Nghiên cứu tổng hợp thuốc kháng sinh linezolid ở quy mô phòng thí nghiệm

DANH MỤC CÁC HÌNH trang Hình 1.1: Nhân oxazolidinon Hình 1.2: Các dẫn chất 5-halomethyl-3-aryl-2 oxazolidinon Hình 1.3: Một số dẫn chất oxazolidinon Hình 1.4: Một số dẫn chất oxazolidino

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với TS Văn Thị Mỹ Huệ và TS Nguyễn Quốc Vượng, những người đã tận tụy hướng dẫn và giúp đỡ em trong quá trình thực hiện luận văn này

Em cũng xin cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của : Ths Nguyễn Thị Huế, Ths Phạm Thị Hằng, Ths Vũ Văn Chiến (Phòng Công Nghệ Hóa Dược – Viện Hóa Sinh Biển – Viện Hàn Lâm Khoa Học Việt Nam), cùng các thầy cô trong các bộ môn, phòng ban, thư viện trường Đại Học Dược Hà Nội

Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn gia đình, anh chị em và các bạn đồng nghiệp đã luôn động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu vừa qua

Hà nội ngày 30 tháng 03 năm 2017 Học viên

Phạm Thị Luân

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

3.1.1 Nghiên cứu quy trình tổng hợp hợp chất

(S)-3-(3-fluoro-4-morpholinophenyl)-2-oxo-5-oxazolidinyl methyl phthalimid (28) từ

27

3.3 KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT VÀ KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC

LINEZOLID VÀ CÁC CHẤT TRUNG GIAN

42

4.1.1 Nghiên cứu quy trình tổng hợp hợp chất

(S)-3-(3-fluoro-4-morpholinophenyl)-2-oxo-5-oxazolidinyl methyl phthalimid (28) từ

Tài liệu tham khảo 67

Phụ lục

hưởng từ hạt nhân carbon 13) Dicloro methan

Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

Dimethyl acetamid N,N dimethyl formamid Dimethyl sulfoxid Ethyl acetat Ethanol Food and Drug Administration Heteronuclear Multiple Bond Coherence

hưởng từ hạt nhân proton) Isopropyl alcohol

Infrared spectroscopy (phổ hồng ngoại) Methanol

Methicillin Resistant Staphyl lococus Aureus Mass spectroscopy(Phổ khối lượng)

Room temperature (Nhiệt độ phòng) Sắc ký lớp mỏng

Triethylamin Tetrahydrofuran Vancomycin Resistant Enterococci

DANH MỤC CÁC HÌNH

trang Hình 1.1: Nhân oxazolidinon

Hình 1.2: Các dẫn chất 5-halomethyl-3-aryl-2 oxazolidinon

Hình 1.3: Một số dẫn chất oxazolidinon

Hình 1.4: Một số dẫn chất oxazolidinon của Dupont và Upjohn

Hình 1.5: Cơ chế tác dụng của linozelid

Hình 1.6: Vai trò của nhân oxazolidinon

Hình 1.7: Cấu trúc của linezolid và các dẫn xuất oxazolidinon đang

trong quá trình th nghiệm lâm sàng

Hình 1.8: Những biến tính ở vòng A

Hình 1.9: Những biến tính ở vòng B

Hình 1.10: Những biến tính vòng C

Hình 1.11: Sơ đồ tổng hợp linezolid theo phương pháp của

Pharmacia & Upjohn

Hình 1.12: Quy trình tổng hợp Linezolid theo phương pháp của Li

Hình 1.13: Phương pháp tổng hợp của Xu

Hình 1.14: Sơ đồ tổng hợp linezolid theo phương pháp của

Lee Pharma Limited

Hình 1.15: Sơ đồ tổng hợp theo phương pháp của Zhang và

Hình 1.19: Phản ứng Gabriel

Hình 1.20: Các sản phẩm trung gian trong phản ứng thủy phân

N-alkylphthalimid với hydrazin

Hình 1.21: Pyridin nhƣ là một chất xúc tác trong phản ứng tổng hợp

amid

Hình 3.1: Sơ đồ tổng hợp

(S)-3-(3-fluoro-4-morpholinophenyl)-2-oxo-5-oxazolidinyl methyl phthalimid (28)

Hình 3.2: Sơ đồ tổng hợp (S)-5(amino

Bảng 3.11: Kết quả tinh chế linezolid

Bảng 3.12: Nhiệt độ nóng chảy của linezolid và các chất trung gian

Bảng 3.13: Số liệu phổ IR của chất 28, 17 và 1

Bảng 3.14: Kết quả đo phổ MS của các chất 28, 17 và 1

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay tình trạng kháng kháng sinh đang có xu hướng ngày càng gia tăng

và nghiêm trọng trên thế giới đặc biệt ở các nước đang phát triển trong đó có Việt Nam [4][36] Hậu quả là dẫn đến chi phí điều trị tăng, thời gian điều trị kéo dài và tỷ lệ t vong cao hơn Trong khi việc kiểm soát các nguyên nhân dẫn đến việc gia tăng tình trạng kháng kháng sinh của các vi khuẩn gặp rất nhiều khó khăn thì việc tìm ra các kháng sinh mới để chống lại các vi khuẩn kháng thuốc luôn là nhu cầu cấp thiết

Trong các loại vi khuẩn kháng thuốc hiện nay, vi khuẩn Enterococci kháng vancomycin (VRE) hay Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) là

những chủng vi khuẩn được các nhà khoa học rất quan tâm [39][7][34] Có một số kháng sinh đã được nghiên cứu và phát triển để điều trị các vi khuẩn này, một trong số đó là linezolid [27]

Linezolid (1) là một kháng sinh tổng hợp toàn phần thuộc nhóm

oxazolidinon mới nhất hiện nay, được nghiên cứu và phát triển bởi công ty Pharmacia & Upjohn (nay thuộc Pfizer) từ năm 1990 [9] và được FDA phê chuẩn s dụng vào năm 2000

Tuy nhiên linezolid trên thị trường có giá thành cao, nên chi phí điều trị là không nhỏ so với thu nhập của người bệnh [25][43] Điều này cho thấy việc nghiên cứu tìm ra qui trình tổng hợp thuốc kháng sinh này đạt hiệu quả cao,

có thể giảm giá thành của thuốc và xa hơn là chủ động được nguồn nguyên

liệu trong nước, là một hướng đi hợp lý Luận văn “Nghiên cứu tổng hợp thuốc kháng sinh linezolid ở quy mô phòng thí nghiệm” được thực hiện

với mục tiêu sau:

1 Tổng hợp được kháng sinh linezolid ở quy mô phòng thí nghiệm từ (cloromethyl)-3-(3-fluoro-4-morpholinophenyl)-oxazolidin-2-on

(5R)-5-2

2 Tinh chế đƣợc linezolid đạt tiêu chuẩn về hàm lƣợng theo USP Pending Monograph 2012

3

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1 Nh ng d n chất kháng khu n nhóm oxazolindinon

Các oxazolidinon cho một nhóm mới của tác nhân kháng khuẩn tổng hợp

có hoạt tính chống lại các vi khuẩn gram dương gây bệnh đa kháng thuốc, bao gồm tụ cầu vàng đã kháng methicilin, liên cầu kháng penicillin [27] Trong cấu trúc của nhóm chất này có chứa khung 2-oxazolidinon (Hình 1.1):

Hình 1.1: Nhân oxazolidinon Những tính chất kháng khuẩn của cấu trúc oxazolidinon đã được ghi nhận đầu tiên (Hình 1.2) vào những năm 1978 bởi Fugitt và Luckenbaugh ở DuPont trong quá trình nghiên cứu việc x lý bệnh ở thực vật mà nguyên nhân là do mầm bệnh vi khuẩn và nấm [13]

4

Hình 1.3: Một số dẫn chất oxazolidinon Cuối năm 1987 nhóm ở DuPont mô tả hai oxazolidinon Dup 721 và Dup

105 (hình 1.4) Ghi nhận hiệu quả kháng khuẩn của lớp oxazolidinon, Steven

J Brickner và các cộng sự ở Upjohn đã tổng hợp hai dẫn chất oxazolidinon là U-100592 và U-100766 (hình 1.4) [8]

Hình 1.4: Một số dẫn oxazolidinon của Dupont và Upjohn

Trong đó U-100766 có độ an toàn trên chuột, chó và người [8] và sau này được phát triển thành linezolid

1.2 Tác dụng của linezolid

Linezolid (1) là một kháng sinh tổng hợp toàn phần thuộc nhóm

oxazolidinon mới nhất hiện nay, có công thức cấu tạo và tên khoa học:

Tên IUPAC:

(S)-N-((3-(3-Fluoro-4-morpholinophenyl)-2-oxooxazolidin-5-yl)methyl)acetamid (1)

Công thức phân t : C16H20FN3O4

5

Khối lượng phân t : 337,35 đvC

1.2.1 Cơ chế tác dụng của linezolid

Linezolid được nghiên cứu và phát triển bởi công ty Pharmacia & Upjohn (nay thuộc Pfizer) từ năm 1990 và được FDA phê chuẩn s dụng vào năm năm 2000, thuốc được đưa ra thị trường với một số tên biệt dược như Zyvox, Zyvoxid, Zyvoxam, Linospan, và Linezolid Linezolid nhìn chung được s dụng để điều trị các trường hợp nhiễm khuẩn nặng gây nên bởi các vi khuẩn Gram (+) mà đã kháng với các họ kháng sinh khác, ví dụ như nhiễm khuẩn

Enterococci kháng vancomycin (VRE) hay Staphylococcus aureus kháng

methicillin (MRSA) Chỉ định dùng chính của kháng sinh này là điều trị nhiễm trùng nặng ở da, các mô mềm và viêm phổi (đặc biệt viêm phổi mắc phải ở bệnh viện), nhiễm khuẩn huyết, viêm màng trong tim và các bệnh nhiễm khuẩn đã kháng các họ kháng sinh khác [22] Sinh khả dụng đường uống của linezolid là 100%

Linezolid ức chế sự tổng hợp protein của vi khuẩn giống như một số dòng kháng sinh khác như cloramphenicol, clindamycin, aminoglycosid, hay macrolid Tuy nhiên tất cả các kháng sinh này ức chế sự tổng hợp protein của

vi khuẩn ở giai đoạn kéo dài mạch peptid, còn linezolid tác dụng ở ngay giai đoạn khởi đầu của sự tổng hợp protein-ức chế sự hình thành phức hợp 70S khởi đầu dịch mã (Hình 1.2) Chính nhờ cơ chế tác dụng đặc biệt này nên chưa thấy hiện tượng vi khuẩn kháng chéo giữa các kháng sinh ở trên với linezolid, vì thường vi khuẩn hay kháng chéo giữa các kháng sinh mà có tác dụng cùng một cơ chế [19]

6

Hình 1.5: Cơ chế tác dụng của linezolid

1.2.2 Liên quan cấu trúc và tác dụng [40]

Cấu tạo của linezolid gồm 3 vòng liên kết với nhau qua dị tố nitơ là (Hình 1.6): vòng

oxazolidion A, vòng thơm B, vòng morpholin C và một mạch nhánh

methylacetamid tại C-5 của vòng A (Hình 1.6) Vòng dị tố oxazolidion 5 cạnh

(vòng A) với cấu hình C-5(S) đóng vai trò cần thiết cho hoạt tính kháng khuẩn;

vòng B là vòng thơm được đòi hỏi với nhóm thế 3-F tăng cường hoạt tính kháng

khuẩn; vòng C là vòng morpholin tăng cường dược động học và tính tan; mạch

nhánh methylacylamid cũng thiết yếu cho hoạt tính kháng khuẩn

Linezolid ngăn chặn

sự hình thành phức khởi đầu

Phức hợp khởi đầu 70S

Ribosom 50S

Aminoglycosid, Macrolid, Tetracyclin, Cloramphenicol,

Lincomycin

7

Hình 1.6: Vai trò của nhân oxazolidinon Ngoài linezolid thì còn một số dẫn xuất oxazolidinon tiềm năng khác

đang đƣợc th nghiệm trên lâm sàng nhƣ Eperezolid (PNU-100592),

Posizolid (AZD2563), Ranbezolid (RBx 7644), Torezolid (TR-701) và

Radezolid (RX-1741) (Hình 1.7) [8]

Nhóm acylaminomethyl C-5 là tối ƣu cho kháng

8

Hình 1.7: Cấu trúc của linezolid và các dẫn xuất oxazolidinon đang trong quá

trình th nghiệm lâm sàng Những nghiên cứu phát triển những thế hệ mới của dòng oxazolidinon hoàn hảo hơn là mục tiêu của các chương trình nghiên cứu tổng hợp thuốc Những biến đổi ở các vòng A, B, C trong phân t linezolid được đề cập trong nhiều tài liệu

Những hợp chất thio tương tự của linezolid và eperezolid, 6a và 7a (hình

1.8) dường như không liên kết với các tiểu đơn vị ribosom 50S của vi khuẩn

và không có khả năng ức chế sự tổng hợp protein của vi khuẩn [8], hoạt tính

kháng khuẩn có huynh hướng tương tự với dẫn chất 8a (Hình 1.8) là hợp chất

thio có hoạt tính kháng khuẩn tương tự của DuP721 [14]

Quesnelle và cộng sự đã báo cáo những tác nhân có những nhóm thế khác nhau ở vòng C, phần lớn các đã tìm được thấy là có tác dụng với các vi khuẩn

Gram dương [28] Những dẫn chất 9a và 10a (Hình 1.8) đã chỉ ra có phổ hoạt tính kháng khuẩn rộng, hơn nữa sulfoxid 9a thể hiện độc tính thấp hơn so với

linezolid trong nghiên cứu 7 ngày ở chuột

9

Trong một nghiên cứu của Wang và cộng sự, một loạt hợp chất 11a, 12a, 13a (Hình 1.8) có chứa nhân đối xứng thể hiện hoạt tính kháng khuẩn tốt [42]

Hình 1.8: Những biến đổi ở vòng A Trong công bố của Bosch và cộng sự, sự tổng hợp thuận lợi của hợp chất

14a (Hình 1.8) có cấu dạng 3 vòng tương tự linezolid nhưng lại không có hoạt tính Merck đã mô tả những dẫn xuất oxazolidinon 15a, 16a (Hình1.9) đã

được thế với phần cyclopropyl thể hiện hoạt tính kháng khuẩn in vitro rất có triển vọng trên các chủng vi khuẩn khác nhau [20]

Selvakuma và cộng sự đã báo cáo chất tương tự linezolid như

tetrahydroazolo-benzothiazin 17a (Hình 1.9) có hoạt tính chống lại các vi

khuẩn Gram dương kháng thuốc nhạy cảm trong dãy với MIC từ 0,25-1µg/ml [35]

Choy và cộng sự từ Pfizer cho thấy sự tổng hợp cấu t oxazolidinon 18a

có cấu dạng hạn chế thể hiện phổ hoạt tính kháng khuẩn rộng trong dãy với

10

MIC từ 0,06-0,25µg/ml với vi khuẩn gram dương và 1-2µg/ml đối với vi khuẩn gram âm [10]

Hình 1.9: Những biến đổi ở vòng B

Một loạt những dẫn xuất N-phenyl piperazinyl của oxazolidinon 19a (Hình

1.10) trong đó những nguyên t nitrogen ở vị trí 4 của vòng piperazinyl đã được thế bởi những nhóm cinamoyl khác nhau Sự tối ưu này đã tìm thấy được một số dẫn chất có hiệu quả chống lại vi khuẩn gram dương [41] Một

dẫn chất điển hình như hợp chất 22a (Hình 1.10) có vòng cyclohexanon đã

cho thấy hoạt tính kháng khuẩn chống lại các chủng Gram dương khác nhau trong dãy với MIC 1-4µg/ml chúng được so sánh với linezolid 0,5-4µg/ml Ranbaxy đã báo cáo sự tổng hợp của oxazolidinon được biến đổi ở vòng C, sự

tối ưu của một dãy chất đã tìm ra hợp chất 23a (Ranbezolid, REBx7644)

(Hình 1.10) đã được phát triển lâm sàng [11]

1.3.1 Phương pháp Pharmacia &Upjohn [30][8][9]

Phương pháp của Pharmacia&Upjohn là một trong những phương pháp phổ biến để tổng hợp nhân oxazolidinon

12

Hình 1.11:Sơ đồ tổng hợp linezolid theo phương pháp c ủa

Pharmacia & Upjoh n Theo sơ đồ (Hình 1.11) chất trung gian 3-fluoro-4-morpholinyl-

nitrobenzen (9) được tổng hợp từ phản ứng thế giữa morpholin (7) và difluoro- nitrobenzen (8) dưới sự có mặt của triethylamin Phản ứng thế chọn

3,4-lọc xảy ra ở vị trí số 4 do ảnh hưởng hoạt hóa của nhóm nitro ở vị trí para so

với F Tiếp theo chất trung gian 9 được hydro hóa với xúc tác là Pd/C để tạo

ra anilin 10 và amin này phản ứng với chloroformat 11 tạo ra carbamat 12 Chuyển carbamat 12 sang dạng anion bằng butyllithium sau đó anion này

được phản ứng với (R)-glycidyl butyrat 13 để đóng vòng tạo thành chất trung

gian chìa khóa oxazolidinon 14 Tiếp theo là phản ứng chuyển hóa nhóm hydroxy của 14 sang nhóm amin qua một số bước bao gồm phản ứng của hợp chất 14 với methylsufonyl clorid tạo ra hợp chất mesylat 15 Phản ứng thế

SN2 nhóm mesylat của 15 với NaN3 để thu được azid 16 Kh hóa azid 16 với xúc tác là Pd/C để tạo ra amin 17 Cuối cùng phản ứng acetyl hóa hợp chất 17

13

để thu được linezolid 1 Nhược điểm của qui trình này là phản ứng giữa

carbamat 12 và (R)-glycidyl butyrat 13 cần diễn ra ở nhiệt độ thấp (-78oC) nên không phù hợp với việc sản xuất và điều chế linezolid ở lượng lớn

1.3.2 Phương pháp của Li [21]

Hình 1.12: Quy trình tổng hợp Linezolid theo phương pháp c ủa

Li

Trong phương pháp này (Hình 1.12), hợp chất chìa khóa dị vòng

(R)-5-(cloromethyl)oxazolidin-2-on 19 được tổng hợp bằng phản ứng trực tiếp giữa

(R)-epiclorohydrin 18 với natri cyanat trong dung môi nước ở nhiệt độ 60oC

Chất trung gian này phản ứng với kali phthalimid để tạo ra hợp chất

(S)-2-((2-oxooxazolidin-5-yl)methyl)isoindolin-1,3-dion 20 Phản ứng Goldberg giữa

20 và 4-(4-bromo-2-fluorophenyl)-morpholin 21 với CuI là xúc tác tạo ra hợp

chất 22 Hợp chất này sẽ phản ứng với hydrazin hydrat để thu được

(S)-5-(aminomethyl)-3-(3-fluoro-4-morpholinophenyl)oxazolidin-2-on 17 Cuối cùng phản ứng acetyl hóa hợp chất 17 để thu được linezolid 1 Ưu điểm của

quy trình này là ít bước phản ứng hơn so với phương pháp của Pharmacia &

Upjohn, tuy nhiên phản ứng tổng hợp vòng

(S)-5-(cloromethyl)oxazolidin-2-on (19) dùng natri cyanat là chất độc hại sẽ không phù hợp với việc sản xuất

linezolid ở quy mô pilot

14

1.3.3 Phương pháp của Xu [18]

Hình 1.13: Phương pháp tổng hợp của Xu Trong phương pháp này (Hình 1.13) chất trung gian chìa khóa

oxazolidinon 14 được tổng hợp qua hai bước phản ứng chính là phản ứng kh

amin hóa hợp chất 10 với (S)-glyceraldehyd acetonid 23 để tạo ra hợp chất

N-[4(R)-(2,2-dimethyl-1,3-dioxolan-4-yl)methyl]-3-fluoro-4- morpholinylanilin

24 Sau khi thủy phân dioxolan 24 này bằng dung dịch acid HCl trong

methanol, phản ứng đóng vòng của chất trung gian này với triphosgen dưới sự

có mặt của K2CO3 để tạo ra 14 Sau đó 1 sẽ được tổng hợp từ 14 với các bước

phản ứng giống như phương pháp của Pharmacia & Upjohn Ưu điểm của

phương pháp này là dùng hợp chất ban đầu (S)-glyceraldehyd acetonid 23 có

thể tổng hợp được từ vitamin C nên giá thành nguyên liệu đầu vào sẽ rẻ hơn

so với dùng (R)-glycidyl butyrat (13) và (R)-epiclorohydrin (18) ở trên Tuy

nhiên phản ứng đóng vòng tạo oxazolidinon 14 phải dùng triphosgen và hiệu

suất phản ứng này cũng thấp nên sẽ không phù hợp với việc sản xuất linezolid

ở quy mô pilot

1.3.4 Phương pháp của Lee Pharma Limited [6]

15

Hình 1.14:Sơ đồ tổng hợp Linezolid theo phương pháp của Lee

Pharma Limited

Trong sơ đồ (Hình 1.14), hợp chất (R)-epiclorohydrin 18 được dùng phản

ứng trực tiếp với anilin 10 tạo thành dẫn xuất 25 Dẫn xuất dị vòng 26 được tổng hợp từ phản ứng carbonylation của 25 với diimidazolyl carbonyl Sau đó acetyl hóa dẫn xuất oxazolidinon 26 bằng natri acetat tạo thành 27 Thủy phân

hợp chất này bằng natri t-butoxid tạo thành alcohol 14 Phản ứng mesylat hóa

alcohol này tạo thành dẫn xuất 15, chất này phản ứng với kali phthalimid cho hợp chất 28 Cuối cùng amin 17 thu được từ phản ứng giữa 28 với hydrazin hydrat và amin này phản ứng với anhydrid acetic để tạo thành linezolid 1

Nhìn chung việc tổng hợp các chất trung gian đến sản phẩm linezolid trong quy trình này cho hiệu suất tương đối cao trong mỗi bước phản ứng Tuy

của Li và có thể áp dụng cho tổng hợp linezolid ở qui mô pilot

1.3.5 Phương pháp của Zhang và cộng sự [44]

Hình 1.15: Sơ đồ tổng hợp theo phương pháp của Zhang và

cộng sự

Để thu được sản phẩm linezolid có cấu hình S tại vị trí C-5 các phương pháp tổng hợp bất đối xứng đã được quan tâm Zhang X X và cộng sự (Hình 1.15) đã điều chế hợp chất isocyanat rồi cho ngưng tụ với tác nhân quang hoạt

oxiran (R- epichlorohydrin) được xúc tiến bởi MgI2 etherat dưới điều kiện không dung môi cho sản phẩm với hiệu suất cao (88-92%)

1.3.6 Phương pháp của Piccionello và cộng sự [26]

Piccionello A P và cộng sự (Hình 1.16) đã s dụng phản ứng Henry xúc tác Cu trong bước chìa khóa với sự trợ giúp của các phối t aminopyridin trong tổng hợp tiền chất quang hoạt và cuối cùng thu được sản phẩm linezolid

có hiệu suất và độ tinh khiết quang học cao

Hình 1.16:Sơ đồ tổng hợp phương pháp của Piccionello và

cộng sự

1.3.7 Phương pháp của Roberto M R và cộng sự [33]

17

Roberto M R và cộng sự (Hình 1.17) đã s dụng các tác nhân chiral với sự

hỗ trợ của các nhóm bảo vệ, qui trình diễn ra nhiều bước thu được sản phẩm linezolid có độ tinh khiết quang học cao

Hình 1.17: Sơ đồ tổng hợp theo phương pháp của Roberto M

R và cộng sự Sau khi tìm hiểu các phương pháp tổng hợp linezolid chúng tôi lựa chọn tổng hợp linezolid theo phương pháp của Li [21] và Lee Pharma Limited [6]

Quy trình tổng hợp linezolid trong luận văn được bắt đầu từ chất 26 và được

nghiên cứu về các điều kiện ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng (Hình 1.18):

Hình 1.18: Sơ đồ tổng hợp linezolid của luận văn

1.4 Các phản ứng liên quan đến quy trình tổng hợp linezolid t chất trung gian 26

1.4.1 Phản ứng Gabriel

18

Phản ứng Gabriel là phản ứng hóa học chuyển alkyl halogen bậc 1 thành amin bậc 1

Hình 1.19: Phản ứng Gabriel Giai đoạn đầu tiên đầu tiên của phản ứng Gabriel có thể s dụng kali phthalimid hoặc natri phthalimid hoặc phthalimid với kali carbonat hay natri carbonat Những qui trình tổng hợp Gabriel đã có nhiều cải tiến cả ở bước alkyl hóa và bước tách loại tạo amin Những dung môi khác nhau đã được đưa vào cho phép thực hiện phản ứng ở nhiệt độ thấp hơn so với qui trình ban đầu, những tác nhân alkyl hóa cũng mới lạ cũng đã được áp dụng [45][15][24] Hơn nữa những điều kiện thay thế cho sự thủy phân và tách loại cũng đã được cải tiến, chẳng hạn như sự thủy phân hydrazin

Các phản ứng alkyl hóa trực tiếp các amin rất khó kiểm soát mức độ alkyl hóa, thông thường thu được các sản phẩm có mức độ alkyl hóa khác nhau là các amin bậc 1, amin bậc 2, amin bậc 3 và thậm chí muối amin bậc 4 Nguyên nhân thu được các amin bậc cao hơn là do các alkyl gắn vào nguyên t ni tơ đẩy điện t làm tăng hoạt tính của các amin đã được thế và các amin này luôn

có xu hướng hình thành các amin có nhiều nhóm thế hơn Thuận lợi chính trong phản ứng Gabriel là tránh sự alkyl hóa tiếp theo thành các amin bậc cao

hơn Bước thủy phân của N- alkylphthalimid có thể tiến hành trong điều kiện

acid hoặc base, tuy nhiên, các phản ứng thủy phân này cần thời gian rất dài để kết thúc phản ứng Vì vậy phản ứng đã được biến tính bởi s dụng hydrazin

để tăng tốc độ phản ứng sự thủy phân

19

Năm 2003, Murry và cộng sự đã chứng minh sự tồn tại của một số sản phẩm trung gian qua sự phân tích phổ các chất trung gian phân lập được từ

phản ứng thủy phân N-alkylphthalimid với hydrazin Từ kết quả phân tích cấu

trúc các sản phẩm trung gian kết hợp với tổng hợp chúng bằng các phương

pháp đã biết, các tác giả đã khẳng định quá trình thủy phân N-alkylphthalimid với hydrazin gồm sự mở vòng N-alkylphthalimid của hydrazin hình thành

chất trung gian amidohydrazid 4, sau đó amidohydrazid 4 đóng vòng hình thành muối amin 9 Muối amin 9 sau đó được x lý với base tạo thành phtalohydrazid 3 và amin RNH2 hoặc được x lý với acid HCl cũng cho

phtalohydrazid 3 và muối amin RNH2.HCl (Hình 1.20)

Hình 1.20: Các sản phẩm trung gian trong phản ứng thủy phân

N-alkylphthalimid với hydrazin

Phản ứng Gabriel được s dụng để tổng hợp chất 17 từ chất đầu vào 26 và chất trung gian 28 Sau đây là bảng tổng kết từ các tài liệu tham khảo về các

điều kiện phản ứng khác nhau ảnh hưởng đến hiệu suất của phản ứng và đây cũng là cơ sở để khảo sát các điều kiện của phản ứng:

Tỷ lệ mol Chất 26/

Kali phthalimid

Dung môi (ml)

Nhiệt

độ (t°C)

Thời gian (giờ)

Hiệu suất (%)

Tỷ lệ mol Chất 28/

hydrazin hydrat

Dung môi (ml)

Nhiệt độ (t°C)

Thời gian (giờ)

Hiệu suất (%)

1.4.2 Phản ứng acetyl hóa tạo amid t amin[32]

Có rất nhiều phương pháp tạo amid trong đó phương pháp đơn giản nhất là cho amin phản ứng với một acid carboxylic [2][5] Nói chung phản ứng này cần một năng lượng hoạt hóa cao, vì vậy khi phản ứng trực tiếp như vậy thường đòi hỏi nhiệt độ cao Tác nhân acyl hóa trong acid carboxylic là một tác nhân yếu do ảnh hưởng của nhóm –OH, do vậy để phản ứng thuận lợi hơn thì thường sẽ s dụng tác nhân acyl ái điện t mạnh hơn như: ester, acid halogenid (phản ứng Schotten-Baumann) và anhydrid (phương pháp Lumière–Barbier)

21

Phản ứng giữa acid halogenid với NH3 hoặc các amin là một phản ứng thông thường trong tổng hợp các amid Acyl hóa các amin đã được biết từ năm 1853, khi Gerhardt báo cáo phản ứng acyl hóa của các anilin Phản ứng này tỏa nhiệt rất cao do vậy cần phải kiểm soát rất cẩn thận bằng cách làm lạnh hỗn hợp phản ứng hoặc thực hiện phản ứng trong dung dịch rất loãng Phản ứng acyl hóa điển hình được tiến hành bởi điều kiện nhỏ chậm một amin trong dung môi khan phù hợp vào dung dịch acid clorid trong sự có mặt

của các base hữu cơ thích hợp như pyridin, TEA, 4-picolin, N-methyl

morpholin and natri 2-ethylhexanoat

Trong phản ứng acyl hóa sự hiện diện của các base là rất quan trọng để trung hòa một lượng acid tương ứng tạo thành, nếu không nó sẽ phản ứng lại các amin và làm giảm hiệu suất của phản ứng Các base hữu cơ đóng vai trò là chất xúc tác trong các phản ứng này

Hình 1.21: Pyridin như là một chất xúc tác trong phản ứng tổng hợp

amid [32]

Thông thường thì chất nhận HCl là một base mạnh hơn amin chất phản ứng (RNH2), do vậy sự acyl hóa của một hỗn hợp đồng lượng của hai amin thường được quan sát sự chuyển đổi của amin yếu hơn thành amid và hydroclorid của amin mạnh hơn trong một số loại dung môi Thông thường thì base hữu cơ hay lựa chọn là các amin bậc 3 như là pyridin, triethylamin

Đa số các nhà nghiên cứu đều s dụng phản ứng N-acyl hóa trong dung

môi hữu cơ, với tác nhân hay gặp là các acid halogenid và anhydrid, với xúc

tác là các base hữu cơ bậc 3 để chuyển chất 17 thành linezolid 1 Sau đây là bảng tổng kết các điều kiện trong phản ứng từ chất 17 thành chất 1

Bảng 1.3: Tổng kết các điều kiện của phản ứng chuyển chất 17 thành chất 1

Xúc tác (mmol)

Dung môi (ml)

Nhiệt

độ (°C)

Thời gian (giờ)

Cách tinh chế linezolid

Hiệu suất (%)

2

Kết tinh lại trong MeOH

1

Kết tinh lại trong IPA

1 Kết tinh lại bằng MeOH 87 [29]

4 10

Acetyl clorid TEA

(2/20) DCM

Nhiệt

độ phòng

1

Sắc ký cột (EA:MeOH

23

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất:

Các hóa chất, dung môi dùng trong quá trình tổng hợp có xuất xứ từ các công ty: Merk, Sigma-Aldrich, Trung Quốc, (ở bảng dưới) Các hóa chất này được s dụng trực tiếp không qua tinh chế thêm

2 Raney®-Nickel alloy TCI- Nhật 98%

3 Tetrahydrofuran, khan TCI- Nhật 98%

4 tert-Butanol 99% TCI- Nhật 99%

5 (R)-(-)-Epiclorohydrin, 98% Sigma-Adrich 98%

6 N,N'-Carbonyldiimidazol (CDI), 97% Sigma-Adrich 97%

7 Acetonitril 99%, khan Sigma-Adrich 99%

8 Bản mỏng silicagel pha thường Merck

9 Bột sắc ký silicagel pha thường Merck

10 n-Hexan (KT ) Trung Quốc 99%

11 Ethyl acetat (KT ) Trung Quốc 99%

12 Diclomethan (KT) Trung Quốc 99%

13 Methanol (KT ) Trung Quốc 99%

- Sắc ký cột s dụng Merck silica gel 40 (mesh 70-230)

- Hệ thống phễu lọc chân không, phễu lọc, phễu chiết quả lê, phễu nhỏ giọt; giấy lọc; máy khuấy từ gia nhiệt, hệ thống sinh hàn xoắn, cân điện

t

- Máy hút khô, tủ sấy

- Máy đo phổ IR đƣợc ghi trên máy Perkin Elmer tại Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Phổ MS đo trên máy phổ khối LC/MS Agilent 1260 thuộc Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Phổ 1H-NMR, 13C-NMR đo trên máy Bruker AC 500 (500MHz) tại Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.3 Nội dung nghiên cứu

25

Chất mục tiêu được tổng hợp theo sơ đồ sau (Hình 1.18):

- Nghiên cứu tổng hợp hợp chất

(S)-3-(3-fluoro-4-morpholinophenyl)-2-oxo-5-oxazolidinyl methyl phthalimid (28) và khảo sát một số yếu tố

ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng

- Nghiên cứu tổng hợp hợp chất

(S)-3-(3-fluoro-4-morpholinophenyl)-2-oxo-5-oxazolidinyl methyl amin (17) và khảo sát một số yếu tố ảnh

hưởng đến hiệu suất phản ứng

- Nghiên cứu tổng hợp sản phẩm

(S)-3-(3-fluoro-4-morpholinophenyl)-2-oxo-5-oxazolidinyl methyl acetamid (1) và khảo sát một số yếu tố

- Theo dõi tiến trình phản ứng bằng SKLM

- Kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM

26

2.4.2 Phương pháp tinh chế và xác định cấu trúc

- Phương pháp tinh chế sản phẩm linezolid là phương pháp kết tinh lại trong một số dung môi phù hợp

- S dụng các phương pháp phổ như IR, MS, NMR một chiều (1D) và hai chiều (2D) để phân tích khẳng định cấu trúc của các sản phẩm tổng hợp

2.4.3 Phương pháp định lượng linezolid

S dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), theo USP Pending Monograph 2012

27

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1 TỔNG HỢP HÓA HỌC

Linezolid 1 được tổng hợp theo sơ đồ sau:

Theo sơ đồ trên linezolid sẽ được nghiên cứu tổng hợp qua 3 bước từ chất

trung gian 26 là

(5R)-5-(cloromethyl)-3-(3-fluoro-4-morpholinophenyl)-oxazolidin-2-on Bước 1 là phản ứng alkyl hoá kali phthalimid bởi alkyl halid

26 Bước 2 là loại bỏ nhóm bảo vệ phthaloyl bởi hydrazin hydrat để thu được amin 17 Bước 3 là acetyl hóa amin 17 thu được sản phẩm linezolid 1

3.1.1 Nghiên cứu quy trình tổng hợp hợp chất

(S)-3-(3-fluoro-4-morpholinophenyl)-2-oxo-5-oxazolidinyl methyl phthalimid (28) t chất

28

*Quy trình chung của phản ứng như sau: Trong một bình 3 cổ được lắp

sinh hàn hồi lưu, được nạp đầy khí nitơ, dung dịch của

(5R)-5-(cloromethyl)-3-(3-flouro-4-morpholinophenyl)-oxazolidin-2-on (chất 26;3,15 g; 10 mmol)

trong DMF (25 ml) được cho thêm kali phthalimid (11 mmol; 2,04 g) Hỗn hợp phản ứng được đun hồi lưu trong khoảng 12 giờ và theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng Phản ứng kết thúc, hỗn hợp được làm lạnh xuống nhiệt

độ phòng, 250 ml nước được thêm vào vào rồi chiết với ethyl acetat (3 x 15 ml) Pha hữu cơ được r a với nước và làm khan qua Na2SO4 , cất loại dung

môi dưới áp suất giảm thu được 3,6 g chất rắn trắng với hiệu suất 85%

Tnc xem tại bảng 3.12

Dữ liệu phổ IR xem tại bảng 3.13 và phụ lục 12

Dữ liệu phổ khối lượng MS: xem tại bảng 3.14 và phụ lục 9

Dữ liệu phổ 1

H-NMR và 13C-NMR: xem tại bảng 3.15, 3.16 và phụ lục 1 và 2

3.1.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất phản ứng

Các phản ứng được tiến hành ở lượng 10 mmol cho cả hai chất 26 và kali

phthalimid theo qui trình chung ở trên Kết quả thu được được trình bày trong bảng 3.1:

DMF (ml)

Hiệu suất (%)

Các kết quả thu được trên bảng 3.1 cho thấy phản ứng tổng hợp

N-alkylphthalimid 28 với tỉ lệ mol chất 26/kali phthalimid là 1/1 (mol/mol)

trong dung môi DMF cho hiệu suất tốt nhất khi thực hiện ở nhiệt độ150o

C Ở nhiệt độ thấp hơn 150o

C phản ứng cho hiệu suất thấp hơn và hình thành nhiều sản phẩm phụ, ở nhiệt độ cao hơn 150oC hiệu suất giảm đi do sản phẩm bị phân hủy Vì vậy điều kiện nhiệt độ tốt nhất cho phản ứng đã được khảo sát là

ở 150 o

C

3.1.1.2 Ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất phản ứng

Để tìm điều kiện tối ưu cho phản ứng, chúng tôi tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất phản ứng Dung môi cho phản ứng phải là các dung môi có khả năng hòa tan các tác nhân phản ứng và cung cấp đủ năng

30

lượng cho phản ứng thế alkyl hóa của N-Phthalimid với akyl halogenua 26 thu được sản phẩm thế N-alkylphthalimid 28 Chúng tôi đã chọn lọc các dung môi

có khả năng hòa tan các tác nhân và có nhiệt độ sôi thấp nhất 100 oC là nhiệt

độ phản ứng đã xảy ra Các dung môi được lựa chọn là toluen, dioxan, DMF, DMAc, các phản ứng được thực hiện theo qui trình chung các kết quả thu được được trình bày trong Bảng 3.2 như sau:

Bảng 3.2: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất phản ứng tổng hợp

chất 28

(g/mmol)

Kali phthalimid g/(mmol)

Dung môi (ml)

Nhiệt độ p/ứ (°C)

Thời gian p/ư

Hiệu suất (%)

tác nhân phản ứng cho hiệu suất cao tương đương nhau

3.1.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ mol đến hiệu suất phản ứng

Các phản ứng được tiến hành theo qui trình chung với các tỉ lệ mol của chất phản ứng và tác nhân khác nhau, kết quả các phản ứng được trình bày trong bảng 3.3 như sau: