotenoid trong thực tiễn

Carotenoid đã được chứng minh là nhóm chất chống oxy hóa hiệu quả(Zaripheh and Erdman), đã mang lại lợi ích cho sức khỏe con người như ngăn ngừa hay trì hoãn các bệnh mãn tính như ung thư, xơ cứng động mạch, đục thủy tinh thể, ngăn ngừa thoái hóa điểm vàng Trong công nghiệp, carotenoid đã được sử dụng làm chất màu thực phẩm, chất bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, và gần đây hơn là

sử dụng trong ngành công nghiệp sản xuất mỹ phẩm và dược phẩm [59] Một số carotenoid được sử dụng làm phụ gia thực phẩm và thức ăn chăn nuôi (bảng 2.2)

Bảng 1.1: Một số carotenoid được sử dụng làm phụ gia trong thực phẩm và

thức ăn chăn nuôi [45]

Carotenoids

Nguồn thu nhận

Vai trò Động thực vật Vi sinh vật

β-carotene Cΰ rốt Blakeslea trispora

Dunaliella salina

Tạo màu thựcphẩm Lycopene Cà chua Blakeslea trispora Streptomyces

chrestomyceticus

Tạo màu thựcphẩm Lutein Ngô, cỏ ba lá, ngũ

cốc

Spongiococcum excentricum Chlorella pyrenoidosa

Thức ăn gia cầm Zeaxanthin Ngô, cỏ ba lá, ngũ

cốc

Flavobacterium sp Thức ăn

gia cầm Canthaxanthin Các loài giáp xác

Lông gia cầm

Cantharellus cinnabarinus Brevibacterium KY-4313 Corynebacterium michiganense

Thức ăn gia cầm

Astaxanthin Vỏ tôm, tổng hợp

nhân tạo

Mycobacterium lacticola Brevibacterium 103

Thức ăn cho cá

Vì vai trò của carotenoid đối với sức khỏe con người, nhu cầu về các hợp chất này ngày càng cao Theo báo cáo, năm 1999, thị trường carotenoid toàn cầu là 786 triệu USD; năm 2004 là 887 triệu USD Năm 2008 là 766 triệu USD, dự tính đến năm 2015 sẽ tăng lên 919 triệu USD, tỷ lệ tăng trưởng hàng năm là 2,3% Đặc biệt thị trường của β-carotene trong năm 2007 là 247 triệu USD và dự tính đến 2015 sẽ đạt 285 triệu USD (BCC, 2008)

Hình 1.1: Biểu đồ đánh giá thị trường carotenoid toàn cầu năm 2007 và 2015

(BCC, 2008)

1.2 Sắc tố lycopene

1.2.1 Cấu trúc và tính chất của lycopene

Lycopene là sắc tố màu đỏ thuộc lớp hydrocarbon carotene của nhóm carotenoid, là một tetreterpene hydrocarbon có chứa 40 nguyên tử carbon và 56 nguyên tử hydro, công thức phân tử là C40H56, phân tử lượng là 536 [47]

Lycopene là hydrocarbon béo, ở dạng rắn có màu đỏ đậm, không tan trong methanol, ethanol, nước nhưng tan trong chloroform, benzen và ete, nhiệt độ nóng chảy là 172-1730C Trong phân tử lycopene có chứa 11 liên kết đôi liên hợp và 2 liên kết đôi không liên hợp (hình 1.1) Do có cấu trúc mạch hở và không có vòng β- ion mà lycopene không có hoạt tính tiền vitamin A như α, β-carotene Sắc tố này có khả năng hấp thu ánh sáng cực đại ở 444,47 và 502nm, có khả năng nhận năng lượng từ các điện tử ở trạng thái kích thích [42]

Hình 1.2: Cấu trúc của tất cả các dạng đồng phân trans-lycopene và một số

đồng phân –cis [62]

Lycopene phân hủy mạnh bởi các gốc tự do như gốc –OH và các gốc hydrogen peroxide, đó chính là cơ sở hoạt tính chống oxi hóa của lycopene Lycopene tác dụng với oxy nguyên tử tạo ra oxy phân tử ở ba trạng thái kích thích khác nhau và có thể tiếp nhận các dạng năng lượng điện tử kích thích [38]

Trong tự nhiên lycopene tồn tại chủ yếu ở dạng đồng phân –trans [14], khi

được đun nóng sẽ xảy ra các phản ứng hóa học giữa các liên kết đôi, tạo ra các đồng

phân mono- hoặc poly-cis của lycopene [25], [60] Vì vậy khi tồn tại trong cơ thể

thực vật hoặc ở dạng rắn thì lycopene tương đối bền, nhưng khi tách chiết ra khỏi khối mô và hòa tan trong các dung môi không phân cực, lycopene lại trở nên kém bền [21], [25], [30]

Lycopene sau khi đi vào dạ dày gặp dịch vị sẽ được chuyển hóa thành dạng – cis, ở dạng này cơ thể hấp dễ dàng hơn và hiệu quả sử dụng cao hơn Do đó trong

huyết thanh người và trong các mô, cơ quan, các lycopene chủ yếu tồn tại ở dạng đồng phân – cis Lycopene liên kết chặt chẽ với các đại phân tử trong thực vật, vì vậy trong thực phẩm sống giá trị sinh học của nó ít được phát huy tác dụng Những thực phẩm này khi nấu lên thì lycopene được giải phóng ra khỏi các phức hợp protein và tăng cường giá trị sinh học của nó Nước xốt cà chua và các sản phẩm thực phẩm chế biến từ cà chua có hàm lượng lycopene cao gấp 4 lần so với khi chưa

chế biến [60]

1.2.2 Vai trò của sắc tố lycopene với con người

1.2.2.1 Vai trò của lycopene đối với sức khỏe con người

Lycopene không phải là chất dinh dưỡng, nhưng thường được tìm thấy trong chế độ ăn uống, chủ yếu là các món ăn chế biến từ cà chua Trong cơ thể người lycopene được hấp thụ qua thức ăn, khi đến ruột non lycopene được hòa tan nhờ muối mật và các mixen lipid tạo thành những vi nang, sau đó được hấp thu qua cơ chế vận chuyển thụ động [48] Lycopene chủ yếu được tích tụ trong gan, túi tinh dịch và tuyến tiền liệt [68], (bảng 1.2) sự tích lũy lycopene trong cơ thể

Bảng 1.2: Phân phối lycopene trong cơ thể người [61]

Phân phối lycopene trong cơ thể

Mô nmol/g trọng lượng ướt

Lycopene có khả năng chống oxy hóa mạnh gấp hai lần β-caroten, gấp 100 lần

vitamin E [19], vì vậy chúng đã được biết đến với một số vai trò sau

Vai trò trong ngăn ngừa lão hóa:

Trong cơ thể con người, nguyên nhân chính của sự lão hóa là do sự tấn công của các gốc tự do sinh ra trong quá trình hoạt động của cơ thể Các gốc tự do gây nên những rối loạn các chuỗi phản ứng hóa học, phá hủy màng tế bào dẫn đến tổn thương tế bào Do đó, để ngăn ngừa lão hóa thì cần thiết phải loại bỏ các gốc tự do trong cơ thể Với khả năng chống oxi hóa mạnh của lycopene có thể chống lại được quá trình lão [29]

Vai trò trong ngăn ngừa nguy cơ ung thư tuyến tiền liệt:

Chức năng chống oxi hóa của lycopene có khả năng làm giảm nguy cơ mắc bệnh của tuyến tiền liệt một cách hiệu quả Hàm lượng lycopene trong tuyến tiền liệt tỷ lệ nghịch với nguy cơ mắc bệnh của tuyến này [24] Sự tăng trưởng khác thường của tế bào biểu bì tuyến tiền liệt là nguyên nhân chính dẫn đến phì đại tuyến tiền liệt Lycopene có khả năng kiềm chế sự tăng trưởng của tế bào biểu bì tuyến tiền liệt, do đó giảm được nguy cơ mắc bệnh này [28]

Vai trò trong ngăn ngừa bệnh tim mạch:

Bệnh tim mạch là một trong những nguyên nhân dẫn tới tử vong của con người, mà nguyên nhân chính là do mỡ trong máu bị oxi hóa Lycopene có chức năng điều tiết cholesterol do đó có tác dụng phòng ngừa chứng xơ cứng động mạch Hàm lượng lycopene trong cơ thể cao thì nguy cơ mắc bệnh tim mạch sẽ giảm, nếu mỗi ngày dùng 60mg lycopene có thể làm giảm 14% cholesterol trong huyết tương [7], [26], [37]

Vai trò tăng cường khả năng miễn dịch:

Chức năng chống oxi hóa của lycopene có khả năng điều tiết hệ miễn dịch bảo

vệ thực bào khỏi sự tự oxi hóa, kích thích khả năng đáp ứng miễn dịch, làm tăng cường đại thực bào và tế bào tiêu độc, do đó nâng cao khả năng miễn dịch của cơ thể [31], [49], [64]

Vai trò giảm nguy cơ bị khối u:

Tác dụng chống oxi hóa của lycopene có thể giúp giảm sự đột biến của DNA,

từ đó dẫn đến giảm nguy cơ mắc bệnh khối u Hàm lượng lycopene trong huyết thanh của người mắc khối u thấp hơn so với người bình thường [23], [50] Trong nhóm carotenoid, lycopene là nhân tố chính trong việc ngăn ngừa ung thư và tiêu diệt các khối u [27]

1.2.2.2 Vai trò của lycopene trong công nghiệp

Trong công nghiệp lycopene được sử dụng rộng rãi, mức độ bổ sung lycopene

trong một số loại thực phẩm được thể hiện trong bảng 1.3

Bảng 1.3: Mức độ sử dụng lycopene công nghiệp thực phẩm (Theo thống kê

của Công ty các sản phẩm dinh dưỡng DSM) [15]

lycopene (mg/kg)

Hương liệu sữa và sữa uống 30

1.2.3 Con đường sinh tổng hợp lycopene trong tự nhiên

Lycopene và tất cả các carotenoid đều được tạo thành từ các tiền chất gọi là isoprenoid (isopentenyl hay terpenoid) Đến nay, có hai con đường sinh tổng các tiền chất này là: Con đường mevalonate (MVA) và con đường C-methyl-D- erythritol 4-phosphate (MEP) Hai con đường này đều tạo ra các tiền chất là isopentenyl diphosphate (IPP) và đồng phân của nó là dimethylallyl diphosphate (DMAPP), trung tâm của quá trình sinh tổng hợp tất cả các carotenoid là isopentenyl diphosphate (IPP) và đồng phân của nó là dimethylallyl diphosphate

(DMAPP), (hình 1.3)

Hình 1.3: Quá trình sinh tổng hợp lycopene trong vi khuẩn E coli từ các tiền

chất trung tâm IPP và DMAPP sử dụng con đường MVA và MEP [17]

Quá trình tổng hợp IPP và DMAPP trong con đường MEP khởi đầu bằng

phản ứng xúc tác bởi enzyme DXP synthase do gen dxs mã hóa tạo sản phẩm là

1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate (DXP) Sau đó DXP được chuyển hóa thành methyl-D-erythritol-4-phosphate (MEP) xúc tác bởi enzyme DXP

2-C-reductoisomerase do gen ispC (dxr) mã hóa Chuỗi các enzyme trong con đường

MEP mã hóa bởi các gen ispD (ygbP), ispE (ychB), ispF (ygbB), ispG (gcpE), và ispH (lytB) được sử dụng cho các phản ứng tiếp theo, giúp chuyển hóa MEP thành

các tiền chất trung tâm IPP Phản ứng chuyển hóa qua lại giữa IPP và đồng phân

DMAPP được thực hiện nhờ enzyme isopentenyl pyrophosphate isomerase được

mã hóa bởi gen idi.

Quá trình tổng hợp IPP và đồng phân của nó trong con đường MVA được bắt đầu bằng phản ứng chuyển hóa ba phân tử acetyl-CoA thành MVA thông qua acetoacetyl-CoA và β-hydroxy-β-methylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA), cuối cùng tạo thành IPP và đồng phân DMAPP

Quá trình tổng hợp lycopene từ tiền chất IPP diễn ra bằng các phản ứng ngưng

tụ liên tiếp của các tiền chất IPP và DMAPP làm cho chuỗi polyprenyl diphosphate kéo dài ra Geranyl diphosphate (GPP, 10C) và farnesyl diphosphate (FPP, 15C)

được tổng hợp bởi enzyme FPP synthase do gen ispA mã hóa Geranylgeranyl diphosphate (GGPP, 20C) được xúc tác bởi enzyme GGPP synthase do gen crtE mã

hóa Hợp chất không màu phytoene (40 cacbon) được tạo thành bằng phản ứng kết

hợp hai phân tử GGPP xúc tác bởi enzyme phytoene synthase do gen crtB mã hóa

Tiếp theo là phản ứng chuyển phytoene từ trạng thái no trở thành không no nhờ

enzyme phytoene desaturase do gen crtI mã hóa làm xuất hiện bốn liên kết đôi, tạo

Bảng 1.4 : Hàm lượng lycopene trong một số loại rau quả [51]

Hàm lượng lycopene trong một số loại rau quả Nguồn µg/g trọng lượng ướt

Trong kỹ thuật chiết xuất lycopene từ thực vật, thì cà chua là đối tượng được quan tâm Hàm lượng lycopene trong cà chua khoảng từ 0,9-4,2 mg/100g, tùy thuộc từng giống cà chua, vị trí địa lý, kỹ thuật canh tác, điều kiện khí hậu và mức độ chín

của quả cà chua Thành phần chính lycopene trong cà chua là ở dạng đồng phân – trans (35-96% lượng lycopene tổng số) [14]

Lycopene được chiết xuất từ loại cà chua có hàm lượng chất này cao, trong phạm vi 150 đến 250 mg/kg Quá trình chiết xuất ban đầu là nghiền cà chua tạo bột

cà chua thô và tách chiết lấy bột cà chua Sau đó bột cà chua được được chiết xuất bằng ethyl acetate Sản phẩm cuối cùng thu được sau khi loại bỏ dung môi bằng cách để ở môi trường chân không 40-600C Sản phẩm lycopene thu được là một chất lỏng nhớt, màu đỏ đậm Lycopene chiết xuất từ cà chua có thể phân tích bằng phương pháp HPLC [40]

Lycopene chiết xuất từ cà chua hay các loại quả khác có thể chứa dư lượng ethyl acetate, được sử dụng trong chiết xuất Quá trình tách chiết còn tạo ra chất thải gây ô nhiễm như kim loại nặng và asen [40] Ngoài ra, phương pháp trên còn có một số nhược điểm như phụ thuộc mùa vụ, tốn diện tích đất gieo trồng Do vậy, cần tìm ra phương pháp mới hiệu quả hơn, đồng thời khắc phục những nhược điểm của phương pháp trên

1.2.4.2 Sản xuất lycopene bằng phương pháp tổng hợp hóa học

Đến nay, cùng với các carotenoid khác như ß-carotene, canthaxanthin, astaxanthin, ß-apo-8′-carotenal, ethyl-ß-apo-8′-carotenoate và citranaxanthin th́ lycopene cũng được tổng hợp bằng phương pháp hóa học ở quy mô công nghiệp [20] Các chất này hầu hết được sản xuất bằng cách tổng hợp các cấu trúc đối xứng, tức là có sự biến đổi đồng nhất các nhóm cuối Phương pháp hiệu quả nhất để xây dựng các cấu trúc đối xứng là sự ngưng tụ Wittig kép giữa một dialdehyde C10 đối xứng đóng vai trò như là đơn vị cấu thành cơ bản tương đương của một muối phosphonium-C15 thích hợp

Vật liệu khởi đầu sử dụng trong tổng hợp lycopene là (E/Z)-pseudoionone có chứa 13 nguyên tử carbon và chưng cất tạo pseudoionone-(E) nguyên chất Quá trình kéo dài thêm hai nguyên tử carbon để tạo ra đơn vị cấu thành cơ bản C15 (E)-

vinyl pseudoionone được thực hiện qua chuỗi phản ứng gồm hai bước: ethynyl hóa

và hydro hóa phần tiếp theo Bước tiếp theo trong quá trình tổng hợp lycopene là việc sắp xếp lại các (E)-vinyl pseudoionone để tạo thành muối C15-phosphonium lycopene, đây là bước rất quan trọng Sau đó các đồng phân lập thể (Z) hình thành tại ba nhóm thế của các liên kết đôi ở vị trí (5)/(6) và (5’)/(6’) trong chuỗi polyene, bước này cần phải giảm tới mức tối thiểu Và được xử lý với hỗn hợp triphenylphosphate và acid acetic để tạo ra C15-phosphonium Việc tăng hàm lượng của đồng phân E bằng phương pháp trao đổi ion giữa acetate và chlorid đã thu được

tỷ lệ đồng phân (E/Z) là 3,7:1 Trong phương pháp này, hàm lượng các đồng phân Z giảm do sự tinh thể hóa Sơ đồ tổng hợp công nghiệp hợp chất lycopene (hình 1.4)

Hình 1.4: Sơ đồ tổng hợp công nghiệp hợp chất lycopene [20]

Lycopene cũng như các hợp chất carotenoid khác đã được tổng hợp bằng phương pháp hóa học và đã tạo ra được sản phẩm tinh khiết và bền vững Tuy nhiên, phương pháp này có một số hạn chế như: sự tổng hợp hóa học một số carotenoid rất phức tạp, mỗi quy trình sản xuất một carotenoid mới thì yêu cầu phải nghiên cứu ra một con đường hóa học mới, điều này là tương đối phức tạp Một số

đồng phân tạo ra bằng tổng hợp hóa học có thể không hoạt động như đồng phân carotenoid trong tự nhiên hoặc có tác dụng phụ, tạo chất thải gây ô nhiễm môi trường [8] Do vậy, cần tìm ra phương pháp mới hiệu quả hơn, đồng thời khắc phục những nhược điểm của phương pháp tổng hợp hóa học

1.2.4.3 Sản xuất lycopene bằng phương pháp điều hướng trao đổi chất (Metabolic engineering)

Kỹ thuật điều hướng trao đổi chất là phương pháp sử dụng công nghệ ADN tái

tổ hợp nhằm biến đổi mạng lưới trao đổi chất trong các tế bào sống để sản xuất ra các hợp chất mong muốn với hiệu suất cao Phương pháp này có thể giúp sản xuất các hợp chất carotenoid hiệu quả hơn mà các phương pháp khác không thể thực hiện được Hầu hết các gen chịu trách nhiệm sản xuất các carotenoid đã được tách

dòng và biểu hiện trong E coli [55]

Các gen mã hóa cho các enzyme trong con đường sinh tổng hợp các

carotenoid của vi khuẩn P ananatis được sử dụng trong nhiều nghiên cứu sinh tổng

hợp các carotenoid trong các vật chủ mà bản thân chúng không chứa các gen này [55] Một số carotenoid đã được sản xuất thành công trong các vi sinh vật dị

carotenoid như: Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Candida utilis, và Zymomonas mobilis, bằng cách biến nạp các gen tham gia sinh tổng hợp các

carotenoid từ các vi sinh vật khác [44]

Điều hướng trao đổi chất đã được nghiên cứu áp dụng làm tăng cường sự biểu

bằng cách đưa các gen crt của P ananatis vào vi khuẩn E coli cùng với gen dxs để

tăng cường sự biểu hiện của tiền chất IPP, hàm lượng lycopene thu được là 1,33

mg/l [41] Kết hợp các gen crt của P ananatis đồng thời tăng cường tổng hợp tiền chất IPP bằng cách đưa gen idi và các gen mvaK1, mvaK2, mvaD của con đường mevalonate vào E coli nhằm tăng cường biểu hiện của đồng loạt các gen tổng hợp

các tiền chất, tăng cường biểu hiện lycopene (Hình 1.5)

Hình 1.5: Con đường tổng hợp lycopene trong E coli sử dụng các gen

Điều hướng trao đổi chất ở vi sinh vật sản xuất một cách hiệu quả các hợp chất carotenoid và có những ưu điểm như : thân thiện với môi trường, giảm chi phí cho quá trình sản xuất, hiệu quả kinh tế cao

1.3 Vi khuẩn P ananatis và nhóm gen carotenoid

P.ananatis (còn có tên là Erwinia uredovora) là vi khuẩn thuộc họ

Enterobacteriaceae là vi khuẩn gram âm, yếm khí tùy tiện, khi nuôi cấy trên môi

trường thạch ở 25-280C cho khuẩn lạc màu vàng Đây là vi khuẩn thường gây bệnh thối ở một số cây trồng như hành, ngô, lúa và một số bệnh ở người [18]

Misawa và cộng sự đã tách dòng và xác định trình tự các gen crt tham gia con đường sinh tổng hợp các carotenoid trong P ananatis, kết quả giải trình tự được công bố trên ngân hàng GenBank số D90087 Biến nạp các gen crt của vi khuẩn này vào E coli và phân tích chức năng của các sản phẩm do các gen đó mã hóa (bảng

1.6)

Bảng 1.6: Các gen crt trong vi khuẩn P ananatis và chức năng tương ứng

CrtE GGPP synthase Geranylgeranyl pyrophosphate

CrtB Phytoene synthase Phytoene

CrtI Phytoene desaturase Lycopene

CrtY Lycopene cyclase β-carotene

CrtZ β-carotene hydroxylase zeaxanthin

Hình 1.6: Con đường sinh tổng hợp lycopene trong P ananatis [41]

Nghiên cứu này cũng đã chỉ ra vai trò của từng gen trong sinh tổng hợp các

carotenoid trong P ananatis

Khi đưa nhóm gen sinh tổng hợp lycopene (crtEIB) từ Erwinia uredovora vào

thì chúng có khả năng tạo ra sắc tố lycopene [39], [54] Hầu hết các gen carotenoid

đã được tách dòng và biểu hiện trong E coli [53], tạo ra các sắc tố carotenoid với

các màu đặc trưng (hình 1.7)

Hình 1.7: Màu của khuẩn lạc carotenoid

1.4 Vi khuẩn E coli và gen idi

Vi khuẩn E coli đã được nghiên cứu và hiểu biết khá rõ về cấu trúc và đặc

tính di truyền, có khả năng sinh sản nhanh, thời gian thế hệ ngắn và thao tác dễ

dàng Vi khuẩn E coli tự nhiên không chứa các gen cho quá trình tổng hợp

lycopene, nhưng chúng có thể cung cấp tiền chất IPP, là đơn vị cấu thành hầu hết các carotenoid như: lycopene, β-carotene, canthaxanthin, astaxanthin và zeaxanthin [16], [42], [53] Hầu hết các gen carotenoid từ các loài vi khuẩn, nấm và thực vật

bậc cao đều có thể biểu hiện chức năng trong E coli [17]

Gen idi có chiều dài 549bp, đã được tách dòng từ chủng UMNK 88 và đã công

bố trên ngân hàng gen mã số CP002729.1 Trong các con đường sinh tổng hợp carotenoid, IPP và đồng phân của nó là DMAPP đứng ở vị trí trung tâm với vai trò

là đơn vị cấu thành cơ bản (building block) IPP và DMAPP được chuyển hóa qua lại nhờ phản ứng isomerization xúc tác bởi enzym isopentenyl diphosphate

isomerase do gen idi mã hóa Trong một số nghiên cứu điều hướng trao đổi chất

(metabolic engineering) carotenoid, sự thiếu hụt IPP là một trong những trở ngại cần vượt qua Công bố gần đây nhất cho thấy khi sử dụng vector TrcDx để biểu

hiện lycopene trong E coli DH5α hàm lượng lycopene chỉ đạt 4.95 mg/l, nhưng khi

sử dụng TrcDx-idi hàm lượng lycopene đạt 12.85 mg/l [13]

1.5 Tình hình nghiên cứu về lycopene trong và ngoài nước

1.5.1 Các nghiên cứu trên thế giới

Sắc tố lycopene và các carotenoid được sự quan tâm nghiên cứu từ trước thể

kỷ XX, nhưng chủ yếu là các nghiên cứu về bản chất hóa học, các tính chất của carotenoid và phân lập tách chiết carotenoid từ các nguồn trong tự nhiên Năm

1875, Millardet chiết xuất được lycopene thô từ cà chua, nhưng không phân biệt được rõ với các carotenoid khác Năm 1910, Willstaller và Escher nghiên cứu chất lycopene và lần đầu tiên xác định được công thức hóa học là C40H56 và khối lượng phân tử của nó là 536,85 Cho đến năm 1985, Colditz và cộng sự đã nghiên cứu về chức năng của các hợp chất carotenoid có trong các loại rau quả và đã phát hiện ra rằng lycopene có khả năng ngăn ngừa ung thư và phòng chống bệnh tim mạch Từ

đó, con người bắt đầu nghiên cứu chiết xuất lycopene trực tiếp từ các nguồn sẵn có trong tự nhiên như: từ thực vật, nấm, tảo và tổng hợp chất này bằng phương pháp hóa học

Năm 1990, Misawa và cộng sự đã tách dòng và xác định trình tự các gen crt

tham gia con đường sinh tổng hợp các carotenoid đồng thời làm sáng tỏ con đường

sinh tổng hợp các carotenoid trong vi khuẩn P ananatis bằng cách sử dụng phương pháp điều hướng trao đổi chất biến nạp các gen crtE, crtB, crtI vào vi khuẩn E coli

tạo ra lycopene và phân tích chức năng sản phẩm do các gen đó mã hóa [42]

Từ đó, có nhiều nghiên cứu khác nhau về điều hướng trao đổi chất nhằm tăng cường tổng hợp lycopene Năm 1998, Miura đã sử dụng các gen carotenoid từ vi

khuẩn P ananatis và A aurantiacum biến nạp vào chủng nấm C utilis, tạo ra

lycopene với hàm lượng 1,1 mg/g trọng lượng khô tế bào [44] Năm 2000, Famer đã

tiến hành đưa các gen crt cùng với các gen dxs, idi và gps vào E coli nhằm tăng

cường biểu hiện của đồng loạt các gen tổng hợp các tiền chất lycopene, sử dụng nguồn carbon chủ yếu là glucose, từ đó có thể điều khiển sự tổng hợp lycopene của

tế bào thông qua việc bổ sung glucose vào môi trường nuôi cấy [22] Cùng trong năm 2000, Wang và cộng sự đã đạt được kết quả tăng vọt khi ông đã tiến hành đưa

gen dxs và gps cùng các gen crt vào chủng vi khuẩn E coli, làm hiệu quả tổng hợp

lycopene tăng lên 45mg/g trọng lượng khô tế bào [63] Năm 2001, Kim và

Keasling sử dụng các gen crt của E herbicola và gen dxs, dxr vào vector biểu hiện trong E coli đồng thời có sự cảm ứng bằng arabinose, hiệu quả sản xuất lycopene

tăng lên 12,3 mg/g trọng lượng khô tế bào [36]

Đến năm 2006, Yoon và cộng sự đã tiến hành đưa con đường mevalonate

ngoại lai vào E coli và cảm ứng bằng Tween 80 0,5% (w/v), hiệu quả tổng hợp

lycopene lên tới 22 mg/g trọng lượng khô tế bào [67] Năm 2007, Jin và

Stephanopoulos tạo ra được chủng E coli sản xuất lycopene với hàm lượng 16

mg/g trọng lượng khô tế bào bằng cách tăng cường biểu hiện của hàng loạt các gen tổng hợp tiền chất carotenoid [32] Cũng trong năm 2007, Yoon và cộng sự đã kết

hợp các gen crt của P ananatis (crtI, crtB) và P agglomerans (crtE), đồng thời tăng cường tổng hợp tiền chất IPP bằng cách đưa gen idi và các gen mvaK1, mvaK2, mvaD của con đường mevalonate vào E coli, kết quả là hàm lượng lycopene tích

lũy trong tế bào lên tới 27,7 mg/g trọng lượng khô tế bào [66]

Ứng dụng kỹ thuật điều hướng trao đổi chất vào sản xuất hợp chất lycopene và các carotenoid khác đã nhận được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới

và đã thu được những thành tựu đáng kể Hiện nay, có nhiều hướng nghiên cứu điều

hướng trao đổi chất, nhằm mang lại hiệu quả sản xuất cao hơn

1.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam một số nghiên cứu về các carotenoid cũng đã được tiến hành Năm 2006, Hà Thị Bích Ngọc và các cộng sự đã tiến hành điều tra một số hợp chất carotenoid trên 30 đối tượng thực vật phổ biến ở Việt Nam bằng phương pháp sắc

ký lỏng cao áp (HPLC) Kết quả cho thấy hàm lượng β-carotene có nhiều trong rau ngót, bí đỏ, rau sam, và nhiều nhất là trong lá đu đủ (57,059%); hàm lượng lutein có nhiều nhất ở lá đinh lăng (50,762%); hàm lượng lycopene có nhiều nhất ở quả cà chua (22,483%) [4]

Nghiên cứu chiết xuất tinh chế và xác định bản chất hóa học, hoạt tính sinh học của một vài carotenoid từ một số cây cỏ Việt Nam dùng trong sản xuất thuốc và thực phẩm thuốc [3]

Năm 2010, Bùi Minh Giao Long và cộng sự khảo sát đối với 54 chủng vi khuẩn

có màu được phân lập từ các mẫu đất, cát ở biển và hồ nuôi tôm (biển Vũng Tàu, Phan Thiết, Long Hải; suối nước nóng Bình Châu; hồ tôm ở Cần Giờ và Bình Thuận), đã chọn được 5 chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp carotenoid Các chủng này đều có hoạt tính chống oxi hóa (thử nghiệm DPPH) lớn hơn 50% Kết quả giải trình tự 16S

rDNA cho thấy các chủng này đều thuộc chi Bacillus, bao gồm Bacillus firmus, Bacillus indicus, Bacillus catenulatus, Bacillus aquimaris, Bacillus marisflav [1]

Khi phân tích các carotenoid ở thịt quả và màng hạt trong trái Gấc Việt Nam cũng bằng phương pháp HPLC, các tác giả đã chỉ ra trong trái Gấc chứa một lượng carotenoid khá lớn, nhất là ở màng hạt gấc Trong một gam thịt quả gấc (phần có màu vàng) chứa 7-37 µg β-carotene, 0.2-1.6 µg lycopene Khi tách chiết bằng phương pháp xà phòng hóa thì một gam thịt quả chứa 4-26 µg β-carotene, 0.1-0.7

µg lycopene, 1-2µg zeaxanthin, 2-5 µg β-cryptoxanthin Trong một gam màng hạt gấc chứa 310-460 µg lycopene, 60-140 µg β-carotene Khi xà phòng hóa mẫu thì lượng lycopene trong màng hạt gấc là 300-400 µg, lượng β-carotene là 50-110 µg, lượng zeaxanthin là 5-13 µg Các tác giả cũng cho rằng nồng độ lycopene trong màng hạt gấc gấp từ 4-10 lần so với lượng lycopene trong một số rau quả được cho

là giàu lycopene [2]

Năm 2007, “Chương trình nghiên cứu khoa học công nghệ trọng điểm quốc gia chương trình là sản xuất các hoạt chất thiên nhiên để làm nguyên liệu sản xuất thuốc, trong đó có nội dung: “Sản xuất các hoạt chất carotenoid để làm thuốc chống lão hóa”, chống ung thư từ quả gấc và hoa cúc vạn thọ đã được phê duyệt"

Tuy nhiên, ở Việt Nam chưa có công bố nào về việc ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp vào sản xuất lycopene cũng như các hợp chất carotenoid Do vậy, việc nghiên cứu ứng dụng phương pháp này để sản xuất lycopene chính là sự đổi mới phương pháp nhằm nâng cao hiệu quả sản xuất các hợp chất carotenoid tại Việt Nam

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu, hóa chất và txhiết bị

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu

Chủng vi khuẩn E coli DH5α được cung cấp từ phòng thí nghiệm Công nghệ

tế bào thực vật, viện Công nghệ sinh học Chủng E coli DH5α khả biến dùng làm vật chủ cho quá trình tách dòng các gen Chủng E coli BL21(DE3) khả biến dùng

làm vật chủ cho quá trình biểu hiện gen

Vi khuẩn P ananatis được cung cấp từ hãng DSMZ (Deutsche Sammlung von

Mikroorganismen Zellkulturen GmbH) và được sử dụng làm nguyên liệu DNA cho

khuếch đại các gen crtE, crtI, crtB

2.1.2 Hóa chất và thiết bị

2.1.2.1 Hóa chất dùng cho tách dòng gen

- Hóa chất dùng cho nuôi khuẩn: Pepton, Beef Extract, Agar, LB

Bảng 2.1: Trình tự và thông tin về các cặp mồi

Dựa vào trình tự nucleotide gen idi, crtE, crtB, crtI được công bố trên ngân

hàng gen NCBI mã số tương ứng lần lượt là CP002729.1, NC-013956.1 (4608461 4609396), NC-013956.1 (4611845 4613323), NC-013956.1 (4613320 4614249), chúng tôi tiến hành thiết kế cặp mồi đặc hiệu để nhân trình tự

nucleotide mã hóa gen idi, crtE, crtI, crtB Ngoài nhiệm vụ nhân gen, mồi còn là

một phần trong quy trình thiết kế nhằm đưa liên tiếp 4 gen vào 1 vector biểu hiện nhằm tạo polycistron mã hóa 4 enzyme trong con đường sinh tổng hợp lycopene

Cặp mồi nhân gen idi có cấu tạo bao gồm:

+ Phần bắt cặp đặc hiệu với trình tự DNA của hệ gen vi khuẩn E coli (phần in

hoa), phần bắt cặp được bắt đầu với bộ ba mở đầu ở mồi xuôi và bộ ba kết thúc ở mồi ngược (in đậm)

+ Phần đầu treo 5’ không bắt cặp (chữ thường), gồm nucleotid đầu tiên ở đầu treo 5’ có vai trò bảo vệ vị trí nhận biết của enzyme giới hạn, vị trí enzyme giới hạn

(phần gạch chân) Ở mồi idi-F vị trí enzyme NdeI được thiết kế trùm lên mã mở

đầu, thiết kế này nhằm thuận tiện việc nhận biết sự nguyên vẹn của mã mở đầu

Các cặp mồi nhân gen crtE, crtB, crtI có cấu tạo bao gồm:

+ Phần bắt cặp đặc hiệu với trình tự DNA của hệ gen vi khuẩn Pantoea ananatis (phần in hoa), phần bắt cặp được bắt đầu với bộ ba mở đầu ở mồi xuôi và

bộ ba kết thúc ở mồi ngược (in đậm) Với mồi xuôi của gen crtB, nucleotide đầu

tiên của phần bắt cặp (T) được thay thế bằng nucleotide (A) biến đổi một bộ ba mã khởi đầu TTG thành ATG

+ Phần đầu treo 5’ không bắt cặp (chữ thường) bao gồm các thành phần tương

tự cặp mồi nhân gen idi Ngoài ra, với các mồi crtEF, crtBF, crtIF còn có thêm trình

tự (aggagg), là vị trí liên kết giúp ribosome gắn vào mRNA và trình tự Shine Dalgarno là 8 nucleotide (phần chữ hoa in nghiêng) tạo khoảng cách tối ưu hóa cho

quá trình dịch mã Hai vị trí này được thiết kế thêm vào hai đầu của các gen crtE, crtB, crtI với mục đích biểu hiện các gen trong vi khuẩn E coli

- Hóa chất điện di: Agarose, Loading dye, Ethidium bromide, hóa chất pha dung dịch đệm TAE (Tris base, EDTA, NaOH, Acid acetic 100%)

- Hóa chất chiết DNA từ gel Agarose (Thôi gel): Bộ Kit MEGA- spinTM

Agarose Gel Extraction của hãng INTRON BiotechnologyTM (Hàn Quốc)

- Hóa chất cho phản ứng gắn nối gen vào vector tách dòng: Bộ Kit pLUG®TA-cloning Kit của hãng iNtRON BiotechnologyTM (Hàn Quốc), các thành phẩn bao gồm: 5X Ligation Buffer, T4 DNA Ligase, nước cất khử ion, vector tách dòng pLUG® TA-cloning

Vector pLUG là vector tách dòng TA có kích thước 2982 bp, cấu trúc của vector được thiết kế bao gồm một gen kháng kháng sinh Amp và một gen LacZα có chứa vị trí đa tách dòng Gen kháng kháng sinh ampicilin (Amp resistant gen) mã hóa cho enzyme phân giải kháng sinh ampicilin, do đó các tế bào mang vector pLUG có thể sống sót và phát triển trên môi trường có ampicilin

Vị trí của gen LacZα được thiết kế bao gồm cả vị trí đa tách dòng, chứa vị trí

cắt của 11enzyme giới hạn: SacI, NotI, XbalI, BamHI, SamI, PstI, EcoRI, HindIII, HindIII, SacI, KpnI Với các tế bào chủ mang vector pLUG tự đóng vòng hay không

có sự gắn xen, operon hoạt động bình thường Trong môi trường có IPTG promoter sẽ được kích hoạt quá trình phiên mã xảy ra, sau đó là quá trình dịch mã tổng hợp enzyme β-Galactosidase Enzyme này xúc tác cho phản ứng chuyển hóa

Lac-cơ chất X-gal thành chất có màu xanh, làm cho khuẩn lạc bao gồm các tế bào này

có màu xanh Trường hợp thứ hai là khi cấu trúc của Lac-Operon bị phá vỡ do gắn xen thành công, dẫn đến enzyme β- Galactosidase không được tổng hợp, không có

sự phân giải cơ chất X-gal nên các khuẩn lạc này sẽ có màu trắng Các khuẩn lạc màu trắng là những khuẩn lạc mong muốn trong chọn lọc dòng

Hình 2.1: Cấu trúc vector tách dòng pLUG® TA-cloning

Các thành phần của vector pLUG được thể hiện trong bảng 2.2

Bảng 2.2 Các thành phần của vector pLUG® TA-cloning

Multiple cloning site Cắt kiểm tra đoạn xen được gắn vào

Vị trí gắn xen Cho phép gắn đoạn xen vào giữa 2 vị trí HindIII

LacZα Chọn lọc dòng, giúp phân biệt các dòng tế bào mang

vector có và không có đoạn xen

Amp resistant gen

Gen kháng kháng sinh Ampicilin, có vai trò trong chọn lọc dòng, nhằm duy trì các dòng tế bào mang vector pLUG

Điểm khởi đầu sao

chép ColE1 origin

Chịu trách nhiệm cho sự tái bản của vector pLUG

trong E coli

Các vị trí enzyme giới hạn trên vị trí đa tách dòng thể hiện ở hình 2.2

Hình 2.2: Các vị trí enzyme trên vị trí đa tách dòng của pLUG® TA-cloning

- Hóa chất cho biến nạp và chọn lọc khuẩn lạc: Môi trường LB đặc và lỏng,

kháng sinh Amp, Xgal 40mM + IPTG 400mM

- Hóa chất tách chiết DNA plasmid: Phương pháp tách chiết bằng Kit: Sử dụng bộ Kit “DNA-spinTM plasmid DNA Purification Kit” của hãng INtRON

Biotechnology (Hàn quốc)

- Enzme giới hạn: HindIII, XhoI, BamHI, KpnI, NdeI, EcoRI của Fementas

2.1.2.2 Hóa chất dùng cho gắn nối gen vào vector

- Enzyme T4 DNA ligase của hãng InvitrogenTM

.

- Vector pRSET-A của hãng InvitrogenTM (hình 2.3)

Hình 2.3: Cấu trúc vector biểu hiện pRSET-A

Thành phần cấu tạo từng phần trong plasmid được thể hiện (bảng 2.3)

Bảng 2.3: Các thành phần của vector pRSET – A

Vùng khởi đầu sao chép

pUC ori

Cho phép tạo ra số lượng bản

sao plasmid lớn trong E coli

Base 2047 -

2720 Gen kháng Ampicilin Chọn lọc các dòng mang

vector tái tổ hợp

Base 1042 -

1902 T7 promoter Kiểm soát chặt chẽ sự biểu

hiện của gen

Base 20 - 39

Vị trí đa tách dòng (MCS) Cho phép gắn gen quan tâm Base 202 - 248

Tín hiệu kết thúc của T7 Cho phép kết thúc quá trình

- Bộ điện di DNA (SCIE-PLAS Consort EV243)

- Cân phân tích Sartorius TE214S

- Máy lắc SK 300

- Máy vortex IKA Genius3

- Pipetman, đầu côn, ống eppendorf

- Tủ lạnh 4ºC (HITACHI), tủ lạnh -20ºC (DAEWOO) và -80ºC (Sanyo)

- Bể ổn nhiệt có bơm khuấy (Pharmacia Biotech)

- Tủ cấy vô trùng (NUAIRE LABGARD)

- Máy ly tâm MIKRO 22 (Hettich zentrifugen)

- Máy ly tâm loại nhỏ: Wealtec E-centrifuge

- Máy PCR AB (Applied Biosystems) Veriti 96 well Fast Thermal Cycler

- Máy xác định trình tự tự động AB 3130 gentic Analyzer (HITACHI)

- Máy chụp ảnh gel Logic 1500, lò vi sóng LG, nồi khử trùng, máy lọc nước siêu sạch, bể rửa sóng siêu âm của Jeiotech – Korea

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (LC – 20A, Shimadzu, Japan)

Mồi đặc hiệu nhân gen PCR

Thu cặn tế bào vi khuẩn

Sản phẩm PCR

Nuôi khuẩn P ananatis (crtE,

crtI, crtB), E coli (idi)

Trình tự của gen

đã được công bố

Thiết kế mồi

Tinh sạch sản phẩm

Gắn gen vào vector tách dòng pLUG

Biến nạp vào vi khuẩn E coli

chủng DH5α

Xác định trình tự gen gen bằng phương pháp Sanger

So sánh trình tự bằng phần mềm

Cấy trải trên môi trường

chọn lọc Tách DNA plasmid

Kiểm tra bằng enzyme cắt

2.2.1.1 Nuôi ph ục hồi khuẩn

- Vi khuẩn E coli DH5α sử dụng làm khuôn DNA cho phản ứng PCR được

nuôi trong môi trường LB ở điều kiện lắc 100 vòng/phút tại nhiệt độ 370C qua đêm

Dịch vi khuẩn ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút để thu cặn tế bào, pha loãng 10

lần để làm khuôn cho phản ứng PCR nhân gen idi

- Vi khuẩn P ananatis dạng đông khô được nuôi phục hồi theo hướng dẫn

của nhà sản xuất DSMZ, sau đó nuôi trong môi trường Nutrient Broth, lắc 120 vòng/phút ở 250C qua đêm Dịch vi khuẩn ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút để

thu cặn tế bào, pha loãng 10 lần để làm khuôn cho phản ứng PCR nhân gen crtE, crtI, crtB

Môi trường sử dụng nuôi khuẩn

NB lỏng: (0,5g Trypton + 0,3g Extract)/ 100ml môi trường

NB đặc: (0,5g Trypton + 0,3g Extract + 1,5g Agar)/ 100ml môi trường

Phản ứng được tiế hành với tổng thể tích 30 µl với các thành phần sau:

DNA (dịch cặn tế bào pha loãng 10 lần)

0,3 µl

30,0 µl

Dùng pipet trộn đều hỗn hợp và ly tâm nhẹ rồi chuyển vào máy PCR, nhiệt độ

gắn mồi tối ưu của gen idi, crtE, crtB ở 570C trong 45 giây và gen crtI ở 550C trong

45 giây Phản ứng diễn ra trong 25 chu kỳ Chu trình nhiệt được cài đặt như sau:

940C trong 5 phút

940C trong 45 giây

570C trong 45 giây (idi, crtE, crtB)

(crtI: 550C trong 45 giây ) 25 chu kỳ

720C trong 1 phút 30 giây

720C trong 8 phút

40C (thời gian tùy chọn)

Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%

2.2.1.3 Tinh sạch DNA từ bản gel sau khi điện di

Sản phẩm PCR sau khi được điện di trên gel agarose 1%, tiến hành thôi gel bằng KIT MEGA-spinTM Agarose Gel Extraction Các bước tinh sạch gel điện di được thực hiện theo hướng dẫn của bộ kit

Hỗn hợp được trộn đều bằng pipet và ly tâm nhẹ, ủ ở nhiệt độ 40C qua đêm

2.2.1.5 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào E coli DH5α khả biến

Sản phẩm phản ứng gắn nối được biến nạp vào tế bào E coli DH5α khả biến

theo phương pháp sốc nhiệt đã được mô tả bởi Sambrook và Russell (2001) [69] Các bước quá trình biến nạp tiến được tiến hành như sau:

(1) Lấy ống tế bào khả biến từ tủ -800C và để trên đá

(2) Hút toàn bộ sản phẩm gắn nối vào ống tế bào khả biến

(3) Để hỗn hợp trên đá lạnh 20 phút

(4) Sốc nhiệt 42oC trong 90 giây và chuyển nhanh vào đá lạnh trong 2 phút (5) Bổ sung 800µl LB lỏng, nuôi lắc 200 vòng/phút ở 370C trong 90 phút (6) Ly tâm dịch nuôi khuẩn ở 4000 vòng/phút trong 4 phút, bỏ phần dịch nổi (7) Bổ sung 100 µl LB lỏng (không có Amp), trộn nhẹ

(8) Cấy trải toàn bộ dịch khuẩn trên môi trường LB + Ampicilin (100 µg/ml)+ X-gal (40 mg/ml) + IPTG (100 µg/ml)

(9) Nuôi ở 370C qua đêm

2.2.1.6 Tách chiết DNA plasmid thu được

Sản phẩm biến nạp sau khi được nuôi ở 370 qua đêm, tiến hành chọn lọc những dòng khuẩn lạc trắng có khả năng mang gen đích, nuôi riêng rẽ trong 7ml

LB lỏng có bổ sung amp qua đêm Ly tâm thu cặn khuẩn các dòng khuẩn lạc thu được và tiến hành tách plasmid bằng Kit “DNA-spinTM” của hãng Intron Biotechnology Các bước tiến hành làm theo hướng dẫn của bộ Kit

2.2.1.7 Cắt DNA plasmid bằng enzyme giới hạn

Sau khi tách plasmid, tiến hành điện di trên gel agarose 1% chọn lọc những dòng khuẩn lạc trắng có khả năng gen đích bằng cách so sánh với kích thước của dòng khuẩn lạc xanh nuôi cùng điều kiện Chọn những dòng plasmid có kích thước cao hơn đối chứng (khuẩn lạc xanh), cắt bằng enzyme giới hạn để kiểm tra

Thành phần phản ứng cắt DNA bằng enzyme giới hạn:

Dung dịch đệm cho enzyme : 1,0 µl

2.2.1.8 Giải trình tự DNA và so sánh với các trình tự đã công bố

Trình tự nucleotide của gen được xác định bằng phương pháp gen dideoxy của Sanger (1977) [69], trên máy AB 3130 gentic Analyzer (HITACHI)

Gen sau khi xác định trình tự được so sánh với các trình tự đã công bố trên ngân hàng gen NCBI qua chương trình BLAST thông qua hệ cơ sở dữ liệu NCBI

2.2.2 Phương pháp thiết kế vector biểu hiện pR-iEIB

Dựa trên cơ sở phân tử của con đường sinh tổng hợp lycopene trong sinh vật

và các vị trí cắt enzyme giới hạn duy nhất trên pRSET-A, chúng tôi thiết kế vector

tái tổ hợp pRSETA-iEIB mang các gen idi, crtE, crtI và crtB đã tách dòng ở trên Khi thiết kế mồi nhân gen idi, crtE, crtI và crtB, chúng tôi đã thiết kế có chứa

những trình tự có vị trí giới hạn duy nhất đó và đã ngầm định gen nào gắn trước gen nào gắn sau vào vector Mục đích của việc thiết kế các vị trí cắt enzyme giới hạn ở

các đầu gen idi, crtE, crtI và crtB như trên là để gắn lần lượt từng gen này theo thứ

tự từ idi → crtE → crtI → crtB vào vector biểu hiện pRSET-A tương ứng với thứ

tự của các vị trí cắt trên pRSET-A (Từ NdeI→ BamHI → XhoI → KpnI → EcoRI)

theo chiều 5’ – 3’ Các gen được gắn vào hoạt động theo nguyên lý polycistron, trên mỗi gen đều có chứa vị trí bám của ribosom, bộ ba mở đầu và bộ ba kết thúc, cho phép các gen này biểu hiện một cách độc lập dưới sự kiểm soát của một promoter (T7 promoter)

Vector tái tổ hợp pR-iEIB có chứa các gen idi, crtE, crtI và crtB được nhân

lên trong tế bào, sau đó phiên mã ra các mRNA dưới sự kiểm soát của T7 promoter

và dịch mã ra các enzyme xúc tác cho quá trình tổng hợp lycopene

Sơ đồ quá trình gắn gen idi, crtE, crtI và crtB được thể hiện trên hình 2.5

Hình 2.5: Sơ đồ phương pháp thiết kế vector pRSET-iEIB Thiết kế vector pRSET-i

Xử lý BamHI

+ XhoI

Ghép nối bằng T4 ligase

Ghép nối bằng T4 ligase

Xử lý XhoI +

KpnI

Ghép nối bằng T4 ligase

Xử lý KpnI +

EcoRI

Ghép nối bằng T4 ligase

Quá trình gắn gen idi vào pRSET- A được thực hiện như sau:

(1) Cắt plasmid gen idi bằng hai enzyme giới hạn NdeI và BamHI ở hai đầu

gen và vector pRSET-A bằng hai enzyme tương ứng để thôi gel, thành phần phản ứng cắt như sau: Dung dịch đệm cho enzyme : 3,0 µl, 20µl DNA plasmid, 2 µl enzyme giới hạn và 5 µl nước cất vô trùng Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 370C, trong

2 giờ Sau đó điện di và thôi gel thu nhận gen idi và vector pRSET-A ở dạng mở

vòng

(2) Gắn nối gen idi vào vector pRSET-A đã được cắt mở vòng, phản ứng gắn

nối có thành phần như sau: 2 µl đệm 5X, 4µl vector, 12 µl DNA và 1 µl enzyme nối T4 ligase Sản phẩm phản ứng được ủ ở 160 trong 5giờ

(3) Biến nạp sản phẩm gắn nối trên vào tế bào khả biến E coli DH5α theo

phương pháp giống phần 2.4.1.5, tuy nhiên có một số điều chỉnh môi trường cấy trải

là LB đặc amp (0,5µg/ml)

(4) Các dòng khuẩn lạc trắng được nhặt nuôi tăng sinh riêng rẽ trong 7ml LB

lỏng có bổ sung amp ở điều kiện lắc 370 qua đêm Tách plasmid các dòng khuẩn lạc thu được bằng Kit “DNA-spinTM” của hãng Intron Biotechnology

(5) Kiểm tra sự có mặt của gen idi trong vector biểu hiện bằng các phản ứng

cắt bằng enzyme giới hạn tương ứng (NdeI, BamHI)

Quá trình gắn các gen tiếp theo: Thực hiện tương tự như trên, chỉ khác ở việc

sử dụng enzyme giới hạn

Thiết kế vector pRSET-iE

Cắt mở vòng plasmid pR-i và crtE bằng BamHI và XhoI và gắn nối tạo thành pRSET-iE (pR-i + crtE)

Thiết kế vector pRSET-iEI

Cắt mở vòng plasmid pR-iE và crtI bằng XhoI và KpnI và gắn nối tạo thành pRSET-iEI (pRiE + crtI)

Thiết kế vector pRSET-iEIB

Cắt mở vòng plasmid pR-iEI và crtB bằng enzyme KpnI và EcoRI, gắn nối tạo thành vector pRSET-iEIB (pR-iEI + crtB)